CN104086665A - 一种高效提取深层液态发酵生产桦褐孔菌菌丝体多糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效提取深层液态发酵生产桦褐孔菌菌丝体多糖的方法，该方法是将桦褐孔菌发酵液分离的菌丝体通过超声波和复合酶解进行处理、分离得到桦褐孔菌多糖。本发明改变了传统的多糖“水提醇沉”的提取方式，提高了桦褐孔菌多糖的提取收率和产品品质，减少了生产中纯化水用量和能源消耗，增加了经济效益。

Description

一种高效提取深层液态发酵生产桦褐孔菌菌丝体多糖的方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体是一种高效提取深层液态发酵生产桦褐孔菌菌丝体多糖的方法。

背景技术

桦褐孔菌又名白桦茸，属担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属，是一种生于桦树上的寄生性大型药用真菌。其子实体呈现类似于碳的黑色块状形态，主要分布于北美北部、俄罗斯、芬兰、中国黑龙江、日本北海道等地区的珍稀药用菌类

桦褐孔菌主要寄生于白桦、榆树、银桦等其他桦木类的树皮下，子实体即菌核表面黑色深裂，菌管前段开裂，菌肉木栓质且具有环纹，孢子椭圆状或卵状，是一种生在在寒带的木腐菌。桦褐孔菌在俄罗斯等地被广泛应用,是一种俄罗斯民间常用药物,已有至少数百年的应用历史，因其在治疗肠胃疾病、缓解癌症症状、预防疾病等方面效果显著,在俄罗斯、中欧、我国东北等地区应用广泛，广受认可，被当地人称为“万能药”。

随着现代生物技术的发展,研究者发现桦褐孔菌的多糖可能是其主要药效成分,目前已经报道的桦褐孔菌多糖药理作用主要包括抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血脂、清除自由基、抑制过氧化脂质生成、抗炎、增强免疫力、抗凝血、抗衰老、止痛等。据报道，桦褐孔菌的抗肿瘤作用主要通过葡聚糖等多糖类物质来激活机体的免疫系统，起到增强机体的抗肿瘤免疫的作用。在治疗肿瘤方面，血清中较高浓度的一氧化氮含量能够影响肿瘤细胞信号的传导和肿瘤内血管的形成，促进肿瘤生长。桦褐孔菌多糖对小鼠肉瘤的生长具有明显的抑制作用。桦褐孔菌多糖降血糖、降血脂作用的研究表明，桦褐孔菌多糖能够促进胆固醇逆向代谢转换为胆固醇酯，抑制肠道内胆固醇吸收，同时能够改善血管内皮功能，降低血脂。桦褐孔菌中多糖类物质具有免疫增强功能，对免疫相关淋巴细胞的活性和功能有促进作用，能够清除体内自由基，延长细胞分裂，延长细胞寿命。

目前国内已有少数院校展开深层液态发酵生产桦褐孔菌的研究，都是以获得桦褐孔菌的菌丝体为主要目标展开研究的，而目前国内关于液态发酵生产桦褐孔菌的功效成分多糖的相关报道很少。目前关于真菌类原料多糖的提取工艺多为传统的水提醇沉法，即向干燥后的菌丝体加入8-20倍重量的水，控制温度80-100℃浸泡2-4h，静止1-2h，然后反复浸提2-3次，然后合并上清液进行浓缩，再用50-85％的酒精进行醇沉，最终烘干即可得到粗多糖。此工艺的缺点是需加入大量水长时间进行浸提，并且为提高收率需反复浸提2-3次，操作周期较长、劳动强度偏大，并且多糖的提取收率多在2-3％，产品成本比较昂贵。并且分离的上清液作为废液直接弃液排掉，增加了治污成本。

发明内容

本发明的目的是为了解决传统多糖的水提醇沉的技术瓶颈，采用此发明能够快速、高效生产出桦褐孔菌多糖。

为了实现上述目的，本发明主要按照下述步骤进行：

本发明的高效提取深层液态发酵生产桦褐孔菌菌丝体多糖的方法包括下述步骤：

1)分离：将桦褐孔菌发酵液经分离，得到桦褐孔菌上清液和湿菌丝体；

2)超声处理：向步骤1)所得的湿菌丝体中加入步骤1)所得2-5倍质量的桦褐孔菌上清液进行稀释，搅拌均匀后进行超声处理10-40min，得到超声处理液；上清液的添加主要是作为水溶性溶液来进行提取菌丝体中的多糖，添加量偏少，提取不完全，收率偏低，并且在超声过程中容易温度偏高，影响设备使用；若添加过多，后期处理需消耗大量的能源，成本偏高；

3)复合酶解：将步骤2)所得超声处理液调节pH值为4-7，控制温度30-70℃，然后向其加入相当于干菌丝体重量0.2-3％的纤维素酶、0.2-3％的蛋白酶，进行酶解1-4h，得到酶解液；

4)分离、浓缩：将步骤3)所得的酶解液进行分离，将分离所得到的上清液经低温浓缩，得到浓缩比重为1.25～1.40(50℃热测)的浓缩浆；

5)醇沉、烘干：加入浓缩浆重量3-5倍量的95％酒精，至混合液酒精度为65-80％(v/v)，静置2-6h，将沉淀物进行真空烘干；烘干至干燥物水分含量为3～8％，即得菌丝体多糖提取物。

其中，步骤1)、4)所述的分离为离心分离，采用三足离心机或高速离心机等离心设备进行，转速为1500-5000rpm。

步骤2)超声所用的设备为超声波细胞粉碎机，其他同等超声设备均可；超声的功率为0.5-2.5kw。

步骤3)所述的纤维素酶的单位酶活为15000μ/g～25000μ/g，所述的蛋白酶的单位酶活为47000μ/g～53000μ/g。

所述的低温浓缩过程均要求控制温度不高于75℃，真空度不低于0.085Mpa。

所述的真空烘干的温度50-75℃，真空度不低于0.085Mpa。

本发明中醇沉次数越多，多糖的含量越高。真空烘干采用的真空干燥箱，本发明提取的多糖含量在30-60％。

本发明具有以下几个突出的优点：

传统的工艺是至少用菌丝体干重的20倍的纯化水进行稀释，而本工艺采用上清液进行稀释，并且添加量只为菌丝体干重的2-5倍；具有以下优点：1、本发明利用上清液替代纯化水进行稀释，减少了废液排放，减少了治污成本；2、因上清液中含部分胞外多糖，作为溶液稀释时，其中所含的多糖也可被回收利用。3、用上清液替代纯化水，节约了纯化水，降低生产成本。

本发明提取路线简洁，节约了大量的能源消耗：因减少了纯化水的加入量，相应的在后期的分离、浓缩等工序减少了大量的电、蒸汽能源的消耗。

缩短了操作周期，减少了劳动强度：本发明改变了传统的多次浸提，采用一次短时间处理，是传统处理时间的1/3-1/6，减轻了工人的劳动强度。

提高了提取收率：传统的水提多糖的提取收率在2-3％，此发明用超声和酶解加剧了菌丝体胞内产物的溶出度，本发明提取多糖收率在4-6％，比传统工艺提升了1倍多。

提升了产品品质：因本发明采用超声和复合酶解处理菌丝体，将部分菌丝体的蛋白降解成可溶性的小分子物质，减少了在醇沉过程中杂质蛋白的含量，提升了多糖的产品品种，采用本发明提取多糖含量多在40％以上，比传统工艺提升了30％以上。

采用本发明可根据市场需求和产品标准，制得不同含量的高品质的多糖，多糖含量可在30-60％。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发明，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。本发明使用于普遍的桦褐孔菌，其来源不受实施例的限制，实施例中使用的菌种编码cfcc60260的桦褐孔菌仅是为了举例说明本发明的技术方案。

实施例1

本发明高效提取深层液态发酵生产桦褐孔菌菌丝体多糖的方法按下述步骤进行：

1、桦褐孔菌发酵液的制备：桦褐孔菌菌种购买于中国林业微生物菌种保藏管理中心(菌种编码cfcc60260)。将活化好的桦褐孔菌摇瓶菌株按接种量10％(v/v)接种于种子培养基(10L)，其中种子培养基组成为葡萄糖3％、蚕蛹粉0.3％、黄豆饼粉1.8％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.15％、消泡剂0.02％，调节pH值6.5，通风比为1：0.3vvm，罐压0.03Mpa，26～28℃振荡培养5天即得桦褐孔菌种子液；将种子液按接种量18％(v/v)接入发酵培养基(50L)，其中发酵培养基组成为葡萄糖2.8％、蚕蛹粉0.5％、黄豆饼粉1.5％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.15％、豆油0.02％，调节pH值6.5；通风比为1：0.5vvm，罐压0.03Mpa，26～28℃培养5天，发酵至菌球变碎、滤液浑浊；还原糖降至最低0.2并略有波动；镜检菌丝细碎，无杂菌污染。即得桦褐孔菌发酵液。其中上述培养基组成中的“％”均表示g/100ml。

2、桦褐孔菌发酵液分离：取上述桦褐孔菌发酵液10Kg通过高速离心机3000rpm进行分离，得到桦褐孔菌上清液液9.3Kg和0.70Kg的湿菌丝体(含水量为81％)；

3、超声处理：向步骤2所得的0.70Kg湿菌丝体中加入2.3Kg的桦褐孔菌上清液进行稀释，搅拌均匀后进行超声处理，超声功率1.5kw，处理时间20min，得到超声处理液3Kg；

4、复合酶解：将步骤3所得超声处理液调节pH值为5.5，45℃水浴，然后向其中缓慢加入纤维素酶2.5g(购自枣庄杰诺生物酶有限公司，单位酶活20000μ/g，下同)、蛋白酶2.5g(购自枣庄杰诺生物酶有限公司，单位酶活50000μ/g，下同)并不断搅拌，搅拌均匀后计时进行酶解2h，得到酶解液；

5、分离、浓缩：将步骤4所得的酶解液用高速离心机5000rpm进行分离，将分离所得到的上清液2.4Kg用旋转蒸发仪低温浓缩，浓缩过程均要求控制温度不高于75℃，真空度不低于0.085MPa，得到浓缩比重为1.3(50℃热测)的浓缩浆70g；

6、醇沉、烘干：向70g浓缩浆的中加入250ml的95％酒精，用酒精计检测混合液酒精度72％(v/v)，缓慢搅拌均匀后静置3h，将底部沉淀物分离用真空干燥箱进行烘干，温度60℃，真空度0.09MPa；烘干1h得桦褐孔菌菌丝体多糖提取物18g。检测水分含量为3.1％，多糖含量为43％，折合纯多糖提取收率为5.82％。

本发明中的纯多糖提取收率是按干菌粉计算的，即纯多糖提取收率＝桦褐孔菌菌丝体多糖提取物质量*多糖含量/[湿菌丝体质量*(1-湿菌丝体含水量)]*100％

实施例2

本发明高效提取深层液态发酵生产桦褐孔菌菌丝体多糖的方法按下述步骤进行：

1、桦褐孔菌发酵液的制备：桦褐孔菌菌种购买于中国林业微生物菌种保藏管理中心(菌种编码cfcc60260)。将活化好的桦褐孔菌摇瓶菌株按接种量15％(v/v)接种于种子培养基(20L)，其中种子培养基组成为葡萄糖3％、蚕蛹粉0.3％、黄豆饼粉1.8％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.15％、消泡剂0.02％，调节pH值6.5，通风比为1：0.3vvm，罐压0.03Mpa，26～28℃振荡培养5天即得桦褐孔菌种子液；将种子液按接种量16％(v/v)接入发酵培养基(100L)，其中发酵培养基组成为葡萄糖2.5％、蚕蛹粉0.5％、黄豆饼粉1.5％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.15％、豆油0.02％，调节pH值6.5；通风比为1：0.5vvm，罐压0.03Mpa，26～28℃培养5天，发酵至菌球变碎、滤液浑浊；还原糖降至最低0.2并略有波动；镜检菌丝细碎，无杂菌污染。即得桦褐孔菌发酵液。其中上述培养基组成中的“％”均表示g/100ml。

2、桦褐孔菌发酵液分离：取上述桦褐孔菌发酵液20Kg通过高速离心机3000rpm进行分离，得到桦褐孔菌上清液液18.6Kg和1.4Kg的湿菌丝体(含水量为80％)；

3、超声处理：向步骤2所得的1.4Kg湿菌丝体中加入4.6Kg的桦褐孔菌上清液进行稀释，搅拌均匀后进行2.0kw超声处理30min，得到超声处理液6Kg；

4、复合酶解：将步骤3所得超声处理液调节pH值为5.5，在水浴控制温度50℃，然后向其缓慢加入纤维素酶4.8g(购自枣庄杰诺生物酶有限公司，单位酶活20000μ/g，下同)、蛋白酶5g(购自枣庄杰诺生物酶有限公司，单位酶活50000μ/g，下同)并不断搅拌，搅拌均匀后计时进行酶解2h，得到酶解液；

5、分离、浓缩：将步骤4所得的酶解液用高速离心机5000rpm进行分离，将分离所得到的上清液4.8Kg用旋转蒸发仪低温浓缩，浓缩过程均要求控制温度不高于75℃，真空度不低于0.085MPa，得到浓缩比重为1.4(50℃热测)的浓缩浆130g；

6、醇沉、烘干：向130g浓缩浆的中加入450ml的95％酒精，用酒精计检测混合液酒精度71％(v/v)，缓慢搅拌均匀后静置2h，将底部沉淀物分离用真空干燥箱进行烘干，温度60℃，真空度0.09MPa；烘干1h得桦褐孔菌菌丝体多糖提取物36g。检测水分含量为3.5％，多糖含量为45％，多糖提取收率为5.78％。

Claims (5)

1.一种桦褐孔菌菌丝体多糖的提取方法，其特征在于该方法包括下述步骤：

1)分离：将桦褐孔菌发酵液经分离，得到桦褐孔菌上清液和湿菌丝体；

2)超声处理：向步骤1)所得的湿菌丝体中加入步骤1)所得2-5倍质量的桦褐孔菌上清液进行稀释，搅拌均匀后进行超声处理10-40min，得到超声处理液；

3)复合酶解：将步骤2)所得超声处理液调节pH值为4-7，控制温度30-70℃，然后向其加入相当于干菌丝体重量0.2-3％的纤维素酶、0.2-3％的蛋白酶，进行酶解1-4h，得到酶解液；

4)分离、浓缩：将步骤3)所得的酶解液进行分离，将分离所得到的上清液经低温浓缩，得到浓缩比重为1.25～1.40的浓缩浆；

5)醇沉、烘干：加入浓缩浆重量3-5倍量的95％酒精，至混合液酒精度为65-80％(v/v)，静置2-6h，将沉淀物进行真空烘干；烘干至干燥物水分含量为3～8％，即得菌丝体多糖提取物。

2.根据权利要求1所述的桦褐孔菌菌丝体多糖的提取方法，其特征在于所述的分离为离心分离，转速控制在1500-5000rpm。

3.根据权利要求1所述的桦褐孔菌菌丝体多糖的提取方法，其特征在于所述的纤维素酶酶活为15000μ/g～25000μ/g，所述的蛋白酶的单位酶活为47000μ/g～53000μ/g。

4.根据权利要求1所述的桦褐孔菌菌丝体多糖的提取方法，其特征在于步骤4)所述的低温浓缩过程均要求控制温度不高于75℃，真空度不低于0.085Mpa。

5.根据权利要求1所述的桦褐孔菌菌丝体多糖的提取方法，其特征在于步骤5)所述的真空烘干的温度控制在50-75℃，真空度不低于0.085Mpa。