KR100871399B1

KR100871399B1 - 면역 활성 증강용 동충하초 액체배양물로부터 얻어지는균체내 다당체와 균체외 다당체 및 그 생산 최적 배양조건

Info

Publication number: KR100871399B1
Application number: KR1020070017188A
Authority: KR
Inventors: 손동환; 송치현; 양병근; 박현
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2007-02-20
Filing date: 2007-02-20
Publication date: 2008-12-02
Also published as: KR20080077524A

Abstract

본 발명은 동충하초(Cordyceps militaris) 균사체 액체배양물로부터 얻어지는 면역활성 증강용 균체내 다당체 (endo-polymer)와 균체외 다당체(exo-polymer) 및 그 생산 최적 조건 및 이를 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것으로 동충하초의 균사체 및 균체외 다당체 생산의 최적 pH, 온도, 교반속도 및 접종량은 각각 6.0, 25℃, 150 rpm, 4%였으며, 최적 탄소원과 질소원은 슈크로즈 20g/L(sucrose)와 효모 추출물 (yeast extract) 4g/L이였다. 또한 이때 생산된 균체내 다당체와 균체외 다당체는 항 보체 활성과 대식세포 리소좀 효소활성을 증가시키는 효과가 있으므로 이를 유효성분으로 하는 면역 활성 증강용 조성물로서 약학적 조성물 또는 건강기능성 조성물로서 유용하게 이용될 수 있는 뛰어난 발명이다.

동충하초, 액체배양, 균사체, 균체내 다당체, 균체외 다당체, 면역 활성, 항보체 활성, 대식세포 리소좀 효소 활성

Description

면역 활성 증강용 동충하초 액체배양물로부터 얻어지는 균체내 다당체와 균체외 다당체 및 그 생산 최적 배양조건 {Endo-polymer and exo-polymer obtained from submerged mycelial culture of Cordyceps militaris increasing immuno-modulating activities and optimum culture conditions for producing the same}

도 1은 동충하초 균사체 액체배양물로부터 얻어지는 균체내 다당체와 균체외 다당체를 회수하는 과정을 나타낸 모식도이다.

도 2는 동충하초 균사체 액체배양물로부터 얻어지는 균체내 다당체와 균체외 다당체의 항보체 활성을 나타낸 것이다.

도 3은 동충하초 균사체 액체배양물로부터 얻어지는 균체내 다당체와 균체외 다당체의 대식세포내 리소솜 효소활성를 나타낸 것이다.

본 발명은 면역 활성 증강용 동충하초 (Cordyceps militaris) 균사체 액체배양물로부터 얻어지는 균체내 다당체 (endo-polymer)와 균체외 다당체 (exo-polymer) 및 그 생산을 위한 최적 배양조건 및 이를 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것으로, 보다 더 상세하게는 동충하초 균사체 액체배양으로 부터 균체내 다당체와 균체외 다당체를 생산하는 최적 배양조건 및 그로부터 얻어진 다당체와 이를 유효성분으로 포함하는 면역 활성 증강 효과가 있는 약학적 조성물에 관한 것이다

내 독소 리포폴리사카라이드 와 인슐린 및 미생물이나 식물 진균으로부터 얻은 수용성 β-1,3-글루칸과 같은 다양한 생고분자물질은 보체 (Complement) 시스템을 활성화시킨다고 알려져 있다. 보체 시스템은 염증내에서 그리고 알레르기 반응에서 숙주 방어 시스템으로 중요한 역할을 담당한다고 알려져 있다. 특히 고등진균으로부터 생산된 많은 타입의 고분자물질들은 항보체 활성, 임파구에서 마이토젠 활성, 인터페론 유도활성 과 같은 면역조절활성을 갖는다고 보고되어 있다. 다양한 버섯의 배양배지와 균사체 및 자실체로부터 추출된 고분자물질의 항보체 활성은 이미 많은 연구가 진행되어져 있다.

동충하초속 버섯 균주는 분류학적으로 자낭균문, 핵균강, 맥각균목, 맥각균과에 속하며 겨울철에는 곤충의 몸에 들어가 양분을 흡수하여 곤충을 죽게하고 여름철이 되면 곤충의 몸에서 버섯을 만들며 이러한 뜻으로 동충하초라 명명되었다.

이러한 동충하초는 cordycepin을 다량으로 함유하고 있어서 항균, 항암, 면역 기능 증가 및 마약에 대한 해독 기능을 지니는 것으로 알려져 있다.

대한민국특허 제 544945 호는 누에 번데기를 프라스틱 용기에 분주한 후 액체종균을 접종하여 배양하고 누에애벌레 동충하초는 누에애벌레에 액체종균을 접종하여 재배한 다음 배양 또는 재배된 동충하초 각 1kg에 8L의 증류수를 가한후 95℃에서 6시간 가열을 반복한 후 여과지로 여과한 여과액을 진공농축하고 동결건조하 여 각 170g의 누에번데기 동충하초와 누에애벌레 동충하초 열수추출물을 얻고 cordycepin의 농도분석을 수행하고 면역기능을 확인함으로서 면역증강용 약학조성물을 제공하고 있다.

또, 애매미유충눈꽃동충하초의 추출물의 혈압강화효과를 규명한 기술은 대한민국특허 제 559998 호에 개시되어 있다. 그리고 우유를 배양 배지한 눈꽃 동충하초 배양에 대하여는 대한민국특허 제 396420 호에, 동충하초 추출물의 노인성 치매에 예방 개선 특허는 대한민국특허 제 561107 호에 각각 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 점들을 감안하여 안출한 것으로 최적화한 액체배양에 의해 생산된 균체내 다당류와 균체외 다당류의 면역증강 효과를 검정한 사실이 없다는 점에 착안하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 동충하초 균사체 액체배양물로부터 얻어진 균체내 다당체와 균체외 다당체가 항 보체 활성 및 대식세포 리소좀 효소활성을 증가시키는 효과를 확인하고 상기 다당체들의 최적 생산 조건을 확립하는데 있다.

본 발명의 목적은 동충하초 (Cordyceps militaris) 균사체 액체배양하고 상기 균사체 배양물로부터 균체내 다당류와 균체외 다당류를 수득한 다음 수득하고 다당류의 항보체 활성과 대식세포 리소좀 효소 활성을 측정함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성 및 효과를 설명한다.

본 발명의 상기 목적은 동충하초 균사체의 최적 배양조건을 조사하는 단계 와; 최적 탄소원과 질소원을 조사하는 단계와; 생산된 균체내 다당체와 균체외 다당체를 수득하는 단계와; 상기 다당체들의 면역증강 효과를 측정하는 단계로 구성된다. 또 본 발명은 항보체 활성, 대식세포 리소좀 효소 활성을 증가시키는 효과를 갖는 동충하초 (Cordyceps militaris) 균사체 액체배양물로부터 분리한 균체내 다당체와 균체외 다당체를 유효성분으로 함유하는 면역 증강용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 다당체들은 pH 6, 25℃, 150 rpm의 배양 조건하에서 탄소원으로 슈크로우스와 질소원으로 효모 추출물을 이용하여 6일동안 배양된 동충하초 균사체 액체배양물로부터 얻어진 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 효과를 실시예와 실험예를 들어 상세히 설명한다.

동충하초 (Cordyceps militraris) 균사체 액체배양물로부터 본 발명의 균체내 다당체와 균체외 다당체를 얻는 방법은 하기와 같다.

동충하초의 종균 배양은 포테이토 덱스트로즈 브로스 (pH 6.0) 100 mL을 포함하는 250 mL 플라스크에 25℃의 회전식 진탕 배양기 (150 rpm)에서 2일 동안 배양하였다.

균체내 다당체와 균체외 다당체의 생산을 위해 사용한 액체배지의 조성은 슈크로우스, MgSO₄, KH₂PO₄, K₂HPO₄, 및 효모 추출물로 구성되며, 멸균 전에 pH를 6.0으로 조정하였다. 액체배양은 200 mL의 배지를 포함하는 500 mL 플라스크를 회전식 진탕배양기 (150 rpm, 25℃)에서 6일간 배양하였다. 균체내 다당체는 액체 배양물을 10,000×g/20분간 원심분리하여 분리된 균사체 (증류수로 3회 세척)를 열수 추출하여 원심분리한 후, 상등액에 에탄올을 첨가한 후 10,000×g/20분간 원심분리하여 회수하고, 균체외 다당체는 액체 배양물을 원심분리하여 분리된 상등액에 에탄올을 첨가 한 다음 1일간 침전시켰다가 10,000×g/20분간 원심분리하여 회수하는 것이 가장 바람직하다.

회수한 각 균체내 다당체와 균체외 다당체는 침전물을 동결건조 후 10,000×g/20분간 원심분리하여 상등액만을 3일간 투석 후 동결건조하여 최종 분리하는 것이 가장 바람직하였다.

상기 배양 및 회수조건에서 수득한 각 다당체들은 보체 고정화 시험을 한 결과, 항 보체 활성을 나타낸다.

또, 상기 배양 및 회수조건에서 수득한 다당체들은 대식세포의 리소좀 효소 활성도 증가시키는 유용한 효과를 보였다.

따라서, 상기 활성들을 가지는 본 발명의 균체내 다당체와 균체외 다당체를 포함하는 약학조성물은 면역 증강용 약학적 조성물로서 유용하다.

또한, 동충하초는 오랫동안 생약 및 식용으로 사용되어 오던 약재들이므로 이들로부터 추출수득된 본 발명의 균체내 다당체와 균체외 다당체들은 독성 및 부작용의 문제가 전혀 없다.

본 발명의 약학적 또는 건강기능식품 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량%를 유효성분으로 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 균체내 다당체 및 균체외 다당체를 유효성분으로 포함하는 약학적 또는 식품조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 균체내 다당체 및 균체외 다당체를 포함하는 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사 용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 40 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위을 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 면역증강 효과를 나타내는 상기 다당체 및 식품학적으로 허용 가 능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 다당체를 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 면역 증강을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 생체고분자의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 mL를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합 성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 화합물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 화합물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.

이밖에도 본 발명의 조성물은 동물사료에 첨가하여 면역증강용 사료첨가제로 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 예시일뿐 본 발명이 이에 의하여 한정되지는 않는다.

<실시예>

실시예 1. 동충하초 (Cordyceps militaris) 균사체 액체배양 최적 조건

동충하초 (C. militaris)는 농촌 진흥청에서 분양 받았다.

상기 동충하초의 종균배양은 균사를 100mL의 PDB (photato dextrose broth, pH 6.0)가 포함된 250 mL 용량의 플라스크에 넣어 약 2일 동안 25℃에서, 150rpm의 회전식 진탕배양기에서 실시하였다.

동충하초 균사체 액체배양의 pH 및 온도의 최적 조건을 확립하기 위해 기초 배지로서 버섯완전배지(MCM)를 사용하였으며, 상기 MCM의 조성은 포도당 20g/L, MgSO₄ 0.5g/L, KH₂PO₄ 0.46g/L, K₂HPO₄ 1.0g/L, 효모 추출물 4g/L로 구성하고 멸균 전에 pH 6.0으로 조정하였다. 액체배양의 실시는 200 mL의 배지를 함유한 500 mL 용량의 플라스크에서 6일 동안 150 rpm, 25℃의 조건에서 회전식 진탕배양기를 사용하여 수행하였다.

상기 기초 배지를 사용하여 초기 pH를 각각 3.0, 4.0, 5.0. 6.0, 7.0, 8.0, 9.0으로, 온도를 각각 15, 20, 25, 30℃로 조절하여 150 rpm으로 6일간 배양하였다. 배양 후 균사체는 냉동 건조하여 건조중량을 구하고, 배양액은 에탄올 침전을 통해 다당체를 회수 한 후 냉동 건조하여 균체외 다당체의 건조 중량을 구하였다. 그 결과 초기 pH에 따른 균사체 및 균체외 다당체의 생산은 표 1에서 나타내었다. 초기 pH 6.0에서 균사체와 균체외 다당체의 생산량이 각각 12.12g/L과 0.87g/L로 최대치를 나타내었다. 온도에 따른 동충하초 버섯의 균사체의 생산은 표2 로, 15~25℃에서 비슷한 생산량을 보였으나, 균체외 다당체의 생산이 25℃에서 0.88g/L으로 최대치를 나타내었다. 교반속도에서 동충하초 균사체와 균체외 다당체의 생산은 표 3에 나타난것 처럼, 150 rpm에서 각각 12.21g/L과 0.90g/L으로 최대였다. 접종량에 따른 균사체와 균체외 다당체 생산은 표 4에 표시된 것처럼, 4% 접종량에서 각각 12.18g/L과 0.89g/L으로 최대치를 나타내었다.

[표 1]

본 발명 초기 pH별 동충하초 버섯의 균사체 및 균체외 다당체의 생산 결과

초기 pH	균사체 (g/L)	균체외 다당체 (g/L)	뱅양 후 pH
3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0	8.81± 0.34 9.00± 0.38 11.64± 0.06 12.12± 0.14 11.56± 0.48 11.73± 0.51 11.79± 0.31	0.22± 0.07 0.49± 0.02 0.77± 0.03 0.87± 0.03 0.66± 0.04 0.64± 0.02 0.35± 0.08	2.19± 0.03 2.73± 0.01 3.59± 0.03 3.96± 0.01 4.38± 0.01 4.65± 0.09 5.88± 0.11

[표 2]

본 발명 온도별 동충하초 버섯의 균사체 및 균체외 다당체의 생산 결과

온도 (℃)	균사체 (g/L)	균체외 다당체 (g/L)
15 20 25 30	12.00± 0.03 12.09± 0.04 12.03± 0.57 2.33± 0.35	0.49± 0.11 0.73± 0.03 0.88± 0.05 0.46± 0.11

[표 3]

본 발명 교반속도별 동충하초 버섯의 균사체 및 균체외 다당체의 생산 결과

교반속도 (rpm)	균사체 (g/L)	균체외 다당체 (g/L)
100 125 150 175	11.20 ± 0.13 11.82 ± 0.22 12.21 ± 0.31 12.05 ± 0.28	0.77 ± 0.06 0.82 ± 0.04 0.90 ± 0.05 0.75 ± 0.04

[표 4]

본 발명 접종량별 동충하초 버섯의 균사체 및 균체외 다당체의 생산 결과

접종량(%)	균사체 (g/L)	균체외 다당체 (g/L)
1 2 3 4 5 6	9.78 ± 0.24 10.27 ± 0.31 11.45 ± 0.28 12.18 ± 0.19 11.79 ± 0.21 11.68 ± 0.37	0.77 ± 0.02 0.76 ± 0.03 0.82 ± 0.02 0.89 ± 0.02 0.75 ± 0.04 0.72 ± 0.03

실시예 2. 동충하초 (Cordyceps militaris) 균사체 액체배양의 최적 탄소원 및 질소원 조사

탄소원의 선정을 위해 상기 기초 배지에서 탄소원으로 말토즈(maltose), 플락토즈(fructose), 글루코즈(glucose), 갈락토즈(galactose), 만노즈(mannose), 슈크로즈(sucrose)를 각각 2%씩 첨가하고 배지의 pH는 상기 실시예 1에서 확립된 6.0으로 조절한 다음 멸균하여 동충하초 균사체를 접종하여 균사체 및 균체외 다당체의 생산량을 조사하였다. 그 결과, 표3에서와 같이 균사체의 경우 슈크로즈에서 12.83g/L으로 최고치를 보인 반면에 균체외 다당체는 글루코즈에서 0.86g/L으로 최적치를 생산하였다.

질소원의 선정은 상기 기초 배지에 효모추출물(yeast extract), 펩톤(peptone), 트립톤(Trypton), 옥수수 조추출 분말(corn steep powder), 맥아 추출물(malt extract), 고기 추출물(meat extract)를 각각 0.4%씩 첨가하고 배지의 pH는 상기 실시예 1에서 확립된 6.0으로 조절한 다음 멸균하여 동충하초 버섯 균사체를 접종하여 균사체 및 균체외 다당체의 생산량을 조사하였다. 그 결과, 표 4에서와 같이 효모 추출물에서 균사체와 균체외 다당체의 생산량이 각각 12.00g/L과 1.05g으로 최고치를 생산하였다.

[표 5]

본 발명 탄소원별 동충하초 버섯의 균사체 및 균체외 다당체의 생산 결과

탄소원	균사체 (g/L)	균체외 다당체 (g/L)
말토즈 플락토즈 글루코즈 갈락토즈 만노즈 슈크로즈	11.77± 0.05 11.71± 0.03 11.76± 0.08 10.75± 0.03 11.79± 0.04 12.83± 0.10	0.74± 0.08 0.57± 0.08 0.86± 0.04 0.75± 0.04 0.75± 0.01 0.76± 0.02

[표 6]

본 발명 질소원별 동충하초 버섯의 균사체 및 균체외 다당체의 생산 결과

질소원	균사체 (g/L)	균체외 다당체 (g/L)
효모추출물 펩톤 트립톤 옥수수 조추출 분말 맥아 추출물 고기 추출물	12.00± 0.17 11.34± 0.14 11.51± 0.12 11.73± 0.06 5.69± 0.13 11.69± 0.14	1.05± 0.03 0.68± 0.02 0.43± 0.05 0.71± 0.11 0.98± 0.04 0.55± 0.06

실험예 1. 항보체 활성 측정

항보체 활성은 Mayer 법 (Kabat and Mayer, 1961)으로 측정하였다. 균체 내.외 고분자물질의 수용액 (100, 500, 1000 ㎍/mL) 50㎕씩을 NHS (normal human serum), GVB⁺⁺ (gelatine veronal buffered saline, pH 7.2)와 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시킨후 반응액에 GVB⁺⁺를 350㎕씩 첨가하고, 이를 10배에서 160배까지 연속 희석하여 750㎕의 GVB⁺⁺와 양의 감작혈구 (1.0×10⁸ cell/mL)을 250㎕씩 첨가하여 1시간 동안 반응시킨 다음 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)를 2.5mL씩 가하여 원심분리 후 상등액의 흡광도를 412nm에서 측정하였다. 한편 대조구는 동일 조건에서 시료를 함유하지 않은 채 측정하며 항보체 활성은 대조구 대비 총보체 용혈 (50% of total complement hemolysis, TCH₅₀)의 저지율 (inhibition of TCH₅₀ 또는 ITCH₅₀)로 나타내었다. 시표의 정확한 활성을 검정하기 위해 역가를 알고 있는 LPS(lipopolysaccharide)를 표준물로 하였다

상기 실험 수행의 결과, 도 2에서 나타낸 바와 같이 동충하초 균체내 다당체와 균체외 다당체를 100, 500, 1000 ㎍/mL의 농도에서 비교하였을 때 항보체 활성은 농도 증가에 비례하여 증가 하였다. 1000 ㎍/mL의 농도에서 균체내 다당체와 균체외 다당체는 각각 65.95%와 63.39%로 가장 높은 보체가를 나타내었다.

실험예 2. 대식세포 리소좀 효소 활성 측정

대식세포는 전염성 미생물을 섭취할 경우 리소좀 효소로 인해 소화에 의한 숙주 방어 시스템에서 중요한 역할을 한다. 복막의 대식세포의 산성 인삼염 활성에 대한 균체내 다당체와 균체외 다당체의 영향을 조사하였다.

2-1. 실험동물의 준비

25g 내외의 무게를 가진 6주령의 수컷 C57BL/6 및 BALB/c 마우스를 대한 바이오링크사 (Daehan Biolink Co., LTD)로부터 구입하여 5 그룹으로 나누었다. 상기 마우스들은 12시간 주기의 명암하에서, 55± 5%의 습도, 22± 2℃의 온도를 가진 방에서 상업용 사육용 사료 (Sam Yang Co., Korea)로 실험기간동안 사육되었다.

2-2. 마우스 대식세포의 준비

대식세포(Macrophages)는 10% 티오글리콜레이트 미디움 3㎖를 복막투여한 후 3일 후에 마우스로부터 채집하였다. 세포농도는 10% 소태아혈청이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified engle medium) 버퍼에 1× 10⁶ cells/mL정도이다. 그 후 200㎕의 세포현탁액(2× 10⁵ cells/mL)은 96 웰 플레이트상에서 배양하였다. 부착된 대식세포는 이산화탄소의 존재하에서 2시간동안 배양함으로서 분리하고 비부착된 대식세포를 제거하기 위해 교반 및 세척을 수행하였다. NO(nitric oxide)의 생성 및 리소좀 효소의 활성을 측정하기 위해서 배양을 생체고분자의 첨가 또는 비첨가, IFN-γ (20 U/mL) 또는 LPS의 존재 또는 부재된 상태에서 습기찬 인큐베이터에서 24시간동안 5% 이산화탄소의 존재하에서 배양하였다.

2-3. 대식세포의 세포 리소좀 효소의 활성측정

리소좀 효소의 활성은 조직 컬쳐 플레이트가 깔린 96 웰 플랫을 사용하여 분석하였다. 마이크로플레이트의 대식세포 단층(2× 10⁵ cells/mL)은 0.1% 트리톤(Triton) X-100 25μL를 첨가하여 용액화 시켰다. 10mM p-니트로페닐 포스페이트 용액 150μL 산 포스파타아제(acid phosphatase)를 위한 기질로서 첨가하였다. 그 후 상기 웰에 구연산염 버퍼 50μL를 첨가하였다. 37℃에서 1시간동안 배양한 후, 0.2M 붕산염 버퍼(pH 9.8) 25μL를 그 반응 혼합물에 첨가하고 405nm에서의 흡광도를 측정하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 본 발명 동충하초의 균체내 다당체와 균체외 다당체를 10, 100, 500, 1000 ㎍/mL의 농도로 대식세포에 투 여한 후, 상대적인 효소 활성은 음성 대조군 (생리식염수)에 비해 균체외 다당체는 1000 ㎍/mL의 농도에서 158%로 가장 높았으며, 균체내 다당체는 500 ㎍/mL의 농도에서 153%로 가장 높았다.

도 6에 있어서 NC는 생리식염수로서 음성 대조군을, LPS는 리포폴리사카라이드로서 양성 대조군을 나타낸다.

이상, 상기 실시예 및 실험예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명 동충하초 (Cordyceps militaris)의 균사체 액체 배양물에서 얻은 면역 촉진 활성 효과를 갖는 균체내 다당체 (endo-polymer)와 균체외 다당체 (exo-polymer)에 관한 것으로 서, 상세하게는 본 발명의 균체내 다당체와 균체외 다당체는 pH 6, 25℃, 150 rpm의 조건하에서 탄소원으로 슈크로우스 20g/L와 질소원으로 효모 추출물 4g/L을 사용하여 배양한 동충하초 균사체 액체배양물에서 회수한 균체내 다당체와 균체외 다당체는 항보체 활성과 대식세포 리소좀 효소 활성을 최대로 증가시키는 효과를 가지고 있다. 따라서 본 발명 방법에 의해 생산된 균체내 다당체와 균체외 다당체는 면역활성 증강용 약학적 조성물 또는 건강기능성 식품조성물로서 보건식품 및 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

동충하초 (Cordyceps militaris)를 감자/덱스트로스 아가 배지 (pH 6)에 접종하고 25℃에서 3일간 배양하는 단계와;

상기 배양균을 포테이토/덱스트로우스 브로스 배지 (pH 6) 100mL에 접종하고 25℃의 회전 진탕배양기(150rpm)에서 종균 배양하는 단계와;

상기 배양 2일 후, 상기 배양물을 무균 상태에서 분쇄하고나서 상기 분쇄물을 미리 조제한 버섯완전 배양배지 (슈크로우스 20 g/L, MgSO₄ · 7H₂O 0.5 g/L, K₂HPO₄ 1 g/L, KH₂PO₄ 0.46 g/L, 효모 추출물 4 g/L 멸균하기 전에 pH는 6로 조정함)에 2%(v/v)로 접종하는 단계와;

상기 배양 배지에 상기 분쇄물을 포함하여 25℃, 150 rpm 조건의 회전 진탕배양기에서 6일 동안 액체배양하는 단계와;

상기 균사체 액체배양물을 10,000 xg로 20분간 원심분리하여 균사체와 상등액으로 분리하여 얻은 균사체를 세척한 후 3번 열수 추출하여 상등액을 에탄올을 침전시켜 원심분리하고 그 침전물을 다시 4℃에서 24시간 후 원심분리하여 얻은 상등액을 물로 희석 후 3일간 투석한 다음 동결건조하여 균체내 다당체를 얻는 단계와;

상기 원심분리하여 얻은 상등액을 에탄올로 침전시켜 원심분리하고 그 침전물을 4℃에서 24시간 후 다시 원심분리하여 얻은 상등을 물로 희석 후 3일간 투석한 다음 동결건조하여 균체외 다당체를 얻는 단계;

로 이루어진 것을 특징으로하는 동충하초 균사체 액체배양물로부터 수득되는 균체내 다당체와 균체외 다당체의 생산방법.
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