상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1로 표기되는 타크롤리무스(tacrolimus)를 생산하는 스트렙토마이세스 클라불리저러스(Streptomyces clavuligerus) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양 배지에서 배양하는 타크롤리무스의 대량 생산방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 상기 화학식 1로 표기되는 타크롤리무스(tacrolimus)를 생산하는 스트렙토마이세스 클라불리저러스(Streptomyces clavuligerus) 균주를 제공한다. 이때, 상기 균주는 스트렙토마이세스 클라불리저러스 CKD 1119(수탁번호 : KCTC 10561BP)인 것이 바람직하다.
본 발명의 신균주는 면역억제 물질에 의해 생육이 저해받는 성질이 있는 곰팡이 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) ATCC 6275를 검정균으로 하는 한천 확산법에 의한 생물학적 정량(bioassay) 및 면역억제 활성(immunosuppressive activity) 실험을 통해 타크롤리무스를 생산하는 미생물을 토양 샘플로부터 선별(screening)된다. 선별된 미생물의 배양학적 특성, 형태학적 특성, 생리학적 특성 및 탄소원 이용성을 살펴본 결과, 본 발명의 균주는 스트렙토마이세스 클라불리저러스로 분류됨을 알 수 있다. 즉, 배지 형태에 따른 생육정도(표 1 참조), Type Ⅰ의 세포벽 조성, LL 형태의 디아미노피멜릭산(diaminopimelic acid)의 관찰 및 콜로니의 형태(표 2 참조) 등에 기초할 때, 방선균에 속하는 스트렙토마이세스 속 균주의 형태학적 특성을 가지고 있다. 또한, 생장온도, 멜라닌 색소, 전분 가수분해작용, 질산기 환원반응 유무, 젤라틴 액화반응 유무, 리트머스 우유의 응고 및 펩톤화, 황화수소 형성유무 및 클라불란산(clavulanic acid) 생성유무의 조사에서 스트렙토마이세스 클라불리저러스의 생리학적 특성을 나타낸다(표 3 참조). 탄소원의 이용성에서도 만노오스 및 포도당의 경우를 제외하고는 스트렙토마이세스 클라불리저러스와 유사하였다(표 4 참조).
보다 자세한 동정을 위해, 본 발명의 균주로부터 게놈 DNA를 분리하고 16S rDNA의 전체 염기서열을 분석한 결과, 본 발명의 균주는 스트렙토마이세스 클라불리저러스의 표준균주인 스트렙토마이세스 클라불리저러스 NRRL3585와 98.39%의 상동성을 가지고 있음을 확인하였다. 그러나, 균주가 분비하는 가용성 색소에 의한 배지 색상, 타크롤리무스 생산여부는 두 균주에서 차이가 있음을 확인하였다. 이에, 본 발명자들은 상기 균주를 '스트렙토마이세스 클라불리저러스 CKD 1119'라 명명하고, 2003년 12월 5일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10561BP).
한편, 본 발명에 의한 스트렙토마이세스 클라불리저러스 CKD 1119의 생리·화학적 특성을 타크롤리무스 생산의 공지균주인 스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스(Streptomyces tsukubaensis) No.9993 및 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MA 6858과 비교한 결과, 3종 균주 모두 세포벽 조성은 타입 I 이면서, LL 형태의 다이아미노피멜릭산(diaminopimelic acid)이 관찰된 점은 동일하나, 그 외 배양학적 특성, 형태학적 특성, 생리학적 특성, 탄소원 이용성 및 발효산물의 차이가 있다. 따라서, 본 발명의 균주는 상기 타크롤리무스 생산의 공지균주들과 동일 속에 속하나, 다른 종에 해당함을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 균주가 생산하는 면역억제 활성을 갖는 물질을 순수분리한 후, 핵자기공명 스펙트럼, 적외선 분광 스펙트럼 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 동정한 결과, 면역억제 활성물질이 상기 화학식 1로 표기되는 타크롤리무스임을 확인하였다(도 1 내지 도 4 참조).
또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 클라불리저러스 균주의 배양에 의한 타크롤리무스의 대량 생산방법을 제공한다. 상기 배양은 말로닉산(malonic acid), 에탄올, 메치오닌(methionine), 탄소원 및 질소원을 포함하는 배지에서 이루어지는 것이 바람직하다. 이때, 상기 탄소원은 전분, 포도당, 옥수수기름, 글리세롤, 말토스, 만노스 및 이노시톨로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이 바람직하며, 전분, 포도당 및 옥수수기름인 것이 가장 바람직하다. 또한, 상기 질소원은 면실밀, 옥수수 침지액, 옥수수 침지분, 대두분, 펩톤 및 효모엑기스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이 바람직하며, 면실밀 및 옥수수침지액인 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는, 스트렙토마이세스 클라불리저러스 CKD 1119 의 종균배양액을 상기 배양 배지(표 5 참조)를 포함한 발효조에 식균하여 배양하였다. 이후, 상기 배양액을 여과 및 추출의 과정을 통해 오일상 잔류물을 수득한 후, 칼럼 크로마토그래피를 통해 목적 화합물을 포함하는 분획을 정제함으로써 정제된 타크롤리무스를 생산한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 미생물의 분리 및 선발
본 발명의 미생물을 분리하기 위해 평판 희석기술을 이용하였다.
구체적으로, 한국의 충남 보령시에서 수집한 토양 약 1 kg을 멸균 시험관에 넣고 멸균수를 가하여 혼합한 후, 약 10분간 정치(定置)시켜 상등액을 수득하였다. 수득된 상등액을 멸균수로 약 100배 희석시킨 후, 상기 희석액 0.1 ㎖을 페트리접시 내의 효모-맥아 한천배지(효모 엑기스 4 g/ℓ, 맥아즙 10 g/ℓ, 포도당 4 g/ℓ, 한천 20 g/ℓ, 증류수 1 ℓ, pH 6.8 ~ 7.0로 제조된 배지) 상에 산포하였다. 이후, 28℃에서 약 21일간 배양시킨 후, 효모-맥아 한천배지상에 증식한 콜로니를 멸균된 바늘을 이용하여 새로운 효모-맥아 한천배지상에 일정 간격을 두고 계대배양하였다.
계대배양되어 증식된 콜로니들을 다시 28℃에서 10일간 배양한 후, 콜로니가 증식된 배지위에 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) ATCC 6275의 포자 현탁액(1x107 ~ 108 세포/㎖)을 0.5 ㎖씩 도포하였다. 이때, 아스퍼질러스 나이거 ATCC 6275는 면역억제 물질에 의해 생육이 저해받는 바, 본 발명의 검정균으로 이용하였다. 상기 검정균을 도포한 후, 28℃에서 2일간 콜로니를 추가배양하여 검정균 아스퍼질러스 나이거의 생장을 많이 저해한 콜로니 276주를 선별하였다.
그 결과, 선별된 균주 중에서 곰팡이 및 세균을 제외한 방선균 127주를 1차 선발한 후, 하기 면역억제 활성 시험을 통해 면역억제 활성을 보이는 균주를 2차 선발하였다.
<실시예 2> 선발 균주들의 면역억제 활성의 시험
실시예 1에서 1차로 선발된 균주가 면역억제 활성을 가지는 물질을 생산하는지 확인하였다.
구체적으로, 열처리에 의한 비활성의 10% 우태아혈청(fetal calf serum)이 포함된 RPMI 1640 배지(GIBCO, Grand Island, NY)를 함유하는 마이크로배양(microculture) 96 웰 플레이트에 쥐 비장의 T 세포(T-cell)를 0.5x106 세포/㎖의 농도로 각 200 ㎕씩 소분하였다. 그 후, 실시예 1에서 1차 선발한 균주 127주 배양액의 메탄올 추출 농축물을 웰(wells)에 분배한 후, 250 ng/㎖의 이오노마이신(ionomycin, ionophore의 일종으로 Ca2+이온 전도물질) 및 10 ng/㎖의 PMA(Peptonized Milk Agar; peptonized milk 1 g, 증류수 1 ℓ) 액체배지를 첨가하였다. 이후, 약 5시간 동안 방사성 동위원소 3H-TdR(Thimidine deoxyribose)(S.A.(Specific activity) 5 Ci/mmol; 농도 1 μCi/㎖)에 반응시킨 후, 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 상기 배양액을 유리솜에 여과시켜 세포를 수확한 후, 분광광도계를 이용하여 방사능 분석을 하였다. 이때, 배양액 시료를 넣지 않은 대조군의 방사능을 100%로 하여 상기 실험군의 결과와 비교하였으며, 정확성을 기하기 위해 상기 실험을 3번 반복하였다.
그 결과, 배양액 시료가 첨가된 실험군의 경우, 방사능이 100% 이하로 감소되는 결과를 보인 균주 1주를 확인하였다. 즉, 본 발명 균주의 특정 성분이 T 세포의 증식을 억제하였으며, 배양액 시료가 면역 억제기능을 갖는 물질을 포함하고 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명자들은 상기 균주를 CKD 1119로 명명하였다.
<실시예 3> 분리된 균주의 동정 및 균체화학적 특성 조사
상기 실시예 2에서 분리된 균주를 동정하기 위하여 세포의 형태학적 특성, 배양학적 특성, 콜로니의 형태적 특성, 생리학적 특성, 탄소원 이용성을 조사하였다.
<3-1> 세포의 형태학적 특성
본 발명의 CKD 1119 균주의 세포벽 조성은 LL-디아미노피멜릭산(LL-diaminopimelic acid) 및 글라이신(glycine)을 포함하는 Type I 이었으며, 세포 전체를 가수분해하여 구성성분을 분석한 결과 LL(글라이신으로부터 디아미노피멜릭산이 교차결합)형태의 디아미노피멜릭산이 관찰되었다. 상기 결과들은 방선균에 속하며 연쇄포자를 갖는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 균주의 형태학적 특징과 상응하는 바, 본 발명의 균주 역시 스트렙토마이세스 속 균주임을 확인하였다.
<3-2> 배양학적 특성
상기 실시예 2에서 분리된 CKD 1119 균주의 배양학적 특성을 조사하였다. 구체적으로, 효모-맥아 한천배지, 감자 한천배지, 오트밀 한천배지, 자펙 글루코스 한천배지, 글루코스-아스파라긴 한천배지, 펩톤-글루코스 한천배지 및 탈지분유 한천배지에 분리된 균주를 각각 식균하고, 28℃에서 7 ~ 14일 동안 배양한 다음, 생육정도, 포자형성, 콜로니 색 및 수용성 색소를 관찰하였다(표 1).
배 지 |
생육정도 |
포자형성 |
콜로니 색 |
수용성 색소 |
효모-맥아 한천배지 |
왕성 |
왕성 |
연한노랑 |
어두운 주황 |
감자 한천배지 |
왕성 |
왕성 |
연한노랑 |
주황 |
오트밀 한천배지 |
미약 |
미약 |
연한노랑 |
연한자주 |
자펙 글루코스 한천배지 |
미약 |
형성안함 |
흰색 |
없음 |
글루코스-아스파라긴 한천배지 |
아주미약 |
형성안함 |
흰색 |
없음 |
펩톤-글루코스 한천배지 |
미약 |
형성안함 |
흰색 |
없음 |
탈지분유 한천배지 |
아주미약 |
형성안함 |
흰색 |
없음 |
그 결과, 효모-맥아 한천배지에서 그 생육정도 및 포자형성이 왕성하였으며, 이때 콜로니 색은 연한노랑을 띄었으며, 어두운 주황색의 수용성 색소를 분비하였다.
<3-3> 콜로니의 형태적 특성
본 발명의 신균주의 형태적 특성을 살펴보기 위해, CKD1119 균주를 효모-맥아 한천배지에서 28℃, 14일 동안 배양한 후, 광학 및 전자현미경을 통해 관찰하였다. 그 결과, 연쇄 포자(spore chain)가 렉티플렉시블(rectiflexible) 형태로 형성되었으며, 포자 표면은 매끄러웠다.
또한, 콜로니 군집의 형태적 특성을 조사하기 위하여 효모-맥아 한천배지에 스트렙토마이세스 클라불리저러스(Streptomyces clavuligerus)의 표준균주인 NRRL 3585(ATCC 27064)및 본 발명의 신균주를 각각 식균한 후, 28℃에서 14일 동안 배양하면서 콜로니 크기 및 콜로니 모양, 콜로니 색상 및 배지 색상을 비교 관찰하였다(표 2).
구 분 |
스트렙토마이세스 클라불리저러스 NRRL 3585 |
CKD 1119 |
콜로니 크기(㎜) |
5 ~ 7 |
5 ~ 7 |
콜로니 모양 |
둥글고 표면 거칠음 |
둥글고 표면에 주름 |
콜로니 색상 |
흰색(아주 연한 노랑) |
흰색(아주 연한 노랑) |
배지 색상 |
흰색 |
어두운 주황 |
그 결과, 콜로니의 크기, 모양, 색상 등 전자 현미경적 형태 및 콜로니 군집 형태에 있어서 거의 유사하였으나, 균주가 분비하는 가용성 색소에 의해 배지 색상에 약간의 차이를 보임을 확인하였다.
<3-4> 생리학적 특성
본 발명의 신균주의 생리학적 특성을 스트렙토마이세스 클라불리저러스 NRRL 3585과 비교하였다. 구체적으로, 상기 균주들을 물 1 ℓ에 글리세롤 15 g, 대두분 38.5 g, 미강유 23 g, KH2PO4 2 g 및 MOPS(3-[N-Morpholino] propanesulfonic acid sodium salt, C7H14NO4SNa) 21 g을 포함한 배지에서 25℃, 약 6일간 배양하였다. 이후, 양 균주의 생장온도, 멜라닌 색소, 전분 가수분해작용, 질산기 환원반응 유무, 젤라틴 액화반응 유무, 리트머스 우유의 응고 및 펩톤화, 황화수소 형성유무, 클라불란산 생성유무 및 타크롤리무스 생성유무와 같은 생리학적 특성을 조사하였다(표 3).
구 분 |
스트렙토마이세스클라불리저러스 NRRL 3585 |
CKD 1119 |
생장 온도 범위 |
18 ~ 35 ℃ |
15 ~ 38 ℃ |
최적 생장 온도 |
28 ℃ |
28 ℃ |
멜라닌 색소 |
- |
- |
전분 가수분해 |
+ |
+ |
질산기 환원반응 |
- |
- |
젤라틴 액화반응 |
- |
- |
리트머스 우유의 응고 |
- |
- |
리트머스 우유의 펩톤화 |
+ |
+ |
황화수소 형성 |
- |
- |
클라불란산 생성 |
+ |
+ |
타크롤리무스 생성 |
- |
+ |
- ; 음성 반응 + ; 양성 반응 |
그 결과, 상기 양 균주가 타크롤리무스 생성유무를 제외하고는 비슷한 생리학적 특성을 가지고 있으며, 약 50 mg/ℓ의 클라불란산을 생산하였다(표 3).
<3-5> 탄소원 이용성
본 발명의 신균주의 탄소원 이용성을 스트렙토마이세스 클라불리저러스 NRRL 3585과 비교하였다.
탄 소 원 |
스트렙토마이세스클라불리저러스 NRRL 3585 |
CKD 1119 |
갈락토스 |
- |
- |
과당 |
- |
- |
글리세린 |
+ |
+ |
람노스 |
- |
- |
라피노스 |
- |
- |
만노스 |
+ |
+ |
만니톨 |
- |
- |
말토스 |
± |
± |
셀로바이오스 |
- |
- |
수용성 전분 |
+ |
+ |
수크로스 |
- |
- |
아라비노스 |
- |
- |
이노시톨 |
± |
± |
자일로스 |
- |
- |
젖당 |
- |
- |
포도당 |
- |
± |
- ; 이용 못함 ± ; 이용성 판단 불확실 + ; 이용성 좋음 |
그 결과, 탄소원 이용성에서 이용 정도가 확실하게 판단되지 않는 포도당의 경우을 제외하고 거의 유사함을 확인하였다(표 4).
이상의 결과를 통하여, 본 발명의 CKD 1119 균주가 스트렙토마이세스 클라불리저러스(Streptomyces clavuligerus)임을 확인할 수 있었다.
<3-6> 16S rDNA 전체서열 분석
본 발명의 균주를 보다 자세하게 동정하기 위해, 균주로부터 게놈 DNA를 분리하고, 16S rDNA의 전체 염기서열을 분석하였다.
구체적으로, 로셀 등의 방법(Rochell, P.A., et al., FEMS Microbiol. Lett., 100: 59-66, 1992)을 이용하여 게놈 유전자(genome DNA)를 분리한 후, 리보솜 소단위 유전자(16S rDNA)를 PCR(polymerase chain reaction; 94℃ 1분, 52-56℃ 1분, 72℃ 2분) 방법으로 합성하였다. 합성된 유전자는 태그 다이데옥시 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트(Tag Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit)를 사용하여 염기서열을 결정한 결과, 결정된 염기서열 개수는 1435 bp이었다. 결정된 염기서열에 대해 NCBI(National Center for Biological Information) BLAST를 이용하여 데이터베이스 분석한 결과, 본 발명의 균주는 스트렙토마이세스 클라불리저러스(Streptomyces clavuligerus)의 표준균주(NRRL 3585)와 98.39%의 상동성을 나타내었다. 통상 16S rDNA 염기서열의 상동성에 있어서 97%를 기준으로 종을 판단하고 있는 최근 추세를 바탕으로, 본 발명의 균주는 스트렙토마이세스 클라불리저러스(Streptomyces clavuligerus)이었다. 이에, 본 발명자들은 상기 분리된 균주를 '스트렙토마이세스 클라불리저러스 CKD 1119'라 명명하고, 2003년 12월 5일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10561BP).
<실시예 4> 스트렙토마이세스 클라불리저러스 CKD 1119 와 스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 No.9993 및 스트렙토마이세스 속 MA 6858의 특성 비교
스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스(Streptomyces tsukubaensis) No.9993 및 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MA 6858은 타크롤리무스 생산의 공지균주인 바, 상기 균주들의 특성은 미국 특허등록 제5,624,842호에 개시된 스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 No.9993 와 미국 특허등록 제5,116,756호에 개시된 스트렙토마이세스 속 MA 6858의 내용을 참고로 하였다.
3종 균주 모두 세포벽 조성은 타입 I 이면서, LL 형태의 다이아미노피멜릭산(diaminopimelic acid)이 관찰된 점은 동일하나, 그 외 여러측면에서 상이함을 확인하였다. 구체적으로, 상기 균주들간의 배양학적 특성, 형태학적 특성, 생리학적 특성, 탄소원 이용성 및 발효산물의 차이를 살펴보았다.
<4-1> 배양학적 특성
효모-맥아 한천배지에서 배양시, 스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 No.9993 균주는 오렌지색 가용성 색소를 분비하며, 스트렙토마이세스 속 MA6858 균주는 색소를 생성하지 않는 반면, 본 발명의 스트렙토마이세스 클라불리저러스 CKD1119는 어두운 오렌지색 또는 붉은색의 가용성 색소를 분비한다.
<4-2> 형태학적 특성
콜로니 색상에 있어서, 스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 No.9993 균주는 회색이고, 스트렙토마이세스 속 MA6858 균주는 황갈색 내지는 흰색인 반면, 본 발명의 스트렙토마이세스 클라불리저러스 CKD1119는 연한노랑색을 나타낸다. 또한, 포자 색상에 있어서, 스트렙토마이세스 속 MA6858 균주는 연한노랑 또는 연한회색인 반면, 본 발명의 스트렙토마이세스 클라불리저러스 CKD1119는 흰색 또는 회색을 나타냈다.
<4-3> 생리학적 특성
전분가수분해에 있어서, 스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 No.9993 균주는 음성인데 반해, 본 발명의 스트렙토마이세스 클라불리저러스 CKD1119는 양성을 나타내었다. 우유의 펩톤화에 있어서, 스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 No.9993 균주는 양성인데 반해, 본 발명의 스트렙토마이세스 클라불리저러스 CKD1119는 음성을 나타내었다. 또한, 황화 수소 형성에 있어서 스트렙토마이세스 속 MA6858 균주는 양성인 반면, 본 발명의 스트렙토마이세스 클라불리저러스 CKD1119는 음성을 나타내었다.
<4-4> 탄소원 이용성
스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 No.9993 균주는 이노시톨 이용성이 음성이고, 수크로스 이용성이 경미한데 반해, 본 발명의 스트렙토마이세스 클라불리저러스 CKD1119는 이노시톨 이용성이 경미하고, 수크로스 이용성은 음성이었다. 또한, 스트렙토마이세스 속 MA6858 균주는 락토스 및 포도당 이용성이 양성인 반면, 본 발명의 스트렙토마이세스 클라불리저러스 CKD1119는 락토스 이용성은 음성이고, 포도당 이용성은 경미했다.
<4-5> 발효산물
스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 No.9993 균주 및 스트렙토마이세스 속 MA6858 균주는 타크롤리무스 만을 생산하는 반면, 본 발명의 스트렙토마이세스 클라불리저러스 CKD1119는 타크롤리무스 뿐만 아니라, 클라불란산도 생산함을 확인하였다.
상기에서 언급된 내용을 바탕으로 비교할 때, 본 발명의 스트렙토마이세스 클라불리저러스 CKD1119는 2종의 타크롤리무스 생산 공지균주 스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 No.9993 및 스트렙토마이세스 속 MA6858과는 다른 종의 균주임을 확인할 수 있었다.
<실시예 5> 균주의 제조 및 배양을 통한 면역억제물질의 특징
실시예 2를 통해 2차 선발된 CKD 1119 균주가 생산하는 면역억제 물질을 동정하였다.
구체적으로, 상기 균주를 30 ㎖의 효모-맥아 한천배지(전분 10 g/ℓ, 효모엑기스 4 g/ℓ, 맥아즙 10 g/ℓ, 한천 20 g/ℓ, 증류수 1 ℓ, 살균 후 pH 6.8 ~ 7.0)가 함유된 페트리접시에서 28℃로, 7 ~ 14일간 단일 콜로니(monocolony)로 배양하였다. 그 후, 1.5 ㎖의 생리식염수에서 배양된 단일 콜로니를 현탁한 후, 상기 고체배지가 함유된 수개의 페트리접시에 도말하고, 다시 28℃에서 7 ~ 14일간 배양하였다. 상기 배양한 페트리접시 1개당 살균된 15%(w/v) 스킴밀크 용액(skim milk solution) 5 ㎖씩을 가한 후, 화염살균한 스파큘라(spacular)로 긁어서 포자 현탁액을 수확하였다. 그 후, 살균된 주사기를 이용하여 포자 현탁액을 유리솜(glass wool)에 통과시켜 균사체가 제거된 포자 현탁액을 제조하였다.
이때, 종균배양을 위해 100 ㎖ 삼각 플라스크에 표 5에 기재된 종균배양 배지 20 ㎖를 첨가하여 121℃, 20분 동안 살균하였다. 그 후, 상기 제조된 포자 현탁액(2.5%(v/v))을 종균배양 배지에 식균하여 28℃에서 220 rpm으로 48시간 동안 배양하여 종균 배양액을 제조하였다. 이후, 본배양을 위해 500 ㎖ 삼각 플라스크에 표 5에 기재된 본배양 배지 100 ㎖를 첨가하여 121℃, 20분 동안 살균하였다. 그후, 상기 제조된 종균 배양액(10%(v/v))을 본배양 배지에 식균하여 25℃에서 220 rpm으로 7 ~ 9일 동안 배양한 후 본배양 배양액을 제조하였다. 종균배양 및 본배양 배지의 조성은 표 5와 같으며, 산업성을 고려하여 주로 저가의 공업용 원료를 사용하였다.
종 균 배 양 배 지 |
본 배 양 배 지 |
조 성 |
첨가량(g/ℓ) |
조 성 |
첨가량(g/ℓ) |
전분 포도당 면실밀 효모 엑기스 옥수수 침지액 탄산칼슘 소포제(SAG-471) |
40 5 10 10 10 2 1 |
전분 포도당 옥수수 기름 면실밀 옥수수 침지액 말로닉산(malonate) 메치오닌(methionine) 에탄올(ethanol) 탄산칼슘 황화철 트윈 80(Tween 80) 소포제(SAG-471) |
100 10 20 30 10 2 0.5 0.3 % 2 0.1 2 1 |
증류수, 살균 후 pH 6.8 ~ 7.0로 조정 |
증류수, 살균 후 pH 6.8 ~ 7.0로 조정 |
그 후, 제조된 본배양 배양액을 60%(v/v) 메탄올로 30 ~ 60분 동안 추출한 다음, 10,000 rpm에서 5 ~ 10분 동안 원심 분리하였다. 분리된 상등액을 표 6과 같은 조건하에서 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography ; HPLC)를 수행하여 타크롤리무스의 최종 생산여부를 확인하였다.
항 목 |
조 건 |
파장 |
205 ㎚ |
칼럼 |
Partisil 5 ODS-3 analytical column (Whatman) |
칼럼 온도 |
60 ℃ |
유속 |
1.0 ㎖/분 |
이동상 |
아세토니트릴(Acetonitrile):0.1% H3PO4 = 65 : 35 |
시료 주입량 |
20 ㎕ |
그 결과, 본 발명의 균주가 생산하는 면역억제 활성을 갖는 물질은 타크롤리무스였다. 또한, 적외선 분광 스펙트럼에서 타크롤리무스의 주요 작용기인 하이드록시기(3447 ㎝-1), 카르보닐기(1743 ㎝-1) 및 탄소 이중결합(1650 ㎝-1)을 확인할 수 있었으며, 13C 및 1H 핵자기공명 스펙트럼을 수행하여 표준물질 스펙트럼(미국 특허등록번호 제 5,624,842)과 비교한 결과 타크롤리무스임을 확인할 수 있었다.(도 1 내지 도 4).
<실시예 6> 스트렙토마이세스 클라불리저러스 CKD1119의 배양에 의한 타크롤리무스 생산성
본 발명의 신균주 스트렙토마이세스 클라불리저러스 CKD1119를 이용하여 발효조(jar fermenter)에서의 타크롤리무스 생산성을 관찰하였다.
구체적으로, 5 ℓ의 둥근 플라스크에 600 ㎖의 전배양 배지를 가하여 121℃에서 40분 동안 살균한 다음, 포자 현탁액을 1%(v/v)되게 식균하였다. 그 후, 식균된 균주를 28℃, 120회 왕복으로 48시간 동안 배양하여, 1단 전배양액(germination culture)을 수득하였다. 상기 1단 전배양액을 3.3%(v/v)되게 전배양액이 18 ℓ 들어있는 30 ℓ 발효조에 식균하였다. 그 후, 24시간 동안 28℃, 400 rpm, 1 vvm의 조건으로 2단 전배양(seed culture)한 다음, 18 ℓ의 본배양액이 들어있는 30 ℓ발효조에 2단 전배양액을 10%(v/v)되게 식균하여 28℃, 300 rpm, 1 vvm의 조건으로 7 ~ 8일 동안 배양하였다.
그 결과, 350 ㎎/ℓ의 타크롤리무스가 생산됨을 확인하였다.
<실시예 7> 생산된 타크롤리무스의 정제
스트렙토마이세스 클리불리저러스 CKD-1119가 생산하는 타크롤리무스를 실시예 6의 방법으로 분리한 후, 하기의 방법으로 정제하였다.
구체적으로, 실시예 6에서 수득된 18 ℓ의 배양액을 0.3 ㎏의 규조토를 사용하여 여과한 후, 균사체 케이크를 22 ℓ의 에틸아세테이트로 추출하여 22 ℓ의 추출물을 수득하였다. 상기 균사체로부터 얻어진 에틸아세테이트 추출물을 감압하에 농축시켜 오일상 잔류물을 수득하였다. 그 후, 상기 오일상 잔류물의 2배에 해당하는 중량의 산성 실리카겔(특제 실리카겔 그레이드 12등급, Fuji Devision Co. 제품)과 혼합하고, 이 혼합물을 에틸아세테이트 중에서 슬러리화하였다. 용매를 증발시키고, 생성된 건조 분말을 n-헥산으로 충진시킨 동일한 산성 실리카겔(400 ㎖) 상에서 칼럼 크로마토그래피를 수행하였다. 이때, 칼럼을 n-헥산(1.2 ℓ) 및 n-헥산과 에틸아세테이트의 혼합물(10:1 v/v, 1.2 ℓ, 5:1 v/v, 1.2 ℓ, 1:1 v/v, 1.2 ℓ및 1:2 v/v, 1.6 ℓ)로 전개하였다. 목적 화합물을 함유하는 분획을 수집한 후, 감압하에서 농축시켜 담황색의 분말을 1 차적으로 수득하였다. 1 차적으로 수득된 담황색 분말을 다시 상기와 동일한 칼럼 크로마토그래피를 수행하여, 백색 분말의 형태로 정제된 0.8 g의 타크롤리무스를 수득하였다.