CN108588142B - 利用真菌多糖提高灵芝菌丝体多糖含量的方法及所得灵芝制品 - Google Patents

利用真菌多糖提高灵芝菌丝体多糖含量的方法及所得灵芝制品 Download PDF

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Abstract

本发明涉及利用真菌多糖提高灵芝菌丝体多糖含量的方法及所得灵芝制品，所述方法将灵芝接种到液体培养基中进行发酵培养，其中，所述液体培养基中含有30～110μg/ml真菌多糖，所述真菌多糖提取自红曲霉、黑曲霉、尖孢镰刀菌或白囊耙齿菌中的一种或多种。本发明所述方法能够在灵芝液体发酵过程中通过增加菌丝体生物量和/或菌丝体胞内多糖的含量的方式提高灵芝培养物中多糖的含量，打破现有灵芝液体发酵工艺中多糖含量偏低的技术瓶颈，制成的灵芝制品具有多糖含量高、营养价值好的优点。

Description

利用真菌多糖提高灵芝菌丝体多糖含量的方法及所得灵芝 制品
技术领域
本发明涉及真菌培养领域，具体而言，涉及利用真菌多糖提高灵芝菌丝体多糖含量的方法及所得灵芝制品。
背景技术
灵芝(Ganoderma lucidum)，属于担子菌纲多孔菌科灵芝属的大型真菌。灵芝作为药食两用大型真菌，含有多种生物活性成分，在我国已有2000多年的药用和食用历史，被历代医药家视为滋补强壮、扶正固本的神奇珍品。
经现代科学研究发现，灵芝多糖是灵芝最重要的有效成分之一，具有提高机体免疫力、抑制肿瘤、促进蛋白质和核酸合成、消除体内自由基延缓衰老抗氧化、耐缺氧能力、抗辐射、提高肝脏解毒功能、降血糖、降血脂等生物活性。
目前，灵芝多糖主要来源于经固体或液体培养方法获得的子实体、孢子粉和灵芝发酵菌丝体。其中，固体培养法的缺点是培养周期较长，灵芝多糖得率比较低。而液体发酵方法不受季节影响，且液体菌种的培养周期短，成本低，能快速增殖菌体细胞，活性物质代谢易于控制，能显著提高生产效率等优点，已经成为获取灵芝多糖的重要手段。
现阶段液体发酵技术的优化主要集中在养基组成、温度、pH值等方面，其对提高灵芝多糖含量的作用有限，灵芝多糖产量偏低仍是限制灵芝工业化发酵生产的主要瓶颈。
因此，本领域亟待对现有的灵芝液体培养方法进行改进，以期提高灵芝培养物中多糖含量，增强其营养价值，突破现有的灵芝发酵生产的瓶颈。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供利用真菌多糖提高灵芝菌丝体多糖含量的方法，所述方法能够在灵芝液体发酵过程中通过增加菌丝体生物量和/或菌丝体胞内多糖的含量的方式提高灵芝培养物中多糖的含量。
本发明的第二目的在于提供根据前述方法获得的灵芝制品，所述灵芝制品具有多糖含量高、营养价值高的特点。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种利用真菌多糖提高灵芝菌丝体多糖含量的方法，所述方法将灵芝接种到液体培养基中进行发酵培养，其中，所述液体培养基中含有30～110μg/ml真菌多糖，所述真菌多糖提取自红曲霉、黑曲霉、尖孢镰刀菌或白囊耙齿菌中的一种或多种。
本发明所述方法在液体培养基中加入从自红曲霉、黑曲霉、尖孢镰刀菌或白囊耙齿菌中提取的真菌多糖，尽管具体作用机制尚不明确，本发明实施例所示实验结果表明，前述真菌多糖打破现有灵芝液体发酵技术的瓶颈，能够刺激灵芝菌丝体生长及其代谢，提高菌丝体的生长，最后提高菌丝体生物量和/或胞内多糖含量，从而在整体上提高灵芝多糖的含量。
在一些具体的实施方式中，所述真菌多糖在培养基中的含量为30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml、或110μg/ml。
在一些具体的实施方式中，所述真菌多糖提取自红曲霉或白囊耙齿菌。
在一些具体的实施方式中，所述灵芝包括美国灵芝、黑芝、中华红芝、日本紫芝或鹿角灵芝中的一种或多种。
在一些具体的实施方式中，所述真菌多糖通过以下方式制备获得：
将真菌接种到液体培养基中进行避光震荡培养，培养结束后，收获菌丝体，经过水提醇沉淀法从所得菌丝体中提取真菌多糖。
在一些具体的实施方式中，所述真菌多糖的具体制备方法包括：
(1)将活化后的真菌接种至液体培养基中，在25～30℃、120～180r/min的条件下避光震荡培养5～7天，培养结束后，分离、干燥和粉碎菌丝体；
(2)所述菌丝体干粉加水溶解，在40～60℃、170～220W的功率下，超声波提取7～15min，离心收集上清，残渣加水在90～110℃下浸提30～60min；
(3)将浸提后分离所得上清与前次上清合并，加入乙醇溶液沉淀18～30h后，离心，所得沉淀加水溶解，加入Sevage试剂过夜，离心，所得上清加入乙醇溶液混匀，再次离心，所得沉淀经干燥即为真菌多糖。
在一些具体的实施方式中，所述真菌多糖的具体制备方法包括：
(1)将活化后的真菌接种至液体培养基中，在26℃、160r/min的条件下避光震荡培养6天，培养结束后，分离出菌丝体，于55～65℃烘箱中烘干至恒重，研磨成粉末；
(2)所述菌丝体干粉加水溶解，所述干粉与水的质量比为1:20；在50℃、200W的功率下，超声波提取10min，离心收集上清，残渣加水在100℃下浸提45min，所述残渣与水的质量比为1:20；
(3)将浸提后分离所得上清与前次上清合并，加入3倍体积的95％乙醇溶液沉淀24h后，离心，所得沉淀加水溶解，加入Sevage试剂过夜，离心，所得上清加入5倍体积95％乙醇溶液混匀，离心20min，所得沉淀经真空冷冻机干燥，即得真菌多糖。
在一些具体的实施方式中，接种的灵芝与液体培养基之间的体积比为8～12：100，例如8：100、9：100、10：100、11：100或12:100，优选为10:100。
在一些具体的实施方式中，所述发酵培养的具体方式为：在25～30℃下避光震荡培养5～7天，优选地，在28℃、160r/min的条件下培养6天。
在一些具体的实施方式中，所述方法还包括培养结束后收集菌丝体，干燥并粉碎得到灵芝粉；优选地，所述方法还进一步包括从所述灵芝粉中提取灵芝多糖。
本发明还涉及根据前述方法获得的灵芝制品。本发明所述灵芝制品具有多糖含量高、营养丰富的优点。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所述方法能够在灵芝液体发酵过程中通过增加菌丝体生物量和/或菌丝体胞内多糖的含量的方式提高灵芝培养物中多糖的含量，打破现有灵芝液体发酵工艺中多糖含量偏低的技术瓶颈。
(2)发明所述灵芝制品根据前述方法制备而成，具有多糖含量高、营养丰富的优点。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
实施例1利用真菌多糖提高灵芝菌丝体多糖含量的方法
1、制备真菌多糖
1.1、将红曲霉菌株进行活化后，接种于液体培养基中进行发酵，160r/min，26℃的摇床中避光震荡培养6天。
1.2、培养结束后，分离出菌丝体，于55-65℃烘箱中烘干至恒重，研磨成粉末。
1.3、将丝状菌丝体干粉，以1:20加入蒸馏水，先超声波提取10min后(50℃，200W)，离心20min，收集上清。
1.4、残渣按如上比例加入蒸馏水，于100℃下浸提，合并上清，并加入3倍体积的95％乙醇醇沉24h，离心后弃上清，得到沉淀。
1.5、去离子水溶解后，加入Sevage试剂，过夜。
1.6、离心15min，取上清，加入5倍体积95％乙醇，离心20min。
1.7、所得沉淀用真空冷冻干燥机干燥，获得真菌多糖，于4℃保存。
2、灵芝液体发酵
2.1、将按照上述方法制备的红曲霉多糖加入到液体培养基中，所述红曲霉多糖的终浓度为50μg/ml，所述液体培养基的配方如下所示：2％葡萄糖(m/v)，0.2％蛋白胨(m/v)，0.2％酵母膏(m/v)，0.1％K2HPO4(m/v)，0.05％MgSO4和0.05％KH2PO4(m/v)。
2.2、加入红曲霉多糖后的液体培养基在121℃灭菌锅内灭菌20min。
2.3、待培养基自然冷却后，接种经过活化的美国灵芝，其中接种的美国灵芝与所述液体培养基的体积比为1:10。
2.4接种后，在160r/min，28℃条件下进行摇床暗培养，连续发酵6d。
2.5、发酵结束后，离心分离得到菌丝体，在55～65℃烘箱中烘干至恒重，研磨成粉末。
实施例2利用真菌多糖提高灵芝菌丝体多糖含量的方法
参照实施例1所述方法进行灵芝液体发酵，区别仅在于：步骤1接种的是经活化的黑曲霉菌种，制备的是黑曲霉多糖，所述步骤2加入到液体培养基中的多糖为黑曲霉多糖。
实施例3利用真菌多糖提高灵芝菌丝体多糖含量的方法
参照实施例1所述方法进行灵芝液体发酵，区别仅在于：步骤1接种的是经活化的尖孢镰刀菌菌种，制备的是尖孢镰刀菌多糖，所述步骤2加入到液体培养基中的多糖为尖孢镰刀菌多糖。
实施例4利用真菌多糖提高灵芝菌丝体多糖含量的方法
参照实施例1所述方法进行灵芝液体发酵，区别仅在于：步骤1接种的是经活化的白囊耙齿菌菌种，制备的是白囊耙齿菌多糖，所述步骤2加入到液体培养基中的多糖为白囊耙齿菌多糖。
实施例5利用真菌多糖提高灵芝菌丝体多糖含量的方法
参照实施例1所述方法进行灵芝液体发酵，区别仅在于：步骤2中所述液体培养基中的红曲霉多糖的终浓度为30μg/ml。
实施例6利用真菌多糖提高灵芝菌丝体多糖含量的方法
参照实施例1所述方法进行灵芝液体发酵，区别仅在于：步骤2中所述液体培养基中的红曲霉多糖的终浓度为70μg/ml。
实施例7利用真菌多糖提高灵芝菌丝体多糖含量的方法
参照实施例1所述方法进行灵芝液体发酵，区别仅在于：步骤2中所述液体培养基中的红曲霉多糖的终浓度为90μg/ml。
实施例8利用真菌多糖提高灵芝菌丝体多糖含量的方法
参照实施例1所述方法进行灵芝液体发酵，区别仅在于：步骤2中所述液体培养基中的红曲霉多糖的终浓度为110μg/ml。
对比例1阴性对照
参照实施例1所述方法进行灵芝液体发酵，区别仅在于：所述方法不包括步骤1，所述步骤2中也不加入红曲霉多糖。
对比例2阳性对照
参照实施例1所述方法进行灵芝液体发酵，区别仅在于，步骤1接种的是经活化的顶头孢菌种，制备的是顶头孢多糖，所述步骤2加入到液体培养基中的多糖为顶头孢多糖。
对比例3
参照实施例1所述方法进行灵芝液体发酵，区别仅在于，步骤1接种的是经活化的米曲霉菌种，制备的是米曲霉多糖，所述步骤2加入到液体培养基中的多糖为米曲霉多糖。
对比例4
参照实施例1所述方法进行灵芝液体发酵，区别仅在于，步骤1制备的是啤酒酵母多糖，所述啤酒酵母多糖的具体制备方法为：将啤酒酵母发酵液于4000r/min离心15min，取上清液，浓缩后加入3倍体积的95％乙醇，4℃下放置24h，于4000r/min的转速下离心10min后取沉淀，冷冻干燥即得所述酵母多糖；所述步骤2加入到液体培养基中的多糖为啤酒酵母多糖。实验例1
检测实施例1～8以及对比文件1～4所述方法所得灵芝菌丝体的所述生物量、单位发酵液中灵芝多糖的总含量以及单位重量灵芝菌丝体中多糖含量。
其中，所述生物量的测定方法如下：取单位体积发酵液，经过离心收集菌丝体，干燥之后称重，所得重量即为单位体积发酵液的生物量。
单位发酵液中灵芝多糖的总含量的测定方法如下：取单位体积发酵液，经过离心收集菌丝体，干燥、粉碎，得灵芝粉并称重，之后通过苯酚-硫酸法测定灵芝粉中多糖的总含量。
单位重量灵芝菌丝体中多糖含量的计算方法如下：将前述测得的多糖总量除以前述灵芝粉重量，即得单位重量灵芝菌丝体中多糖含量。
所述生物量、单位发酵液中灵芝多糖的总含量以及单位重量灵芝菌丝体中多糖含量具体检测结果参见表1。
根据表1所示实验结果可知，与阴性对照相比，在灵芝液体发酵过程中，红曲霉能够明显刺激灵芝菌丝体的生长和多糖的积累，其中所述灵芝菌丝体的生物量提高23.3％，单位重量菌丝体中多糖的含量提高78.8％，单位发酵液中总多糖的含量增加了1.2倍，效果甚至明显优于本领域公知能够用于刺激灵芝积累多糖的顶头孢多糖。同时，与对比例1相比，实施例2～3所述黑曲霉多糖、尖孢镰刀菌多糖和白囊耙齿菌多糖也分别通过增加菌丝体生物量和/或菌丝体胞内多糖含量的方式提高单位发酵液中多糖的总含量，其中尖孢镰刀菌多糖的效果也明显优于阳性对照顶头孢多糖。相反，其他的真菌多糖，例如米曲霉多糖和酵母多糖则无该效果。另外，根据实施例1、实施例5～8所示实验数据可知，30～110μg/ml红曲霉多糖均能够有效地刺激灵芝菌丝体的生长和多糖的积累。
表1不同培养方法下灵芝的生物量和多糖含量
Figure BDA0001557633630000091
Figure BDA0001557633630000101
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.利用真菌多糖提高灵芝菌丝体多糖含量的方法，其特征在于，所述方法将灵芝接种到液体培养基中进行发酵培养，其中，所述液体培养基中含有30~110μg/ml提取自红曲霉的真菌多糖，或者，所述液体培养基中含有50μg/ml提取自黑曲霉、尖孢镰刀菌或白囊耙齿菌中的一种的真菌多糖；
所述灵芝为美国灵芝。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述真菌多糖通过以下方式制备获得：将真菌接种到液体培养基中进行避光震荡培养，培养结束后，收获菌丝体，经过水提醇沉淀法从所得菌丝体中提取真菌多糖。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述真菌多糖的具体制备方法包括：
（1）将活化后的真菌接种至液体培养基中，在25~30℃、120~180 r/min的条件下避光震荡培养5~7天，培养结束后，分离、干燥和粉碎菌丝体；
（2）所述菌丝体干粉加水溶解，在40~60℃、170~220W的功率下，超声波提取7~15 min，离心收集上清，残渣加水在90~110℃下浸提30~60 min；
（3）将浸提后分离所得上清与前次上清合并，加入乙醇溶液沉淀18~30h后，离心，所得沉淀加水溶解，加入Sevage试剂过夜，离心，所得上清加入乙醇溶液混匀，再次离心，所得沉淀经干燥即为真菌多糖。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，接种的灵芝与液体培养基之间的体积比为8~12:100。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，接种的灵芝与液体培养基之间的体积比为10:100。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的具体方式为：在25~30℃下避光震荡培养5~7天。
7.据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的具体方式为：在28℃、160r/min的条件下培养6天。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括培养结束后收集菌丝体，干燥并粉碎得到灵芝粉。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还进一步包括从所述灵芝粉中提取灵芝多糖。
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