CN105567570B - 小蝉草菌丝体及胞外多糖液体发酵的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种小蝉草菌丝体及胞外多糖液体发酵的生产方法。以一种小蝉草菌种为出发菌株，通过液体深层发酵，获得菌丝体和胞外多糖。斜面试管菌种于无菌条件下经研磨后，接入液体培养基中制备成液体菌种，再用于液体深层发酵，经过振荡培养或搅拌培养后，获得培养物，利用离心或过滤等方法分离菌丝体和培养液，可获得菌丝体（干重）5‑8 g/L。培养液经超滤或乙醇沉淀后获得胞外多糖，得率为0.5‑1.2g/L。利用以上工艺可进行小蝉草菌丝体和胞外多糖的生产，具有较高的开发价值。

Description

小蝉草菌丝体及胞外多糖液体发酵的生产方法
技术领域
本发明涉及大型真菌液体发酵培养技术领域，小蝉草(Cordyceps sobolifera)菌丝体及胞外多糖的液体发酵生产方法。
背景技术
传统医学与现代科学研究都表明，虫草拥有极高的保健作用和药用价值，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、滋阴壮阳、保肝益肺和提高免疫力等功效。因而越来越受到人们的喜爱，市场需求不断扩大。虫草是一类寄生于昆虫体上的真菌与其寄主昆虫形成的虫菌复合体，分类学上隶属于子囊菌门(Ascomycota )、核菌纲(Pyenomycetes )、麦角菌科(Clavicipitaceae )、虫草属(Cordyceps)。至今为止，世界上已知的虫草有500多种，我国已知种类有130种，如：蛹虫草（C. militaris）、台湾虫草（C. formosana）、古尼虫草（C. gunnii）、凉山虫草（C. liangshanensis）、江西虫草(C. jiangxiensis)、巴恩斯虫草(C. barnesis)虫草等种类，不少种类补发现具有类似于冬虫夏草的化学成分及药理作用，可作为冬虫夏草的替代品加以开发。由于冬虫夏草生长要求严苛，子实体人工培育仍停留在试验阶段，其菌丝体可进行规模化发酵生产，但因周期长等因素，导致产品价格（百令胶囊）居高不下。目前，除了蛹虫草子实体可进行商业性规模化生产外，其他虫草种类多处于研究阶段。
小蝉草（C. sobolifera），又名小蝉花或土蝉花，根据《 证类本草》记载，小蝉草主产广东和福建，同作传统中药“蝉花”入药。由于使用习惯和资源分布等原因，小蝉草一直未被真正关注，其研究多集中在分类鉴定。幸兴球（1975）明确小蝉草和大蝉草（C. cicadae）是分类学上两个不同的种。梁宗琦（2007）在《真菌志•虫草属》中也同意这一观点。此外，该文献中对小蝉草的人工培养进行了初步的描述：在PDA上菌落生长缓慢，23oC培养56天，直径仅有25-30mm。这一培养特性明显区别于大蝉草，大蝉草在PDA上25 oC培养14天，菌落直径达80mm(刘爱英 2012)。因此，根据两者在生物学上，特别是生长速度的差异，可确定目前有关“蝉花”（部分使用C. sobolifera的学名）的报道大部分实际上为大蝉花（C. cicadae），但对小蝉草液体培养的研究未见报道。小蝉草具有与大蝉草相似的药用价值，统作“蝉花”一起收购和销用。发明人自江苏南京紫金山采集分离得一株小蝉草菌种，经形态和分子鉴定，确定其为小蝉草。本发明利用此菌种进行液体培养，获得的菌丝体可用于功能食品等开发。
发明内容
本发明的目的是提供一种小蝉草菌丝体及胞外多糖的液体培养方法。
本发明通过如下步骤来实现：
1、母种培养
将斜面菌种接种在PDA培养基上，20-28oC下暗培养20-30天，菌落直径长至4-6cm。
2、液体菌种的制备
把生长好的斜面菌种即母种（步骤1）用接种针挑出，转移至无菌的研钵中，加入少许无菌水，进行研磨，制备成菌种混悬液，再将混悬液接至一级液体培养基GPBY（葡萄糖10-20g, 蛋白胨1-5g，牛肉浸膏1-4g，酵母浸膏0.5-1g，水1000 mL, pH5.0-8.5），容器装量为20%-60%，20-28oC下，振荡培养，摇床转速为120-180r/min，培养7-10天，至菌丝球充满液体培养基，即可用作液体菌种。
3、液体培养
液体培养可采用两种方式进行，一为振荡培养，另一为搅拌培养。振荡培养方式：将以上液体菌种（步骤2）按接种量5%-15%（V/V）的比例，接种至液体培养基（同菌种液体培养基GPBY），容器装量及其他培养条件同液体菌种，培养4-7天，至菌丝球充满全部培养基。搅拌培养方式：接比例接入适量的液体菌种后，利用磁力搅拌器进行培养，培养室温度设置为20-28oC下，培养时间4-7天。
4、收集小蝉草菌丝体及胞外多糖产品
在菌丝体生物量达到最高峰时，中止培养，采用离心法或过滤法收集菌丝，菌丝（湿重）得率为70-100g/L；在40-60oC下烘干菌丝，菌丝（干重）产率5-8 g/L。离心得的上清液或过滤得的滤液直接加入适量酒精进行多糖沉淀，也可进行浓缩后再进行多糖沉淀。最后利用离心的方法收集多糖，多糖经40-50oC下烘干或冷冻干燥，得率为0.5-1.2g/L。
具体实施方式
下面结合具体实施方法对本发明进一步说明，但本发明不限于以下实施例。
实例一
1、母种培养
将斜面菌种接种在PDA培养基上，25oC下暗培养25天，菌落直径长至4-5 cm。
2、液体菌种的制备
把生长好的斜面菌种即母种用接种针挑出，转移至无菌的研钵中，按每支菌种5mL的比例加入无菌水，进行研磨，制备成菌种混悬液，再将混悬液按1%的体积比接至一级液体培养基GPBY（葡萄糖20g, 蛋白胨5g，牛肉浸膏4g，酵母浸膏1g，水1000 mL, pH6.0-6.5），容器装量为40%，25oC下，振荡培养，摇床转速为120r/min，培养10天，至菌丝球充满液体培养基，即可用作液体菌种。
3、液体培养
液体培养采用振荡培养方式进行。将以上液体菌种按接种量5%（V/V）的比例，接种至液体培养基（同菌种液体培养基GPBY），容器装量为40%，25oC下，振荡培养，摇床转速为130r/min，培养8天，菌丝球充满全部培养基。
4、收集小蝉草菌丝体及胞外多糖产品
在菌丝体生物量达到最高峰时，中止培养，采用离心法收集菌丝体，5000 r/min，离心10min，菌丝体得率为80g/L（湿重），在60oC下烘干菌丝体，菌丝体产率8 g/L（干重）。离心得的上清液进行浓缩，体积浓缩至原来的1/3时，加入4倍体积的酒精，充分搅拌混匀后，放置在4oC下，过夜，最后利用离心的方法收集多糖，多糖经冷冻干燥，得率为0.6g/L。
实例二
1、母种培养
将斜面菌种接种在PDA培养基上，20oC下暗培养30天，菌落直径长至4 cm。
2、液体菌种的制备
把生长好的斜面菌种即母种用接种针挑出，转移至无菌的研钵中，按每支菌种6mL的比例加入无菌水，进行研磨，制备成菌种混悬液，再将混悬液按5%的体积比接至液体种培养基GPBY（葡萄糖15g, 蛋白胨4g，牛肉浸膏4g，酵母浸膏0.5g，水1000 mL, pH6.0），容器装量为30%，20oC下，振荡培养，摇床转速为130r/min，培养8天，至菌丝球充满液体培养基，即可用作液体菌种。
3、液体培养
液体培养采用振荡培养方式进行。将以上液体菌种按接种量10%（V/V）的比例，接种至液体培养基（同菌种液体培养基GPBY），容器装量为60%，25oC下，进行搅拌培养，将培养容器放置在磁力搅拌器上，进行搅拌培养，培养时间4天。
4、收集小蝉草菌丝体及胞外多糖产品
在菌丝体生物量达到最高峰时，中止培养，采用过滤法收集菌丝体，利用布氏漏斗和真空泵进行，菌丝体得率为100g/L（湿重），在50oC下烘干菌丝体，菌丝体产率10 g/L（干重）。滤液进行浓缩，体积浓缩至原来的1/4时，加入3倍体积的酒精，充分搅拌混匀后，放置在4oC下，过夜，最后利用离心的方法收集多糖，多糖经冷冻干燥，得率为0.9g/L。

Claims (2)

1.一种小蝉草 (Cordyceps sobolifera) 菌丝体及胞外多糖的液体培养方法，其特征包括以下的步骤：
第一步：将小蝉草接种在PDA培养基上，20-25℃下进行暗培养，使菌落直径长至4-6cm，得到斜面菌种；
第二步：第一步得到的斜面菌种，在经灭菌的研钵里，加入适量无菌水进行研磨，接种至液体种培养基，20-28℃下振荡培养，培养7-10天，至菌丝球充满全部培养基，得到液体菌种，所述的液体种培养基pH6.0-6.5，每1000 mL培养基中含有葡萄糖10-20 g，蛋白胨1-5g，牛肉浸膏1-4 g，酵母浸膏0.5-1 g；
第三步：将第二步得到的液体菌种接种到液体培养基进行液体培养，所述的液体培养基pH5.0-8.5，每1000 mL培养基中含有葡萄糖10-20 g，蛋白胨1-5 g，牛肉浸膏1-4 g，酵母浸膏0.5-1 g，其余为水；
第四步：第三步的液体培养采用振荡培养或搅拌培养，振荡培养方式：将第二步中的液体菌种按接种量5%-15%（V/V）的比例，接种至液体培养基，100-180 r/min，培养4-7天，至菌丝球充满全部培养基，搅拌培养：按比例接入适量的液体菌种后，利用磁力搅拌器进行培养，培养室温度设置为20-28℃下，培养时间4-7天；
第五步：将第四步中的培养物进行菌丝体和培养液的分离，采用离心法或过滤法收集菌丝，湿菌丝得率为70-100 g/L；在40-60℃下烘干菌丝，干菌丝产率5-8 g/L；离心得的上清液或过滤得的滤液直接加入适量酒精进行多糖沉淀，或进行浓缩后再进行多糖沉淀，最后利用离心的方法收集多糖，多糖经40-50℃下烘干或冷冻干燥，得率为0.5-1.2 g/L。
2.根据权利要求1所述的一种小蝉草 (Cordyceps sobolifera) 菌丝体及胞外多糖的液体培养方法，其特征是第一步所述的暗培养时间是20-30天，第二步所述的振荡培养是120-180 r/min，培养时间是7-10天，第三步所述的液体培养基占容器体积分数是10%-60%，第四步所述的搅拌培养的搅拌速度是120-200 r/min。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI701335B (zh) * 2018-12-25 2020-08-11 葡萄王生技股份有限公司 用於預防及/或改善急性肺損傷的蟬花菌絲體活性物質、其製備方法以及用途
CN111187723B (zh) * 2019-09-30 2022-05-31 贵州科学院 大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102277397A (zh) * 2011-07-26 2011-12-14 广东省微生物研究所 一种广东虫草胞外多糖的生产方法
CN104277099A (zh) * 2014-05-03 2015-01-14 浙江省亚热带作物研究所 一种虫生真菌抗菌肽的制备方法和应用
WO2015092538A1 (en) * 2013-12-18 2015-06-25 Maxgroup Rights Holdings Ltd Use of extract or fraction of ophiocordyceps in manufacture of medicament for treatment of sleeping disorder

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102277397A (zh) * 2011-07-26 2011-12-14 广东省微生物研究所 一种广东虫草胞外多糖的生产方法
WO2015092538A1 (en) * 2013-12-18 2015-06-25 Maxgroup Rights Holdings Ltd Use of extract or fraction of ophiocordyceps in manufacture of medicament for treatment of sleeping disorder
CN104277099A (zh) * 2014-05-03 2015-01-14 浙江省亚热带作物研究所 一种虫生真菌抗菌肽的制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
蝉花的研究进展;李挺 等;《中药材》;20080925;第31卷(第9期);第1443-1448页 *
蝉花菌株的筛选及菌丝体成分分析;文欣 等;《食品与机械》;20130518;第29卷(第3期);第61-65页 *

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