CN109182148B - 一种提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法 - Google Patents

一种提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于蛹虫草栽培技术领域，具体涉及一种提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法。本发明所述提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，利用萝卜、甘蔗、山楂作为培养原料的营养物质，并添加鸡蛋清，能够有效对蛹虫草发酵过程中虫草酸的进行诱导；并通过添加月桂酰基谷氨酸钠作为诱导剂，有效提高了菌丝体胞内虫草酸的含量；同时在菌丝体发酵过程中辅以特定光暗比的光照诱导，进一步利用物理诱导方式增强了蛹虫草菌丝体中虫草酸的积累，有效提高了菌丝体胞内虫草酸的含量。

Description

一种提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法
技术领域
本发明属于蛹虫草栽培技术领域，具体涉及一种提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法。
背景技术
蛹虫草(Cordycepsmilitaris(L.)Link)又名北冬虫夏草，隶属于真菌门(Eumycota)、子囊菌门(Ascomycota)、子囊菌亚门(Ascomycotinia)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)、虫草科(Cordycipitaceae)、虫草属(Cordyceps)的模式种。蛹虫草通常与冬虫夏草具有相似的生物活性成分，主要包括虫草素、虫草酸、虫草多糖、麦角甾醇、氨基酸、核苷类物质等，蛹虫草的功效也与冬虫夏草相似，是冬虫夏草的良好代用品，且虫草素含量也高于冬虫夏草。踊虫草是一种天然资源，呈现出世界性分布，但数量很少，多数依靠人工栽种培植。
虫草酸是蛹虫草的主要活性成分之一，虫草酸含量的高低被认为是衡量虫草质量的主要标准之一，一般认为虫草酸含量高的虫草的药用价值高。试验测定，冬虫夏草含虫草酸成分约为7％，而蛹虫草中的虫草酸活性成分含量要明显高于冬虫夏草，使其应用价值得到人们的广泛关注。
药理学研究表明，虫草酸具有促进人体新陈代谢、改善人体微循环系统、明显降低血脂、抑制细菌、增强对疾病的抵抗力等作用，以及镇咳、祛痰、平喘的功效；虫草酸可用于预防与治疗脑血栓、脑出血、心肌梗塞、长期衰竭、抗肝组织纤维化、抗脂质过氧化等症，同时由于虫草的增强免疫功能使肝脏的解毒作用增强，从而能够有效保护肝细胞。目前，由于对蛹虫草虫草酸等活性成分的需求增长迅速，野生蛹虫草资源被疯狂采摘而日益稀少昂贵，而通过化学合成其活性成分的途径工艺复杂且产量极低，严重制约其广泛的药源应用。
研究发现，通过液体发酵生产技术制得的虫草酸，与从蛹虫草子实体、菌丝体中直接提取得到的虫草酸等活性成分在生化结构、生理作用上基本是相同的，而且具有培养周期短、生产流程易控制、活性物质易于提取等优点，虫草酸等活性物质的提取含量及效率都要远高于利用人工栽培虫草进行生产和提取。但是目前的蛹虫草及虫草酸等活性成分的生产仍是以传统的固体栽培为主，液体培养研究和应用由于发展时间短，许多发酵技术和工艺仍不成熟，整体产量和发酵水平较低，限制了其工业化生产的发展。因此，如何通过液体发酵手段有效提高蛹虫草菌丝体中虫草酸的含量，具有积极的意义。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，以解决现有技术中虫草酸液体发酵工艺存在着整体产量和发酵水平较低的问题。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，包括在菌株活化培养基中进行菌种活化、在种子液培养基中进行种子液培养、以及在菌丝体发酵培养基中进行发酵罐菌丝体培养的步骤；
所述菌丝体培养的步骤包括在菌丝体发酵培养过程中进行光照诱导培养的步骤，控制光周期光暗比为L2-6：D18-22，控制光照强度均为1000-3000lx。
优选的，所述提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，所述菌丝体培养的步骤中，控制光照强度以200-300lx/天的幅度增加。
优选的，所述提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，所述菌丝体发酵培养基包括如下质量含量的组分：萝卜2-4％、甘蔗2-5％、豆粕粉1-3％、蛋白胨2-4％、乳木果油0.8-2％、山楂1-2％、鸡蛋清1-3％、MgSO4 0.05-0.08％、KH2PO4 0.04-0.06％，自然pH。
更优的，所述提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，所述菌丝体发酵培养基还包括0.01-0.02％的月桂酰基谷氨酸钠。
具体的，所述山楂为以山楂味原料，经去核、破碎、加水制浆、加入果胶酶解处理后所得的山楂酶解物。
优选的，所述菌丝体培养步骤的发酵条件包括：控制发酵温度为20-25℃，搅拌转速150-180rpm，通风量0.8-1.2m3/h。
优选的，所述种子液培养基包括如下质量含量的组分：葡萄糖0.5-1％、酵母提取物0.2-0.4％、萝卜0.8-1.5％、鸡蛋清0.5-1％、MgSO4 0.01-0.03％、KH2PO4 0.01-0.03％，自然pH。
优选的，所述种子液培养步骤的条件包括：控制培养温度22-28℃，搅拌转速120-150rpm。
优选的，菌株活化培养基包括如下质量含量的组分：马铃薯5-10％、葡萄糖2-4％、萝卜0.5-1％、鸡蛋清0.3-0.5％、自然pH。
优选的，所述菌种活化步骤的条件包括：于20-30℃、转速120-180rpm进行避光培养2-3天。
本发明所述提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，利用萝卜、甘蔗、山楂作为培养原料的营养物质，并添加鸡蛋清，能够有效对蛹虫草发酵过程中虫草酸的进行诱导；并通过添加月桂酰基谷氨酸钠作为诱导剂，有效提高了菌丝体胞内虫草酸的含量；同时在菌丝体发酵过程中辅以特定光暗比的光照诱导，进一步利用物理诱导方式增强了蛹虫草菌丝体中虫草酸的积累，有效提高了菌丝体胞内虫草酸的含量。
具体实施方式
在本发明下述实施例中，选用的培育蛹虫草的菌株为现有技术常规已知菌株即可，本发明方案通过对各级发酵培养基的筛选，有助于提高虫草酸的含量。下述实施例选用的所述蛹虫草菌株具体为蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株“大孢子头北虫草09-888”(购自于辽宁锦州市亚泰微生物研究所)。
实施例1
本实施例所述的提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，包括在菌株活化培养基中进行菌种活化、在种子液培养基中进行种子液培养、以及在菌丝体发酵培养基中进行发酵罐菌丝体培养的步骤。
本实施例所述菌株活化培养基包括如下质量含量的组分：按照马铃薯5％、葡萄糖4％、萝卜0.5％、鸡蛋清0.5％的比例取上述组分；分别取马铃薯50g和萝卜5g进行混合制浆、并加入葡萄糖40g、鸡蛋清5g混匀，加水定容至1L，自然pH，121℃灭菌20min后，分装于试管中，将蛹虫草菌种在无菌条件下接入试管，于20℃、转速180rpm进行避光活化培养2-3天。
本实施例所述种子液培养基包括如下质量含量的组分：按照葡萄糖0.5％、酵母提取物0.4％、萝卜0.8％、鸡蛋清1％、MgSO4 0.01％、KH2PO40.03％的比例取上述组分；取选定量的萝卜加水进行制浆，并加入选定量的所述葡萄糖、酵母提取物、鸡蛋清、MgSO4和KH2PO4混匀，加水定容至5L，自然pH，分装于500mL三角瓶内，每瓶装液量100mL，封口后于121℃灭菌20min，取出培养基自然冷却至室温。无菌条件下，将所述活化培养后的菌液按照5％的接种量接种至所述液体培养基中，于22℃，控制搅拌转速150rpm，摇瓶培养2-3天。
本实施例所述菌丝体发酵培养基包括如下质量含量的组分：萝卜2％、甘蔗5％、豆粕粉1％、蛋白胨4％、乳木果油0.8％、山楂2％、鸡蛋清1％、MgSO4 0.08％、KH2PO4 0.04％的比例取上述组分；取选定量的萝卜、甘蔗和山楂加水进行混合制浆，加入所述豆粕粉、蛋白胨、乳木果油、鸡蛋清、MgSO4、KH2PO4混匀，加水定容至5L，装入发酵罐，于121℃灭菌20min，取出培养基自然冷却至室温。无菌条件下，按照10％的接种量接入上述种子液培养基，控制发酵温度20℃，搅拌转速180rpm，通风量0.8m3/h，进行发酵培养。整个发酵培养过程中，还同时对发酵罐进行光照诱导培养，控制光周期光暗比为L2：D22，控制光照强度为3000lx，发酵培养120h，放罐收获。
实施例2
本实施例所述的提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，包括在菌株活化培养基中进行菌种活化、在种子液培养基中进行种子液培养、以及在菌丝体发酵培养基中进行发酵罐菌丝体培养的步骤。
本实施例所述菌株活化培养基包括如下质量含量的组分：按照马铃薯10％、葡萄糖2％、萝卜1％、鸡蛋清0.3％的比例取上述组分；分别取马铃薯100g和萝卜10g进行混合制浆、并加入葡萄糖20g、鸡蛋清3g混匀，加水定容至1L，自然pH，121℃灭菌20min后，分装于试管中，将蛹虫草菌种在无菌条件下接入试管，于30℃、转速120rpm进行避光活化培养2-3天。
本实施例所述种子液培养基包括如下质量含量的组分：按照葡萄糖1％、酵母提取物0.2％、萝卜1.5％、鸡蛋清0.5％、MgSO4 0.03％、KH2PO4 0.01％的比例取上述组分；取选定量的萝卜加水进行制浆，并加入选定量的所述葡萄糖、酵母提取物、鸡蛋清、MgSO4和KH2PO4混匀，加水定容至5L，自然pH，分装于500mL三角瓶内，每瓶装液量100mL，封口后于121℃灭菌20min，取出培养基自然冷却至室温。无菌条件下，将所述活化培养后的菌液按照5％的接种量接种至所述液体培养基中，于28℃，控制搅拌转速120rpm，摇瓶培养2-3天。
本实施例所述菌丝体发酵培养基包括如下质量含量的组分：萝卜4％、甘蔗2％、豆粕粉3％、蛋白胨2％、乳木果油2％、山楂1％、鸡蛋清3％、MgSO4 0.05％、KH2PO4 0.06％的比例取上述组分；取选定量的萝卜、甘蔗和山楂加水进行混合制浆，加入所述豆粕粉、蛋白胨、乳木果油、鸡蛋清、MgSO4、KH2PO4混匀，加水定容至5L，装入发酵罐，于121℃灭菌20min，取出培养基自然冷却至室温。无菌条件下，按照10％的接种量接入上述种子液培养基，控制发酵温度25℃，搅拌转速150rpm，通风量1.2m3/h，进行发酵培养。整个发酵培养过程中，还同时对发酵罐进行光照诱导培养，控制光周期光暗比为L6：D18，控制光照强度为1000lx，发酵培养120h，放罐收获。
实施例3
本实施例所述的提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，包括在菌株活化培养基中进行菌种活化、在种子液培养基中进行种子液培养、以及在菌丝体发酵培养基中进行发酵罐菌丝体培养的步骤。
本实施例所述菌株活化培养基包括如下质量含量的组分：按照马铃薯8％、葡萄糖3％、萝卜0.8％、鸡蛋清0.4％的比例取上述组分；分别取马铃薯80g和萝卜8g进行混合制浆、并加入葡萄糖30g、鸡蛋清4g混匀，加水定容至1L，自然pH，121℃灭菌20min后，分装于试管中，将蛹虫草菌种在无菌条件下接入试管，于25℃、转速150rpm进行避光活化培养2-3天。
本实施例所述种子液培养基包括如下质量含量的组分：按照葡萄糖0.8％、酵母提取物0.3％、萝卜1.2％、鸡蛋清0.8％、MgSO4 0.02％、KH2PO4 0.02％的比例取上述组分；取选定量的萝卜加水进行制浆，并加入选定量的所述葡萄糖、酵母提取物、鸡蛋清、MgSO4和KH2PO4混匀，加水定容至5L，自然pH，分装于500mL三角瓶内，每瓶装液量100mL，封口后于121℃灭菌20min，取出培养基自然冷却至室温。无菌条件下，将所述活化培养后的菌液按照5％的接种量接种至所述液体培养基中，于25℃，控制搅拌转速135rpm，摇瓶培养2-3天。
本实施例所述菌丝体发酵培养基包括如下质量含量的组分：萝卜3％、甘蔗4％、豆粕粉2％、蛋白胨3％、乳木果油1.2％、山楂1.5％、鸡蛋清2％、MgSO4 0.06％、KH2PO4 0.05％的比例取上述组分；取选定量的萝卜、甘蔗和山楂加水进行混合制浆，加入所述豆粕粉、蛋白胨、乳木果油、鸡蛋清、MgSO4、KH2PO4混匀，加水定容至5L，装入发酵罐，于121℃灭菌20min，取出培养基自然冷却至室温。无菌条件下，按照10％的接种量接入上述种子液培养基，控制发酵温度22℃，搅拌转速165rpm，通风量1m3/h，进行发酵培养。整个发酵培养过程中，还同时对发酵罐进行光照诱导培养，控制光周期光暗比为L4：D20，控制光照强度为2000lx，发酵培养120h，放罐收获。
实施例4
本实施例所述的提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，包括在菌株活化培养基中进行菌种活化、在种子液培养基中进行种子液培养、以及在菌丝体发酵培养基中进行发酵罐菌丝体培养的步骤。
本实施例所述菌株活化培养基包括如下质量含量的组分：按照马铃薯8％、葡萄糖3％、萝卜0.8％、鸡蛋清0.4％的比例取上述组分；分别取马铃薯80g和萝卜8g进行混合制浆、并加入葡萄糖30g、鸡蛋清4g混匀，加水定容至1L，自然pH，121℃灭菌20min后，分装于试管中，将蛹虫草菌种在无菌条件下接入试管，于25℃、转速150rpm进行避光活化培养2-3天。
本实施例所述种子液培养基包括如下质量含量的组分：按照葡萄糖0.8％、酵母提取物0.3％、萝卜1.2％、鸡蛋清0.8％、MgSO4 0.02％、KH2PO4 0.02％的比例取上述组分；取选定量的萝卜加水进行制浆，并加入选定量的所述葡萄糖、酵母提取物、鸡蛋清、MgSO4和KH2PO4混匀，加水定容至5L，自然pH，分装于500mL三角瓶内，每瓶装液量100mL，封口后于121℃灭菌20min，取出培养基自然冷却至室温。无菌条件下，将所述活化培养后的菌液按照5％的接种量接种至所述液体培养基中，于25℃，控制搅拌转速135rpm，摇瓶培养2-3天。
本实施例所述菌丝体发酵培养基包括如下质量含量的组分：萝卜3％、甘蔗4％、豆粕粉2％、蛋白胨3％、乳木果油1.2％、山楂1.5％、鸡蛋清2％、MgSO4 0.06％、KH2PO4 0.05％的比例取上述组分；取选定量的萝卜、甘蔗加水进行混合制浆；取选定量的所述山楂去核、粉碎，并加入占山楂2倍重量的水制浆，随后加入占所述山楂量0.5wt％的果胶酶进行常温下酶解2h，得到山楂酶解物；将所得山楂酶解物加入至萝卜、甘蔗浆中，并加入所述豆粕粉、蛋白胨、乳木果油、鸡蛋清、MgSO4、KH2PO4混匀，加水定容至5L，装入发酵罐，于121℃灭菌20min，取出培养基自然冷却至室温。无菌条件下，按照10％的接种量接入上述种子液培养基，控制发酵温度22℃，搅拌转速165rpm，通风量1m3/h，进行发酵培养。整个发酵培养过程中，还同时对发酵罐进行光照诱导培养，控制光周期光暗比为L4：D20，控制光照强度为2000lx，发酵培养120h，放罐收获。
实施例5
本实施例所述的提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，包括在菌株活化培养基中进行菌种活化、在种子液培养基中进行种子液培养、以及在菌丝体发酵培养基中进行发酵罐菌丝体培养的步骤。
本实施例所述菌株活化培养基包括如下质量含量的组分：按照马铃薯8％、葡萄糖3％、萝卜0.8％、鸡蛋清0.4％的比例取上述组分；分别取马铃薯80g和萝卜8g进行混合制浆、并加入葡萄糖30g、鸡蛋清4g混匀，加水定容至1L，自然pH，121℃灭菌20min后，分装于试管中，将蛹虫草菌种在无菌条件下接入试管，于25℃、转速150rpm进行避光活化培养2-3天。
本实施例所述种子液培养基包括如下质量含量的组分：按照葡萄糖0.8％、酵母提取物0.3％、萝卜1.2％、鸡蛋清0.8％、MgSO4 0.02％、KH2PO4 0.02％的比例取上述组分；取选定量的萝卜加水进行制浆，并加入选定量的所述葡萄糖、酵母提取物、鸡蛋清、MgSO4和KH2PO4混匀，加水定容至5L，自然pH，分装于500mL三角瓶内，每瓶装液量100mL，封口后于121℃灭菌20min，取出培养基自然冷却至室温。无菌条件下，将所述活化培养后的菌液按照5％的接种量接种至所述液体培养基中，于25℃，控制搅拌转速135rpm，摇瓶培养2-3天。
本实施例所述菌丝体发酵培养基包括如下质量含量的组分：萝卜3％、甘蔗4％、豆粕粉2％、蛋白胨3％、乳木果油1.2％、山楂1.5％、鸡蛋清2％、MgSO4 0.06％、KH2PO40.05％、月桂酰基谷氨酸钠0.01％的比例取上述组分；取选定量的萝卜、甘蔗加水进行混合制浆；取选定量的所述山楂去核、粉碎，并加入占山楂2倍重量的水制浆，随后加入占所述山楂量0.5wt％的果胶酶进行常温下酶解2h，得到山楂酶解物；将所得山楂酶解物加入至萝卜、甘蔗浆中，并加入所述豆粕粉、蛋白胨、乳木果油、鸡蛋清、MgSO4、KH2PO4、月桂酰基谷氨酸钠混匀，加水定容至5L，装入发酵罐，于121℃灭菌20min，取出培养基自然冷却至室温。无菌条件下，按照10％的接种量接入上述种子液培养基，控制发酵温度22℃，搅拌转速165rpm，通风量1m3/h，进行发酵培养。整个发酵培养过程中，还同时对发酵罐进行光照诱导培养，控制光周期光暗比为L4：D20，控制光照强度为2000lx，发酵培养120h，放罐收获。
实施例6
本实施例所述的提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，包括在菌株活化培养基中进行菌种活化、在种子液培养基中进行种子液培养、以及在菌丝体发酵培养基中进行发酵罐菌丝体培养的步骤。
本实施例所述菌株活化培养基包括如下质量含量的组分：按照马铃薯8％、葡萄糖3％、萝卜0.8％、鸡蛋清0.4％的比例取上述组分；分别取马铃薯80g和萝卜8g进行混合制浆、并加入葡萄糖30g、鸡蛋清4g混匀，加水定容至1L，自然pH，121℃灭菌20min后，分装于试管中，将蛹虫草菌种在无菌条件下接入试管，于25℃、转速150rpm进行避光活化培养2-3天。
本实施例所述种子液培养基包括如下质量含量的组分：按照葡萄糖0.8％、酵母提取物0.3％、萝卜1.2％、鸡蛋清0.8％、MgSO4 0.02％、KH2PO4 0.02％的比例取上述组分；取选定量的萝卜加水进行制浆，并加入选定量的所述葡萄糖、酵母提取物、鸡蛋清、MgSO4和KH2PO4混匀，加水定容至5L，自然pH，分装于500mL三角瓶内，每瓶装液量100mL，封口后于121℃灭菌20min，取出培养基自然冷却至室温。无菌条件下，将所述活化培养后的菌液按照5％的接种量接种至所述液体培养基中，于25℃，控制搅拌转速135rpm，摇瓶培养2-3天。
本实施例所述菌丝体发酵培养基包括如下质量含量的组分：萝卜3％、甘蔗4％、豆粕粉2％、蛋白胨3％、乳木果油1.2％、山楂1.5％、鸡蛋清2％、MgSO4 0.06％、KH2PO40.05％、月桂酰基谷氨酸钠0.02％的比例取上述组分；取选定量的萝卜、甘蔗加水进行混合制浆；取选定量的所述山楂去核、粉碎，并加入占山楂2倍重量的水制浆，随后加入占所述山楂量0.5wt％的果胶酶进行常温下酶解2h，得到山楂酶解物；将所得山楂酶解物加入至萝卜、甘蔗浆中，并加入所述豆粕粉、蛋白胨、乳木果油、鸡蛋清、MgSO4、KH2PO4、月桂酰基谷氨酸钠混匀，加水定容至5L，装入发酵罐，于121℃灭菌20min，取出培养基自然冷却至室温。无菌条件下，按照10％的接种量接入上述种子液培养基，控制发酵温度22℃，搅拌转速165rpm，通风量1m3/h，进行发酵培养。整个发酵培养过程中，还同时对发酵罐进行光照诱导培养，控制光周期光暗比为L4：D20，控制光照强度为2000lx，发酵培养120h，放罐收获。
实施例7
本实施例所述的提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，包括在菌株活化培养基中进行菌种活化、在种子液培养基中进行种子液培养、以及在菌丝体发酵培养基中进行发酵罐菌丝体培养的步骤。
本实施例所述菌株活化培养基包括如下质量含量的组分：按照马铃薯8％、葡萄糖3％、萝卜0.8％、鸡蛋清0.4％的比例取上述组分；分别取马铃薯80g和萝卜8g进行混合制浆、并加入葡萄糖30g、鸡蛋清4g混匀，加水定容至1L，自然pH，121℃灭菌20min后，分装于试管中，将蛹虫草菌种在无菌条件下接入试管，于25℃、转速150rpm进行避光活化培养2-3天。
本实施例所述种子液培养基包括如下质量含量的组分：按照葡萄糖0.8％、酵母提取物0.3％、萝卜1.2％、鸡蛋清0.8％、MgSO4 0.02％、KH2PO4 0.02％的比例取上述组分；取选定量的萝卜加水进行制浆，并加入选定量的所述葡萄糖、酵母提取物、鸡蛋清、MgSO4和KH2PO4混匀，加水定容至5L，自然pH，分装于500mL三角瓶内，每瓶装液量100mL，封口后于121℃灭菌20min，取出培养基自然冷却至室温。无菌条件下，将所述活化培养后的菌液按照5％的接种量接种至所述液体培养基中，于25℃，控制搅拌转速135rpm，摇瓶培养2-3天。
本实施例所述菌丝体发酵培养基包括如下质量含量的组分：萝卜3％、甘蔗4％、豆粕粉2％、蛋白胨3％、乳木果油1.2％、山楂1.5％、鸡蛋清2％、MgSO4 0.06％、KH2PO40.05％、月桂酰基谷氨酸钠0.015％的比例取上述组分；取选定量的萝卜、甘蔗加水进行混合制浆；取选定量的所述山楂去核、粉碎，并加入占山楂2倍重量的水制浆，随后加入占所述山楂量0.5wt％的果胶酶进行常温下酶解2h，得到山楂酶解物；将所得山楂酶解物加入至萝卜、甘蔗浆中，并加入所述豆粕粉、蛋白胨、乳木果油、鸡蛋清、MgSO4、KH2PO4、月桂酰基谷氨酸钠混匀，加水定容至5L，装入发酵罐，于121℃灭菌20min，取出培养基自然冷却至室温。无菌条件下，按照10％的接种量接入上述种子液培养基，控制发酵温度22℃，搅拌转速165rpm，通风量1m3/h，进行发酵培养。整个发酵培养过程中，还同时对发酵罐进行光照诱导培养，控制光周期光暗比为L4：D20，控制光照强度为2000lx，发酵培养120h，放罐收获。
实施例8
本实施例所述的提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，包括在菌株活化培养基中进行菌种活化、在种子液培养基中进行种子液培养、以及在菌丝体发酵培养基中进行发酵罐菌丝体培养的步骤。
本实施例所述菌株活化培养基包括如下质量含量的组分：按照马铃薯8％、葡萄糖3％、萝卜0.8％、鸡蛋清0.4％的比例取上述组分；分别取马铃薯80g和萝卜8g进行混合制浆、并加入葡萄糖30g、鸡蛋清4g混匀，加水定容至1L，自然pH，121℃灭菌20min后，分装于试管中，将蛹虫草菌种在无菌条件下接入试管，于25℃、转速150rpm进行避光活化培养2-3天。
本实施例所述种子液培养基包括如下质量含量的组分：按照葡萄糖0.8％、酵母提取物0.3％、萝卜1.2％、鸡蛋清0.8％、MgSO4 0.02％、KH2PO4 0.02％的比例取上述组分；取选定量的萝卜加水进行制浆，并加入选定量的所述葡萄糖、酵母提取物、鸡蛋清、MgSO4和KH2PO4混匀，加水定容至5L，自然pH，分装于500mL三角瓶内，每瓶装液量100mL，封口后于121℃灭菌20min，取出培养基自然冷却至室温。无菌条件下，将所述活化培养后的菌液按照5％的接种量接种至所述液体培养基中，于25℃，控制搅拌转速135rpm，摇瓶培养2-3天。
本实施例所述菌丝体发酵培养基包括如下质量含量的组分：萝卜3％、甘蔗4％、豆粕粉2％、蛋白胨3％、乳木果油1.2％、山楂1.5％、鸡蛋清2％、MgSO4 0.06％、KH2PO40.05％、月桂酰基谷氨酸钠0.015％的比例取上述组分；取选定量的萝卜、甘蔗加水进行混合制浆；取选定量的所述山楂去核、粉碎，并加入占山楂2倍重量的水制浆，随后加入占所述山楂量0.5wt％的果胶酶进行常温下酶解2h，得到山楂酶解物；将所得山楂酶解物加入至萝卜、甘蔗浆中，并加入所述豆粕粉、蛋白胨、乳木果油、鸡蛋清、MgSO4、KH2PO4、月桂酰基谷氨酸钠混匀，加水定容至5L，装入发酵罐，于121℃灭菌20min，取出培养基自然冷却至室温。无菌条件下，按照10％的接种量接入上述种子液培养基，控制发酵温度22℃，搅拌转速165rpm，通风量1m3/h，进行发酵培养。整个发酵培养过程中，还同时对发酵罐进行光照诱导培养，控制光周期光暗比为L4：D20，控制光照强度为2000lx，并且在发酵过程中，控制光照强度以200lx/天的幅度增加，至光照强度为3000lx时则不再增加，发酵培养120h，放罐收获。
实施例9
本实施例所述的提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，包括在菌株活化培养基中进行菌种活化、在种子液培养基中进行种子液培养、以及在菌丝体发酵培养基中进行发酵罐菌丝体培养的步骤。
本实施例所述菌株活化培养基包括如下质量含量的组分：按照马铃薯8％、葡萄糖3％、萝卜0.8％、鸡蛋清0.4％的比例取上述组分；分别取马铃薯80g和萝卜8g进行混合制浆、并加入葡萄糖30g、鸡蛋清4g混匀，加水定容至1L，自然pH，121℃灭菌20min后，分装于试管中，将蛹虫草菌种在无菌条件下接入试管，于25℃、转速150rpm进行避光活化培养2-3天。
本实施例所述种子液培养基包括如下质量含量的组分：按照葡萄糖0.8％、酵母提取物0.3％、萝卜1.2％、鸡蛋清0.8％、MgSO4 0.02％、KH2PO4 0.02％的比例取上述组分；取选定量的萝卜加水进行制浆，并加入选定量的所述葡萄糖、酵母提取物、鸡蛋清、MgSO4和KH2PO4混匀，加水定容至5L，自然pH，分装于500mL三角瓶内，每瓶装液量100mL，封口后于121℃灭菌20min，取出培养基自然冷却至室温。无菌条件下，将所述活化培养后的菌液按照5％的接种量接种至所述液体培养基中，于25℃，控制搅拌转速135rpm，摇瓶培养2-3天。
本实施例所述菌丝体发酵培养基包括如下质量含量的组分：萝卜3％、甘蔗4％、豆粕粉2％、蛋白胨3％、乳木果油1.2％、山楂1.5％、鸡蛋清2％、MgSO4 0.06％、KH2PO40.05％、月桂酰基谷氨酸钠0.015％的比例取上述组分；取选定量的萝卜、甘蔗加水进行混合制浆；取选定量的所述山楂去核、粉碎，并加入占山楂2倍重量的水制浆，随后加入占所述山楂量0.5wt％的果胶酶进行常温下酶解2h，得到山楂酶解物；将所得山楂酶解物加入至萝卜、甘蔗浆中，并加入所述豆粕粉、蛋白胨、乳木果油、鸡蛋清、MgSO4、KH2PO4、月桂酰基谷氨酸钠混匀，加水定容至5L，装入发酵罐，于121℃灭菌20min，取出培养基自然冷却至室温。无菌条件下，按照10％的接种量接入上述种子液培养基，控制发酵温度22℃，搅拌转速165rpm，通风量1m3/h，进行发酵培养。整个发酵培养过程中，还同时对发酵罐进行光照诱导培养，控制光周期光暗比为L4：D20，控制光照强度为2000lx，并且在发酵过程中，控制光照强度以300lx/天的幅度增加，至光照强度为3000lx时则不再增加，发酵培养120h，放罐收获。
对比例1
本对比例所述的发酵培养蛹虫草的方法，包括在菌株活化培养基中进行菌种活化、在种子液培养基中进行种子液培养、以及在菌丝体发酵培养基中进行发酵罐菌丝体培养的步骤，具体的培养方法同实施例3，其区别仅在于，所述菌种活化步骤中，所述活化培养基中不含有鸡蛋清。
对比例2
本对比例所述的发酵培养蛹虫草的方法，包括在菌株活化培养基中进行菌种活化、在种子液培养基中进行种子液培养、以及在菌丝体发酵培养基中进行发酵罐菌丝体培养的步骤，具体的培养方法同实施例3，其区别仅在于，所述种子液培养步骤中，所述种子液培养基中不含有鸡蛋清。
对比例3
本对比例所述的发酵培养蛹虫草的方法，包括在菌株活化培养基中进行菌种活化、在种子液培养基中进行种子液培养、以及在菌丝体发酵培养基中进行发酵罐菌丝体培养的步骤，具体的培养方法同实施例3，其区别仅在于，所述发酵罐菌丝体培养步骤中，所述菌丝体发酵培养基中不含有鸡蛋清。
对比例4
本对比例所述的发酵培养蛹虫草的方法，包括在菌株活化培养基中进行菌种活化、在种子液培养基中进行种子液培养、以及在菌丝体发酵培养基中进行发酵罐菌丝体培养的步骤，具体的培养方法同实施例3，其区别仅在于，所述发酵罐菌丝体培养步骤中，所述菌丝体发酵培养基中不含有萝卜。
对比例5
本对比例所述的发酵培养蛹虫草的方法，包括在菌株活化培养基中进行菌种活化、在种子液培养基中进行种子液培养、以及在菌丝体发酵培养基中进行发酵罐菌丝体培养的步骤，具体的培养方法同实施例3，其区别仅在于，所述发酵罐菌丝体培养步骤中，所述菌丝体发酵培养基中不含有山楂。
对比例6
本对比例所述的发酵培养蛹虫草的方法，包括在菌株活化培养基中进行菌种活化、在种子液培养基中进行种子液培养、以及在菌丝体发酵培养基中进行发酵罐菌丝体培养的步骤，具体的培养方法同实施例3，其区别仅在于，所述发酵罐菌丝体培养步骤中，所述菌丝体发酵培养基中不含有乳木果油。
对比例7
本对比例所述的发酵培养蛹虫草的方法，包括在菌株活化培养基中进行菌种活化、在种子液培养基中进行种子液培养、以及在菌丝体发酵培养基中进行发酵罐菌丝体培养的步骤，具体的培养方法同实施例3，其区别仅在于，所述发酵罐菌丝体培养步骤中，不进行相应的光照诱导处理。
对比例8
本对比例所述的发酵培养蛹虫草的方法，包括在菌株活化培养基中进行菌种活化、在种子液培养基中进行种子液培养、以及在菌丝体发酵培养基中进行发酵罐菌丝体培养的步骤，具体的培养方法同实施例3，其区别仅在于，所述菌丝体发酵培养基包括如下质量含量的组分：乳糖0.3％、糖蜜0.2％、豆粕粉0.2％、蛋白胨0.3％，MgSO4 0.02％、CaCl20.003％、KH2PO4 0.03％、K2HPO4 0.03％。
实验例
分别收集上述实施例1-9及对比例1-8中发酵制得的发酵液，进行菌丝体胞内虫草酸含量的检测。
本发明中对各个实施例制得发酵液样品中虫草酸的提取采用现有技术方法即可，例如：将各个实施例制得发酵液离心后收集固体菌丝体，并将制得的蛹虫草菌丝体于65℃烘干1-3h，并研成粉末，备用；取0.1g蛹虫草菌丝体粉末加20mL体积浓度为50％的乙醇溶液，以500W的功率微波处理1min，然后12000r/min离心5min，取上清液，沉淀中加入20mL体积浓度为50％的乙醇溶液，按前述步骤微波处理并离心，合并上清液，制得虫草酸。
本发明下述实验例中对发酵液在虫草酸含量的检测方法可按照常规方法进行，例如以中国专利CN102605005A中记载的检测方法进行，包括如下步骤：
1、虫草酸待测样品的制备
取上述步骤制得的虫草酸，用体积浓度为50％的乙醇溶液定容至50mL；
2、虫草酸活性成分的测定
采用本领域常规的高碘酸钠比色法测定(参照：温鲁，尹起范，唐玉玲等，蛹虫草与有关虫草活性成份检测比较[J].食品科学，2004，25(8)：155-157)：
(1)标准曲线的建立
以甘露醇为基准的标准曲线制作：称取105℃干燥2h并冷却至室温的甘露醇粉末，配成5mg/mL的标准溶液；精确吸取甘露醇标准溶液0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL置试管中，分别加蒸馏水水至1.0mL，然后加1mL、15mM的高碘酸钠试液(3.2g高碘酸钠溶于蒸馏水中，加10.2mL浓盐酸，蒸馏水定容至1L)混匀，室温放置10min，加2mL 0.1wt％鼠李糖，4mL新配制的Nash试液(称取乙酸胺150g，蒸馏水溶解，加入2mL冰醋酸，2mL乙酰丙酮，定容至1L)，摇匀，置于53℃水浴中保温15min。用分光光度计在420nm下测定反应溶液的吸光度值，以甘露醇含量(mg/mL)为横坐标，吸光度值A420为纵坐标，绘制得到标准曲线；
(2)虫草酸活性成分产量的检测
取虫草酸待测样品500μL于试管中，用蒸馏水定容至1.0mL，摇匀；空白对照为1.0mL水。然后加1mL 15mM的高碘酸钠试液(3.2g高碘酸钠溶于蒸馏水中，加10.2mL浓盐酸，蒸馏水定容至1L)混匀，室温放置10min，加2mL 0.1％鼠李糖，4mL新配制的Nash试液(称取乙酸胺150g，蒸馏水溶解，加入2mL冰醋酸，2mL乙酰丙酮，定容至1L)，摇匀，置于53℃水浴中保温15min；用分光光度计在420nm下测定反应溶液的吸光度值，并根据标准曲线计算虫草酸待测样品中虫草酸含量为。
按照上述方法测定上述实施例1-9及对比例1-8中制得的单位体积(1L)发酵液中，菌丝体胞内虫草酸含量(g/L发酵液)，记录于下表1。
表1各样品发酵液虫草酸含量(g/L发酵液)
Figure BDA0001830678610000171
Figure BDA0001830678610000181
从上表数据可见，本发明所述提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，利用萝卜、甘蔗、山楂作为培养原料的营养物质，并添加鸡蛋清，能够有效对蛹虫草发酵过程中虫草酸的进行诱导；并通过添加月桂酰基谷氨酸钠作为诱导剂，有效提高了菌丝体胞内虫草酸的含量；同时在菌丝体发酵过程中辅以特定光暗比的光照诱导，进一步利用物理诱导方式增强了蛹虫草菌丝体中虫草酸的积累，有效提高了菌丝体胞内虫草酸的含量。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (6)

1.一种提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，其特征在于，包括在菌株活化培养基中进行菌种活化、在种子液培养基中进行种子液培养、以及在菌丝体发酵培养基中进行发酵罐菌丝体培养的步骤；
所述菌丝体培养的步骤包括在菌丝体发酵培养过程中进行光照诱导培养的步骤，控制光周期光暗比为L2-6：D18-22，控制光照强度均为1000-3000lx；
所述菌丝体发酵培养基包括如下质量含量的组分：萝卜2-4％、甘蔗2-5％、豆粕粉1-3％、蛋白胨2-4％、乳木果油0.8-2％、山楂1-2％、鸡蛋清1-3％、MgSO4 0.05-0.08％、KH2PO40.04-0.06％，月桂酰基谷氨酸钠0.01-0.02％，自然pH；
所述种子液培养基包括如下质量含量的组分：葡萄糖0.5-1％、酵母提取物0.2-0.4％、萝卜0.8-1.5％、鸡蛋清0.5-1％、MgSO4 0.01-0.03％、KH2PO40.01-0.03％，自然pH；
菌株活化培养基包括如下质量含量的组分：马铃薯5-10％、葡萄糖2-4％、萝卜0.5-1％、鸡蛋清0.3-0.5％、自然pH。
2.根据权利要求1所述提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，其特征在于，所述菌丝体培养的步骤中，控制光照强度以200-300lx/天的幅度增加。
3.根据权利要求1或2所述提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，其特征在于，所述山楂为以山楂为原料，经去核、破碎、加水制浆、加入果胶酶解处理后所得的山楂酶解物。
4.根据权利要求3所述提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，其特征在于，所述菌丝体培养步骤的发酵条件包括：控制发酵温度为20-25℃，搅拌转速150-180rpm，通风量0.8-1.2m3/h。
5.根据权利要求4所述提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，其特征在于，所述种子液培养步骤的条件包括：控制培养温度22-28℃，搅拌转速120-150rpm。
6.根据权利要求5所述提高蛹虫草菌丝体中虫草酸含量的方法，其特征在于，所述菌种活化步骤的条件包括：于20-30℃、转速120-180rpm进行避光培养2-3天。
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