KR100340663B1 - 이노노투스 오브리쿠우스의 인공배양물로부터 분리된 항암면역활성 다당류의 제조방법 및 그 용도 - Google Patents
이노노투스 오브리쿠우스의 인공배양물로부터 분리된 항암면역활성 다당류의 제조방법 및 그 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 이노노투스 오브리쿠우스(Inonotus obliquus)로부터 분리된 항암 면역활성 물질의 제조 방법 및 그 용도에 관한 것으로, 특히 이노노투스 오브리쿠우스의 균사체와 자실체를 인공배양하고 이 배양물로부터 열수추출, 에탄올추출 등의 과정을 거쳐 분리된 버섯유래 항암 면역활성 다당류의 제조방법 및 이를 활성성분으로 포함하는 기능성 식품 및 의약 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 이노노투스 오브리쿠우스(Inonotus obliquus)로부터 분리된 항암 면역활성 물질의 제조 방법 및 그 용도에 관한 것으로, 특히 이노노투스 오브리쿠우스의 균사체와 자실체를 인공배양하고 이 배양물로부터 열수추출, 에탄올추출 등의 과정을 거쳐 분리된 버섯유래 항암 면역활성 다당류의 제조방법 및 이를 활성성분으로 포함하는 기능성 식품 및 의약 용도에 관한 것이다.
현대인들은 각종 공해물질 및 발암물질에 노출되어 있으며, 매년 암 발생률은 증가하고 있다. 발암에는 유전적인 요인도 있지만 체내의 면역기능이 저하되어 암이 발생하면 그 치료가 매우 어려울 뿐만 아니라 생존율도 낮기 때문에 예방이 최선이라고 할 수 있다.
현재 암을 예방하기 위한 시도의 일환으로 각종 식용 및 약용버섯들이 이용되고 있다. 버섯류는 각종 생리기능, 예를 들면 항암작용, 면역증강작용, 혈압 및 혈당저하작용, 항산화 효과 등을 갖는 것으로 알려져 있고, 그 이용형태는 버섯자실체를 그대로 섭취하거나, 또는 자실체 및 균사체 추출물로서 이용되고 있다.
본 발명은 국내에서는 생소한 이노노투스 오브리쿠우스 버섯을 대상으로 한 것으로, 이 버섯의 인공배양 및 이로부터 생체내에서 항암 면역활성 효과를 갖는 물질을 제조하는 방법, 그리고 이 활성물질의 용도에 관한 것이다.
이노노투스 오브리쿠우스(Inonotus obliquus(Pers)pilot)는 소나무비늘버섯과 (Hymenochaetaceae) 시루뻔버섯속(Inonotus)에 속하는 다년생의 담자균 버섯으로, 자연상태에서 시베리아, 홋카이도 등의 북위 45도 이상의 북반구에 분포하며, 일반적으로 자작나무, 오리나무, 마가목 등의 줄기나 그루터기에 자생하는 버섯이다. 격막을 가지고 있으며 핵이동을 위한 꺽쇠연결체(Clamp connection)를 가지고 있지 않은 백색부후균의 일종으로, 자연상태에서 성장하면 검은색의 균핵덩어리가 되어 자작나무 등의 줄기를 가해하게 된다. 버섯균의 조직은 KOH 반응과 잔토크로닉 (Xantochronic) 반응을 보이는 특성을 가지고 있다.
이노노투스 오브리쿠우스 버섯은 아직 국내에서는 미기록 종인데, 이와 동일한 속에 속하는 9종의 버섯이 현재 보고되어 있다. 동일한 속의 너도밤나무 시루뻔버섯(I. Dryadeus(Pers.:Fr.)Murr)의 경우는 갓 표면에서 박테리아에 항균활성을 보이는 물질을 다량 분비하는 것으로 알려져 있다. 우리나라에서는 동의보감(1613)에 혹시루뻔버섯(I. Nodulosus(Fr.)Pilat.)이 뇌환(雷丸)이라 하여 기록되어 있고, 수 세기에 걸쳐 약용되어 오면서 그 효과와 안전성이 이미 입증된 바 있다.
이노노투스 오브리쿠우스는 러시아에서는 예로부터 차, 음료로 음용되어 왔으며, 현재는 위장과 관련된 모든 암치료에 사용되고 있고, 일본에서는 에이즈와 O-157 및 간암의 치료제로 이용되고 있다.
이 버섯은 챠가 또는 차가(Chaga), 카바노아나타케, 봇나무혹버섯, 백화나무버섯, 검은자작나무버섯, 푸스코스포리아 오블리쿠아(Fuscosporia obliqua)라고도 알려져 있으며, 강력한 제암작용과 강한 면역활성작용이 있는 것으로 보고되어 있다 (일본생약학회 제41회 연회연구발표). 또한 세포와 바이러스 양쪽 모두에 작용함으로써 항에이즈 활성을 보이는 것으로 알려져 있다 (제7회 일본에이즈학회).
이노노투스 오브리쿠우스 버섯의 다당체에 함유되어 있는 베타글루칸, 헤테로글루칸에는 강한 항산화효과와 세포활성효과가 있는 것으로 인정되고 있다 (제암성다당류에 관한연구, 일본생약학회 제27보). 이 버섯의 균핵과 균사체로부터 추출한 다당류의 수용성 및 수불용성 다당체는 항종양활성 및 혈당강하작용이 있는 것으로 조사되었다.
그러나 이노노투스 오브리쿠우스 버섯은 국내에서는 아직 보고되지 않은 종으로 입수하기가 어렵고, 또한 세계적으로도 자연계에 널리 분포하지 않는 희귀종으로 그 생산량이 극히 제한되어 있으므로 자연상태의 자실체는 입수가 어려우며, 고가로 거래되고, 균사체의 분리 및 순수배양도 용이하지 않아 이용이 활발하지 못한 실정이다.
이에 본 발명자들은 러시아에서 수집된 자연상태의 이노노투스 오브리쿠우스(Inonotus obliquus)로부터 항암 면역활성과 미생물학적 특성이 우수한 균주를 분리동정하여 인공배양에 성공하였으며, 나아가 이 인공배양물로부터 자연산 이노노투스 오브리쿠우스와 거의 동등한 우수한 항암 면역활성물질을 분리하는데 성공하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이노노투스 오브리쿠우스와 관련된 기존의 특허로는 이 버섯의 자연산 추출물이, 면역증강 및 강장효과를 가지는 천연물 복합체의 첨가물로서 이용된 경우가 있으며(러시아연방, RU2125460C1), 식물재료와 함께 보드카 제조의 향료 첨가물의 일종으로 이용된 경우가 있다(러시아연방 RU2141517C1). 또한 구취 및 항염증효과를 갖는 치약성분의 일종으로 이용된 경우가 있다(러시아연방 RU2131725C1).
기존의 연구보고에 따르면, 자연상태의 버섯을 증류수로 추출한 추출액이 인 비트로(in vitro) 상에서 사람의 자궁암세포의 증식을 저해한다는 보고가 있으며(Rzymowska, 1997), 또한 자연산 버섯의 추출물이 인 비트로(in vitro) 상에서 위궤양 등에 효과가 있다고 보고된 바 있다(Pashinsky 외, 1998).
본 발명의 목적의 하나는, 이노노투스 오브리쿠우스를 인공적으로 배양하여 이용하는 것이다.
이를 위해 본 발명에서는, 러시아에서 수집된 자연상태의 이노노투스 오브리쿠우스(Inonotus obliquus)로부터 항암 면역활성과 미생물학적 특성이 우수한 균주를 분리 동정하였다. 본 발명에 사용된 이노노투스 오브리쿠우스(Inonotus obliquus) 균주는, 생명공학연구소 유전자원센터에 2000년 11월 28일자로 기탁된 기탁번호 KCTC 0894BP 의 균주이다.
본 발명의 다른 목적은 이노노투스 오브리쿠우스 균주로부터 항암 면역활성 작용을 가진 버섯유래 다당류를 분리 정제하는 것이다.
이노노투스 오브리쿠우스 버섯 추출물의 생체내 항암 면역활성 작용은 잘 알려져 있으며 이들 버섯의 생리활성 성분은 다당류의 글루칸으로 알려져 있다. 그러나, 정제된 순수한 글루칸은 경구투여에서는 흡수되지 않고 주사를 통해서만 그 효과를 나타내므로, 경구투여의 경우 정제된 글루칸은 사용되지 않고 글루칸에 펩티드가 결합된 당단백의 상태로 사용되게 된다.
따라서, 본 발명에서는 경구투여로도 항암 면역활성효과를 나타낼 수 있도록 이노노투스 오브리쿠우스로부터 크루드(crude)한 형태의 복합다당을 추출한다. 추출방법은 인공 배양된 이노노투스 오브리쿠우스 버섯을 물과 에탄올로 각각 추출한후 수득된 다당류를 혼합하여 이노노투스 오브리쿠우스의 세포내 다당, 세포외 다당 및 항암활성을 갖는 단백다당을 포함하는 복합다당(complex polysaccharides)을 얻는다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기와 같은 방법으로 추출된 이노노투스 오브리쿠우스의 복합다당체를 활성 성분으로 포함하는 기능성 식품과 의약 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명에서는 인공배양으로부터 얻어진 버섯의 자실체와 자연에서 채취한 자실체로부터 추출한 다당체의 항암 면역활성을 비교하고, 액체배양에 의하여 생산된 균사체가 균사체 내외로 생산하는 다당체, 곡물배지와 원목에서 고체배양된 버섯생산물의 항암 면역활성을 비교한다. 이러한 비교실험을 통하여 본 발명에서는 이노노투스 오브리쿠우스 버섯의 산업적인 제형화를 위한 기초 생물활성 자료를 제공한다.
본 발명에서 버섯생산물이라 함은 버섯의 몸을 이루거나 버섯균주가 생산해 내는 균사체와 자실체, 액체 배양의 경우에는 균사체 내의 다당류와 균사체 밖으로 분비되는 다당류를 포함한다.
또한, 본 발명에서 다당류라 함은, 이노노투스 오브리쿠우스의 버섯생산물로부터 추출한 알코올 비가용성인 다당체 및 수용성 다당체, 세포내 다당, 세포외 다당 및 당 이외의 성분을 포함하는 복합다당(complex polysaccharide), 예를 들어 항암활성을 갖는 단백다당 등을 모두 포함하는 개념으로 사용된다.
도 1은 이노노투스 오브리쿠우스를 액체배양하여 항암 면역활성 다당류를 추출하는 과정을 나타낸 블록도이다.
도 2는 이노노투스 오브리쿠우스를 원목배양하여 인공자실체로부터 항암 면역활성 다당류를 추출하는 과정을 나타낸 블록도이다.
본 발명에서는 러시아에서 수집된 자연상태의 이노노투스 오브리쿠우스 (Inonotus obliquus)로부터 항암 면역활성과 미생물학적 특성이 우수한 균주를 분리 동정하여 인공배양 등에 이용하였다. 본 발명에 사용된 이노노투스 오브리쿠우스(Inonotus obliquus) 균주는, 생명공학연구소 유전자원센터에 2000년 11월 28일자로, 기탁번호 KCTC 0894BP 로 기탁되었다.
이노노투스 오브리쿠우스(
Inonotus obliquus
) 버섯균주의 인공배양
본 발명에서 이노노투스 오브리쿠우스(Inonotus obliquus)의 인공배양은 액체배양법과 고체배양법을 모두 사용할 수 있으며, 고체배양법으로는 원목배양법을 사용한다.
1) 액체배양
이노노투스 오브리쿠우스 버섯균주를 포도당 2%∼10%, 펩톤 0.1∼2%, 효모추출액 0.1∼2%를 필수성분으로 포함하는 액체배지에서 3∼30일간 배양하여 균사체를 얻는다.
배지에는 상기 필수성분 외에 인산제2칼륨, 황산마그네슘, 염화칼슘 등의 무기물과, 황산철, 황산아연, 황산구리 등의 미량원소를 첨가하여 균사체의 발육을 돕도록 할 수 있다. 배지의 pH와 온도는 이노노투스 오브리쿠우스의 생육에 적절한 약 pH 5∼7, 20℃∼30℃ 정도로 조절하며, 5∼20 시간 정도 배양하여 대량의 균사체가 생산될 수 있도록 한다. 본 발명에서는 이와 같은 방법으로 액체배지에서 이노노투스 오브리쿠우스 KTCT0894BP 버섯균주를 인공배양하여 전체 중량 20∼40g/L 의 대량의 균사체를 얻었다.
2) 원목배양
이노노투스 오브리쿠우스 균주를 원목에서 배양하여 기능성 식품 및 의학적 용도로 사용될 인공자실체를 얻는다. 원목배양을 위한 종균제조를 위하여 원목 톱밥에 미강을 첨가한 배지에, 맥아추출물배지에서 배양된 이노노투스 오브리쿠우스 균사를 떼어내 접종하고 20∼30 일간 25∼30℃ 암조건하에 배양한다.
원목으로는, 이노노투스 오브리쿠우스의 특성에 따라 참나무, 자작나무, 오리나무, 참나무 등의 활엽수 원목이 사용될 수 있다. 주로, 11월에서 2월 사이에 벌채된 원목을 음지에서 자연건조하여 직경 10∼15㎝, 길이 20∼25㎝로 토막내어 사용한다. 절단된 원목을 폴리프로필렌 봉지에 넣어 면전한 다음 121℃에서 15시간 멸균한 후 상온으로 냉각하여 상기 배양된 종균을 원목의 상층부에 70∼150g 정도를 고루 펼쳐서 접종한다. 균사체 배양은 적정온도인 25∼30℃에서 30∼40일 동안 백색의 버섯균사가 원목의 전체에 활착하고 원목 표면의 균사체의 색깔이 검은 색으로 변하기 시작할 때까지 배양실에서 시행한다.
버섯의 자실체를 유도하기 위하여, 상기 배양된 원목을 폴리프로필렌 봉지를 벗기고 배수가 잘되는 토질의 영지버섯 재배사의 토양에 원목의 상층부가 지상부로 5∼8㎝ 정도 돌출되도록 매몰하고, 접종원으로 사용된 균사체를 제거한 다음 모래를 얇게 깔아주고 관수한다. 10∼30℃ 하에서 20∼50일 후 원목의 표면에 버섯의 원기가 형성되기 시작하면 환기를 충분히 시켜주고 자실체의 형성을 유도한다.
본 발명에서는 이와 같은 이노노투스 오브리쿠우스 KTCT0894BP 버섯균주의 원목배양에서 검은색의 붙임성 균괴가 원주 형태로 발전하여 12개월 후 원목 1Kg 당 약 25∼40g의 자실체를 얻었다.
항암 면역활성물질의 추출
1) 액체배양으로 얻은 균사체로부터 항암 면역활성물질을 추출하는 공정
액체배양으로 얻은 이노노투스 오브리쿠우스의 균사체로부터 항암 면역활성물질을 추출하는 공정은, (a) 이노노투스 오브리쿠우스의 균사체를 배양여액과 혼합하여 균질화한 후 실온 내지 100℃의 증류수로 3∼24 시간 동안 열수추출한 후 원심분리하여 비침전물인 열수추출액을 얻는 단계; (b) 상기 열수추출액 중 일부를 진공농축한 후, 최종농도 40∼90%가 되도록 에탄올을 가하여 침전물을 얻는 단계; (c) 상기 침전물을 투석한 후 동결건조하여 다당류를 얻는 단계; (d) 상기 단계 (a)에서 얻은 열수추출액 중 나머지 잔부를 농축한 후 투석하고 이를 분무건조하여 다당류를 얻는 단계; 를 포함하여 이루어지며, 최종산물은 단계(c) 및 (d)에서 얻은 다당류를 포함한다. 그러나, 단계(c)에서 얻은 다당류만을 별도로 사용할 수도 있다.
이하, 도 1을 참조하여 본 공정의 각 단계를 보다 구체적으로 설명한다.
열수추출액을 얻는 단계 (a)는, 균사체를 배양여액과 혼합하여 균질화 한 후 실온 내지 100℃, 바람직하게는 95℃에서 3시간 내지 24시간, 바람직하게는 6시간 동안 열수추출한 후 원심분리하여 침전물인 균사체를 제거하고 비침전물인 열수추출액을 얻는다.
얻어진 열수추출액 중 일부를 취하여 진공농축한 후, 최종농도 40∼90%가 되도록 에탄올을 가한다. 다당류에 에탄올을 가하면 결정이 석출되는데, 이를 이용하여 각각의 알코올 농도에 비가용성인 다당류를 추출해 낼 수 있다. 에탄올을 가한 뒤, 3℃ 내지 20℃, 바람직하게는 4℃에서 12시간 내지 48시간, 바람직하게는 24시간 동안 방치하여 다당류를 석출시킨다. 결정이 석출되면 원심분리하여 침전물을 얻고, 침전물을 다시 30∼100℃로 가열된 100㎖의 물에 녹인 후, 투석막으로 투석하여 분자량 3,000 이상의 다당류를 분리한다. 분리한 다당류는 -70℃ 정도에서 동결건조하여 세포내 다당과 세포외 다당, 항암활성을 갖는 단백다당을 포함하는 복합다당(complex polysaccharide)을 얻는다.
또한, 별도로 상기 단계 (a)에서 얻은 열수추출액을 농축하여 투석한 후, 분무건조하여 다당류를 얻는다. 여기서 얻어지는 다당류는 수용성 다당류로 세포내외 다당체가 포함된다.
본 공정은 액체배양한 이노노투스 오브리쿠우스 균사체 뿐만 아니라 자연산 이노노투스 오브리쿠우스의 균사체에도 적용될 수 있다.
본 공정을 통해 이노노투스 오브리쿠우스 균사체로부터 알코올 비가용성인 다당체 및 수용성 다당체, 즉 세포내 다당, 세포외 다당 및 항암활성을 갖는 단백다당 등의 복합다당(complex polysaccharide)을 포함한 이노노투스 오브리쿠우스 균사체의 모든 다당류를 얻을 수 있다.
2) 원목배양으로 얻은 인공자실체로부터 항암 면역활성물질을 추출하는 공정
원목배양으로 얻은 이노노투스 오브리쿠우스의 인공자실체로부터 항암 면역활성물질을 추출하는 공정은, (a) 이노노투스 오브리쿠우스의 인공자실체를 실온에서 중량의 변화가 없을 때까지 건조시킨 후 분쇄하여 분말을 얻고 이 분말을 5∼20배 부피의 증류수에 현탁하여 현탁액을 얻는 단계; (b) 상기 현탁액을 실온 내지 100℃의 증류수로 3∼24 시간 동안 열수추출한 후 원심분리하는 단계; (c) 단계(b)로부터 상등액인 열수추출액을 취하여 진공농축한 후 최종농도 40∼90%가 되도록 에탄올을 가하여 침전물을 얻는 단계; (d) 상기 침전물을 투석한 후 동결건조하여 다당류를 얻는 단계; (e) 별도로 상기 단계(b)로부터 자실체인 침전물을 분리하고, 이 자실체에 5∼20 부피의 증류수를 가하여 현탁액을 만들고, 이 현탁액을 실온 내지 100℃의 증류수로 3∼24 시간 동안 열수추출한 후 원심분리하여 상등액인 열수추출액을 얻고, 이를 균질화한 다음 농축하여 투석하고, 동결건조하거나 또는 분무건조하여 다당류를 얻는 단계; 포함하여 이루어지며, 최종산물은 단계 (d) 및 (e)에서 얻은 다당류를 포함한다. 그러나, 단계(d)에서 얻은 다당류만을 별도로 사용할 수도 있다.
본 공정은 이노노투스 오브리쿠우스의 자연산 균사체에도 그대로 적용되어 동일한 방법으로 항암 면역활성물질인 복합다당체를 얻을 수 있다.
이하, 도 2를 참조하여 본 공정의 각 단계를 구체적으로 설명한다.
원목배양을 통해 얻은 이노노투스 오브리쿠우스의 자실체 또는 자연상태에서 채집된 이노노투스 오브리쿠우스의 자실체를 실온에서 중량의 변화가 없을 때까지 건조시킨 후, 햄머밀 등으로 분쇄하여 분말을 만든다. 각 분말을 5∼20배 부피의 증류수에 현탁하여 실온 내지 100℃, 바람직하게는 95℃에서 3시간 내지 24시간, 바람직하게는 6시간 동안 열수로 추출하고 균질화한 후, 원심분리하여 침전물인 버섯균사체는 제거하고 비침전물인 열수추출액을 얻는다. 이를 진공농축한 후, 최종농도 40∼90%가 되도록 에탄올을 가하고 3℃ 내지 20℃, 바람직하게는 4℃에서 12시간 내지 48시간, 바람직하게는 24시간 동안 방치하여 다당류를 석출시킨다. 결정이 석출되면 원심분리하여 침전물을 얻고, 이 침전물을 물에 녹여서 분자량 투석을 한 후 동결건조, 바람직하게는 -70℃ 정도에서 동결건조하여 다당류를 얻는다.
또한, 별도로 상기 단계(b)에서 원심분리한 후, 자실체인 침전물을 분리하고, 이 자실체에 5∼20 부피의 증류수를 가하여 현탁액을 만들고, 이 현탁액을 실온 내지 100℃의 증류수로 3∼24 시간 동안 열수추출한 후 원심분리하여 상등액인 열수추출액을 얻고, 균질화한 다음 농축하여 투석하고, 동결건조하거나 또는 분무건조하여 다당류 및 기타 버섯추출물을 포함하는 열수추출물을 얻는다.
본 공정을 통해 이노노투스 오브리쿠우스 버섯균주의 자실체로부터 알코올 비가용성인 다당체 및 수용성 다당체를 포함하는 모든 다당류를 얻을 수 있다.
용도
상기와 같이 물과 에탄올을 이용하여 추출된 본 발명의 이노노투스 오브리쿠우스 버섯 추출물, 즉 항암 면역활성 다당류는 수득된 형태 그대로 항암, 면역증강 등의 의약용도 및 기능성 식품, 건강보조식품 등의 용도로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 활성 다당류를 유효성분으로 하여 항암제 및 면역증강제를 제조할 경우, 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체나 부형제를 첨가하여 통상의 약제학적 방법으로 제제화할 수 있다. 제제화는, 예를 들어 산제, 정제, 캅셀제, 과립제, 액제, 환제, 분산제, 시럽제 등의 경구투여제와; 에어로졸제, 연고 등의 외용제; 주사제 등의 제형으로 할 수 있다.
또한, 같은 방법으로 건강보조식품의 용도로, 산제, 정제, 캅셀제, 과립제, 액제, 환제, 분산제, 시럽제 등의 형태로 제제화할 수 있다.
본 발명에서 수득된 이노노투스 오브리쿠우스의 활성 다당류를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 활성물질, 즉 이노노투스 오브리쿠우스로부터 추출된 다당류는 광범위한 투여범위에 대해 유효하다. 예를 들어, 활성물질의 성인 1일 투여량은 통상적으로 200㎎∼5,000㎎의 범위, 바람직하게는 1,000㎎∼3,000㎎을 수회로 나누어 복용하는 것이 좋다. 그러나, 실제적으로 투여되는 활성물질의 양은 사용목적에 따라 달라질 수 있으므로 상기 투여범위에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 활성 다당류를 유효성분으로 포함하는 항암제는 암의 치료 및 증식억제에 사용 가능하며, 면역증강제는 에이즈 등의 면역결핍 질환에 치료 및 증상악화억제 목적으로 사용 가능하다.
또한 본 발명의 방법으로 수득된 다당류를 여러 식품에 포함시켜 암예방, 면역증강 등의 효과를 가진 다양한 형태의 기능성 식품으로 가공할 수 있다. 이렇게 기능성 식품이나 기호식품의 첨가물로 이용될 경우, 본 발명에 따른 복합다당체는, 효과면에서 바람직하게는 식품 전체 중량의 0.1% 내지 40%로 첨가될 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.05% 내지 20%로 첨가될 수 있다. 그러나, 식품에 따라 또는 사용목적에 따라 0.1% 이하의 극히 소량이 첨가될 수도 있다.
본 발명의 방법으로 수득된 다당류를 상기와 같은 방법으로 의약 또는 기능성 식품으로 제제화할 때는, 유효활성성분에 영향을 주지 않는 범위에서, 감미제, 착색제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등의 보조제가 첨가될 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서 수득된 이노노투스 오브리쿠우스의 추출물을 다류로 제조하기 위해서는, 기존의 커피, 홍차, 녹차, 보리차, 결명자차, 둥글레차 등에 수득된 다당류 추출물을 첨가하여 사용할 수 있으며, 이때 향미제 등 식품에 사용되는 통상의 첨가제를 부가할 수 있다. 또한, 본 발명의 항암 면역활성물질을 건강 드링크제, 플레버 음료, 탄산음료, 주스 등의 무주정 음료나, 사탕, 껌, 쵸콜렛, 아이스크림, 요구르트 등에 첨가하면 통상적인 기호식품의 섭취로도 자연스럽게 암발생 등을 예방할 수 있으며, 소주, 청주 등 각종 주류에 첨가할 경우에는 버섯 특유의 맛과 향을 살리면서 항암, 면역증진 등의 효과를 가진 기능성 주정음료를 만들 수 있다.
또한, 본 발명에서 추출된 활성 다당류는, 기존에 알려진 이노노투스 오브리쿠우스의 용도인 구취예방, 항염증 등의 용도로도 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
이노노투스 오브리쿠우스 KTCT0894BP 버섯균주의 인공 액체배양
이노노투스 오브리쿠우스 균주의 액체배양을 위하여 배지 1 리터당 포도당 50g, 펩톤 10g, 효모추출물 10g, 인산 제2칼륨 0.5g, 황산마그네슘 0.5g, 염화칼슘 0.4g을 넣은 배지를 사용하였다. 또한 대량생산배지로는 배지 1 리터당 가용성 전분 20g, 포도당 40g, 효모추출물 10g, 대두분 5g, 인산 제2칼륨 0.5g, 황산마그네슘 0.5g, 염화칼슘 0.4g 및 미량원소로서 황산철, 황산아연, 황산구리 등을 넣은 배지를 사용하였다. 모든 배지는 멸균 후 pH를 6으로 조절하여 사용하였다.
상기의 종균배지 50㎖가 담긴 250㎖ 용량의 진탕배양용 삼각플라스크를 121℃에서 20분간 멸균한 후 맥아추출물배지 상의 이노노투스 오브리쿠우스KTCT0894BP 균사를 떼어내 접종하고 28℃에서 3일간 진탕배양하여 1차 종배양액으로 하였다. 배양된 1차 종배양액을 5,000rpm 에서 30초간 균질화한 후 상기와 동일한 조건에서 멸균된 종배지 2 리터가 들어있는 배양조(Jar fermenter)에 접종하여 28℃에서 배양하여 2차 종배양액으로 하였다.
이어서 300L의 생산배지가 들어있는 500L 용량의 발효조를 상기와 동일한 조건으로 멸균 시킨 후 2차 종배양액을 접종하여 5일간 배양하여 3차 종배양액으로 하였다. 배양된 3차 종배양액을 3,000 리터의 생산배지가 들어있는 상기 동일한 조건으로 멸균한 3,000 리터 용량의 발효조에 접종하여 5일간 배양하여 대량으로 균사체를 생산할 수 있었으며, 전체중량 28g/L 의 균사체를 얻었다.
실시예 2
이노노투스 오브리쿠우스 KTCT0894BP 버섯균주의 자실체 배양
기능성 식품 및 의학적 용도로 사용될 이노노투스 오브리쿠우스 KTCT0894BP 균주의 자실체를 얻기 위한 종균제조를 위하여 참나무 톱밥에 미강을 첨가한 배지에 맥아추출물배지 에서 배양된 이노노투스 오브리쿠우스 KTCT0894BP 균사를 떼어내 접종하고 22 일간 28℃ 조건에서 암조건하에서 배양하였다.
11월에서 2월 사이에 벌채된 원목을 음지에서 자연건조하여 직경 10∼15㎝, 길이 20∼25㎝ 로 토막내어 사용하였다. 절단된 원목을 폴리프로필렌 봉지에 넣어 면전한 다음 121℃에서 15시간 멸균한 후 상온으로 냉각하여 상기 배양된 종균을 원목의 상층부에 100g 정도를 골고루 펼쳐 접종하였다. 균사체 배양은 최적온도인28℃에서 32일 동안 백색의 버섯균사가 원목의 전체에 활착하고 원목 표면의 균사체의 색깔이 검은 색으로 변하기 시작할 때까지 배양실에서 시행하였다.
버섯의 자실체 유도를 위하여 상기 배양된 원목을 폴리프로필렌 봉지를 벗기고 배수가 잘되는 토질의 영지버섯 재배사의 토양에 6㎝ 정도 원목의 상층부가 지상부로 돌출되도록 매몰하였고 접종원으로 사용된 균사체를 제거하고 모래를 얇게 깔아준 다음 관수하였다. 27일 후 원목의 표면에 버섯의 원기가 형성되기 시작하면 환기를 충분히 시켜주고 자실체의 형성을 유도한다. 붙임성 균괴가 원통 형태로 발전하여 12개월 후 원목 1Kg 당 32g의 자실체를 얻었다.
실시예 3
식용곡류를 이용한 이노노투스 오브리쿠우스 KTCT0894BP 버섯균주의 곡립배양
기능성 식품 용도로 사용될 이노노투스 오브리쿠우스 KTCT0894BP 균주의 버섯 생산물을 얻기 위한 방법으로 식용곡류를 이용한 인공배양을 실시하였다. 사용된 곡물의 종류로는 현미, 보리, 늘보리(농협), 율무를 그대로 사용하거나 볶은 후에 사용하였으며 배지는 단용하거나 두가지 이상의 종류를 섞어서 사용하였다. 대상곡물을 24시간 동안 냉수에 침지시켜 수분조절을 한 후 병당 600g 씩을 칭량하여 폴리프로필렌 배양병에 입봉한 후 40분간 멸균하였다. 멸균이 끝난 후 배지가 상온으로 되었을 때 실시예 1의 종배양액을 10% 접종하고 28℃, 암조건에서 20일 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양병을 제거하고 열풍건조한 후 햄머밀(이카사, 독일)로 마쇄하여 가루로 만들어 사용하였다.
실시예 4
항암 면역활성물질의 추출
1) 상기 실시예 1에서 얻은 균사체 100g을 적량의 배양여액과 혼합하여 1시간 동안 균질화한 후 95℃에서 6시간 동안 열수추출한 후 6000rpm 에서 30분간 원심분리하여 침전물인 균사체를 제거하고 비침전물인 열수 추출액을 얻었다. 이를 진공농축하여 100㎖로 만든 후 최종농도 60%가 되도록 에탄올을 가하고 4℃에서 24시간 동안 방치하였다. 이를 6,000rpm 에서 30분간 원심분리하여 침전물을 얻고, 침전물을 다시 70℃로 가열된 100㎖의 물에 녹여서 투석막으로 투석하여 분자량 3,000이상의 다당류를 분리한 후 -70℃에서 동결건조하여 세포내 다당과 세포외 다당, 그리고 당 이외의 성분을 가진 다당류 4.3g 을 얻었다. 또한 실시예 1에서 얻어진 균사체 100g을 상기와 같은 방법으로 배양여액과 혼합하고 균질화하여 열수추출한 후 원심분리하여 비침전물인 열수 추출액을 얻고, 이를 농축하고, 투석한 후 분무건조하여 3.5g의 추출물을 얻었다. 위에서 얻은 다당류 4.3g과 3.5g의 추출물을 합하여 총 7.8g의 복합다당 추출물(이하 "추출물 A"로 표기함)을 얻었다.
2) 자연산 이노노투스 오브리쿠우스 버섯의 자실체와 실시예 2에서 생산된 자실체를 실온에서 중량의 변화가 없을 때까지 건조시킨 후, 각각 햄머밀로 분쇄하여 분말로 하였다. 얻어진 각각의 분말 100g을 10배 부피의 증류수에 현탁하여 95℃에서 6시간 동안 열수추출하고 균질화한 후 6,000rpm에서 30분간 원심분리하여 침전물인 버섯균사체를 제거하고 비침전물인 열수 추출액을 얻었다. 이를 진공농축하여 100㎖로 만든 후 최종농도 60%가 되로록 에탄올을 가하고 4℃에서 24시간 동안 방치하였다. 이를 6,000rpm 에서 30분간 원심분리하여 침전물을 얻고, 침전물을 다시 70℃로 가열된 100㎖의 물에 녹여서 분자량 투석 한 후 -70℃에서 동결건조하여 다당류(polysaccharide)를 각각 3.2g(자연산), 3.7g(인공배양) 얻었다. 또한 원심분리를 통하여 얻어진 자실체에 10배 부피의 물을 가하여 70℃에서 열수로 추출하고 균질화한 후 원심분리하여 비침전물을 농축하고, 이를 투석한 후 분무건조하여 각각 4g(자연산), 3.2g(인공배양)의 열수추출물을 얻었다. 자연산 자실체의 경우 총 7.2g(이하 "추출물 B"로 표기함), 인공배양 자실체의 경우 총 6.9g(이하 "추출물 C"로 표기함)의 복합다당 추출물을 얻었다.
3) 상기 실시예 3에서 곡물배지에서 배양된 이노노투스 오브리쿠우스 버섯의 균사체로부터 항암 면역활성물질의 추출은 다음과 같은 방법으로 실시하였다. 배양된 균사체를 포함하는 건조·분쇄된 곡물 100g을 티백에 담은 후 95℃, 20배 부피의 온수에 6 분간 침지시켜 충분히 용출시키고, 용출된 것을 진공농축한 후 분무건조하여 다당류가 포함된 균사체 추출물 5g(이하 "추출물 D"로 표기함)을 얻었다.
실시예 5
급성독성 실험
실시예 4에서 얻어진 이노노투스 오브리쿠우스 KTCT0894BP 의 추출물 A,C,D를 각각 4주령된 ICR 마우스 10마리에 10,000㎎/㎏의 농도로 복강(5마리) 및 경구 (5마리)투여하고 15일간 관찰하였다. 관찰결과, 각각 10 마리 모두에서 아무런 이상이 발견되지 않았다.
실시예 6
종양 증식 저지율 조사 실험
실시예 4에서 얻어진 이노노투스 오브리쿠우스 KTCT0894BP 버섯 추출물을 이용해 다음과 같은 제암시험을 하였다. 5주령의 ICR 수컷 마우스 1군 6마리로 대조군과 처리군을 나누고, 사르코마 180의 복수형 종양 약 1 × 106개/마우스를 모든 마우스의 옆복부 피하에 이식하였다. 이식 다음날 부터는 대조군에는 생리식염수를 1일 1회 10일간 복강 투여하고, 처치군에는 각각 10, 30 및 100㎎/㎏의 비율로 실시예 4에서 얻어진 복합다당체 추출물을 생리식염수에 용해한 후 0.45㎍의 세균여과막으로 멸균하여 1일 1회 10일간 투여하였다. 5주 후, 고형암을 적출하여 처리군의 평균중량과 대조군의 평균중량을 비교하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.
| 투여량(㎎/㎏)시료 | 10 | 30 | 100 |
| 자연산 이노노투스 오브리쿠우스버섯 추출물(B) | 76% | 89% | 100% |
| 액체배양을 통한 이노노투스 오브리쿠우스 균사체 생산물 추출물(A) | 66% | 75% | 99% |
| 원목재배된 이노노투스 오브리쿠우스 자실체 추출물(C) | 72% | 88% | 100% |
| 현미배지에서 곡립배양된 이노노투스 오브리쿠우스 균사체 추출물(D) | 24% | 40% | 68% |
실시예 7
종양 증식 저지율 조사 실험
실시예 6과 동일한 시료를 사용하여 5주령 ICR 수컷 마우스에 사르코마 180 고형 종양을 동일하게 이식하고, 이식 다음날부터 시료를 각각 500㎎/Kg 씩, 1,000㎎/㎏ 씩, 1일 1회 경구투여하고, 5주 후에 고형종양을 적출하고, 평균 중량을 대조군과 비교하였다. 얻어진 결과를 표 2에 나타내었다.
| 투여량(㎎/㎏)시료 | 500 | 1000 |
| 자연산 이노노투스 오브리쿠우스버섯 추출물(B) | 85% | 100% |
| 액체배양을 통한 이노노투스 오브리쿠우스 균사체 생산물 추출물(A) | 75% | 97% |
| 원목재배된 이노노투스 오브리쿠우스 자실체 추출물(C) | 83% | 100% |
| 현미배지에서 곡립배양된 이노노투스 오브리쿠우스 균사체 추출물(D) | 42% | 63% |
실시예 8
면역 증강 작용 조사 실험
마우스 백혈병 세포 L-1210 을 0.013% 글루타르알데히드-인산 완충 용액으로 처리한 후, 그 세포를 다시 콘카나발린 A로 처리하여 GA-conA-L-1210 세포를 조제하였다. 이 세포를 마우스 BDF1수컷에 1 × 106개/마우스를 복강 내에 주사하였다.
제1회의 주사 후, 1주간 후에 2회째의 주사를 하였다. 그 다음날, 실시예 4에서 얻어진 이노노투스 오브리쿠우스 KTCT0894BP 의 복합다당체를 각 그룹의 마우스에 500㎎/㎏ 씩 경구투여 하였다. 약제투여 후, 6일째에 L-1210 의 생세포 1 ×102개/마우스를 모든 마우스의 복강 내에 이식하고, 면역부활 활성을 마우스의 생존 평균 일수에 의해 측정 하였다. 결과를 표 3에 나타내었다.
| 시료 | 평균 생존 일수 | 연명률 |
| 대 조 군 | 13일 | - |
| 자연산 이노노투스 오브리쿠우스버섯 추출물(B) | 19일 | 46.2% |
| 액체배양을 통한 이노노투스 오브리쿠우스 균사체 생산물 추출물(A) | 18일 | 38.5% |
| 원목재배된 이노노투스 오브리쿠우스 자실체 추출물(C) | 19일 | 46.2% |
| 현미배지에서 곡립배양된 이노노투스 오브리쿠우스 균사체 추출물(D) | 14일 | 7.7% |
실시예 9
면역 증강 작용 조사 실험
실시예 8과 동일하게 L-1210 의 백신을 BFD 수컷 마우스에 복강 내에 투여 하였다. 투여일은 2회로 하고, 1주간 걸쳐 투여하였다. 세포 수는 1 × 106개/마우스로 하였다. 그리고 실시예 4에서 얻어진 이노노투스 오브리쿠우스 KTCT0894BP 버섯 추출물을 조제하여 100㎎/Kg씩 각각 복강 내에 투여하였다. 약제 투여 후, 6일째에 L-1210의 생세포 1 × 102개/마우스를 모든 마우스의 복강내에 이식하였다. 이 때의 평균 생존 일수를 표 4에 나타내었다.
| 시료 | 평균 생존 일수 | 연명률 |
| 대 조 군 | 13일 | - |
| 자연산 이노노투스 오브리쿠우스버섯 추출물(B) | 16일 | 23.1% |
| 액체배양을 통한 이노노투스 오브리쿠우스 균사체 생산물 추출물(A) | 15.5일 | 19.2% |
| 원목재배된 이노노투스 오브리쿠우스 자실체 추출물(C) | 16일 | 23.1% |
| 현미배지에서 곡립배양된 이노노투스 오브리쿠우스 균사체 추출물(D) | 14일 | 7.7% |
본 발명에서는 이노노투스 오브리쿠우스를 인공배양하여 자연산 이노노투스 오브리쿠우스의 추출물과 거의 대등한 효과를 갖는 항암 면역활성 다당류를 얻는 방법을 제공한다. 본 발명에서 얻어진 다당류는 항암 면역활성을 갖는 유효성분으로 의약용도 및 건강보조식품의 용도로 사용될 수 있으며, 또한 용량을 조절하여 다양한 식품에 첨가되어 항암, 면역증강의 기능성 식품 용도로 사용될 수 있다.
Claims (10)
- 이노노투스 오브리쿠우스 버섯균주를 포도당 2%∼10%, 펩톤 0.1∼2%, 효모추출액 0.1∼2%를 필수성분으로 포함하는 액체배지에서 3∼30일간 배양하여 얻은 균사체를 이용하여, (a) 이 균사체를 배양여액과 혼합하여 균질화한 후 실온 내지 100℃의 증류수로 3∼24 시간 동안 열수추출한 후 원심분리하여 비침전물인 열수추출액을 얻는 단계; (b) 상기 열수추출액 중 일부를 진공농축한 후, 최종농도 40∼90%가 되도록 에탄올을 가하여 침전물을 얻는 단계; (c) 상기 침전물을 투석한 후 동결건조하여 다당류를 얻는 단계; 그리고 (d) 상기 단계(a)에서 얻은 열수추출액 중 나머지 잔부를 농축한 후 투석하고 이를 분무건조하여 다당류를 얻는 단계; 를 포함하는, 단계(c) 및 (d)에서 수득한 다당류로 이루어진 복합다당체의 제조방법.
- 원목 톱밥에 미강을 첨가한 배지에, 맥아추출물배지에서 배양된 이노노투스 오브리쿠우스 균사를 떼어내 접종·배양하여 얻은 종균을, 다시 원목에 접종하여 생산한 인공 자실체를 이용하여, (a) 이노노투스 오브리쿠우스의 인공자실체를 실온에서 중량의 변화가 없을 때까지 건조시킨 후 분쇄하여 분말을 얻고 이 분말을 5∼20배 부피의 증류수에 현탁하여 현탁액을 얻는 단계; (b) 상기 현탁액을 실온 내지 100℃의 증류수로 3∼24 시간 동안 열수추출한 후 원심분리하는 단계; (c) 단계(b)로부터 상등액인 열수추출액을 취하여 진공농축한 후 최종농도 40∼90%가 되도록 에탄올을 가하여 침전물을 얻는 단계; (d) 상기 침전물을 투석한 후 동결건조하여 다당류를 얻는 단계; 그리고 (e) 별도로 상기 단계(b)로부터 자실체인 침전물을 분리하고, 이 자실체에 5∼20배 부피의 증류수를 가하여 현탁액을 만들고, 이 현탁액을 실온 내지 100℃의 증류수로 3∼24 시간 동안 열수추출한 후 원심분리하여 상등액인 열수추출액을 얻고, 이를 균질화한 다음 농축하여 투석하고, 동결건조하거나 또는 분무건조하여 다당류를 얻는 단계; 를 포함하는, 단계(d) 및 (e)에서 수득한 다당류로 이루어진 복합다당체의 제조방법.
- 제 1 항의 방법으로 제조된 복합다당체 또는 제 1 항의 단계(c)에서 얻은 다당류를 유효성분으로 포함하는 항암제.
- 제 2 항의 방법으로 제조된 복합다당체 또는 제 2 항의 단계(d)에서 얻은 다당류를 유효성분으로 포함하는 항암제.
- 제 1 항의 방법으로 제조된 복합다당체 또는 제 1 항의 단계(c)에서 얻은 다당류를 유효성분으로 포함하는 면역증강제.
- 제 2 항의 방법으로 제조된 복합다당체 또는 제 2 항의 단계(d)에서 얻은 다당류를 유효성분으로 포함하는 면역증강제.
- 제 1 항 또는 제 2 항의 방법으로 제조된 복합다당체를 포함하는 건강보조 및 기능성 식품.
- 제 7 항에 있어서, 상기 식품은 다류, 요구르트, 건강음료, 껌, 과자, 빵, 초콜렛, 아이스크림 중 하나의 형태를 갖는 기능성 식품인 것을 특징으로 하는 식품.
- 제 7 항에 있어서, 상기 식품은 산제, 정제, 캅셀제, 과립제, 액제, 환제, 분산제, 시럽제 중 하나의 형태를 갖는 건강보조식품인 것을 특징으로 하는 식품.
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