JP3587778B2 - 脱脂ゴマを発酵することによりｓｏｄ様活性画分および抗酸化活性画分を得る方法、並びにそれにより得られるｓｏｄ様活性画分および抗酸化活性画分 - Google Patents
脱脂ゴマを発酵することによりｓｏｄ様活性画分および抗酸化活性画分を得る方法、並びにそれにより得られるｓｏｄ様活性画分および抗酸化活性画分 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
微生物を用いて発酵することにより、脱脂ゴマからＳＯＤ様活性画分および抗酸化活性画分を得る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ゴマは、大豆等の油脂原料穀物に比べて原料単価が高価である。それにも関わらず、搾油処理後の脱脂ゴマは、一般的に、肥料または飼料として安価な脱脂大豆と同等に利用されているに過ぎない。
【０００３】
一方、ゴマは抗酸化性作用を有していることで知られている。しかしながら、その活性は脂溶性のリグナン類に限られており、脱脂ゴマに含まれるその量は極僅かであることも、また、分かっている。したがって、従来の方法により、脱脂ゴマからリグナン類を抽出回収しても、採算が合わず実用的ではなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、脱脂ゴマの有効利用法を提供することを目的とする。具体的には、脱脂ゴマから、優れたＳＯＤ様活性画分および抗酸化活性画分を得る方法を提供することを目的とし、更に、それにより得られたＳＯＤ様活性画分および抗酸化活性画分を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、一般的に肥料または飼料として処理されている脱脂ゴマを、微生物で発酵することにより、優れたＳＯＤ様活性画分および／または抗酸化活性画分が得られるという驚くべき発見をした。本発明は、この発見を基に成されたものである。
【０００６】
従って、上記課題を解決し、目的を達成する手段は以下に示す通りである。即ち、
（１） 脱脂ゴマを微生物により発酵することにより、ＳＯＤ様活性画分および／または抗酸化活性画分を得る方法；
（２） （１）に記載の微生物がアスペルギルス属の微生物である方法。
【０００７】
（３） （１）または２の何れか１項に記載のＳＯＤ様活性画分および／または抗酸化活性画分を得る方法であって、
前記微生物を脱脂ゴマを含む培地中で培養することと、および
得られた培養物を８０％メタノールで抽出することと、
を具備する方法；
（４） 脱脂ゴマを微生物により発酵することにより得られるＳＯＤ様活性画分および／または抗酸化活性画分；並びに
（５）微生物を使用して脱脂ゴマからセサミノールを産生する方法であって、
微生物を脱脂ゴマを含む培地中で培養することと、
得られた培養物を８０％メタノールで抽出することと、および
得られた抽出液をＸＡＤ−７カラムに供し、１００％酢酸エチルを用いて溶出することと、
を具備するセサミノール産生方法；
である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
［活性物質の製造方法］
本発明は、脱脂ゴマを微生物により発酵することにより、ＳＯＤ様活性画分および／または抗酸化活性画分を得る方法である。
【０００９】
この方法は、一般的に安価な肥料または飼料として処理されている脱脂ゴマを、微生物で発酵することにより、優れたＳＯＤ様活性画分および／または抗酸化活性画分が得られるという本発明者らによる驚くべき発見に基づく。
【００１０】
具体的には、本発明の方法は、一般的に使用される食品微生物を脱脂ゴマを含有する培養液に添加し、微生物により発酵させる過程を具備する。得られた前記発酵物からは、優れたＳＯＤ様活性画分および抗酸化活性画分が得られる。詳しくは、この発酵物を、水メタノール混液により振盪抽出し、更に遠心分離して、その上清を得ることにより、活性画分を得ることが可能である。前記上清を更に、蒸発による溶媒除去、凍結乾燥等のそれ自身公知の方法により、乾燥物とすることも可能である。
【００１１】
この分画に好ましい溶媒は、水メタノール混液であり、その濃度はメタノールが４０％から１００％でよく、好ましくは約８０％メタノールである。
【００１２】
また、ここで使用する「活性画分」の語は、特に断りのない場合は、前記発酵物を水メタノール混液で抽出した画分をいう。この活性画分は、前記水メタノール混液により抽出しただけの画分であってもよく、これを濃縮した濃縮画分であってもよく、また、濃縮乾燥したものであってもよい。
【００１３】
本発明の方法に使用可能な微生物は、種々の微生物でよく、例えば、一般的に使用される食品微生物等を含むである。ここで用いる「食品微生物」とは、味噌、醤油、パン、および酒等の発酵食品を製造するために使用される微生物をいう。例えば、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ；一般的にショウユコウジカビともいう）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ；一般的にキコウジカビともいう）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ；一般的にアワモリのコウジカビともいう） 等の糸状菌および酵母等である。最も効率よく、且つ多量に活性物質を生成することから、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）を用いることが好ましい。更に、アスペルギルス・ソヤ、アスペルギルス・アワモリおよびアスペルギルス・オリゼー、特に、アスペルギルス・ソヤ・ＩＡＭ２６６４株、ＩＡＭ２６７３株、ＩＡＭ２６７４株、ＩＡＭ２６７７株、ＩＡＭ２７０３株、ＩＡＭ１２１７６株およびＩＡＭ１３９０２株、アスペルギルス・オリゼー・ＩＡＭ２６０９株およびＩＡＭ２６４９株、並びにアスペルギルス・アワモリＩＡＭ２１１２株を用いることがより好ましい。更に、アスペルギルス・ソヤ・ＩＡＭ２６７４株は、後述する通り、安定した本発明のＳＯＤ様活性画分を得ることが可能であることから特に好ましい。
【００１４】
本発明の方法において使用可能な発酵用培地は、蒸留水に脱脂ゴマを添加することにで調製することが可能である。このとき、添加する脱脂ゴマの量は、５０ｇ／ｌから５００ｇ／ｌでよく、２００ｇ／ｌから３００ｇ／ｌが好ましい。このように調製した発酵用培地に、使用する微生物を白金耳により接種するればよい。
【００１５】
本発明の発酵は、用いる微生物の要求性に応じて、好気性条件下で振盪培養を行っても、好気性条件下で静置培養を行っても、または暗所で嫌気性条件下で行なう。
【００１６】
また、本発明における発酵は、ｐＨ６から８で行なうことができ、より好ましくはｐＨ６．５から７．２で行なう。ｐＨの調整は、例えば、リン酸緩衝液を用いることにより行い得る
本方法における発酵は、２０℃から４５℃で行なうことが可能であり、３０℃から４５℃が好ましく、３６℃がより好ましい。
【００１７】
後述の実施例において詳述するが、アスペルギルス・ソヤにより発酵した後に、水メタノール混液により抽出して得た本発明のは活性画分は、未発酵脱脂ゴマを水メタノール液で同様に抽出した画分よりも、約２倍のＳＯＤ様活性および抗酸化活性がある。
【００１８】
また、本発明の更なる側面は、セサミノールの製造方法である。セサミノール画分は、アスペルギルス・ソヤ等の微生物により脱脂ゴマを発酵した後、水メタノール混液で抽出して得た活性画分を、更にＸＡＤ７カラムに供し、１００％の酢酸エチルにより溶出することで得られる。
【００１９】
［活性画分］
本発明の更なる側面は、脱脂ゴマを微生物により発酵することにより得られるＳＯＤ様活性画分である。具体的には、脱脂ゴマを微生物により発酵した後に得られる水メタノール混液による抽出画分である。本発明の画分は、優れたＳＯＤ様活性を有する。このようなＳＯＤ様活性画分は、前述した方法により製造することが可能である。
【００２０】
本発明のＳＯＤ様活性画分は、これを、更に、ＸＡＤ７を用いたカラムクロマトグラフィに供し、各溶出液により得られた溶出画分、即ち、１００％水溶出画分、２０％、４０％、６０％、８０％および１００％メタノール溶出画分、並びに１００％酢酸エチル溶出画分の全てに分布している。また、後述するように、セサミノールにＳＯＤ様活性がないことは確認されているので、本発明の活性画分に含まれる活性成分は、セサミノール以外の成分であることが示唆される。また、後述する用途に、前記夫々の溶出画分を単独で使用してもよく、それらを組み合わせて使用してもよい。
【００２１】
本発明のもう１つの側面は、脱脂ゴマを微生物により発酵することにより得られる抗酸化活性画分である。具体的には、脱脂ゴマを微生物により発酵した後に得られる水メタノール混液抽出画分である。本発明の活性画分は、優れた抗酸化活性を有する。このような抗酸化活性画分は、前述した方法により製造することが可能である。
【００２２】
本発明の抗酸化活性画分は、これを、更に、ＸＡＤ７を用いたカラムクロマトグラフィに供し、各溶出液により得られる夫々の溶出画分、即ち、１００％水溶出画分、２０％、４０％、６０％、８０％および１００％メタノール溶出画分、並びに１００％酢酸エチル溶出画分の全てに分布している。一方、セサミノール画分は、１００％酢酸エチル溶出画分である。従って、本発明の活性画分に含まれる活性成分は、セサミノールと、それ以外の成分とからなることが示唆される。また、後述する用途に、前記夫々の溶出画分を単独で使用してもよく、それらを組み合わせて使用してもよい。
【００２３】
［活性画分の利用分野］
本発明のＳＯＤ様活性画分および抗酸化活性画分、または夫々の溶出画分を、医薬品、化粧品、医薬部外品および飲食料品等に含有することが可能である。その場合、一般的に使用される担体、賦形剤、保存剤等の添加物と混合することが可能である。
【００２４】
本発明の画分を活性成分として含有する医薬組成物は、様々な活性酸素の関与する疾患（例えば、虚血性疾患、動脈硬化、糖尿病、腎炎、老化、癌等）の予防および治療に効果的である。また、本発明の活性画分を添加した食品は、栄養強化食品または特定保健用食品として用いることが可能である。更に、抗酸化剤として食品、その他に用いることも可能である。
【００２５】
本発明の医薬組成物は、上述した方法により得られたＳＯＤ様活性画分および抗酸化活性画分、またはそれらを上記の通りにＸＡＤ７カラムに供した後で得られた溶出画分の少なくとも１を活性成分として含有する。また、本画分を含有する医薬組成物は、その上更に、他の様々な薬効を有する薬剤を共に含有することも可能である。この場合、配合による各薬剤の有効性、安全性等に問題がないことを確認することは当業者に周知である。
【００２６】
本発明の医薬組成物は、ＳＯＤ様活性画分および／または抗酸化活性画分は、乾燥重量で、投与量約１０ｍｇ／体重ｋｇ／日から約１００ｍｇ／体重ｋｇ／日の範囲内での有効量を、１回または数回に分割する方法で投与すればよい。或いは、前記用量の範囲に相当する本発明の何れかの画分の有効量を、１回または数回に分割する方法で投与すればよい。厳密な用量は、投与様式、投与薬の剤形、治療する対象の症状および体重等により広範に変化し得るので、責任のある医師または獣医師の経験と選択によって決定されるべきものである。
【００２７】
投与経路は、活性成分が適切且つ希望する作用部位に効果的に輸送される限り、経口または非経口投与、例えば経直腸、経皮膚、皮下、静脈内、尿道内、筋肉内、鼻腔内、眼科的経路等の如何なる経路による投与も可能であるが、経口が好ましい。
【００２８】
本発明を化粧品として利用する場合の例は、所望に応じて、種々の担体および添加剤等と混合することが可能であり、洗浄料、クリーム、化粧水、メーキャップ用品、毛髪用製品、日焼け止め製品等の特殊香粧品等に含有することが可能であるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
本発明の食品として利用できるものの例には、米類、豆類、小麦粉、澱粉、砂糖、澱粉糖、パン類、麺類、菓子類、食用油、乳製品（バター、チーズ、アイスクリーム、乳酸菌製品等）、豆製品、園芸加工品（缶詰、ジャム、乾燥果実、果実飲料等）、清涼飲料、発酵食品類（酒類、食酢、醤油、ソース、味噌、納豆、漬物等）、肉製品類（ハム、ベーコン、ソーセージ、缶詰類）、卵製品、水酸食品類、各種冷凍食品類、乾燥食品類、インスタント食品類、およびレトルト食品類等が挙げられる。また、調味料類、酵素製品類等に添加することも可能である。しかし、これらに限定されるものではない。
【００３０】
【実施例】
１．菌の選別
種々の菌を、脱脂ゴマ培地中に生育させた。その発酵産物中に得られたＳＯＤ様活性を比較した。その結果から、ＳＯＤ様活性画分産生能の高い菌を選別した。
【００３１】
［サンプルの調製方法］
以下に列記した菌を、以下の適切な培地の斜面培養した。その後、各菌を、三角フラスコ中の下記のゴマ脱脂粕培地、１０ｍｌに接種し、恒温振盪培養器（ＡＴ１２Ｒ、ＴＨＯＭＡＳ社製）を用いて、室温にて、１５５ｒｐｍで振盪培養を６日間行なった。
【００３２】
振盪培養後、夫々に４０ｍｌのメタノールを添加し、約１日間、振盪抽出（１５４から１５５ｒｍｐ）した後、その抽出液を微量遠心分離器（ＭＸ−１６０、ＴＯＭＹ社製）を用いて、１５℃、９０００ｒｐｍ、１５分間の低温遠心分離を行ない、その上清をサンプルとした。
【００３３】
［対象微生物］
試験に供した食品微生物は、３種１０株の糸状菌である。これらの菌株は、財団法人応用微生物研究奨励会（東京都文京区）より入手した。以下に、使用した菌名を表１に纏めた。
【００３４】
【表１】
【００３５】
［培地］
脱脂ゴマ培地は、脱脂ゴマ（かどや製油社製）２ｇに蒸留水１０ｍｌを添加し、リン酸緩衝液にてｐＨ７．０に調整することにより得た。
【００３６】
［試験方法］
ＳＯＤ様活性測定法（ＮＢＴ法）
上記で得たサンプルについて、体外診断用医薬品として販売されている「ＳＯＤテストワコー」（和光社製）を用いたＮＢＴ法によりＳＯＤ様活性測定を行なった。
【００３７】
［測定原理］
ＮＢＴ法は、キサンチン（ＸＡ）−キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）系により生成する・Ｏ２ −がＳＯＤによりＨ２Ｏ２とＯ２に不均一化される割合を、ジホルマザンの生成阻害率、即ち、ＳＯＤ無添加時のジホルマザン生成により得られる吸光度に対する、その減少率から測定する方法である。
【００３８】
［測定方法］
任意に希釈したサンプルを０．１ｍｌずつ試験管に添加し、そこに、０．４０ｍＭのキサンチンおよび０．２４ｍＭのニトロブルーテトラゾリウム（ＮＯ２−ＴＢ）を含有するリン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ８．０）である発色試液の１．０ｍｌと、０．０４９ユニット／ｍｌのキサンチンオキシダーゼを含有する酵素液の１．０ｍｌと加え、温浴中（３７℃）で２０分間、反応した。２０分後、６９ｍＭのドデシル硫酸ナトリム溶液を２ｍｌ添加して反応停止し、吸光度を測定した。
【００３９】
得られた吸光度から、この反応系で生ずるスーパーオキサイドアニオンによるニトロブルーテトラゾリウム還元に伴なう吸光度（５６０ｎｍ）の増加に対する、各サンプルの増加阻害率（消去活性能）を求めた。具体的には、以下の式より阻害率Ｉ（％）を求めた。
【００４０】
【数１】
【００４１】
その結果、以下の表６に示す。この結果から、アスペルギルス・ソヤが特に優れていることが明らかとなった。詳しくは、アスペルギルス・ソヤおよびアスペルギルス・オリゼー、特に、アスペルギルス・ソヤ・ＩＡＭ２６６４株、ＩＡＭ２６７３株、ＩＡＭ２６７４株、ＩＡＭ２６７７株、ＩＡＭ２７０３株、ＩＡＭ１２１７６株およびＩＡＭ１３９０２株、アスペルギルス・オリゼー・ＩＡＭ２６０９株およびＩＡＭ２６４９株、並びにアスペルギルス・アワモリＩＡＭ２１１２株は、優れた活性物質産生能を有していることが明らかとなった。また、アスペルギルス・ソヤ・ＩＡＭ２６７４株は、本発明のＳＯＤ様活性画分を安定して産生することも既に明らかになっている。従って、以後の試験は、アスペルギルス・ソヤ・ＩＡＭ２６７４株を用いて行なった。
【００４２】
【表２】
【００４３】
ここで、表中の略称は、以下の通りである；Ａ．Ｓはアスペルギルス・ソヤ、Ａ．Ｏ．はアスペルギルス・オリゼー、Ａ．Ａ．はアスペルギルス・アワモリである。
【００４４】
２．ＳＯＤ様活性画分についての検討
脱脂ゴマをアスペルギルス・ソヤ、即ち、コウジカビで発酵することにより得られるＳＯＤ様活性画分について更に検討を進めた。
【００４５】
［脱脂ゴマ抽出物との比較］
まず、本発明のためにアスペルギルス・ソヤで発酵した脱脂ゴマと、発酵工程を経ていない未発酵脱脂ゴマの抽出画分について、ＳＯＤ様活性を比較した。
【００４６】
ＳＯＤ様活性画分は、次のように調製した。アスペルギルス・ソヤを上記の脱脂ゴマ培地中に白金耳により接種し、恒温振盪培養器（ＡＴ１２Ｒ、ＴＨＯＭＡＳ社製）中で、３６℃、１５５ｒｐｍで、６日間培養した。培養後、４０ｍｌの１００％メタノールにより３６℃、１５５ｒｐｍで、１日間振盪抽出を行なった。その後、遠心分離を微量遠心分離器（ＭＸ−１６０、ＴＯＭＹ社製）で行なって上清を得た。上清を濃縮乾燥した。更に、この濃縮乾燥品を５０ｍｌの８０％メタノールに溶解し、または、上清から０．１ｍｌ分取し、上記方法と同様にＳＯＤを測定した。
【００４７】
このとき、比較対照物として、未発酵脱脂ゴマ水メタノール抽出液を用いた。脱脂ゴマ水メタノール抽出液は、２ｇの脱脂ゴマ（かどや製油社製）を５０ｍｌの８０％メタノール液を用いて、３６℃、１５５ｒｐｍで、１日間振盪抽出を行ない調製し、前記の方法によりＳＯＤ活性を測定した。
【００４８】
その結果、本発明のＳＯＤ活性画分は、未発酵脱脂ゴマよりも高いＳＯＤ様活性を有していた（図１）。
【００４９】
［溶出画分の比較］
次に、未発酵脱脂ゴマと、アスペルギルス・ソヤによる発酵により得た本発明のＳＯＤ様活性画分とを、更にカラムクロマトグラフィーに供し、各溶出液により得た溶出画分について、ＳＯＤ活性を測定した。
【００５０】
本発明のＳＯＤ様活性画分は、次のように得た。上記の脱脂ゴマ培地中にアスペルギルス・ソヤを白金耳で接種し、恒温振盪培養器（ＡＴ１２Ｒ、ＴＨＯＭＡＳ社製）中で、３６℃、１５５ｒｐｍで、６日間培養した。培養後、４０ｍｌの１００％メタノールにより３６℃、１５５ｒｐｍで、１日間振盪抽出を行なった。その後、遠心分離を微量遠心分離器（ＭＸ−１６０、ＴＯＭＹ社製）で行なって上清を得た。更に、この上清をエバポレーターにより５ｍｌまで濃縮した。この濃縮液をＸＡＤ−７カラム（オルガノ社製）による逆相カラムクロマトグラフィーに供した。その後、溶出液として、１００％水、２０％メタノール、４０％メタノール、６０％メタノール、８０％メタノール、１００％メタノールおよび１００％酢酸エチルを順次用いて溶出し、各溶出画分を得た。各溶出は、カラムの３倍量の溶出液を用いたので、得られた溶出液は約５０ｍｌに濃縮してからサンプルとした。得られたサンプルについてのＳＯＤ様活性を測定した。
【００５１】
その結果を図２に示す。未発酵脱脂ゴマ抽出液の１００％水、２０％メタノール、４０％メタノール、および６０％メタノールによる各溶出画分は、夫々に対応するアスペルギルス・ソヤの発酵物から得た溶出画分に対して、約半分程度の活性しかなかった。一方、未発酵脱脂ゴマの８０％メタノール、１００％メタノールおよび１００％酢酸エチルによる溶出画分の活性については、検出できなかった。この結果から、アスペルギルス・ソヤの発酵により、未発酵脱脂ゴマからでは得られなかった、新規活性画分を得ることが可能であることが分かった。
【００５２】
３．１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）還元活性
次に、脱脂ゴマをアスペルギルス・ソヤで発酵することにより得られる画分について、抗酸化活性能を評価した。抗酸化活性能の評価は、１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（以下、ＤＰＰＨと略す）還元活性を測定することにより行なった。
【００５３】
［ＤＰＰＨ還元活性の測定方法］
ＤＰＰＨ還元活性の測定は、ブロイス（Ｍ．Ｓ．Ｂｒｏｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ，１８１，１１９９−１２００（１９５８））の方法に従い行なった。この方法は、ＤＰＰＨの吸光度が、抗酸化性物質により減少することを指標とする。
【００５４】
具体的には、エタノール中の０．１ｍＭのＤＰＰＨ溶液２ｍｌに、測定すべきサンプルを２５μｌ添加し、２０分後に５１６ｎｍにおける吸光度を測定する方法である。
【００５５】
［サンプルの調製］
サンプルは、次のように調製した。上記の脱脂ゴマ培地中に、アスペルギルス・ソヤを白金耳により接種し、恒温振盪培養器（ＡＴ１２Ｒ、ＴＨＯＭＡＳ社製）中で、３６℃、１５５ｒｐｍで、６日間培養した。培養後、４０ｍｌの１００％メタノールにより３６℃、１５５ｒｐｍで、１日間振盪抽出を行なった。その後、遠心分離を微量遠心分離器（ＭＸ−１６０、ＴＯＭＹ社製）で行なって上清を得た。上清を濃縮乾燥した。この濃縮乾固品を、８０％メタノールの５０ｍｌに溶解してサンプルとした。
【００５６】
また、陽性対照として用いたセサミノールおよびα−トコフェロールは、ジメチルスルホキシド中で、５０μＭ、１００μＭ、５００μＭ、１ｍＭ、５ｍＭおよび１０ｍＭに調製した。
【００５７】
更に、比較対照物として、発酵過程を経ていない未発酵脱脂ゴマ抽出物を用いた。未発酵脱脂ゴマ抽出物は、２ｇの脱脂ゴマ（かどや製油社製）を５０ｍｌの８０％メタノール液を用いて、３６℃、１５５ｒｐｍで、１日間振盪抽出を行ない調製した。
【００５８】
前述の通りに調製したサンプルについて、ＤＰＰＨ還元活性を測定した。その結果、本発明のアスペルギルス・ソヤ発酵抽出物は、未発酵脱脂ゴマ抽出物よりも高い活性を有していることが分かった（図３）。
【００５９】
［溶出画分の比較］
次に、未発酵脱脂ゴマ抽出物と、アスペルギルス・ソヤの発酵により得た本発明の抽出画分を、カラムクロマトグラフィーにより分画し、得られた各溶出画分について抗酸化活性を測定した。
【００６０】
本発明の活性画分は、次のように得た。上記の脱脂ゴマ培地中にアスペルギルス・ソヤを白金耳により接種し、恒温振盪培養器（ＡＴ１２Ｒ、ＴＨＯＭＡＳ社製）中で、３６℃、１５５ｒｐｍで、６日間培養した。培養後、８０％メタノールにより３６℃、１５５ｒｐｍで、１日間振盪抽出を行なった。その後、遠心分離を微量遠心分離器（ＭＸ−１６０、ＴＯＭＹ社製）で行なって上清を活性画分として得た。
【００６１】
得られた活性画分を、エバポレーターにより約５ｍｌまで濃縮した。更に、これをＸＡＤ−７カラム（オルガノ社製）による逆相カラムクロマトグラフィーに供した。その後、溶出液として、１００％水、２０％メタノール、４０％メタノール、６０％メタノール、８０％メタノール、１００％メタノールおよび１００％酢酸エチルを順次用いて溶出し、各溶出画分を得た。各溶出は、カラムの３倍量の溶出液により行なったので、各分画溶液を約５０ｍｌに濃縮してからサンプルとした。得られたサンプルについてのＤＰＰＨ還元活性を測定した。
【００６２】
その結果を図４に示す。何れの溶出画分に関しても、アスペルギルス・ソヤ発酵活性画分由来の方が、未発酵脱脂ゴマ抽出物由来のものに比較し、高い活性を有していることが明らかとなった。
【００６３】
［培養物に含まれるセサミノールの抗酸化活性］
アスペルギルス・ソヤ発酵活性画分の１００％酢酸エチル画分をＨＰＬＣで精製した結果、セサミノールを得た。セサミノールは、０．５μＭから１０ｍＭまで段階毎にジメチルスルホキシドに溶解してサンプルとした。得られたサンプルについてのＤＰＰＨ還元活性を上述と同様な方法で測定した。
【００６４】
その結果を図５に示す。本発明の培養物に含まれるセサミノールは、代表的な抗酸化剤α−トコフェロールと同等の高い活性を有していることが示された。
【００６５】
【発明の効果】
本発明の方法により、脱脂ゴマを、微生物、特にアスペルギルス・ソヤを用いて発酵することにより、ＳＯＤ様活性画分および抗酸化活性画分を得ることが可能である。
【００６６】
脱脂ゴマを微生物により発酵することにより得られるＳＯＤ様活性画分は、未発酵脱脂ゴマを抽出しただけの画分とは異なる成分を含み、その活性は非常に高い。
【００６７】
また、本発明のセサミノール製造方法を行なうことにより、脱脂ゴマを有効に利用でき、それにより多量のセサミノールを得ることも可能である。また、本セサミノール製造方法は、微生物による発酵を利用した方法であるため、単離した酵素を利用する方法とは異なり、製造方法がシンプルである。また、本方法に使用する微生物は、何度も繰り返して使用することが可能であるため、経費を節減することにも繋がる。
【図面の簡単な説明】
【図１】アスペルギルス・ソヤ発酵物と未発酵脱脂ゴマとの８０％メタノール抽出液のＳＯＤ様活性を示すグラフ。
【図２】アスペルギルス・ソヤ発酵物と未発酵脱脂ゴマとを夫々ＸＡＤ７カラムクロマトグラフィーに供することにより得られた各画分のＳＯＤ様活性を示すグラフ。
【図３】アスペルギルス・ソヤ発酵物と未発酵脱脂ゴマとのメタノール抽出液のＤＰＰＨ還元活性を示すグラフ。
【図４】アスペルギルス・ソヤ発酵物と未発酵脱脂ゴマとを夫々ＸＡＤ７カラムクロマトグラフィーに供することにより得られた各分画のＤＰＰＨ還元活性を示すグラフ。
【図５】アスペルギルス・ソヤ発酵物からの酢酸エチル１００％画分からＨＰＬＣを用いて単離したセサミノールと、α−トコフェロールのＤＰＰＨ還元活性を示すグラフ。
【発明の属する技術分野】
微生物を用いて発酵することにより、脱脂ゴマからＳＯＤ様活性画分および抗酸化活性画分を得る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ゴマは、大豆等の油脂原料穀物に比べて原料単価が高価である。それにも関わらず、搾油処理後の脱脂ゴマは、一般的に、肥料または飼料として安価な脱脂大豆と同等に利用されているに過ぎない。
【０００３】
一方、ゴマは抗酸化性作用を有していることで知られている。しかしながら、その活性は脂溶性のリグナン類に限られており、脱脂ゴマに含まれるその量は極僅かであることも、また、分かっている。したがって、従来の方法により、脱脂ゴマからリグナン類を抽出回収しても、採算が合わず実用的ではなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、脱脂ゴマの有効利用法を提供することを目的とする。具体的には、脱脂ゴマから、優れたＳＯＤ様活性画分および抗酸化活性画分を得る方法を提供することを目的とし、更に、それにより得られたＳＯＤ様活性画分および抗酸化活性画分を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、一般的に肥料または飼料として処理されている脱脂ゴマを、微生物で発酵することにより、優れたＳＯＤ様活性画分および／または抗酸化活性画分が得られるという驚くべき発見をした。本発明は、この発見を基に成されたものである。
【０００６】
従って、上記課題を解決し、目的を達成する手段は以下に示す通りである。即ち、
（１） 脱脂ゴマを微生物により発酵することにより、ＳＯＤ様活性画分および／または抗酸化活性画分を得る方法；
（２） （１）に記載の微生物がアスペルギルス属の微生物である方法。
【０００７】
（３） （１）または２の何れか１項に記載のＳＯＤ様活性画分および／または抗酸化活性画分を得る方法であって、
前記微生物を脱脂ゴマを含む培地中で培養することと、および
得られた培養物を８０％メタノールで抽出することと、
を具備する方法；
（４） 脱脂ゴマを微生物により発酵することにより得られるＳＯＤ様活性画分および／または抗酸化活性画分；並びに
（５）微生物を使用して脱脂ゴマからセサミノールを産生する方法であって、
微生物を脱脂ゴマを含む培地中で培養することと、
得られた培養物を８０％メタノールで抽出することと、および
得られた抽出液をＸＡＤ−７カラムに供し、１００％酢酸エチルを用いて溶出することと、
を具備するセサミノール産生方法；
である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
［活性物質の製造方法］
本発明は、脱脂ゴマを微生物により発酵することにより、ＳＯＤ様活性画分および／または抗酸化活性画分を得る方法である。
【０００９】
この方法は、一般的に安価な肥料または飼料として処理されている脱脂ゴマを、微生物で発酵することにより、優れたＳＯＤ様活性画分および／または抗酸化活性画分が得られるという本発明者らによる驚くべき発見に基づく。
【００１０】
具体的には、本発明の方法は、一般的に使用される食品微生物を脱脂ゴマを含有する培養液に添加し、微生物により発酵させる過程を具備する。得られた前記発酵物からは、優れたＳＯＤ様活性画分および抗酸化活性画分が得られる。詳しくは、この発酵物を、水メタノール混液により振盪抽出し、更に遠心分離して、その上清を得ることにより、活性画分を得ることが可能である。前記上清を更に、蒸発による溶媒除去、凍結乾燥等のそれ自身公知の方法により、乾燥物とすることも可能である。
【００１１】
この分画に好ましい溶媒は、水メタノール混液であり、その濃度はメタノールが４０％から１００％でよく、好ましくは約８０％メタノールである。
【００１２】
また、ここで使用する「活性画分」の語は、特に断りのない場合は、前記発酵物を水メタノール混液で抽出した画分をいう。この活性画分は、前記水メタノール混液により抽出しただけの画分であってもよく、これを濃縮した濃縮画分であってもよく、また、濃縮乾燥したものであってもよい。
【００１３】
本発明の方法に使用可能な微生物は、種々の微生物でよく、例えば、一般的に使用される食品微生物等を含むである。ここで用いる「食品微生物」とは、味噌、醤油、パン、および酒等の発酵食品を製造するために使用される微生物をいう。例えば、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ；一般的にショウユコウジカビともいう）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ；一般的にキコウジカビともいう）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ；一般的にアワモリのコウジカビともいう） 等の糸状菌および酵母等である。最も効率よく、且つ多量に活性物質を生成することから、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）を用いることが好ましい。更に、アスペルギルス・ソヤ、アスペルギルス・アワモリおよびアスペルギルス・オリゼー、特に、アスペルギルス・ソヤ・ＩＡＭ２６６４株、ＩＡＭ２６７３株、ＩＡＭ２６７４株、ＩＡＭ２６７７株、ＩＡＭ２７０３株、ＩＡＭ１２１７６株およびＩＡＭ１３９０２株、アスペルギルス・オリゼー・ＩＡＭ２６０９株およびＩＡＭ２６４９株、並びにアスペルギルス・アワモリＩＡＭ２１１２株を用いることがより好ましい。更に、アスペルギルス・ソヤ・ＩＡＭ２６７４株は、後述する通り、安定した本発明のＳＯＤ様活性画分を得ることが可能であることから特に好ましい。
【００１４】
本発明の方法において使用可能な発酵用培地は、蒸留水に脱脂ゴマを添加することにで調製することが可能である。このとき、添加する脱脂ゴマの量は、５０ｇ／ｌから５００ｇ／ｌでよく、２００ｇ／ｌから３００ｇ／ｌが好ましい。このように調製した発酵用培地に、使用する微生物を白金耳により接種するればよい。
【００１５】
本発明の発酵は、用いる微生物の要求性に応じて、好気性条件下で振盪培養を行っても、好気性条件下で静置培養を行っても、または暗所で嫌気性条件下で行なう。
【００１６】
また、本発明における発酵は、ｐＨ６から８で行なうことができ、より好ましくはｐＨ６．５から７．２で行なう。ｐＨの調整は、例えば、リン酸緩衝液を用いることにより行い得る
本方法における発酵は、２０℃から４５℃で行なうことが可能であり、３０℃から４５℃が好ましく、３６℃がより好ましい。
【００１７】
後述の実施例において詳述するが、アスペルギルス・ソヤにより発酵した後に、水メタノール混液により抽出して得た本発明のは活性画分は、未発酵脱脂ゴマを水メタノール液で同様に抽出した画分よりも、約２倍のＳＯＤ様活性および抗酸化活性がある。
【００１８】
また、本発明の更なる側面は、セサミノールの製造方法である。セサミノール画分は、アスペルギルス・ソヤ等の微生物により脱脂ゴマを発酵した後、水メタノール混液で抽出して得た活性画分を、更にＸＡＤ７カラムに供し、１００％の酢酸エチルにより溶出することで得られる。
【００１９】
［活性画分］
本発明の更なる側面は、脱脂ゴマを微生物により発酵することにより得られるＳＯＤ様活性画分である。具体的には、脱脂ゴマを微生物により発酵した後に得られる水メタノール混液による抽出画分である。本発明の画分は、優れたＳＯＤ様活性を有する。このようなＳＯＤ様活性画分は、前述した方法により製造することが可能である。
【００２０】
本発明のＳＯＤ様活性画分は、これを、更に、ＸＡＤ７を用いたカラムクロマトグラフィに供し、各溶出液により得られた溶出画分、即ち、１００％水溶出画分、２０％、４０％、６０％、８０％および１００％メタノール溶出画分、並びに１００％酢酸エチル溶出画分の全てに分布している。また、後述するように、セサミノールにＳＯＤ様活性がないことは確認されているので、本発明の活性画分に含まれる活性成分は、セサミノール以外の成分であることが示唆される。また、後述する用途に、前記夫々の溶出画分を単独で使用してもよく、それらを組み合わせて使用してもよい。
【００２１】
本発明のもう１つの側面は、脱脂ゴマを微生物により発酵することにより得られる抗酸化活性画分である。具体的には、脱脂ゴマを微生物により発酵した後に得られる水メタノール混液抽出画分である。本発明の活性画分は、優れた抗酸化活性を有する。このような抗酸化活性画分は、前述した方法により製造することが可能である。
【００２２】
本発明の抗酸化活性画分は、これを、更に、ＸＡＤ７を用いたカラムクロマトグラフィに供し、各溶出液により得られる夫々の溶出画分、即ち、１００％水溶出画分、２０％、４０％、６０％、８０％および１００％メタノール溶出画分、並びに１００％酢酸エチル溶出画分の全てに分布している。一方、セサミノール画分は、１００％酢酸エチル溶出画分である。従って、本発明の活性画分に含まれる活性成分は、セサミノールと、それ以外の成分とからなることが示唆される。また、後述する用途に、前記夫々の溶出画分を単独で使用してもよく、それらを組み合わせて使用してもよい。
【００２３】
［活性画分の利用分野］
本発明のＳＯＤ様活性画分および抗酸化活性画分、または夫々の溶出画分を、医薬品、化粧品、医薬部外品および飲食料品等に含有することが可能である。その場合、一般的に使用される担体、賦形剤、保存剤等の添加物と混合することが可能である。
【００２４】
本発明の画分を活性成分として含有する医薬組成物は、様々な活性酸素の関与する疾患（例えば、虚血性疾患、動脈硬化、糖尿病、腎炎、老化、癌等）の予防および治療に効果的である。また、本発明の活性画分を添加した食品は、栄養強化食品または特定保健用食品として用いることが可能である。更に、抗酸化剤として食品、その他に用いることも可能である。
【００２５】
本発明の医薬組成物は、上述した方法により得られたＳＯＤ様活性画分および抗酸化活性画分、またはそれらを上記の通りにＸＡＤ７カラムに供した後で得られた溶出画分の少なくとも１を活性成分として含有する。また、本画分を含有する医薬組成物は、その上更に、他の様々な薬効を有する薬剤を共に含有することも可能である。この場合、配合による各薬剤の有効性、安全性等に問題がないことを確認することは当業者に周知である。
【００２６】
本発明の医薬組成物は、ＳＯＤ様活性画分および／または抗酸化活性画分は、乾燥重量で、投与量約１０ｍｇ／体重ｋｇ／日から約１００ｍｇ／体重ｋｇ／日の範囲内での有効量を、１回または数回に分割する方法で投与すればよい。或いは、前記用量の範囲に相当する本発明の何れかの画分の有効量を、１回または数回に分割する方法で投与すればよい。厳密な用量は、投与様式、投与薬の剤形、治療する対象の症状および体重等により広範に変化し得るので、責任のある医師または獣医師の経験と選択によって決定されるべきものである。
【００２７】
投与経路は、活性成分が適切且つ希望する作用部位に効果的に輸送される限り、経口または非経口投与、例えば経直腸、経皮膚、皮下、静脈内、尿道内、筋肉内、鼻腔内、眼科的経路等の如何なる経路による投与も可能であるが、経口が好ましい。
【００２８】
本発明を化粧品として利用する場合の例は、所望に応じて、種々の担体および添加剤等と混合することが可能であり、洗浄料、クリーム、化粧水、メーキャップ用品、毛髪用製品、日焼け止め製品等の特殊香粧品等に含有することが可能であるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
本発明の食品として利用できるものの例には、米類、豆類、小麦粉、澱粉、砂糖、澱粉糖、パン類、麺類、菓子類、食用油、乳製品（バター、チーズ、アイスクリーム、乳酸菌製品等）、豆製品、園芸加工品（缶詰、ジャム、乾燥果実、果実飲料等）、清涼飲料、発酵食品類（酒類、食酢、醤油、ソース、味噌、納豆、漬物等）、肉製品類（ハム、ベーコン、ソーセージ、缶詰類）、卵製品、水酸食品類、各種冷凍食品類、乾燥食品類、インスタント食品類、およびレトルト食品類等が挙げられる。また、調味料類、酵素製品類等に添加することも可能である。しかし、これらに限定されるものではない。
【００３０】
【実施例】
１．菌の選別
種々の菌を、脱脂ゴマ培地中に生育させた。その発酵産物中に得られたＳＯＤ様活性を比較した。その結果から、ＳＯＤ様活性画分産生能の高い菌を選別した。
【００３１】
［サンプルの調製方法］
以下に列記した菌を、以下の適切な培地の斜面培養した。その後、各菌を、三角フラスコ中の下記のゴマ脱脂粕培地、１０ｍｌに接種し、恒温振盪培養器（ＡＴ１２Ｒ、ＴＨＯＭＡＳ社製）を用いて、室温にて、１５５ｒｐｍで振盪培養を６日間行なった。
【００３２】
振盪培養後、夫々に４０ｍｌのメタノールを添加し、約１日間、振盪抽出（１５４から１５５ｒｍｐ）した後、その抽出液を微量遠心分離器（ＭＸ−１６０、ＴＯＭＹ社製）を用いて、１５℃、９０００ｒｐｍ、１５分間の低温遠心分離を行ない、その上清をサンプルとした。
【００３３】
［対象微生物］
試験に供した食品微生物は、３種１０株の糸状菌である。これらの菌株は、財団法人応用微生物研究奨励会（東京都文京区）より入手した。以下に、使用した菌名を表１に纏めた。
【００３４】
【表１】
［培地］
脱脂ゴマ培地は、脱脂ゴマ（かどや製油社製）２ｇに蒸留水１０ｍｌを添加し、リン酸緩衝液にてｐＨ７．０に調整することにより得た。
【００３６】
［試験方法］
ＳＯＤ様活性測定法（ＮＢＴ法）
上記で得たサンプルについて、体外診断用医薬品として販売されている「ＳＯＤテストワコー」（和光社製）を用いたＮＢＴ法によりＳＯＤ様活性測定を行なった。
【００３７】
［測定原理］
ＮＢＴ法は、キサンチン（ＸＡ）−キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）系により生成する・Ｏ２ −がＳＯＤによりＨ２Ｏ２とＯ２に不均一化される割合を、ジホルマザンの生成阻害率、即ち、ＳＯＤ無添加時のジホルマザン生成により得られる吸光度に対する、その減少率から測定する方法である。
【００３８】
［測定方法］
任意に希釈したサンプルを０．１ｍｌずつ試験管に添加し、そこに、０．４０ｍＭのキサンチンおよび０．２４ｍＭのニトロブルーテトラゾリウム（ＮＯ２−ＴＢ）を含有するリン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ８．０）である発色試液の１．０ｍｌと、０．０４９ユニット／ｍｌのキサンチンオキシダーゼを含有する酵素液の１．０ｍｌと加え、温浴中（３７℃）で２０分間、反応した。２０分後、６９ｍＭのドデシル硫酸ナトリム溶液を２ｍｌ添加して反応停止し、吸光度を測定した。
【００３９】
得られた吸光度から、この反応系で生ずるスーパーオキサイドアニオンによるニトロブルーテトラゾリウム還元に伴なう吸光度（５６０ｎｍ）の増加に対する、各サンプルの増加阻害率（消去活性能）を求めた。具体的には、以下の式より阻害率Ｉ（％）を求めた。
【００４０】
【数１】
その結果、以下の表６に示す。この結果から、アスペルギルス・ソヤが特に優れていることが明らかとなった。詳しくは、アスペルギルス・ソヤおよびアスペルギルス・オリゼー、特に、アスペルギルス・ソヤ・ＩＡＭ２６６４株、ＩＡＭ２６７３株、ＩＡＭ２６７４株、ＩＡＭ２６７７株、ＩＡＭ２７０３株、ＩＡＭ１２１７６株およびＩＡＭ１３９０２株、アスペルギルス・オリゼー・ＩＡＭ２６０９株およびＩＡＭ２６４９株、並びにアスペルギルス・アワモリＩＡＭ２１１２株は、優れた活性物質産生能を有していることが明らかとなった。また、アスペルギルス・ソヤ・ＩＡＭ２６７４株は、本発明のＳＯＤ様活性画分を安定して産生することも既に明らかになっている。従って、以後の試験は、アスペルギルス・ソヤ・ＩＡＭ２６７４株を用いて行なった。
【００４２】
【表２】
ここで、表中の略称は、以下の通りである；Ａ．Ｓはアスペルギルス・ソヤ、Ａ．Ｏ．はアスペルギルス・オリゼー、Ａ．Ａ．はアスペルギルス・アワモリである。
【００４４】
２．ＳＯＤ様活性画分についての検討
脱脂ゴマをアスペルギルス・ソヤ、即ち、コウジカビで発酵することにより得られるＳＯＤ様活性画分について更に検討を進めた。
【００４５】
［脱脂ゴマ抽出物との比較］
まず、本発明のためにアスペルギルス・ソヤで発酵した脱脂ゴマと、発酵工程を経ていない未発酵脱脂ゴマの抽出画分について、ＳＯＤ様活性を比較した。
【００４６】
ＳＯＤ様活性画分は、次のように調製した。アスペルギルス・ソヤを上記の脱脂ゴマ培地中に白金耳により接種し、恒温振盪培養器（ＡＴ１２Ｒ、ＴＨＯＭＡＳ社製）中で、３６℃、１５５ｒｐｍで、６日間培養した。培養後、４０ｍｌの１００％メタノールにより３６℃、１５５ｒｐｍで、１日間振盪抽出を行なった。その後、遠心分離を微量遠心分離器（ＭＸ−１６０、ＴＯＭＹ社製）で行なって上清を得た。上清を濃縮乾燥した。更に、この濃縮乾燥品を５０ｍｌの８０％メタノールに溶解し、または、上清から０．１ｍｌ分取し、上記方法と同様にＳＯＤを測定した。
【００４７】
このとき、比較対照物として、未発酵脱脂ゴマ水メタノール抽出液を用いた。脱脂ゴマ水メタノール抽出液は、２ｇの脱脂ゴマ（かどや製油社製）を５０ｍｌの８０％メタノール液を用いて、３６℃、１５５ｒｐｍで、１日間振盪抽出を行ない調製し、前記の方法によりＳＯＤ活性を測定した。
【００４８】
その結果、本発明のＳＯＤ活性画分は、未発酵脱脂ゴマよりも高いＳＯＤ様活性を有していた（図１）。
【００４９】
［溶出画分の比較］
次に、未発酵脱脂ゴマと、アスペルギルス・ソヤによる発酵により得た本発明のＳＯＤ様活性画分とを、更にカラムクロマトグラフィーに供し、各溶出液により得た溶出画分について、ＳＯＤ活性を測定した。
【００５０】
本発明のＳＯＤ様活性画分は、次のように得た。上記の脱脂ゴマ培地中にアスペルギルス・ソヤを白金耳で接種し、恒温振盪培養器（ＡＴ１２Ｒ、ＴＨＯＭＡＳ社製）中で、３６℃、１５５ｒｐｍで、６日間培養した。培養後、４０ｍｌの１００％メタノールにより３６℃、１５５ｒｐｍで、１日間振盪抽出を行なった。その後、遠心分離を微量遠心分離器（ＭＸ−１６０、ＴＯＭＹ社製）で行なって上清を得た。更に、この上清をエバポレーターにより５ｍｌまで濃縮した。この濃縮液をＸＡＤ−７カラム（オルガノ社製）による逆相カラムクロマトグラフィーに供した。その後、溶出液として、１００％水、２０％メタノール、４０％メタノール、６０％メタノール、８０％メタノール、１００％メタノールおよび１００％酢酸エチルを順次用いて溶出し、各溶出画分を得た。各溶出は、カラムの３倍量の溶出液を用いたので、得られた溶出液は約５０ｍｌに濃縮してからサンプルとした。得られたサンプルについてのＳＯＤ様活性を測定した。
【００５１】
その結果を図２に示す。未発酵脱脂ゴマ抽出液の１００％水、２０％メタノール、４０％メタノール、および６０％メタノールによる各溶出画分は、夫々に対応するアスペルギルス・ソヤの発酵物から得た溶出画分に対して、約半分程度の活性しかなかった。一方、未発酵脱脂ゴマの８０％メタノール、１００％メタノールおよび１００％酢酸エチルによる溶出画分の活性については、検出できなかった。この結果から、アスペルギルス・ソヤの発酵により、未発酵脱脂ゴマからでは得られなかった、新規活性画分を得ることが可能であることが分かった。
【００５２】
３．１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）還元活性
次に、脱脂ゴマをアスペルギルス・ソヤで発酵することにより得られる画分について、抗酸化活性能を評価した。抗酸化活性能の評価は、１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（以下、ＤＰＰＨと略す）還元活性を測定することにより行なった。
【００５３】
［ＤＰＰＨ還元活性の測定方法］
ＤＰＰＨ還元活性の測定は、ブロイス（Ｍ．Ｓ．Ｂｒｏｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ，１８１，１１９９−１２００（１９５８））の方法に従い行なった。この方法は、ＤＰＰＨの吸光度が、抗酸化性物質により減少することを指標とする。
【００５４】
具体的には、エタノール中の０．１ｍＭのＤＰＰＨ溶液２ｍｌに、測定すべきサンプルを２５μｌ添加し、２０分後に５１６ｎｍにおける吸光度を測定する方法である。
【００５５】
［サンプルの調製］
サンプルは、次のように調製した。上記の脱脂ゴマ培地中に、アスペルギルス・ソヤを白金耳により接種し、恒温振盪培養器（ＡＴ１２Ｒ、ＴＨＯＭＡＳ社製）中で、３６℃、１５５ｒｐｍで、６日間培養した。培養後、４０ｍｌの１００％メタノールにより３６℃、１５５ｒｐｍで、１日間振盪抽出を行なった。その後、遠心分離を微量遠心分離器（ＭＸ−１６０、ＴＯＭＹ社製）で行なって上清を得た。上清を濃縮乾燥した。この濃縮乾固品を、８０％メタノールの５０ｍｌに溶解してサンプルとした。
【００５６】
また、陽性対照として用いたセサミノールおよびα−トコフェロールは、ジメチルスルホキシド中で、５０μＭ、１００μＭ、５００μＭ、１ｍＭ、５ｍＭおよび１０ｍＭに調製した。
【００５７】
更に、比較対照物として、発酵過程を経ていない未発酵脱脂ゴマ抽出物を用いた。未発酵脱脂ゴマ抽出物は、２ｇの脱脂ゴマ（かどや製油社製）を５０ｍｌの８０％メタノール液を用いて、３６℃、１５５ｒｐｍで、１日間振盪抽出を行ない調製した。
【００５８】
前述の通りに調製したサンプルについて、ＤＰＰＨ還元活性を測定した。その結果、本発明のアスペルギルス・ソヤ発酵抽出物は、未発酵脱脂ゴマ抽出物よりも高い活性を有していることが分かった（図３）。
【００５９】
［溶出画分の比較］
次に、未発酵脱脂ゴマ抽出物と、アスペルギルス・ソヤの発酵により得た本発明の抽出画分を、カラムクロマトグラフィーにより分画し、得られた各溶出画分について抗酸化活性を測定した。
【００６０】
本発明の活性画分は、次のように得た。上記の脱脂ゴマ培地中にアスペルギルス・ソヤを白金耳により接種し、恒温振盪培養器（ＡＴ１２Ｒ、ＴＨＯＭＡＳ社製）中で、３６℃、１５５ｒｐｍで、６日間培養した。培養後、８０％メタノールにより３６℃、１５５ｒｐｍで、１日間振盪抽出を行なった。その後、遠心分離を微量遠心分離器（ＭＸ−１６０、ＴＯＭＹ社製）で行なって上清を活性画分として得た。
【００６１】
得られた活性画分を、エバポレーターにより約５ｍｌまで濃縮した。更に、これをＸＡＤ−７カラム（オルガノ社製）による逆相カラムクロマトグラフィーに供した。その後、溶出液として、１００％水、２０％メタノール、４０％メタノール、６０％メタノール、８０％メタノール、１００％メタノールおよび１００％酢酸エチルを順次用いて溶出し、各溶出画分を得た。各溶出は、カラムの３倍量の溶出液により行なったので、各分画溶液を約５０ｍｌに濃縮してからサンプルとした。得られたサンプルについてのＤＰＰＨ還元活性を測定した。
【００６２】
その結果を図４に示す。何れの溶出画分に関しても、アスペルギルス・ソヤ発酵活性画分由来の方が、未発酵脱脂ゴマ抽出物由来のものに比較し、高い活性を有していることが明らかとなった。
【００６３】
［培養物に含まれるセサミノールの抗酸化活性］
アスペルギルス・ソヤ発酵活性画分の１００％酢酸エチル画分をＨＰＬＣで精製した結果、セサミノールを得た。セサミノールは、０．５μＭから１０ｍＭまで段階毎にジメチルスルホキシドに溶解してサンプルとした。得られたサンプルについてのＤＰＰＨ還元活性を上述と同様な方法で測定した。
【００６４】
その結果を図５に示す。本発明の培養物に含まれるセサミノールは、代表的な抗酸化剤α−トコフェロールと同等の高い活性を有していることが示された。
【００６５】
【発明の効果】
本発明の方法により、脱脂ゴマを、微生物、特にアスペルギルス・ソヤを用いて発酵することにより、ＳＯＤ様活性画分および抗酸化活性画分を得ることが可能である。
【００６６】
脱脂ゴマを微生物により発酵することにより得られるＳＯＤ様活性画分は、未発酵脱脂ゴマを抽出しただけの画分とは異なる成分を含み、その活性は非常に高い。
【００６７】
また、本発明のセサミノール製造方法を行なうことにより、脱脂ゴマを有効に利用でき、それにより多量のセサミノールを得ることも可能である。また、本セサミノール製造方法は、微生物による発酵を利用した方法であるため、単離した酵素を利用する方法とは異なり、製造方法がシンプルである。また、本方法に使用する微生物は、何度も繰り返して使用することが可能であるため、経費を節減することにも繋がる。
【図面の簡単な説明】
【図１】アスペルギルス・ソヤ発酵物と未発酵脱脂ゴマとの８０％メタノール抽出液のＳＯＤ様活性を示すグラフ。
【図２】アスペルギルス・ソヤ発酵物と未発酵脱脂ゴマとを夫々ＸＡＤ７カラムクロマトグラフィーに供することにより得られた各画分のＳＯＤ様活性を示すグラフ。
【図３】アスペルギルス・ソヤ発酵物と未発酵脱脂ゴマとのメタノール抽出液のＤＰＰＨ還元活性を示すグラフ。
【図４】アスペルギルス・ソヤ発酵物と未発酵脱脂ゴマとを夫々ＸＡＤ７カラムクロマトグラフィーに供することにより得られた各分画のＤＰＰＨ還元活性を示すグラフ。
【図５】アスペルギルス・ソヤ発酵物からの酢酸エチル１００％画分からＨＰＬＣを用いて単離したセサミノールと、α−トコフェロールのＤＰＰＨ還元活性を示すグラフ。
Claims (3)
- ＳＯＤ様活性による活性酸素抑制効果を有する活性酸素抑制剤であって、
アスペルギルス属の微生物を、脱脂ゴマを含む培地中で培養する工程と、
得られた培養物をメタノール水溶液で抽出する工程と、
を具備する、脱脂ゴマを微生物により発酵してＳＯＤ様活性画分を得る方法によって得られた画分を含むことを特徴とする活性酸素抑制剤。 - 前記メタノール水溶液は、４０％〜１００％メタノールである、請求項１に記載の活性酸素抑制剤。
- 前記メタノール水溶液は、８０％メタノールである、請求項２に記載の活性酸素抑制剤。
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