KR101105632B1 - 꽃송이버섯 추출물 및 그것의 항암제로서의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 꽃송이버섯 추출물 및 그것의 항암제로서의 용도를 개시한다.

꽃송이버섯, 항암

Description

꽃송이버섯 추출물 및 그것의 항암제로서의 용도{Extract of Sparassis crispa and Its Use as an Anti-cancer Medicine}

본 발명은 꽃송이버섯 추출물 및 그것의 항암제로서의 용도에 관한 것이다.

암이란 일반적으로 인체 조직을 이루고 있는 세포의 주기에 이상이 생겨 세포가 정상적으로 분화하지 않고 성장을 조절할 수 없이 커진 것 중 악성인 것을 말한다.

암은 개시(initiation), 촉진(promotion) 및 진행(progression)의 세 단계를 거쳐 발생하는데, 환경이나 음식물 속에 포함된 발암 물질에 의해 세포 돌연변이가 일어나고 이러한 세포들이 발암 물질의 계속적인 자극을 받으면서 비정상적인 증식을 계속하여 암 조직을 형성하는 것으로 알려져 있다.

암을 치료하기 위한 항암제의 연구 방법에는 암세포에 대한 직접적인 세포 독성 물질을 탐색하는 방법, 생체의 면역 능력을 조절하는 물질을 탐색하는 방법, 암세포의 전이를 억제하는 물질을 탐색하는 방법, 최근에 주목되고 있는 혈관신생 을 억제하는 물질을 탐색하는 방법 등이 있다.

현재 사용되고 있는 항암제들은 효소 제제나 백신 등의 생물학적 제제, 화학 합성 의약품, 천연물 유래의 의약품 등으로 크게 구분할 수 있는데, 이 중 효소, 백신 등의 생물학적 제제는 실용 단계에 있는 상태는 아니며, 화학 합성 의약품은 암의 종류에 따라 약리작용이 다양하고(Gillman., et al., Maxwell Macmillan. , 18, pp 1202, 1986), 독성에 의한 부작용이 다양하게 나타나기 때문에 암 치료시 문제점으로 지적되고 있다(Chung., et al., J. Wonkwang Medical Sci. , 3 , pp 13-34, 1987).

근래에는 세포 배양 기술이 급격히 발달함에 따라 각종 세포를 배양한 후, 여러 독성 물질을 투여함으로써 이들의 세포 독성에 대한 기전을 세포 수준에서 규명하려는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 항암제의 부작용을 최소화하고 치료 효과를 높이기 위하여 천연물을 이용한 항암제의 개발이 지속적으로 시도되고 있다.

한편, 꽃송이버섯(Sparassis crispas)은 여름과 가을 사이 침엽수의 살아있는 나무 뿌리 근처나 그루터기에 뭉쳐서 양배추처럼 발생하는 담자균류에 속하는 목재 부후균을 말한다.

이 꽃송이버섯은 낙엽송 등 생입목에 심각한 피해를 주어 목재의 압축 강도를 약 75%~40% 정도 현저히 떨어뜨리는 것으로 알려져 왔었다.

그러나 최근 고혈압, 당뇨병, 폐암, 대장암, 전립선암 등에 효능이 있는 β-글루칸을 다량 보유한다고 알려지면서, 그것의 인공 재배 방법에 대한 관심이 고조되고 있다.

대한민국 특허 제449947호, 대한민국 특허 제483333호, 대한민국 특허 제474979호, 대한민국 특허 제816504호 등이 꽃송이버섯 인공 재배 방법에 대한 기술들이다.

본 발명은 본 발명자들이 개발한 인공 재배 방법을 통하여 얻어진 꽃송이버섯의 추출물의 항암 활성 등을 개시한다.

본 발명의 목적은 항암 활성을 가지는 꽃송이버섯 추출물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 꽃송이버섯 추출물을 이용한 항암제 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 기타의 목적이나 구체적인 양태 등은 이하에서 제시될 것이다.

일 측면에 있어서, 본 발명은 항암 활성을 가지는 꽃송이버섯 추출물에 관한 것이다.

본 발명에서 추출 대상으로 사용된 꽃송이버섯은 본 발명자들이 삼나무를 이용하여 인공 재배한 것으로, 아래의 <실험예 2>에서 확인되듯이 그 유전자적 특성이 한라산 자생 꽃송이버섯이나 참나무를 이용하여 인공 재배한 꽃송이버섯((주)하 나바이오텍, 대한민국 경기도)과는 다른 꽃송이버섯이다. 더 구체적으로 핵 리보솜 DNA(nrDNA)의 ITS(internal transcribed spacer) 부위의 GC 함량이 한라산 자생 꽃송이버섯이나 참나무를 이용하여 재배한 꽃송이버섯의 경우 모두 51.6%로 일치하나, 본 발명에서 추출 대상으로 사용된 꽃송이버섯은 그 GC 함량이 50.6%로 상기 비교 대상 꽃송이버섯들과는 달랐다.

이처럼 본 발명에서 추출 대상으로 사용한 꽃송이버섯은 그 유전자적 특성이 자생 꽃송이버섯이나 다른 인공 재배한 꽃송이버섯과는 근본적으로 다른 것으로, 그 구체적인 재배 방법은 아래의 참조예에서 확인할 수 있다.

본 명세서에서 "꽃송이버섯"은 살균 처리된 삼나무(Cryptomeria japonica) 단목에 꽃송이버섯의 종균을 접종하고 재배한 것으로서 그것의 핵 리보솜 DNA의 ITS 부위의 GC 함량이 50.6%인 꽃송이버섯으로 정의된다. 바람직하게는 ITS 부위의 염기서열이 서열번호 1의 서열을 가지는 꽃송이버섯으로 정의된다.

또 본 명세서에서, "항암 활성"은 혈액암, 대장암 및/또는 간암에 대한 개선 활성을 의미한다. 구체적으로는 혈액암 세포주인 HL-60, 대장암 세포주인 HT-29 및/또는 간암 세포주인 HepG-2의 증식 억제 활성으로서 정의될 수 있다.

또 본 명세서에서, "개선"이란 암, 특히 혈액암, 대장암 및/또는 간암이 가지는 병리적 증상의 개선, 치료 및 이러한 병리적 증상의 발병 억제/지연을 포함하는 의미이다.

또 본 명세서에서, "추출물"은 추출 대상으로 상기 정의된 꽃송이버섯을 사용하고 추출 용매로서 물, 증류수, 에탄올을 포함한 탄소수 5 이하의 알칸올, n-헥 산을 포함한 탄소수 5 내지 8의 n-알칸, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 것을 의미한다. 이들 추출 용매는 후술하겠지만, 어떠한 항암 활성을 가지는 추출물을 의도하느냐에 따라 달라질 수 있다.

여기서 추출 방법은 열수, 가온, 냉침, 초음파 방사, 교반, 이들을 혼합한 방법 등의 임의의 방법이 사용될 수 있다. 이들 추출 방법도 어떠한 항암 활성을 가지는 추출물을 의도하느냐에 따라 달라질 수 있으며, 당업자는 그의 통상의 능력 범위 내에서 각 항암 활성에 따른 적합한 추출 방법을 선택할 수 있다.

한편, 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되듯이, 본 발명의 80% 에탄올 추출물, 추출 용매로서 증류수를 사용한 상온 추출물, 그리고 40℃, 60℃ 및 80℃ 열수 추출물은 대장암 세포주인 HT-29 및 간암 세포주 HepG-2에 대해서 대체로 낮은 세포 증식 억제 활성을 보이고 있지만, n-헥산 분획물, 메틸렌클로라이드 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물의 경우는 상대적으로 높은 세포 증식 억제 활성을 보이고 있다.

혈액암 세포주인 HL-60의 경우는 어떠한 추출 용매를 사용하였든 모든 추출물이 그 증식 억제 활성을 보여주고 있다.

전술한 바를 종합할 때, 본 발명의 꽃송이 추출물은 구체적으로는 두 가지의 양태로 정의될 수 있다.

제1의 양태는 (a) 추출 대상으로서, 살균 처리된 삼나무에 꽃송이버섯의 종균을 접종하여 재배한 것으로 그것의 핵 리보솜 DNA의 ITS 부위의 GC 함량이 50.6%인 꽃송이버섯을 사용하고, (b) 추출 용매는 비극성이거나 극성이 약한 용매, 구체 적으로 n-헥산을 포함한 탄소수 5 내지 8의 n-알칸, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하며, (c) 활성으로서는 대장암 및/또는 간암 억제 활성, 구체적으로 대장암 세포주인 HT-29 및/또는 간암 세포주 HepG-2의 증식 억제 활성을 가지는 것으로 정의되는 경우이며,

제2의 양태는 a) 추출 대상으로서, 살균 처리된 삼나무에 꽃송이버섯의 종균을 접종하여 재배한 것으로 그것의 핵 리보솜 DNA의 ITS 부위의 GC 함량이 50.6%인 꽃송이버섯을 사용하고, (b) 추출 용매는 임의의 추출 용매 구체적으로는 극성·비극성 여부를 불문한 추출 용매, 더 구체적으로는 물, 증류수, 에탄올 및 부탄올을 포함한 탄소수 5 이하의 알칸올, n-헥산을 포함한 탄소수 5 내지 8의 n-알칸, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 또는 이들의 혼합 용매를 사용하며, (c) 활성으로서는 혈액암 억제 활성, 구체적으로 혈액암 세포주 HL-60의 증식 억제 활성을 가지는 것으로 정의되는 경우이다.

한편 아래의 실시예 및 실험예는 꽃송이버섯 추출물이 대장암, 간암 및 혈액암을 불문하고 비극성 방향으로 분획 될수록 더 활성이 높음을 보여준다.

그러므로 본 발명의 꽃송이버섯 추출물이 상기 어떠한 양태로 정의되든 비극성 방향으로 더 분획되는 것이 바람직하다.

비극성 방향으로 더 분획된 분획물의 예로서는 꽃송이버섯을 극성 용매 예컨대 물이나 에탄올로 추출한 후에 그 추출물을 비극성 용매 예컨대 n-헥산과 혼합·분획하여 얻은 n-헥산 분획물이나, 그 n-헥산 분획물을 극성 용매 예컨대 물이나 에탄올과 다시 혼합·분획하여 얻은 제2의 n-헥산 분획물이 예시될 수 있다. 또 꽃 송이버섯을 비극성 용매 예컨대 n-헥산이나 메틸렌클로라이드로 추출한 후에 그 추출물을 극성 용매 예컨대 물이나 에탄올로 혼합·분획하여 얻은 n-헥산이나 메틸렌클로라이드 분획물이나, 그 n-헥산이나 메틸렌클로라이드 분획물을 극성 용매 예컨대 물이나 에탄올과 다시 혼합·분획하여 얻은 제2의 n-헥산이나 메틸렌클로라이드 분획물도 비극성 방향으로 더 분획된 분획물의 예로서 예시될 수 있다.

그러므로 본 명세서에서 "비극성의 방향으로 더 분획된 분획물"의 의미는 극성이 강한 용매와 약한 용매를 혼합하여 분획하거나 극성 용매와 비극성 용매를 혼합하여 분획하였을 때 극성이 약하거나 비극성 용매의 분획물을 의미한다고 할 수 있다. 당업자는 그의 통상의 능력 범위 내에서 극성의 강약, 극성 용매와 비극성 용매를 확인·판별할 수 있다. 본 명세서에서 극성 용매 및 비극성 용매의 의미 그리고 극성이 강한 용매 및 극성이 약한 용매의 의미는 당업계의 통상적인 의미를 따른다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 앞서 정의된 바의 꽃송이버섯을 추출 대상으로 하고 비극성이거나 극성이 약한 추출 용매 구체적으로는 n-헥산을 포함한 탄소수 5 내지 8의 n-알칸, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올을 포함한 탄소수 4 또는 5의 n-알칸올을 사용하여 얻어진 꽃송이버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장암 개선제 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명의 대장암 개선제 조성물은 그 유효성분이 바람직하게는 비극성 방향 으로 더 분획된 분획물인 경우가 바람직하다. 그 이유는 전술한 바와 같다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 앞서 정의된 바의 꽃송이버섯을 추출 대상으로 하고 비극성이거나 극성이 약한 추출 용매 구체적으로는 n-헥산을 포함한 탄소수 5 내지 8의 n-알칸, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올을 포함한 탄소수 4 또는 5의 알칸올을 사용하여 얻어진 꽃송이버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암 개선제 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 간암 개선제 조성물도 그 유효성분이 바람직하게는 비극성 방향으로 더 분획된 분획물인 경우가 바람직하다. 그 이유도 전술한 바와 같다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 앞서 정의된 바의 꽃송이버섯을 추출 대상으로 하고, 물, 증류수, 에탄올 및 부탄올을 포함한 탄소수 5 이하의 n-알칸올, n-헥산을 포함한 탄소수 5 내지 8의 n-알칸, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 또는 이들의 혼합 용매 등 임의의 추출 용매를 사용하여 얻어진 꽃송이버섯 추출물을 유효성분으로 하는 혈액암 개선제 조성물에 관한 것이다.

여기서도 상기 추출물은 비극성 방향으로 분획된 분획물인 경우가 바람직하다. 그 이유도 앞서 설명한 바와 같다.

한편 본 발명의 항암제 조성물(즉 대장암 개선제 조성물, 간암 개선제 조성물 또는 혈액암 개선제 조성물을 말함; 이하 같음)은 그 유효성분인 상기 정의된 꽃송이버섯 추출물을 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 의도하는 항암 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게서, 대장암, 간암 또는 혈액암의 개선, 치료, 또는 이러한 병리적 증상의 발병 억제/지연을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 항암제 조성물은 그 유효성분인 앞서 정의된 바의 꽃송이버섯 추출물을 포함하는 이외에, 항암 활성을 상승·보강할 수 있도록 항암 활성이 있다고 알려진 공지의 화합물, 천연 추출물 등을 포함할 수 있다.

그러한 화합물, 천연 추출물로서 예컨대 대장암 개선 활성이 있는 이중 치환 피라졸로벤조디아제핀(WO 2006/040036), 대한민국 특허 제844366호가 개시하는 해조류 추출물 등이나, 간암 개선 활성이 있는 도세탁셀(WO 2001/15675), 알릴티오피리다진 유도체(대한민국 특허 제446103호) 등을 들 수 있다.

본 발명의 항암제 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.

본 발명의 항암제 조성물은 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효물질인 꽃송이버섯 추출물을 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 경구용 제형(정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등), 비경구형 제형(멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액), 국소형 제형(용액, 크림, 연고, 겔, 로션, 패치) 등으로 제조될 수 있다.

상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으 면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성(충분히 낮은 독성)을 지니지 않는다는 의미이다.

약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등) 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 정제화제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.

부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 본 발명의 약제학적 조성물이 수성 현탁제로 제조될 경우에 적합한 부형제로서는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있다. 주사액으로 제조되는 경우 적합한 부형제로서는 링거액, 등장 염화나트륨 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 경우에 따라서는 국소적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 껌류, 비타민 복합제, 건강 보조식품, 특수 영양 보충용 식품, 기능성 음료 등으로 제조될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 유효성분인 꽃송이버섯 추출물이 포함되는 것 이외에, 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 감미제, 사과, 레몬, 감귤 등의 과일이나 녹차잎, 둥굴레, 대잎 등의 차류에서 얻어진 풍미제, 카테킨, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤 등의 생리활성 성분, 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물 등의 미네랄 등이 또한 첨가될 수 있으며, 여타의 식품 첨가물이 첨가되어도 무방하다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 항암 활성을 가지는 꽃송이버섯 추출물과 그 추출물의 항암제로서의 용도를 제공할 수 있다.

이하 본 발명은 참조예, 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

< 참조예 > 삼나무를 이용한 꽃송이버섯 재배

먼저 직경이 15 내지 20cm 정도의 삼나무 원목을 채취하여 15cm 정도로 절단하였다. 절단한 원목(이하 "단목")을 생이스트 5% 수용액에 24시간 침수시킨 후 꺼내어 부직포가 깔린 비닐 봉지에 넣고 밀봉하였다. 그 다음 살균기에서 80~100℃의 온도로 8시간 살균시킨 후, 미생물에 의한 오염을 방지할 수 있는 클린 시설이 설치된 냉각기로 옮겨 24 내지 30시간 자연 냉각시켰다. 냉각 후 클린 부스 내에서 꽃송이버섯의 액체 종균을 절단한 원목 1개당 30㎖로 접종시켰다. 접종 직후 비닐 봉지에 넣어 밀봉하고 15일 동안은 20℃ 내외의 온도에서 배양하고, 그 후 70일간은 25℃에서 배양하였다. 배양 완료된 원목을 봉지에서 꺼내어 상판 위에 미리 비닐을 깔고 그 위에 스폰치(두께1cm) 판을 편 다음 단목을 15cm간격으로 배열한 다음 2일간은 1일 2-3회 관수하여 배양 중에 건조된 표면에 수분을 보충하였다. 발이실내온도는 20℃ 내외로 유지하고 실내습도는 95% 내외로 높게 유지하였다. 버섯 발이 후 실내온도 및 습도를 계속 같게 유지하고 광은 형광등을 설치 밝게 유지하였으며, 실내 공기 유통을 위해 휀을 2대 설치하고 환기는 2-3회 1시간씩 실시하였다. <도 1>의 삼나무 원목을 이용하여 재배된 꽃송이버섯 사진이다.

<실시예> 삼나무 원목 재배 꽃송이버섯의 추출물 제조

<실시예 1> 열수 추출에 의한 추출물의 제조

열수 추출은 진탕항온기를 사용하였으며, 시료(<참조예>의 꽃송이버섯; 이하 같음) 무게의 20배에 해당하는 증류수로 추출하였다. 온도는 40℃로 조절하여 24시간 동안 추출한 다음 와트만 종이여과지(Whatman No.2)로 여과하여 그 여액을 감압·농축시킨 후 실험하기 전까지 -20℃에서 보관하였다.

<실시예 2> 열수 추 출에 의한 추출물의 제조

상기 <실시예 1>과 동일한 공정으로 추출하되, 추출 온도를 60℃로 추출하였다.

<실시예 3> 열수 추출에 의한 추출물의 제조

상기 <실시예 1>과 동일한 공정으로 추출하되, 추출 온도를 80℃로 추출하였다.

<실시예 4> 상온 추출에 의한 추출물의 제조

시료 무게의 20배에 해당하는 증류수를 넣고 교반하면서 24시간 동안 추출한 후 와트만 종이여과지(Whatman No.2)로 여과하여 그 여액을 감압·농축시킨 후 실험하기 전까지 -20℃에서 보관하였다.

<실시예 5> 상온 추출에 의한 추출물의 제조

상기 <실시예 4>와 동일한 공정으로 추출하되, 추출 용매를 80% 에탄올로 하여 추출하였다.

<실시예 6> 용매 분획에 의한 추출물의 제조

용매 분획 추출물의 제조를 위해서, 먼저 삼나무 원목 재배 꽃송이버섯 시료438g에 100% 에탄올을 첨가하여 침출시켰으며, 침출 후 와트만 종이여과지(Whatman No.2)로 여과하여 그 여액을 감압·농축시켜 분말화하였다.

그 분말 시료를 1L의 증류수에 현탁시킨 후 동량의 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 및 부탄올 순으로 교반 후의 정치 시간을 24시간으로 하여 용매 분획을 실시하였으며, 분획물들은 감압·농축시킨 후 실험하기 전까지 -20℃에서 보관하였다.

< 실험예 > 꽃송이버섯 추출물의 항암 활성 평가 및 삼나무 재배 꽃송이버섯의 균주 구분을 위한 유전자 분석

<실험예 1> 삼나무 원목재배 꽃송이버섯의 항암 활성 평가

본 실험을 위하여 급성 전골수성 백혈병 환자에서 유래한 혈액암 세포주 HL-60, 대장암 세포주인 HT-29, 및 간암 세포주 HepG-2를 한국세포주은행(KCLB)으로부터 분양받아 100 units/mL의 penicillin-streptomycin(GIBCO, Grand Island, NY, USA)과 10%의 fetal bovine serum(FBS; GIBCO, Grand Island, NY, USA)이 함유된 RPMI 1640 배지(GIBCO, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 계대 배양은 3~4일에 한 번씩 시행하여 세포를 배양하였다.

상기의 각 세포(2.0～5.0×10⁴/mL)를 96 well plate의 well에 넣고, 상기 각 실시예의 추출물의 시료를 200㎍/㎖의 농도가 되로록 첨가하여 이를 3일간 배양한 다음, 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT; Sigma, St. Louis, MO, USA) 100㎍을 첨가하고 4시간 동안 더 배양하였다. 배양한 Plate를 1,000rpm에서 10분간 원심분리하고 조심스럽게 배지를 제거한 다음, dimethylsulfoxide(DMSO; Sigma, St. Louis, MO, USA) 150㎕를 가하여 MTT 환원에 의해 생성된 formazan 침전물을 용해시킨 후 microplate reader(Bio-TEK instrumenis. Inc., Winooski Vermont, WI, USA)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하여 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군(시료를 첨가하지 아니한 경우)의 흡광도 값과 비교하여 세포 증식 억제 정도를 조사하였다.

그 결과를 <도 2>에 나타내었다.

<도 2>를 참조하여 보면 혈액암 세포주 HL-60에 대해서는 모든 추출물이 활성을 나타내었으나, 대장암 세포주 HT-29 및 간암 세포주 HepG2에 대해서는 대체로 비극성이거나 극성이 약한 추출물에 한해서 활성을 나타내었다. 도 2에서 A는 <실시예 4>의 추출물, B는 <실시예 1>의 추출물, C는 <실시예 2>의 추출물, D는 <실시예 3>의 추출물, E는 <실시예 5>의 추출물, F 내지 I는 <실시예 6>의 각 분획물이다.

상기 실험은 3번 반복 실험 결과를 MEAN±SD로 나타낸 것이다.

<실험예 2> 삼나무 재배 꽃송이버섯의 균주 구분을 위한 유전자 분석

본 실험에서는 상기 참고예에서 얻어진 삼나무 재배 꽃송이버섯의 균주 구분을 위하여, 제주도 한라산에 자생하고 있는 꽃송이버섯(이하 "자생 꽃송이버섯"), 일본에서 참나무 재배 송이버섯(이하 "참나무 꽃송이버섯")((주) 하나바이오텍, 대한민국 경기도)과의 핵 리보솜 DNA(nrDNA, nuclear ribosomeal DNA) ITS(internal transcribed spacer) 부위의 염기서열을 분석·비교하였다.

<1> 실험 방법

<1-1> Genomic DNA 추출

꽃송이버섯의 genomic DNA는 꽃송이버섯 조직에서 10mg을 적출하여 Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA)을 사용하여 제조사의 방법에 따라 추출하였다. 분리된 DNA는 1.0% agarose gel 상에서 100V, 20분간 전기영동을 실시하여 단일밴드로 나타나는 것을 확인한 후 분리된 DNA를 UV/VIS spectrophotometer로 260 nm와 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량을 확인하여 순도 1.8 이상인 시료만을 유전자 증폭을 위한 주형(template) DNA로 사용하였다.

<1-2> 유전자 탐색용 시발체 설계 및 PCR

실험 대상 세 가지 꽃송이버섯의 핵 리보솜 DNA ITS (internal transcribed spacer) 부위를 분석하기 위한 시발체(primer)는 White 등(1990)에 의해 고안되어 버섯류의 종 판별 및 계통유전학적 분석에 많이 이용되었던 범용 시발체(universal primer)인 ITS 1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3': 서열번호 2)과 ITS 4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3': 서열번호 3) 시발체를 사용하였다. 증폭을 위한 중합연쇄반응에서 반응혼합액은 template DNA 10ng, primer 각각 20pM, dNTP (Promega, USA) 200μM, MgCl₂ 1.8mM, 10× reaction buffer (10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 0.1% Triton X-100) 2.5μl, Taq DNA polymerase (Promega, USA) 2.5units에 멸균된 3차 증류수를 첨가하여 총 반응량을 25μl로 하였다. PCR 반응은 MyCycler Thermal Cycler (Bio-Rad, USA)를 사용하여 94℃에서 5분간 예열한 후, 94℃에서 20초, 57℃ 에서 20초, 72℃에서 1분으로 이어지는 cycle을 30회 반복한 다음, 72℃에서 10 분간 보관하여 목적 유전자를 증폭하였다.

<1-3> Cloning 과 Plasmid DNA 분리

PCR에 의해 증폭된 각각의 유전자 단편은 1% agarose gel 상에서 100V, 30분간 전기영동하여 확인하고, 확인된 PCR-products는 TOPO TA Cloning kit (Invitrogen, USA)를 사용하여 cloning 하였다. Ligation은 PCR product 0.5μl (50ng), TOPO vector 0.4μl, salt solution 0.4μl에 멸균수를 첨가하여 총 반응액이 2μl가 되게 한 후 상온에서 10분 동안 반응시켰다. 선별한 white colony를 ampicillin이 들어있는 LB-broth (50μg/ml) 배지에서 8시간 동안 배양한 후 Minipreps DNA Purification System (Promega, USA)을 사용하여 plasmid DNA를 분리하였으며, 분리된 Plasmid DNA는 1% agarose gel에서 전기영동으로 확인하였다.

<1-4> 염기서열 분석

염기서열 분석은 PRISMTM Ready Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer, ABI, USA)을 사용하여 실시하였으며, 모든 처리과정은 제조사의 manual에 따라 수행하였다. Cyclic sequencing을 위하여 Cy5가 표지된 vector inner primer인 M13 forward primer(5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3': 서열번호 4)와 M13 reverse primer(5'-AAC AGC TGT GAC CAT G-3': 서열번호 5)를 사용하여 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 40초를 30회 실시한 다음 가닥 신장을 위하여 72℃에서 10분간을 더 유지하며 stop solution을 첨가하기 전까지 4℃에 보관한다. 전기영동은 7 M urea, 6% acrylamide gel 상에서, buffer는 0.6×TBE buffer를 사용하며, ABI 310 Prism Autosequencer (Perkin-Elmer, USA)를 사용하여 1000V에서 700분간 실시 하였다.

<1-5> 유전자 염기서열 결정 및 분석

삼나무 재배 꽃송이버섯의 유전자 분석의 신뢰도를 높이기 위해 각각의 PCR-product에서 3개의 클론을 이용하여 염기서열 분석하였다. 유전자 단편의 염기서열 결정과 분석은 기존에 발표한 염기서열과 비교하여 결정하였으며, 각각의 유전자의 염기서열들은 Clustal W program(Thompson 등, 1994)을 이용하여 염기서열의 상동성을 비교하였다.

<2> 실험 결과

<2-1> ITS 증폭

실험 대상 세 가지 꽃송이버섯의 nrDNA의 ITS 부위를 증폭한 결과는 <도 3>과 같으며, 실험 대상 세 가지 꽃송이버섯 모두 동일한 크기의 증폭 산물이 확인되었다.

<2-2> 염기서열 분석

실험 대상 세 가지 꽃송이버섯의 nrDNA의 ITS 부위의 염기서열의 상동성을 비교한 결과를 <도 4>에 나타내었으며, 삼나무를 이용하여 재배한 꽃송이버섯의 nrDNA의 ITS 부위의 염기서열을 서열번호 1에 나타내었다.

그리고 아래의 <표 1>에는 실험 대상 세 가지 꽃송이버섯의 nrDNA의 ITS 부위의 길이나 GC 함량을 나타내었다.

[표 1]

nrDNA의 ITS 부위의 길이나 GC 함량

분류	ITS
	Length(bp)	GC content(%)
자생 꽃송이버섯	643	51.6
참나무 꽃송이버섯	643	51.6
삼나무 꽃송이버섯	644	50.6

상기 <표 1>에서 알 수 있듯이, 자생 꽃송이버섯과 참나무 꽃송이버섯의 nrDNA의 ITS 부위의 염기서열은 각각 길이가 643 bp, GC 함량은 51.6%를 보이며 두 균주간 100% 일치함을 보였다. 그러나, 삼나무에서 재배된 꽃송이버섯은 ITS 부위의 길이가 644bp로서, 타 균주에 비해 1 bp가 더 큰 것으로 나타났으며, GC 함량 또한 50.6%로서 다소 낮게 나타남을 확인하였다.

도 1은 삼나무 원목을 이용하여 재배된 본 발명의 추출 대상인 꽃송이버섯 사진이다.

도 2는 본 발명의 꽃송이버섯 추출물의 혈액암 세포주 HL-60, 대장암 세포주인 HT-29 및 간암 세포주 HepG-2에 대한 증식 억제 효과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 3은 한라산 자생 꽃송이버섯(lane 1), 참나무를 이용하여 재배한 꽃송이버섯(lane 2) 및 삼나무 원목을 이용하여 재배된 본 발명의 추출 대상인 꽃송이버섯(lane 3)의 nrDNA의 ITS 부위를 증폭한 결과의 전기영동 사진이다.

도 4는 한라산 자생 꽃송이버섯(WSB-01), 참나무를 이용하여 재배한 꽃송이버섯(WSB-02) 및 삼나무 원목을 이용하여 재배된 본 발명의 추출 대상인 꽃송이버섯(WSB-03) nrDNA의 ITS 부위의 염기서열의 상동성을 비교한 결과이다. 도 4에서 점(dot)은 한라산 자생 꽃송이버섯의 염기서열과 같음을 의미한다.

<110> Jeju Hi-tech Industry Development Institute <120> Extract of Sparassis crispa and Its Use as Anti-cancer Medicine <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 644 <212> DNA <213> Sparassis crispa <400> 1 tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta tcgagttcag aagcgaggtt gtagctggcc 60 ttctcggagg catcgtgcac gcctcgcccg tcccatatca tacctgtgaa ctttttggta 120 ggcgggtttg tgtcggcctc gaaaggggtc gaccggccct ccggccgtct ttatatacac 180 accatacgag tctttagaat gtttgtgcgt ctcgacgcat cttatatata actttcggcg 240 acggatctct tggctctcgc atcgatgaag aacgcagcga aacgcgataa gtaatgtgaa 300 ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacct tgcgctcctc ggtattccga 360 ggagcatgcc tgtttgagtg tcatgaaatt atcaacccct tctcctttat tggtggtggg 420 gcttggactt ggaggctttg cgggctttta aatgagtcgg ctcctctcaa atgcattagc 480 tcgaaccctt gcggatcggc catcggtgtg atataatgtc gacgtcgtgg tcgtgagcgt 540 cggatcggct tctaatggtc ccctttcgga gacggaattt gaacttgtga cctcaaatca 600 ggtaggacta cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg agga 644 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS-1 primer <400> 2 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS-4 primer <400> 3 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 forward primer <400> 4 gtaaaacgac ggccagt 17 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 reverse primer <400> 5 aacagctgtg accatg 16

Claims (17)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 추출 대상인 꽃송이버섯을 추출 용매인 100% 에탄올에 침지시켜 얻어진 추출액에서 추출 용매를 제거한 분말상의 꽃송이버섯 추출물을 증류수에 현탁시킨 후 동량의 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 부탄올을 첨가하여 순차적으로 분획하였을 때 얻어지는 분획물 중, n-헥산 분획물 또는 메틸렌클로라이드 분획물을 유효성분으로 포함하되,

   상기 추출 대상인 꽃송이버섯은 살균 처리된 삼나무에 꽃송이버섯의 종균을 접종하여 재배한 것으로 핵 리보솜 DNA의 ITS 부위의 GC 함량이 50.6%이고 그것의 염기서열이 서열번호 1의 서열을 가진 꽃송이버섯인 것을 특징으로 하는 대장암 개선제 조성물.
10. 제9항에 있어서,

    상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 대장암 개선제 조성물.
11. 제9항에 있어서,

    상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 대장암 개선제 조성물.
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 추출 대상인 꽃송이버섯을 추출 용매인 100% 에탄올에 침지시켜 얻어진 추출액에서 추출 용매를 제거한 분말상의 꽃송이버섯 추출물을 증류수에 현탁시킨 후 동량의 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 부탄올을 첨가하여 순차적으로 분획하여 얻어진, n-헥산 분획물, 메틸렌클로라이드 분획물, 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물을 유효성분으로 포함하되,

    상기 추출 대상인 꽃송이버섯은 살균 처리된 삼나무에 꽃송이버섯의 종균을 접종하여 재배한 것으로 핵 리보솜 DNA의 ITS 부위의 GC 함량이 50.6%이고 그것의 염기서열이 서열번호 1의 서열을 가진 꽃송이버섯인 것을 특징으로 하는 혈액암 개선제 조성물.
16. 제15항에 있어서,

    상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 혈액암 개선제 조성 물.
17. 제15항에 있어서,

    상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 혈액암 개선제 조성물.

Images