KR101138464B1

KR101138464B1 - 이노노투스 오블리쿠스 ｗｉ０６２８ 균주, 그의 항당뇨활성 추출물 및 추출방법

Info

Publication number: KR101138464B1
Application number: KR1020040052193A
Authority: KR
Inventors: 이계관; 김종래; 권호균; 정은미; 이동수; 정선오
Original assignee: 환인제약 주식회사
Priority date: 2004-07-06
Filing date: 2004-07-06
Publication date: 2012-04-25
Also published as: KR20060003982A

Abstract

본 발명은 항당뇨 활성 물질을 생산하는 이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (Inonotus obliquus KCTC 10665BP) 균주에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이 균주의 배양물로부터 분리되는 약리학적 활성 추출물 및 그 추출방법에 관한 것이다.

상세하게는, 본 발명은 더욱 강력한 항당뇨 활성을 가지는 추출물을 다량으로 생성하는 신규 이노노투스 오블리쿠스 균주 WI0628 (KCTC 10665BP), 이 균주의 배양물로부터 분리된 추출물로서 그 구성 단당류의 성분이 글루코즈, 만노즈, 갈락토즈 및 라이보즈를 포함하는 것인 항당뇨 활성 물질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이노노투스 오블리쿠스의 균사체를 인공배양하고 이 배양물에 압력을 가하여 110~130℃ 에서 1~24시간 동안 순환펌프를 이용하여 추출액을 순환시키면서 추출하는 방법에 관한 것이다. 또한, 추가로 상기 추출물을 한외여과하여 저분자량의 물질을 제거하여 얻은 것인 항당뇨 활성의 추출방법에 관한 것이다.

이노노투스 오블리쿠스, 항당뇨, ITS

Description

이노노투스 오블리쿠스 ＷＩ０６２８ 균주, 그의 항당뇨 활성 추출물 및 추출방법 {Inonotus obliqqus WI0628, its extract with antidiabetic activity and its extraction method}

도 1은 이노노투스속 균주 동정을 위해 리보솜 DNA의 ITS 부위 염기서열 분석과 증폭을 위해 사용된 프라이머 위치와 리보솜 DNA 구조를 나타낸 그림이다.

도 2는 신규 이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (KCTC 10665BP) 균주의 배양, 추출 및 정제 과정을 포함하는 다당류 물질의 제조공정도이다.

본 발명은 항당뇨작용의 약리학적 활성이 우수한 물질을 다량으로 생성하는 신규한 균주, 이 균주의 배양물로부터 분리되는 약리학적 활성 추출물 및 그 추출방법에 관한 것이다.

당뇨병은 혈당 조절 호르몬인 인슐린이 제대로 만들어지지 않거나 작용을 하지 못하여 발병하는 질환으로, 음식물의 대사에 의해 생성된 포도당이 세포 내로 이동되지 못하고 그대로 혈액 속에 남아 고혈당 상태를 초래하고, 이로 인해 다음( 多飮), 다뇨(多尿), 다식(多食)의 3대 증상이 나타나며, 다양한 합병증이 수반된다. 그러므로 혈액 내의 포도당 함량을 낮추어 주는 것은 당뇨병에서 당뇨 합병증으로 인한 여러 가지 질환을 예방하는데 중요한 요소이다. 당뇨병은 대표적인 성인성 대사질환으로 세계인구의 5%가 걸려 있으며, 그로 인한 인명적, 경제적 손실은 실로 막대하다. 당뇨병 치료제로는 인슐린이 가장 이상적이고 가장 효능이 높은 것으로 알려져 있으나 그 지속시간이 짧고 경구적으로는 작용을 나타내지 못하므로 주사제로 사용하여야 하는 단점이 있다. 현재까지 경구용 혈당강하제로는 설폰요산계(sulphonylurea) 및 비구아니드(biguanide)계 약물이 있다. 설폰요산계 약물은 췌장의 베타세포에서 만들어진 인슐린의 분비를 촉진시켜 혈당강하작용을 나타내나, 간독성 및 저혈당을 야기한다. 또한, 비구아니드계 약물은 오심, 식욕부진, 설사 등의 부작용을 나타낸다. 따라서 이러한 부작용을 감소시킬 수 있는 다른 기전의 경구용 당뇨 치료제 개발이 요구되고 있다.

차가버섯은 학명이 Inonotus obliquus 혹은 Fuscoporia obliquus 두가지로 불리고 있으며, 소나무비늘버섯과 (Hymenochaetaceae)의 시루뻔버섯속 (Inonotus)에 속하는 다년생의 담자균 버섯으로, 자연상태에서 시베리아, 훗카이도 등의 북위 45도 이상의 북반구에 분포하며, 일반적으로 자작나무, 오리나무, 마가목 등의 줄기나 그루터기에 자생하는 버섯이다. 격막을 가지고 있으며 핵이동을 위한 꺽쇠연결체(Clamp connection)를 가지고 있지 않은 백색부후균의 일종으로, 자연상태에서 성장하면 검은색의 균핵덩어리가 되어 자작나무 등의 줄기를 가해하게 된다.

차가버섯의 주산지인 러시아에서는 이미 1958년부터 차가버섯에 대한 연구가 시작되었다. 차가버섯은 뜨거운 물에 우려먹는 방법으로 일찍부터 이용되어 왔으며, Burczyk 등 (Antimitotic activity of aqueous extracts of Inonotus obliquus. Boll Chim Farm. 1996 May;135(5):306-9.)과 Rzymowska는 (The effect of aqueous extracts from Inonotus obliquus on the mitotic index and enzyme activities. Boll Chim Farm. 1998 Jan;137(1):13-5.) 차가버섯 추출물이 항종양 및 항암 효과를 가지고 있다고 보고하였다.

차가버섯은 국내에서는 희귀종으로 알려져 보고된 바가 없으며 일반적으로 북위 45도 이상의 북반구에 분포하므로 세계적으로도 그 생산량이 극히 제한되어 있다. 따라서 자연상태의 자실체는 입수가 어렵고 균사체의 분리 및 순수배양도 용이하지 않아 현재 국내에서는 주로 차가버섯 자실체가 항암 및 항당뇨용을 포함한 여러가지 민간요법으로 이용되고 있으며 국내에서 유통되는 차가버섯 자실체의 대부분은 러시아로부터 고가로 수입된 것들이다.

이에 본 발명자들은 이전까지 보고된 바가 없는 차가버섯 자실체를 강원도 설악산에서 국내 최초로 수집하여 항당뇨 활성과 미생물학적 특성이 우수한 균주를 분리 동정하여 인공배양에 성공하였으며 이 인공배양물로부터 기존의 차가버섯보다 우수한 항당뇨 활성 물질을 분리하는데 성공함으로써 본 발명을 달성하였다.

본 발명의 목적은 기존의 차가버섯보다 항당뇨 활성이 우수하며 또한 다량의 항당뇨 활성물질을 생산하는 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신규 이노노투스 오블리쿠스 균주로부터 분리된 우수한 항당뇨 활성을 갖는 추출물을 제공하는 것이며, 아울러 그 추출방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 강원도 설악산에서 2003년 국내 최초로 수집한 이노노투스 오블리쿠스 자실체로부터 균사조직을 무균적으로 떼어 내어 고체배지상에 옮겨 순수 분리하였으며; 신규 이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (KCTC 10665BP) 균주를 포함하여 이노노투스 속(Inonotus) 균주 3종을 각각 감자 텍스트로스 아가 (Potato dextrose agar : PDA ) 고체 배지에서 배양하고; PDA 고체배지에서 배양된 균사체를 다시 각각 감자 덱스트로스 브로스 (potato dextrose broth) 액체 배지에서 배양하고; 배양된 각각의 균사체로부터 전체 DNA를 분리하고; 상기 분리된 DNA로부터 리보솜 DNA를 분리한 후 ITS (Internal transcribed spacer) 부위의 염기서열을 분석한 결과 이노노투스 오블리쿠스 균주로 확인되었으며, 이 신규 이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (KCTC 10665BP)로부터 종래와는 전혀 상이한 항당뇨 활성 물질이 얻어진다는 것을 발견하여, 2004년 6월 14일자로 한국생명과학연구원 생물자원센터에 기탁번호 KCTC 10665BP 로서 기탁하였다.

본 발명의 이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (Inonotus obliquus KCTC 10665BP) 균주의 균학적 특성은 다음과 같다.

배양적 형태적 특성을 보면 포테이토 글루코즈 한천배지에서 이노노투스 오블리쿠스 KCTC 10665BP를 배양한 후 균사 색깔 및 형태를 관찰해 본 결과 균사색깔은 연노란색을 띠고 한천배지의 색깔을 진갈색으로 변화시키는 특징이 있다. 또한 균사체의 현미경 관찰결과 클램프 커넥션(clamp connection)을 가지고 있으며 균사체의 격막에는 유연공(dolipore)이 있다.

본 발명의 이노노투스 오블리쿠스 KCTC 10665BP 균주의 최적 생육환경은 최적 산성도가 5이고 최적 성장온도는 30℃ 이며 35℃ 이상에서는 급격한 성장속도 저해가 일어난다.

리보좀 DNA 분석 결과, 본 발명의 신규 균주인 이노노투스 오블리쿠스 KCTC10665BP는 이노노투스 분류군이 정확히 일치하는 결과를 얻었다. 따라서 본 균주의 표본 자실체는 환인제약(주) 중앙연구소 균주 보관실에 표본번호 WI0628로 보존되어 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여 상기 이노노투스 오블리쿠스 WI 0628 (Inonotus obliquus KCTC 10665BP) 균주를 배양하여 이 균주로부터 항당뇨 활성을 갖는 물질을 추출 분리하여 정제한 후 이 물질의 항당뇨 활성 효과를 측정하였다. 또한 이노노투스 오블리쿠스 균사체 추출물의 구성 단당류의 종류와 구성비율을 조사하였다.

본 발명의 다른 태양은 상기 이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (Inonotus obliquus KCTC 10665BP) 균주로부터 분리되고, 구성당이 20~90 중량%의 글루코즈, 1~20 중량%의 만노즈, 1~20 중량%의 갈락토즈 및 0.5~15 중량%의 라이보즈를 포함하는 항당뇨 활성의 추출물에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 상기 이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (Inonotus obliquus KCTC 10665BP) 균주의 균사체로부터 열수 추출한 것으로서, 그 구성당이 86.8 중량%의 글루코즈, 6.4 중량%의 만노즈, 4.0 중량%의 갈락토즈 및 2.8 중량%의 라이보즈를 포함하는 항당뇨 활성의 추출물에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 상기 이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (Inonotus obliquus KCTC 10665BP) 균주의 균사체로부터 열수 추출한 후 한외여과를 통해 저분자량의 물질을 제거하여 얻은 것으로서, 그 구성당이 71.2 중량%의 글루코즈, 14.9 중량%의 만노즈, 11.6 중량%의 갈락토즈 및 2.3 중량%의 라이보즈를 포함하는 항당뇨 활성의 추출물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 태양은, 상기 이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (Inonotus obliquus KCTC 10665BP) 균주의 균사체를 110~130℃ 에서 1~24시간 동안 고압하에서 순환 펌프를 이용하여 추출액을 순환시켜 추출하는 것을 특징으로 하는 상기 추출물의 추출방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 추출방법은, 상기 방법에 추가로 한외여과를 더 실시하여 저분자량의 물질을 제거하고 고분자 분획으로서 추출물을 얻는 것일 수 있다.

상기 이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (Inonotus obliquus KCTC 10665BP) 균주로부터 분리된 다당류 추출물에는 라이보즈가 포함되어 있다. 이는 차가버섯 추출물로서 이전에 보고된 바 없는 구성성분이다.

또한 본 발명의 이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (Inonotus obliquus KCTC 10665BP) 균주는 액상 배양시 다량의 항당뇨 활성 다당류를 생산할 수 있으며 또한 기존의 차가버섯 보다 항당뇨 활성이 매우 탁월함을 확인하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 리보솜 DNA 분석

제 1 공정 : 균주 배양

본 실험의 계통분류에 사용한 이노노투스 오블리쿠스 균주는 2003년 강원도 설악산에서 국내 최초로 채집한 균주와 한국생명공학연구원 생물자원센타(KCTC)에서 표준 종으로 이노노투스의 2종 균주를 분양받아 사용하였다(표 1).

이노노투스속 균주목록

순	균주명	균주번호	출처
1	I. obliquus	KCTC 26136	생물자원센타
2	I. obliquus	KCTC 26152	생물자원센타
3	I. obliquusWI0628	KCTC 10665BP	강원도 설악산

종배양의 배양조건은, 각각의 균주들을 감자 덱스트로즈 아가 배지에서 25℃ 7～10일간 배양한 뒤 균사조각을 약 0.5㎝크기로 잘라내어 WIM (표2) 배지가 50 ㎖씩 분주 된 250 ㎖ 삼각플라스크에 10개씩 접종하여 25℃ 에서 100rpm으로 진탕 배양하였다.

7일간 배양된 균주를 분쇄기로 4,000rpm에서 1분간 마쇄하여 pH 6.0으로 조절된 50㎖의 감자 덱스트로즈 브로스 배지에 10%(v/v)되게 접종한 후 30℃에서 100rpm으로 12일간 진탕 배양하였다

WIM 배지조성

배지 성분	배지 조성 (g/L)
글루코스	20
펩톤	5
이스트 추출물	6
KH₂PO₄	1
K₂HPO₄	0.5
MgSO₄7H₂O	2
pH	5.5

제 2 공정 : 게노믹 (genomic) DNA 분리

배양된 균사는 멸균된 3차 증류수로 여러 번 세척하여 배지성분을 씻어낸 후 수분을 제거한 뒤 미리 냉동 보관된 막자사발에 균사와 액체질소를 넣고 급냉시킨 상태에서 미세한 분말로 분쇄하였다. 균사분말 400 ㎎당 400 ㎕의 DNA 추출 완충용액(SDS 3%, EDTA 50mM, Tris-HCl pH7.2 50mM, 2-mercaptoethanol 1%)를 첨가하여 강하게 섞어 준 후 65℃ 에서 1시간 반응하였다. 반응 후 다시 400 ㎕의 페놀:클로로포름:이소아밀알코올(25:24:1)을 첨가하여 섞어준 후 실온에서 30분간 방치한 다음 25℃에서 12,000 g로 10분간 원심분리 하였다. 상등액을 새로운 실험관으로 옮긴 후 0.1 부피의 3 M 소듐 아세테이트와 0.54 부피의 이소프로판올을 첨가하여 약하게 섞어 준 다음 4℃에서 30분간 방치한 뒤 12,000 g로 5분간 4℃에서 원심 분리하여 상등액을 제거하고 침전물만 취하였다. 다시 침전물에 500 ㎕의 70 % 에탄올을 가한 뒤에 동일조건으로 원심 분리하여 수회 세척한 후 상온에서 15분간 건조한 다음 멸균 3차 증류수로 녹여 1% 아가로즈 젤 상에서 DNA를 확인하였다.

제 3 공정 : 프라이머 작성 및 PCR 반응

분리된 게노믹 DNA의 ITS 영역을 증폭하기 위해 사용된 프라이머는, 곰팡이류의 ITS 영역을 증폭하기 위한 유니버셜 프라이머 (universal primer)인 ITS5(forward) 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAAC AAGG-3'(22mer)와 ITS4(reverse) 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(20mer)를 사용하였다. PCR반응은 Perkin-Elmer사의 2400 GeneAmp™ PCR system을 이용하여 0.2㎖ PCR tube에서 Taq DNA 중합효소 2.5U, dNTP 250 M, 게노믹 DNA 50ng, 프라이머 50pmole, KCl 40mM, MgCl2 1.5mM이 되게 50㎕의 10mM Tris-HCl(pH9.0)로 조절한 다음 96℃에서 30초간 분해과정 (denaturation), 52 에서 30초간 연결과정 (annealing), 72℃에서 1분간 연장과정 (extention) 순으로 30 사이클 실시하였으며 증폭된 리보솜 DNA의 부위는 도 1과 같다.

제 4 공정 : PCR 산물의 정제

PCR 산물을 1.5% 아가로즈 젤 상에서 80 V의 전압으로 40분간 전기영동한 뒤 EtBr로 염색하여 UV 트랜스일루미네이터상에서 원하는 밴드를 확인, 잘라낸 다음 Bioneer사의 AccuPrep™ 젤 정제 키트로 rDNA를 회수하였다. 회수된 rDNA는 80 % 에탄올로 수회 세척과정을 거친 뒤 상온에서 15분간 건조시킨 다음 멸균 3차 증류수 30 ㎕에 녹인 후 다시 1.5 % 아가로즈 젤에 전기영동하여 rDNA의 순도를 확인하였다.

제 5 공정 : 염기서열 자동분석

정제된 rDNA의 염기서열은 염기서열 분석기 (PE 377 DNA Sequencer)를 이용하여 결정하였다.

제 6 공정 : 유연관계 분석

제 5 공정의 염기서열 분석 결과와 미국국립생물정보센타 유전자 은행 (NCBI GeneBank) 에서 이노노투스 속 균주 9종의 ITS2부위의 특이적 염기서열을 비교하였다. 일반적으로 ITS2 부위의 유전자는 보존성이 매우 높은 것으로 알려져 있다. ITS2 부위의 염기서열을 비교 분석한 결과 한국생명공학연구원 생물자원센타(KCTC)에서 분양 받은 표준 종의 이노노투스 오블리쿠스 2종과 100% 일치하였다. 이 같은 결과로 볼 때 강원도 설악산에서 채집된 WI0628 이노노투스 (Inonotus)속 균주는 I. obliquus에 속하는 균주로 판단되었다(표3).

실시예 2 : 이노노투스 오블리쿠스( KCTC 10665BP ) 균주의 대량 배양

이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (KCTC 10665BP) 균주는 자연계의 자실체로부터 균사체를 분리하여 사용하였다. 이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (KCTC 10665BP) 균주는 100ml의 감자 덱스트로즈 브로스 (potato dextrose broth) 복합배지가 들어있는 500ml 삼각플라스크에서 10일 배양하였다。배양된 균사체를 다시 200ml 내지 300ml의 WIM 배지가 들어있는 1L 삼각플라스크에 종균 10%(v/v)으로 접종한 후 10일 배양하고 이 배양액을 10%(v/v) 종균으로 사용하였다. 종균으로 사용하는 균사체는 멸균된 믹서기에 넣은 후 균질화시켜 7L 용량의 상부형 발효기(Marubishi Co. Ltd.)에 5L의 WIM 배지가 포함되어 있는 용기에 접종하였다. 이노노투스 오블리 쿠스 WI0628 (KCTC 10665BP) 균주의 배양 환경은 공기주입속도를 0.1 vvm내지 1 vvm으로 조정하면서 공급하였다. 공기주입속도 1 vvm 이상에서는 다량의 거품발생으로 인하여 균사체가 배양기 벽면에 붙어자라는 경향이 있어서 공기주입속도는 1 vvm 이하로 조정하였다. 배양온도는 배양실내에 온냉방기를 설치하여 실내 온도를 20℃ 내지 35℃로 조정하여 5일내지 10일간 배양하였다. 생물반응기는 멸균기를 이용하여 121℃ 로 20분간 실시하였다. 배양종료 후 배양 균사체는 여과지로 여과하고 증류수로 3회 세척한 후 건조기에서 105℃, 8시간 동안 건조 후 균사체 무게 측정하여 건조중량으로 15 g/L를 얻었다.

실시예 3 : 항당뇨 활성 추출물의 제조

실시예 2에서 얻어진 균사체 10kg을 물 50L에 넣고 110℃ 이상에서 5시간 동안 고압하에서 열수추출기로 가압열수 추출을 실시하였으며 또한 순환 펌프를 이용하여 물을 계속 순환시키면서 추출을 실시하였다. 가압열수 순환 추출 후 균사체 케익은 여과하여 제거하였다. 생성된 여과액을 여과시스템(Satocon slice, satorius co.)으로 미세여과(0.2㎛)를 수행하여 남아있던 균사체 찌거기를 제거한 후 건조장치(BUCHI, Rotavapor 124)로 건조하여 항당뇨 활성 추출물을 수득하였다.

실시예 4 : 항당뇨 활성 고분자 분획의 제조

실시예 3에서 얻어진 이노노투스 오블리쿠스 균주의 추출액을 여과시스템 (Satocon slice, satorius co.)으로 미세여과(0.2㎛)를 수행하여, 남아있던 균사체 찌꺼기를 제거하고 한외여과(MW10,000)를 통해 저분자량의 물질을 제거하면서 1/20 농축된 농축액을 얻었다. 이 농축액을 건조장치(BUCHI, Rotavapor 124)로 건조하여 고분자량의 추출물을 건조분말로 수득하였다.

비교실시예 1 : 항당뇨 활성 추출물의 제조

기존의 러시아산 이노노투스 오블리쿠스 자실체 10kg에 대하여 실시예 3과 같은 방법으로 처리하여 추출물을 수득하였다.

실험예 1. 균주의 배양학적 특성 및 항당뇨 활성 물질의 생산성

이노노투스 오블리쿠스 공시 균주 2종과 본 발명의 균주를 감자 텍스트로즈 아가(potato dextrose agar) 고체 배지에서 30℃를 유지하면서 7~10일간 배양한 후 균사조각을 약 0.5 cm 크기로 잘라내어 100ml의 감자 텍스트로즈 브로스(potato dextrose broth) 액체 배지가 들어있는 500ml 삼각플라스크에서 10일간 배양하였다. 배양된 균사체를 WIM 배지가 200ml 들어있는 1L 삼각플라스크에 10%(v/v)으로 접종한 후 30℃의 진탕배양기(shaking incubator)에서 100～150rpm으로 교반하면서 7일간 배양하였다. 배양 종료 후 배양 균사체를 여과지로 여과하고 증류수로 3회 세척한 후 105℃ 건조기에서 8시간 동안 건조 후 균사체 무게를 측정하였다.

상기에서 얻어진 1종의 이노노투스 오블리쿠스 균주와 2종의 공시균주의 균사체 10g을 물 50ml에 넣고 100℃에서 5시간 동안 항당뇨활성 물질을 추출하였다. 추출 완료후 균사체는 여과지로 여과하여 제거하였고 균사체 추출 여과액은 한외여 과막(MW10,000)를 통해 저분자량 물질을 제거한 후 건조장치(BUCHI, Rotavapor 124)로 건조하여 고분자량의 추출물을 건조분말로 수득하였다. 그 결과는 표 4와 같다.

이노노투스 오블리쿠스 균주의 균사체 및 항당뇨활성 물질 생산성

균주	건조중량(g/L)	균사체 단위무게당 항당뇨 활성물질의 생산수율(%)
Inonotus obliquus KCTC26136	4.03	4.1
Inonotus obliquus KCTC26152	5.12	4.3
Inonotus obliquus WI0628 KCTC 10665BP	8.43	5.8

실험예 2 : 항당뇨 활성 추출물질의 구성당 및 구성 비율

실시예 3 및 4에서 얻은 추출물질의 구성 단당류 성분을 분석하기 위하여 가스 크로마토그래피를 실시하였다. 추출물질을 구성하고 있는 단당류의 분석은 Mitruka (1975)의 방법에 준하였으며 시료 20mg을 3% 염산-메탄올과 함께 테프론 마개로 된 시험관에 넣고 시험관안의 공기를 질소로 치환시킨 후 80℃의 건조기에 15분간 방치 후 마개를 단단히 막아 20시간 동안 메탄올라이시스 시켰다. 이를 1ml의 무수 피리딘에 녹인 후 0.2ml의 hexamethyldisilazane과 0.1ml의 trimethylchlorosilane을 가하고 30초간 맹렬히 진탕한 뒤 10분간 방치 후 RTX-5 캐필러리 컬럼 ( 0.53 ㎜ ×30 m )이 장착된 GC (Varian 3800)에 의해 분석하였다. 이 때, 컬럼 온도는 초기에 180℃에서 1분 간격으로 4℃ 씩 온도를 증가시켜 최종온도가 220℃ 가 유지되도록 하였고, 검출기의 온도는 280℃, 주입부의 온도는 250 ℃로 유지하였다. 가스 크로마토그래피에 의해 분석된 추출물질의 구성당 및 구성비율을 하기 표 5에 나타내었다.

본 발명에서 사용된 신규 이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (Inonotus obliquus KCTC 10665BP) 균주로부터 추출 분리된 물질은 주 구성당으로 글루코즈, 만노즈, 갈락토즈, 라이보즈를 포함하며 상기 구성당의 합을 100%로 계산하였을 때 그 구성성분이 86.8 %의 글루코즈, 6.4 %의 만노즈, 4 %의 갈락토즈 및 2.8 %의 라이보즈로 이루어져 있으며 신규 이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (Inonotus obliquus KCTC 10665BP) 균주로부터 한외여과를 통해 수득한 고분자 분획은 그 구성성분이 71.2 %의 글루코즈, 14.9 %의 만노즈, 11.6 %의 갈락토즈 및 2.3 %의 라이보즈로 이루어져 있다. 이노노투스 오블리쿠스 자실체의 단당류 구성과 비교하여 이노노투스 오블리쿠스 균사체의 추출물의 구성당은 특이적으로 라이보즈가 포함되어 있었다. 또한 이전에 보고된 추출물의 구성당의 종류와 성분비가 완전히 다르며 또한 라이보즈가 추출물의 구성 단당 성분으로 보고된 경우는 전혀 없으므로 매우 특이적인 발명이라 할 수 있다(표 5).

이노노투스 오블리쿠스 추출물의 구성당 조성

	글루코즈	만노즈	갈락토즈	라이보즈
실시예 3	86.8	6.4	4.0	2.8
실시예 4	71.2	14.9	11.6	2.3

실험예 3 : 항당뇨 활성 효과

제 1 공정 : 실험동물의 식이 및 당뇨 유발

알록산(Alloxan)은 췌장의 베타세포에 선택적으로 세포독성을 나타내는 화합물로서, 알록산으로 당뇨를 유발시킨 마우스를 당뇨 모델로 이용하여 혈당강하 효과에 대한 연구가 이루어지고 있다. 당뇨를 유발시키기 위하여 6주령된 ICR 마우스에 100mg/kg의 알록산을 24시간 간격으로 3회 복강 투여하고 최초 투여일로부터 5일 째에 5시간 절식 시킨 후 마우스의 안구정맥총에서 혈액을 채취하였다. 혈당을 측정하여 혈장 포도당 농도가 200mg/이 이상인 것을 당뇨가 유발된 것으로 판단하여 실험에 사용하였으며 실험군은 당뇨 대조군과 이노노투스 오블리쿠스 균사체 추출물 투여군 및 고분자 분획 투여군으로 나누어 실험하였다.

각 실험군마다 10마리의 마우스를 실험에 사용하였으며 각 실험군의 평균 혈당이 320mg/dl 내외가 되도록 하여 실험하였다. 비교실시예 1, 실시예 3 및 실시예 4의 추출물들 각각을 500mg/kg의 양으로 24시간 마다 경구로 10일간 투여하였다.

제 2 공정 : 분석시료 채취 및 시료분석

제 1 공정에서 비교실시예 1, 실시예 3 및 실시예 4의 추출물들을 각각 10일간 경구 투여한 후 실험 마우스의 안구정맥총에서 혈액을 채취하여 3000rpm에서 원심분리로 혈장을 취해 혈당을 측정하였다. 혈장 중 포도당 농도는 glucose oxidase 법을 이용한 glucose kit(영동제약)를 사용하여 측정하였다.

실험 결과 당뇨 대조군의 혈당은 초기 혈당에 비해 9.3% 증가하였으나, 기존의 이노노투스 오블리쿠스 추출물 (비교실시예) 투여군의 경우 19.3% 감소하여 기 존의 차가버섯 추출물의 경우에도 항당뇨 효과가 약간 있음을 알 수 있었다. 한편, 본 발명의 이노노투스 오블리쿠스 균주 추출물 투여군들의 경우 혈당은 초기 혈당에 비하여 실시예 3의 추출물 투여군이 45.2% 감소하였으며 실시예 4의 추출물 투여군이 49.2% 감소하여 항당뇨 효과가 매우 우수할 뿐만아니라 기존의 이노노투스 오블리쿠스에 비하여 탁월함을 확인할 수 있었다. (표 6).

이노노투스 오블리쿠스 추출물에 의한 항당뇨 효과

	혈중포도당			체중		동물수
	초기 혈당치 (mg/dl)	10일후 혈당치 (mg/dl)	증감율 (%)	체중변화 (g)	변화율 (%)	동물수
당뇨대조군	321±11.02	354±19.38	+9.3	+3	+12.0	10
비교실시예 1의 추출물투여군	321±14.20	259±18.26	-19.3	-1	-4.0	10
실시예 3의 추출물 투여군	314±24.2	172±18.22	-45.2	-1	-4.0	10
실시예 4의 추출물 투여군	321±20.28	163±23.86	-49.2	0	0	10

이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명은 자연에서 채취한 이노노투스 균주로부터 리보솜 DNA를 분리하여 ITS 부위의 염기서열을 조사하고 기존에 알려진 공시균주와 진화적 유연관계 및 미생물학적 특성이 동일한 신규의 이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (Inonotus obliquus KCTC 10665BP) 균주를 동정하여 제공하는 효과가 있다. 또한 이러한 신규의 이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (Inonotus obliquus KCTC 10665BP) 균주로부터 추출 분리된 물질은 기존의 이노노 투스 오블리쿠스보다 항당뇨 활성 물질의 함량이 월등히 높을 뿐만 아니라 항당뇨 활성이 매우 뛰어나므로, 생물의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

항당뇨 활성 물질을 생산하는 이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (Inonotus obliquus) KCTC 10665BP 균주.
제 1항의 이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (Inonotus obliquus KCTC 10665BP) 균주로부터 분리되고, 구성당이 20~90 중량%의 글루코즈, 1~20 중량%의 만노즈, 1~20 중량%의 갈락토즈 및 0.5~15 중량%의 라이보즈를 포함하는 항당뇨 활성의 추출물.
제 2항에 있어서, 상기 추출물이 이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (Inonotus obliquus KCTC 10665BP) 균주의 균사체로부터 열수 추출한 것이며, 그 구성당이 86.8 중량%의 글루코즈, 6.4 중량%의 만노즈, 4.0 중량%의 갈락토즈 및 2.8 중량%의 라이보즈를 포함하는 것인 항당뇨 활성의 추출물.
제 2항에 있어서, 상기 추출물이 이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (Inonotus obliquus KCTC 10665BP) 균주의 균사체를 열수 추출한 후 한외여과를 통해 분자량 10,000 이하의 저분자량의 물질을 제거하여 얻은 것이며, 그 구성당이 71.2 중량%의 글루코즈, 14.9 중량%의 만노즈, 11.6 중량%의 갈락토즈 및 2.3 중량%의 라이보즈를 포함하는 것인 항당뇨 활성의 추출물.
이노노투스 오블리쿠스 WI0628 (Inonotus obliquus KCTC 10665BP) 균주의 균사체를 110~130℃ 에서 1~24시간 동안 0.4~1.8 kg/cm² G의 고압하에서 순환 펌프를 이용하여 추출액을 순환시켜 추출하고,

추가로 한외여과를 더 실시하여 분자량 10,000 이하의 저분자량의 물질을 제거하고 고분자 분획으로서 추출물을 얻는 것을 특징으로 하는, 제2항의 추출물의 추출방법.
삭제
제 2항의 항당뇨 활성의 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물.