EA004148B1 - Фармацевтическая композиция на основе 3,6-ангидрогалактопиранозы, и/или ее производных, и/или растворимого сахарида, содержащего данное соединение, применение композиции и входящих в ее состав ингредиентов, пищевой продукт, содержащий указанную композицию, и применение пищевого продукта - Google Patents

Фармацевтическая композиция на основе 3,6-ангидрогалактопиранозы, и/или ее производных, и/или растворимого сахарида, содержащего данное соединение, применение композиции и входящих в ее состав ингредиентов, пищевой продукт, содержащий указанную композицию, и применение пищевого продукта Download PDF

Info

Publication number
EA004148B1
EA004148B1 EA200000512A EA200000512A EA004148B1 EA 004148 B1 EA004148 B1 EA 004148B1 EA 200000512 A EA200000512 A EA 200000512A EA 200000512 A EA200000512 A EA 200000512A EA 004148 B1 EA004148 B1 EA 004148B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
aldehyde
anhydrogalactopyranose
activity
hydrate
production
Prior art date
Application number
EA200000512A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200000512A1 (ru
Inventor
Татсудзи Еноки
Хироаки Сагава
Таканари Томинага
Еидзи Нисийама
Нобуто Койама
Такеси Сакаи
Фу-Гонг Йу
Катсусиге Икаи
Икуносин Като
Original Assignee
Такара Сузо Ко., Лтд
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Такара Сузо Ко., Лтд filed Critical Такара Сузо Ко., Лтд
Publication of EA200000512A1 publication Critical patent/EA200000512A1/ru
Publication of EA004148B1 publication Critical patent/EA004148B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/3472—Compounds of undetermined constitution obtained from animals or plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/3544—Organic compounds containing hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/3562—Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A61K31/341—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide not condensed with another ring, e.g. ranitidine, furosemide, bufetolol, muscarine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/60—Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/10—Laxatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)

Abstract

Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из 3,6-ангидрогалактопиранозы, представленной формулой Iее альдегида и гидрата и 2-O-метилированных производных 3,6-ангидрогалактопиранозы, ее альдегида и гидрата; и растворимого сахарида, содержащего данное соединение на своем восстанавливающем конце, проявляющая апоптоз-индуцирующую, антипролиферативную, канцеростатическую, антиаллергическую, иммуномодулирующую и подавляющую образование липид-пероксидного радикала, образование оксида азота (NO) и образование меланина активность, что позволяет использовать ее в качестве средства профилактики и лечения состояний, при которых показано вышеуказанное действие, в частности, в составе пищевого продукта.

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к использованию физиологически активных веществ, полученных из водорослей. Более конкретно, оно относится к фармацевтической композиции, антиоксиданту, консервирующей композиции для пищевых продуктов и напитков и косметической композиции, которые включают в качестве активного ингредиента данное физиологически активное вещество, а также к функциональному пищевому продукту и напитку, которые включают данное физиологически активное вещество. Кроме того, оно относится к сахариду, проявляющему подобные функции.
Обоснование создания изобретения
Недавно обнаружен способ гибели клеток или тканей, названный апоптоз (саморастворение или саморазрушение клеток).
Апоптоз - это гибель, которая изначально запрограммирована в геноме клетки, и которая отличается от некроза, представляющего собой патологическую гибель клетки. Определенные внешние и внутренние факторы запускают активность генов, программирующих апоптоз, чтобы вызвать биосинтез протеина запрограммированной гибели клетки. В некоторых случаях протеин запрограммированной гибели клетки, присутствующий в клетке в своей неактивной форме, становится активным. Образованный таким образом активный протеин запрограммированной гибели клетки разрушает клетку, приводя ее к гибели.
Большое значение имеет тот факт, что активация апоптоза в желаемых тканях или клетках делает их способными удалять из живого организма клетки, не являющиеся необходимыми, или вредные для организма клетки организма естественным путем.
Цели изобретения
Известно, что олигосахариды, полученные из водорослей, такие как агар, используются как исходный материал для пищевых продуктов (Еооб Сйеш1са1, 1988-2, 40-44; Веккайи Еооб С11списа1 (Ех1га ИишЬег Еооб Сйет1са1)-4, 1990, ИесетЬет, 127-131; 1Р-А-6-38691). Однако их физиологические функции, такие как вызывающая апоптоз активность, неизвестны.
Главной целью настоящего изобретения является разработка из продуктов естественного происхождения высоко безопасного вещества, имеющего такую физиологическую функцию, как активность в индуцировании апоптоза, а также создание фармацевтической композиции для предупреждения или лечения заболеваний, чувствительных к данным веществам, такой как композиция для индуцирования апоптоза, включающей данное вещество в качестве активного ингредиента, а также функциональных пищевых продуктов и напитков, включающих данное вещество в качестве составляющего его компонента.
Краткое изложение сущности изобретения
Вкратце, первый аспект настоящего изобретения представляет собой фармацевтическую композицию, которая включает в качестве активного ингредиента по крайней мере один член, выбранный из группы, состоящей из соединения, выбранного из группы, состоящей из 3,6-ангидрогалактопиранозы, представленной формулой 1
У°н
ОН , ее альдегида и гидрата, и 2-О-метилированных производных 3,6-ангидрогалактопиранозы, альдегида и гидрата; и растворимого сахарида, содержащего соединение на своем восстанавливающем конце, причем названная композиция используется для лечения или предупреждения заболеваний, чувствительных к данному соединению.
Второй аспект настоящего изобретения представляет собой пищевой продукт или напиток, содержащий по крайней мере один член, выбранный из группы, состоящей из соединения, выбранного из группы, состоящей из 3,6-ангидрогалактопиранозы, представленной формулой 1, ее альдегида и гидрата, и 2-О-метилированных производных 3,6ангидрогалактопиранозы, ее альдегида или гидрата; и растворимого сахарила, содержащего соединение на своем восстанавливающем конце, причем названный пищевой продукт или напиток используются для облегчения болезненного состояния или для предупреждения заболевания, чувствительного к данному соединению.
Третий аспект настоящего изобретения представляет собой антиоксидант, который включает в качестве активного ингредиента по меньшей мере один из членов, выбранных из группы, состоящей из соединения, выбранного из группы, состоящей из 3,6-ангидрогалактопиранозы, представленной формулой 1, ее альдегида и гидрата, и 2-О-метилированных производных 3,6ангидрогалактопиранозы, ее альдегида и гидрата; и растворимого сахарида, содержащего данное соединение.
Четвертый аспект настоящего изобретения представляет собой пищевой продукт или напиток, включающий антиоксидант третьего аспекта настоящего изобретения.
Пятый аспект настоящего изобретения представляет собой антиоксидант, выбранный из группы, состоящей из соединения, выбранного из группы, состоящей из 3,6-ангидрогалактопиранозы, представленной формулой 1, ее альдегида и гидрата, и 2-О-метилированных производных 3,63 ангидрогалактопиранозы, ее альдегида и гидрата; и растворимого сахарида, содержащего данное соединение.
Шестой аспект настоящего изобретения представляет собой консервирующую композицию для сохранения пищевых продуктов и напитков в свежем состоянии, который включает в качестве активного ингредиента по меньшей мере один член, выбранный из группы, состоящей из соединения, выбранного из группы, состоящей из 3,6-ангидрогалактопиранозы, представленной формулой 1, ее альдегида и гидрата, и 2-О-метилированных производных 3,6ангидрогалактопиранозы, ее альдегида и гидрата; и растворимого сахарида, содержащего данное соединение.
Седьмой аспект настоящего изобретения представляет собой косметическую композицию, которая включает в качестве активного ингредиента по крайней мере один сахарид, выбранный из группы, состоящей из агаробиозы, агаротетраозы, агарогексаозы, агарооктаозы, ккарабиозы и в-Э-галактопиранозил-3,6-ангидро2-О-метил-Ь-галактозы.
Восьмой аспект настоящего изобретения представляет собой кислый пищевой продукт или напиток, включающий в качестве активного ингредиента по крайней мере один член, выбранный из группы, состоящей из соединения, выбранного из группы, состоящей из 3,6-ангидрогалактопиранозы, представленной формулой 1, ее альдегида и гидрата, и 2-О-метилированных производных 3,6ангидрогалактопиранозы, ее альдегида и гидрата; и растворимого сахарила, содержащего данное соединение.
Еще один аспект настоящего изобретения представляет собой использование по крайней мере одного члена, выбранного из группы, состоящей из соединения, выбранного из группы, состоящей из 3,6-ангидрогалактопиранозы, представленной формулой 1, ее альдегида и гидрата, и 2-О-метилированных производных 3,6ангидрогалактопиранозы, ее альдегида и гидрата; и растворимого сахарила, содержащего данное соединение, при получении фармацевтической композиции, пищевого продукта или напитка, антиоксиданта, консервирующей композиции для сохранения свежести пищевых продуктов или напитков или косметической композиции.
Ниже настоящее изобретение будет объяснено более подробно со ссылками на прилагающиеся рисунки.
Краткое описание рисунков
Фиг. 1 иллюстрирует элюационный график гель-фильтрации агара, подвергнутого разложению с помощью 0,12н. НС1.
Фиг. 2 иллюстрирует элюационный график гель-фильтрации агара, подвергнутого разложению с помощью 1н. хлористо-водородной кислоты.
Фиг. 3 иллюстрирует хроматограмму
ВЭЖХ с исключением по размерам агара, подвергнутого разложению кислотой.
Фиг. 4 иллюстрирует масс-спектр апоптозиндуцирующего и канцеростатического вещества.
Фиг. 5 иллюстрирует спектр 1 Н-ЯМР апоптоз-индуцирующего и канцеростатического вещества (гидратная форма).
Фиг. 6 иллюстрирует спектр 1 Н-ЯМР апоптоз-индуцирующего и канцеростатического вещества (альдегидная форма) .
Фиг. 7 иллюстрирует график элюирования ВЭЖХ с нормальной фазой агаробиозы, агаротетраозы и агарогексаозы.
Фиг. 8 иллюстрирует масс-спектр пика, полученного на 66,7 мин.
Фиг. 9 иллюстрирует масс-спектр пика, полученного на 78,5 мин.
Фиг. 10 иллюстрирует масс-спектр пика, полученного на 85,5 мин.
Фиг. 11 иллюстрирует масс-спектр 3,6ангидро-Ь-галактозы.
Фиг. 12 иллюстрирует спектр 1 Н-ЯМР 3,6ангидро-Ь-галактозы (гидрат).
Фиг. 13 иллюстрирует спектр 1Н-ЯМР 3,6ангидро-Ь-галактозы (альдегид).
Фиг. 14 иллюстрирует отношение между временем инкубации и числом жизнеспособных клеток, полученных путем инкубации НЬ-60 клеток с добавлением одного из олигосахаридов в конечной концентрации 250 мкМ.
Фиг. 15 иллюстрирует отношение между временем инкубации и числом жизнеспособных клеток, полученных путем инкубации НЬ-60 клеток с добавлением одного из олигосахаридов в конечной концентрации 125 мкМ.
Фиг. 16 иллюстрирует график элюирования ВЭЖХ с нормальной фазой агара, обработанного нагреванием в 0,5М фосфате.
Фиг. 17 иллюстрирует калибровочную кривую агаробиоза.
Фиг. 18 иллюстрирует соотношение между временем нагревания и количеством агаробиозы, полученного в 0,2% растворе агара в 0,1М НС1.
Фиг. 19 иллюстрирует соотношение между временем нагревания и количеством агаробиоза, полученного в 0,2% растворе агара в 0,1М лимонной кислоте.
Фиг. 20 иллюстрирует образование агароолигосахарида в 500 мМ лимонной кислоте при
80°С.
Фиг. 21 иллюстрирует образование агароолигосахарида в 500 мМ лимонной кислоте при 95°С.
Фиг. 22 иллюстрирует образование агароолигосахаридов в 1200 мМ молочной кислоте при 80°С.
Фиг. 23 иллюстрирует образование агароолигосахаридов в 1200 мМ молочной кислоте при 95°С.
Фиг. 24 иллюстрирует получение агароолигосахаридов в 1000 мМ яблочной кислоте при 80°С.
Фиг. 25 иллюстрирует получение агароолигосахаридов в 1000 мМ яблочной кислоте при 95°С.
Фиг. 26 иллюстрирует получение агароолигосахаридов в 1000 мМ яблочной кислоте при 70°С.
Фиг. 27 иллюстрирует хроматограмму
ВЭЖХ с нормальной фазой к-карагенана, расщепленного с помощью кислоты.
Фиг. 28 иллюстрирует масс-спектр апоптоз-индуцирующего и карциностатического вещества.
Фиг. 29 иллюстрирует спектр 1Н-ЯМР апоптоз-индуцирующего и карциностатического вещества.
Фиг. 30 иллюстрирует результат гельфильтрации на колонке с Се11и1о1ше ОСЬ-25.
Фиг. 31 иллюстрирует результаты гельфильтрации на колонке с 8ерйабех ЬН-20.
Фиг. 32 иллюстрирует масс спектр собой Р-О-галактопиранозил-(1-4)-3,6-ангидро-2-Ометил-Ь-галактозы.
Фиг. 33 иллюстрирует Ή-ЯМР спектр β-Όгалактопиранозил-( 1-4)-3,6-ангидро-2-О-метилЬ-галактозы.
Фиг. 34 иллюстрирует соотношение между концентрацией агаробиозы и уровнем поглощения 3Н-тимидина при бластогенезе лимфоцитов, индуцированном СопА.
Фиг. 35 иллюстрирует соотношение между концентрацией агаробиозы и уровнем поглощения 3Н-тимидина в смешанной лимфоцитной реакции.
Фиг. 36 иллюстрирует концентрацию ΝΟ- 2 в культуральной среде в присутствии различных концентраций агаробиозы.
Фиг. 37 иллюстрирует концентрацию ΝΟ- 2 в культуральной среде в присутствии различных концентраций неоагаробиозы.
Фиг. 38 иллюстрирует концентрацию ΝΟ- 2 в культуральной среде в присутствии раствора агара, расщепленного хлористо-водородной кислотой или лимонной кислотой.
Фиг. 39 иллюстрирует концентрацию ΝΟ-2 в культуральной среде в присутствии 3,6ангидро-И-галактозы или галактозы.
Фиг. 40 иллюстрирует концентрацию ΝΟ-2 в культуральной среде при различных условиях.
Фиг. 41 иллюстрирует канцеростатическую активность олигосахаридов настоящего изобретения.
Фиг. 42 иллюстрирует ингибирующую активность в РСА реакции олигосахаридов настоящего изобретения.
Подробное описание изобретения
Альдегид 3,6-ангидрогалактопиранозы формулы 1 (далее здесь называемый просто как «3,6-ангидрогалактопираноза») настоящего изобретения представляет собой соединение формулы 2
Его гидрат представляет собой соединение формулы 3
2-О-метилированное производное 3,6ангидрогалактопиранозы представляет собой соединение формулы 4
Альдегид метилированного производного представляет собой соединение формулы 5
Гидрат метилированного производного представляет собой соединение формулы 6
Структура используемых здесь формул с 1 по 6 может быть представлена различными формами. Имеется в виду, что формулы с 1 по 6 включают подобные различные формы и их возможные таутомеры. Кроме того, конфигурация формул с 1 по 6 не ограничивается конкретно одной, если только сохраняется желаемая активность, и может быть представлена Иформой и Ь-формой, или их смесью.
Растворимые сахариды настоящего изобретения представляют собой, без какого-либо ограничения, растворимые сахариды, содержащие по крайней мере одно соединение, выбранное из 3,6-ангидрогалактопиранозы, ее альдегида и гидрата, и 2-О-метилированного производного 3,6-ангидрогалактопиранозы, ее альдегида и гидрата (далее здесь они все вместе называются «соединения формул с 1 по 6), и могут быть получены путем разложения вещества, содержащего по крайней мере одно соединение, выбранное из соединений формул с 1 по 6 (здесь
Ί далее просто называемое, как «исходное вещество») в условиях кислой среды при рН ниже 7, создаваемой кислотой и/или ферментом, или путем химического синтеза. Растворимые сахариды настоящего изобретения не ограничиваются конкретно одним, если только они не отвердевают или не переходят в полутвердое состояние (желатинируются) при их использовании. Таким образом, любые сахариды, содержащие по крайней мере одно соединение, выбранное из соединений формул с 1 по 6, которые при их использовании могут быть превращены в золь, включаются в растворимые сахариды настоящего изобретения. Примеры растворимых сахаридов, использующихся в настоящем изобретении, включают сахариды, не восстанавливающий конец которых представляет собой сахар, отличный от Ь-галактоза-6сульфата, например, агаробиозу, агаротетраозу, агарогексаозу, агарооктаозу, к-карабиозу, β-Όгалактопиранозил-3,6-ангидро -2-О -метил-Ьгалактозу и им подобные.
Исходные вещества, используемые для получения растворимых сахаридов, не ограничиваются конкретно одним и включают, например, вязкие полисахариды из красных водорослей, такие как агароза, агаропектин, фуноран, порфиран, карагенан, фурцеларан и гипнеан [КуотЙ8и-8Йирраи 1пс., «Та1ои5е1кадаки 1-Кадакикеи (ВюскетБиу οί РоНкасскапйек 1Скет18йу-), рр. 314 (1969)].
Исходные вещества включают также такие материалы, которые содержат эти полисахариды. Например, в качестве исходного материала для агарозы и агаропектина используются красные водоросли, относящиеся к роду СеНШасеае. такие как СеШшт атаики, СеШшт ]арошсит, СеШшт расШсит, СеШшт 5иЬсо51а1ит, Р1егос1ай1а 1еиш5, АсаиШореШк _)арошса и им подобные, красные водоросли, относящиеся к роду бтасйапасеае, такие как СгасПапа уетгисока, бтасйапа §1§а8 и им подобные, красные водоросли, относящиеся к роду Сегат1асеае, такие как Сетатшт коийоц Сатру1аеркога куриаео1йек и им подобные, и другие красные водоросли. Обычно в качестве исходного материала используется сочетание нескольких видов красных водорослей. Хотя обычно в качестве исходного материала используют водоросли, высушенные на солнце, в настоящем изобретении могут быть использованы водоросли как свежие, так и высушенные. Также могут использоваться водоросли, которые отбеливаются во время опрыскивания водой во время сушки, то есть отбеленные грубые водоросли.
Исходный материал в виде водорослей экстрагируется горячей водой и затем охлаждается для получения «холодного желе». Воду удаляют из этого «холодного желе» путем дегидратации замораживанием или компрессионной дегидратации с последующим получением агара. Агар в различных формах, таких как брусок, полоса, пластина, нить или порошок и им подобных, может быть использован вне зависимости от источника водорослей. Обычно агар содержит 70% агарозы и около 30% агаропектина. Агар затем подвергают дальнейшей очистке для получения агарозы с высокой степенью чистоты. Может быть использована очищенная агароза с высокой степенью чистоты или низкой степенью чистоты, с различным содержанием самой агарозы.
Исходные вещества включают вышеупомянутый исходный материал в виде водорослей, ледяного желе, агар, очищенную агарозу, очищенный агаропектин и промежуточные продукты или побочные продукты, полученные в процессе получения этих веществ.
Агароза представляет собой полисахарид, основная структура которого альтернативно связана с Ό-галактозой и 3,6-ангидро-Ьгалактозой. В этой структуре 1 положение Όгалактозы и 4 положение 3,4-ангидро-Ьгалактозы связываются друг с другом посредством β-гликозной связи, и 3,6-ангидро-Ьгалактоза (положение 1) и Ό-галактоза (3 положение) связываются друг с другом посредством α-гликозидной связи, а-1,3-связь гидролизуется посредством мягкого гидролиза, проводимого с разбавленной кислотой или α-агарозой [СаГЬойуйт., Век., Уо1. 66, р.207 (1978)], и в-1,4-связь избирательно гидролизуется β-агарозой.
Карагенан представляет собой полисахарид, который содержится в красных водорослях, таких как 61датйиасеае, 8о11епасеае, Нуриеасеае и им подобных. Известны к-карагенан, λ-карагенан и η-карагенан.
К-карагенан имеет основную структуру, в которой О-галактоза-4-сульфат в положении 1 связан с 3,6-ангидро-О-галактозой (по 4 положению) посредством β-гликозидной связи, 3,6ангидро-Э-галактоза по 1 положению связана с О-галактоза-4-сульфатом в 3 положении посредством α-гликозидной связи, и они альтернативно повторяются. λ-карагенан имеет основную структуру, в которой Ό-галактоза в 1 положении связана с О-галактоза-2,6-дисульфатом в 4 положении посредством β-гликозидной связи, О-галактоза-2,6-дисульфат в 1 положении связан с Ό-галактозой в 3 положении посредством α-гликозидной связи, и они альтернативно повторяются. Карагенан используется в качестве агента, желатинирующего пищевые продукты.
Исходные вещества настоящего изобретения также включают частично разложенные продукты вышеприведенных исходных веществ с использованием химических, физических и/или ферментативных способов.
Примеры химического разложения включают гидролиз в условиях кислой или нейтральной среды. Примеры физического разложения включают радиационное воздействие электромагнитных волн или ультразвуковых волн.
Примеры ферментативного разложения включают гидролиз с помощью гидролазы, такой как агараза, карагеназа и им подобных.
Разложение исходных веществ в условиях кислой или нейтральной среды не ограничивается конкретно одним видом разложения, при условии, что разложение дает соединения формул с 1 по 6 и растворимые полисахариды, содержащие по меньшей мере одно из этих соединений, обладающих активностью, включающей: апоптоз; канцеростатическую активность; антиоксидантную активность, такую как активность по подавлению продуцирования активного кислорода, активность по подавлению продуцирования оксида азота (здесь далее называемый N0); иммунорегуляторную активность и им подобные. Примеры сахаридов включают агаробиози агаротетраозу, агарогексаозу, агарооктаозу скарабиозу (здесь далее называемый просто «карабиоза»), в-О-галактопиранозил-3,6ангидро-2-О-метил-Ь-галактозу и им подобные; и сахариды, содержащие соединения, выбранные из соединений формул с 1 по 6 на их восстанавливающем конце, чьи не восстанавливающие концы представляют собой сахариды, отличные от Ь-галактоза-6-сульфата.
Например, исходные вещества растворяются или суспендируются в кислоте и взаимодействуют с получением соединений, выбранных из соединений формул с 1 по 6 и растворимых сахаридов, содержащих по крайней мере одно из этих соединений, использующихся в настоящем изобретении. Реакционное время, требующееся для получения соединения, выбранного из соединений формул с 1 по 6 и растворимых сахаридов, содержащих по крайней мере одно из этих соединений, может быть сокращено при нагревании в ходе процесса.
Для растворения или суспендирования исходных веществ (например, вещества, которое содержит агарозу, или самой агарозы) используются такие виды кислот, которые не ограничены конкретно одной, и могут быть как неорганическими, такими как хлористо-водородная кислота, азотная кислота и им подобные; органическими кислотами, такими как лимонная кислота, муравьиная кислота, уксусная кислота, молочная кислота, аскорбиновая кислота и им подобные, твердыми кислотами, такими как катионобменные смолы, катионобменные волокна, катионобменные мембраны, и им подобные.
Концентрация кислот не имеет ограничений, но кислоты могут использоваться в концентрациях от 0,0001 до 5н., предпочтительно от 0,01 до 1н. Кроме того, температура реакции не имеет ограничений, но реакция может проводиться при температуре от 0 до 200°С, предпочтительно от 20 до 130°С. Время реакции также не имеет ограничений, но реакция может проводиться в течение от нескольких секунд до нескольких дней. Подходящие вид и концентрация кислот, температура реакции и время протекания реакции могу быть выбраны в зависимости от конкретного вида исходных веществ, содержащих по крайней мере одно соединение, выбранное из соединений формул с 1 по 6, таких как агароза или карагенан, а также из представляющих интерес соединений, выбранных из соединений формул с 1 по 6, от выхода сахаридов, содержащих данное соединение, и уровня полимеризации растворимого представляющего интерес сахарида, содержащего соединение, выбранное из соединений формул от 1 по 6 на своем восстанавливающем конце. В целом реакция кислотного разложения протекает более быстро при выборе сильной кислоты, чем при выборе слабой кислоты, при кислоте с высокой концентрацией быстрее, чем при кислоте с низкой концентрацией, и при высокой температуре быстрее, чем при низкой температуре.
Кроме того, в общем, когда используется твердая кислота, сильная катионобменная смола дает лучшую эффективность реакции разложения, чем слабая катионобменная смола. Кроме того, когда количество твердой кислоты относительно количества исходного вещества больше, и температура реакции выше, реакция кислотного разложения протекает более быстро.
Например, раствор сахарила, выбранного в настоящем изобретении, который получен путем суспендирования агара в 0,1н. хлористоводородной кислоте в количестве 10% по весу, растворения агара путем нагревания при 100°С в течение 13 мин и удаления нерастворимых веществ, в дальнейшем не желатинируется даже когда раствор охлаждают до его точки замерзания. Когда сахариды, содержащиеся в этом растворе, анализируют с помощью гель-фильтрации ВЭЖХ, ВЭЖХ с нормальной фазой и им подобными способами, сахариды с более высоким молекулярным весом едва наблюдаются, и почти все из сахаридов являются расщепленными до растворимых сахаридов, причем содержат 10 или меньшее количество сахаров. Подобным же образом, в случае твердых кислот, раствор сахаридов настоящего изобретения, полученный путем превращения 1 вес. ч. коммерчески доступной сильной катионобменной смолы Να-типа в ее Н-тип с помощью 1н. у хлористоводородной кислоты, помещенной в 79 вес. ч. деионизированной воды, добавления и суспендирования 10 вес. ч. агара и нагревания смеси при 95°С в течение 180 мин, не дает больше желатинирования, даже если раствор охладить до его точки замерзания. Когда сахариды, содержащиеся в этом растворе, анализируют путем гель-фильтрации ВЭЖХ, ВЭЖХ с нормальной фазой и им подобными способами, сахариды с высоким молекулярным весом едва наблюдаются, и почти все сахариды являются расщепленными до растворимых сахаридов, содержащих 10 или меньше сахаров.
Кроме того, с целью получения растворимого сахарида, используемого в настоящем изобретении, имеющего соединение, выбранное из соединений формул с 1 по 6, на своем восстанавливающем конце, может быть получено большое количество физиологически активного олигосахарида, такого как сахарид для антиоксиданта, путем применения органической кислоты, такой как лимонная кислота, молочная кислота или яблочная кислота, выбирая подходящую концентрацию кислоты в пределах от нескольких 10 мМ до нескольких М, температуру нагревания от 70 до 95°С, и время нагревания от нескольких 10-ков минут до 24 ч. Кроме того, полученный физиологически активный олигосахарид обладает стабильностью при длительном хранении, если он получен в условиях кислой среды, если предусмотреть, чтобы условия не стали щелочными после гидролиза.
Разложенные исходные вещества могут быть использованы непосредственно как они есть, или после нейтрализации, как соединения для применения в настоящем изобретении, то есть соединения, выбранные из соединений формул с 1 по 6, и растворимых сахаридов, содержащих по крайней одно из этих соединений, например, такие сахариды, как агаробиоза, агаротетраоза, агарогексаоза, агарооктаоза ккарабиозд и в-Л-галактопиранозил-3,6-ангидро2-О-метил-Ь-галактоза и им подобные. Однако они могут быть далее очищены. Соединение, выбранное из соединений формул с 1 по 6 и растворимые сахариды, содержащие эти соединения на своих восстанавливающих концах, например, олигосахариды, такие как агаробиоза, агаротетраоза, агарогексаоза, агарооктаоза, к-карабиоза и в-Л-галактопиранозил-3,6-ангидро-2-О-метил-Ь-галактоза, может быть очищено путем использования, например, их апоптоз-индуцирующей активности или канцеростатической активности в качестве показателя. В качестве способа очистки можно использовать известные способы, такие как химический способ, физический способ и им подобные. Соединение, выбранное из соединений формул с 1 по 6 или растворимого сахарида, содержащего по крайней мере одно из соединений, которые являются апоптоз-индуцирующими веществами, полученными при кислотном разложении, может быть очищено с помощью сочетания известных способов очистки, таких как гельфильтрация, фракционирование с использованием мембраны, разделяющей по молекулярному весу, экстракция растворителем и хроматография с использованием ион-обменных смол и им подобных.
Структуры полученных соединений могут быть проанализированы с помощью известных способов, таких как масс-спектрометрия, ядерно-магнитный резонанс, измерение спектра поглощения УФ или ИК и им подобными способами.
Агаробиоза, один из примеров активного ингредиента настоящего изобретения, представляет собой дисахарид, в котором Л-галактоза в 1 положении и 3,6-ангидро-Ь-галактоза в 4 положении связаны друг с другом посредством βгликозидной связи. Его α-изомер и β-изомер существуют благодаря тому, что аномерный углерод присутствует в 1 положении 3,6ангидро-Ь-галактозы, и агаробиозы, предназначенные для использования в настоящем изобретении, включают оба эти изомера.
Сахарид, содержащий соединение, выбранное из соединений формул с 1 по 6 на своем восстанавливающем конце, используемый в качестве активного ингредиента в настоящем изобретении, представляет собой такой сахарид, в котором один или большее количество сахаров связаны с одной или большим количеством гидрокси групп, в положении, отличном от 1 положения в соединении, выбранном из соединений формул с 1 по 6, причем этот сахарид не ограничен одним конкретным сахаридом, но любым, обладающим апоптоз-индуцирующей активностью, канцеростатической активностью, антиоксидантными активностями, такими как активность по подавлению продуцирования активного кислорода, активности по подавлению продуцирования N0 и т.д. и/или иммунорегуляторной активностью.
Их примеры включают продукты разложения исходных веществ, таких как продукты из агарозы, полученные путем разложения с помощью кислоты или переваривания с помощью α-агарозы, такой как агаробиоза, агаротетраоза, агарогексаоза, агарооктаоза, агародекаоза, β-Лгалактопиранозил-3,6-ангидро-2-О-метил-Егалактоза и им подобных. Кроме того, в качестве примера могут быть приведены продукты из карагенана, полученные путем разложения кислотами или переваривания с помощью карагеназы, такие как карабиоза. Кроме того, сахариды настоящего изобретения, которые содержат соединения, выбранные из соединений формул с 1 по 6, на своем восстанавливающем конце, включают такие, в которых один или большее количество сахаров, выбранных из гексозы, таких как глюкоза, маноза, галактоза и т.д., пентоза, таких как ксилоза, арабиноза, рибоза и т.д., уроновых кислот, таких как глюкуроновая кислота, галактуроновая кислота, маннуроновая кислота, глюроновая кислота и т. д., аминосахаров, таких как глюкозамин, галактозамин и т.д., сиаловых кислот, таких как Ν-ацетилнейраминовая кислота и т.д., деоксисахаров, таких как фукоза и т.д., а также их сложных эфиров, амидов и их лактонов, связываются с гидроксигруппами, находящимися в положении, отличном от 1-го в формулах, выбранных из соединений формул с 1 по 6. Кроме того, сахариды на13 стоящего изобретения, которые содержат соединения, выбранные из соединений формул с 1 по 6, на своих восстанавливающих концах, включают такие, в которых группы пирувата и/или сульфата связаны с сахаридами, содержащими соединения, выбранные из соединений формул с 1 по 6 на своих восстановленных концах, например, такие сахариды, как агаробиоза, агаротетраоза, агарогексаоза, агарооктаоза, ккарабиоза, в-Э-галактопиранозил-3,6-ангилдро2-О-метил-Ь-галактоза и им подобные, а также с сахаридами, гидрокси группы которых являются метилированными. Как было описано выше, предпочтительно сахариды настоящего изобретения, которые содержат соединения, выбранные из соединений формул с 1 по 6 на своем восстанавливающем конце, представляют собой такие, не восстанавливающие концы которых являются сахарами, отличными от Ь-галактоза6-сульфата.
Так как аномерный углерод присутствует в 1 положении соединения на восстанавливающем конце сахарида, содержащего 3,6-ангидрогалактопиранозу или его 2-О-метилированное производное на своем восстанавливающем конце, для таких соединений существуют α-изомер и β-изомер. Они оба могут быть использованы в качестве сахаридов настоящего изобретения, которые содержат 3,6-ангидрогалактопиранозу или ее 2-О-метилированное производное на своем восстанавливающем конце.
Молекулярный вес не имеет конкретного ограничения, если только соединение обладает такой физиологической активностью, как апоптоз-индуцирующая активность, канцеростатическая активность, антиоксидантная активность, такая как активность по подавлению продуцирования активного кислорода, активность по подавлению продуцирования N0 и/или иммунорегуляторная активность.
Конечно, смесь α-изомера, β-изомера, альдегида и гидрата, и смесь Ό-изомера и Ьизомера может быть использована в настоящем изобретении как соединение, выбранное из соединений формул с 1 по 6, или сахарид, содержащий это соединение на своем восстанавливающем конце.
Таким образом, соединение, выбранное из соединений формул с 1 по 6 или сахарида, содержащего это соединение на своем восстанавливающем конце, используемое в настоящем изобретении, обладает апоптоз-индуцирующей активностью, канцеростатической активностью, антиоксидантными активностями, такими как активность по подавлению продуцирования, т.е. образования активного кислорода, активность по подавлению продуцирования липидпироксидного радикала, активность по подавлению продуцирования N0, иммунорегуляторная активность и антиаллергическая активность. Затем, в соответствии с настоящим изобретени ем предлагается фармацевтическая композиция, включающая в качестве активного ингредиента по крайней мере одно соединение, выбранное из соединений формул с 1 по 6, и растворимые сахариды, содержащие эти соединения на своем восстанавливающем конце, для лечения или предупреждения заболеваний, чувствительных по крайней мере к одному из этих соединений, например, терапевтические или профилактические композиции для этих заболеваний.
Примеры заболеваний, чувствительных к данным соединениям, включают заболевания, требующие для своего лечения или предупреждения индуцирования апоптоза, таких как карциноматозные заболевания, заболевания, которые для своего лечения или предупреждения требуют подавления продуцирования активного кислорода, заболевания, которые для своего лечения или предупреждения требуют подавления продуцирования липидпироксидного радикала, заболевания, которые для своего лечения или предупреждения требуют подавления продуцирования N0, или заболевания, которые для своего предупреждения или лечения требуют иммунорегуляции, такие как аллергические заболевания. Фармацевтическая композиция настоящего изобретения для лечения или предупреждения подобных заболеваний может быть использована в качестве композиции для индуцирования апоптоза, канцеростатической композиции, антиоксидантов, таких как ингибитор продуцирования активного кислорода, ингибитор продуцирования липидпироксидного радикала, ингибитор продуцирования оксида азота, противовоспалительной композиции, иммунорегулятора, противоаллергической композиции и им подобных.
Например, композиция настоящего изобретения для индуцирования апоптоза пригодна для удаления ауто-реактивных лейкоцитов у больных, страдающих аутоиммунными заболеваниями, опухолевых клеток, клеток, инфицированных вирусом и им подобных. Она может быть использована для удаления из живого организма не обязательных или вредоносных клеток естественным образом путем индуцирования апоптоза в целевых тканях и клетках. Примеры заболеваний, для которых эффективна композиция настоящего изобретения для индуцирования апоптоза, включают аутоиммунные заболевания, такие как системная красная волчанка, гломерулонефрит иммунного характера, рассеянный склероз, коллагеновое заболевание и т. д., ревматизм и им подобные.
Композиция настоящего изобретения для индуцирования апоптоза может быть использована в способе индуцирования апоптоза, и этот способ применим для пояснения механизма индуцирования апоптоза, а также в качестве скрининга для апоптоз-индуцирующих соединений и ингибиторов индуцирования апоптоза.
Так как активность по индуцированию апоптоза с помощью композиции для индуцирования апоптоза настоящего изобретения подавляется ингибитором Сакраке, например, ингибитором ΙΤ-1β конвертирующего фермента У[2-Уа1-А1а-0Ь-Акр(0Ме)-фторметилкетон: производства Такага 81шхо|. Таким образом, считается, что апоптоз, вызванный данной композицией, представляет собой гибель клеток, происходящую благодаря апоптозу, зависящему от Сакраке.
Показано, что Сакраке функционирует как важный медиатор апоптоза, так как он повышается до различных видов гибели клеток; его избыточная экспрессия индуцирует гибель клеток; апоптоз подавляется пептидным ингибитором или ингибирующим белком, таким как СгтА и р35; и у мыши, получившей ударную дозу Сакраке-1 и Сакраке-3, подавляется часть в норме наблюдаемого апоптоза [8е1кадаки (ΒίοекетщЕу), νοί. 70, р. 14-21 (1998)]. Так, в течение процесса апоптоза, Сакраке, который представляет собой цистеиновую протеазу, активируется для разложения ядерных или цитоплазматических белков. Изначально Сакраке синтезируется в виде своего предшественника и затем активируется в процессе своей активности. От регуляции подобной активации Сакраке зависит вопрос жизни или смерти клетки. У млекопитающих имеется 10 и более типов Сакраке. Восходящий поток Сакраке процессирует нисходящий поток Сакраке с усилением активности внутриклеточного разложения белков по каскадному типу [8а1Ьо Кодаки (Се11 Тес1по1оду), Уо1. 17, р. 875-80 (1998)]. И наоборот, процессирование активности может подавляться ингибитором цистеиновой протеазы, Сакраке, для остановки клеточной гибели путем Сакракезависимого апоптоза.
Соединения, используемые в настоящем изобретении, пригодны для подавления продуцирования окисляющих веществ, таких как активный кислород. Т.о. антиоксидант, такой как ингибитор продуцирования активного кислорода, который включает данное соединение в качестве своего активного ингредиента, пригоден для лечения или предупреждения заболеваний, вызванных продуцированием и/или избытком активного кислорода.
В целом, активный кислород может быть подразделен на активный кислород в виде радикала и активный кислород в нерадикальной форме. Активный кислород в виде радикала включает гидрокси радикал, гидроксиперокси радикал, перокси радикал, алкокси радикал, диоксид азота (ΝΟ2), N0, тилрадикал и супероксид. С другой стороны, активный кислород в нерадикальной форме включает несчетный кислород, перекись водорода, липидный гидропероксид, хлористо-водородную кислоту, озон и пироксонитрит. Все они имеют отношение к разным патологическим состояниям, таким как воспалительные заболевания, диабеты, раковые заболевания, артериосклероз, невроз, ишемическое реперфузионное заболевание и им подобные.
В живом организме активный кислород всегда продуцируется в низких концентрациях из нескольких источников. Они представляют собой супероксид, физиологически истекающий из электронной транспортной системы, такой как митохондрия; перекись водорода; гидрокси радикал, катализируемый переходным металлом, таким как медь и железо; гипохлорная кислота, образованная нейтрофилами или моноцитами для защиты против инфекций; ΝΟ, полученная путем разложения аргинина и ему подобных, и они неизбежны. Живой организм обладает системой, удаляющей активный кислород, включая ферменты и соединения с низким молекулярным весом, направленной против продуцирования активного кислорода для поддержания баланса между продуцированием и удалением. Однако живой организм страдает от окислительных процессов, когда деятельность системы продуцирования активного кислорода по некоторым причинам преобладает над элиминирующей системой благодаря активации вышеприведенных путей или, наоборот, благодаря инактивации элиминирующей системы. Такие условия называются оксидативным стрессом. Более того, кроме дисбаланса внутри организма, живой организм всегда испытывает оксидативный стресс из-за окружающей организм среды, например атмосферы, пищи и им подобных. Таким образом, оксидативный стресс неизбежно происходит в повседневной жизни человека.
Таким образом, как было описано выше, оксидативный стресс относится к различным заболеваниям, и живой организм всегда подвергается воздействию условий, вызывающих заболевания, или болезненные условия становятся более серьезными благодаря оксидативному стрессу. Таким образом, антиоксидант, такой как ингибитор продуцирования активного кислорода настоящего изобретения, пригоден для предупреждения и лечения заболеваний, вызванных оксидативным стрессом или для предупреждения ухудшения болезненного состояния благодаря такому оксидативному стрессу.
Кроме того, реакция перекисного окисления липидов всегда связана с оксидативным стрессом и немедленно вызывает продуцирование липид-пероксидного радикала. 4-гидрокси2-ноненал (ΗΝΕ), продуцирующийся таким образом, представляет собой токсичный альдегид, специфически нацеленный на глютатион или белок. Продукты реакции ΗΝΕ и белка определяются в различных больных тканях и считаются факторами, вызывающими болезненные состояния, связанные с оксидативным стрессом. Т.о., антиоксидант, который содержит антиоксидантное вещество, используемое в настоящем изобретении и которое может подавлять продуцирование липид-пероксидных радикалов, пригодно для предупреждения и лечения возрастных заболеваний, вызванных оксидативным стрессом.
N0 является основным компонентом происходящего из эндотелия фактора релаксации (ΕΌΚΕ) Щайге, Уо1. 327, р. 524-526 (1987)]. В соответствии с настоящим изобретением предлагается фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения заболеваний, которые требуют для своего лечения или предупреждения подавления продуцирования NО.
В настоящем изобретении заболевания, требующие подавления продуцирования N0 не ограничены одним конкретным заболеванием и включают, например, системную гипотензию, вызванную токсическим шоком, лечение некоторыми цитокинами и им подобными, ответное снижение кровяного давления, аутоиммунные заболевания, воспаление, артрит, ревматоидный артрит, диабет, воспалительные заболевания кишечника, недостаточность функционирования сосудистой системы, патогенный ангиостаз, повреждение тканей, кардиоваскулярная ишемия, гиперальгезия, церебральная ишемия, заболевания, связанные с васкуляризацией, раковые заболевания и им подобные, включая заболевания, описанные в 1Ρ-Ά 9-504524, 1Ρ-Ά 9505288, 1Ρ-Ά 8-501069, 1Ρ-Ά 8-512318 и 1Ρ-Ά 6508849.
Для N0 синтеза (N08), при котором продуцируется N0 и Ь-цитрулин из Ь-аргинина и кислорода, известны сN08 тип, который конститутивно экспрессируется, и (N08 тип, который является индуцируемым типом. В макрофагах и им подобных (N08 индуцируется путем стимуляции цитотоксина или цитокинов (например, ЬР8, ЮТ-у) для продукции N0. (N08 сам по себе является необходимым для поддержания системы живого организма. Однако, с другой стороны, показано, что (N08 вызывает различные заболевания, когда он под воздействием различных факторов экспрессируется избыточно, причем продуцируется избыточное количество N0.
Авторы настоящего изобретения утверждают, что соединения, выбранные из соединений формул с 1 по 6, и растворимые сахариды, содержащие эти соединения на своих восстанавливающих концах, такие как агаробиоза агаротетраоза и агарогексаоза, подавляют подобную экспрессию (N08.
Подтверждение этому найдено на белковом уровне путем вестерн-блоттинга и на уровне информационной РНК с помощью индуцирования обратной трансферазой полимеразной цепной реакции (ЯГ-РСК.). Так, соединения, используемые в настоящем изобретении, пригодны для лечения и предупреждения заболеваний, которые требуют подавления продуцирования N0, путем подавления экспрессии (N08.
который чрезмерно экспрессируется вследствие различных факторов, продуцируя избыточное количество N0.
Данные соединения настоящего изобретения подавляют продуцирование N0 в макрофагах и являются пригодными для лечения и предупреждения заболеваний, вызванных продуцированием N0 в макрофагах, воспаления, раковых заболеваний и им подобных. Кроме того, подавление продуцирования N0 с помощью сахаридов, используемых в настоящем изобретении, не является антагонистическим подавлением веществ, индуцирующих продуцирование N0, таких как ЬР8 или ЮТ-у. Усиление подавляющего эффекта на продуцирование N0 наблюдается при предварительном добавлении сахаридов, используемых в настоящем изобретении. Следовательно, соединения настоящего изобретения являются очень пригодными как таковые для предупреждения продуцирования антиоксидантов.
Ингибитор продуцирования N0 настоящего изобретения применим для изучения механизма продуцирования N0 и характера активности N0 и может быть использован для скрининга материалов, вовлеченных в механизм продуцирования N0.
Васкуляризация необходима для роста твердых опухолей, и фактор роста сосудистого эндотелия/фактор сосудистой проницаемости (УЕСЕ) играет важную роль в этом процессе. В различных опухолевых клетках УЕСЕ индуцируется N0. Ингибитор продуцирования N0 настоящего изобретения также подавляет продуцирование УЕСЕ для опухолевых клеток путем подавления продуцирования N0, таким образом подавляя васкуляризацию вокруг опухолевых тканей. Когда ингибитор продуцирования N0 настоящего изобретения назначается мыши, у которой раковые клетки трансплантированы подкожно для образования твердого рака, васкуляризация вокруг раковой ткани становится незначительной, и раковые клетки исчезают, нитрозамины представляют собой ряд соединений, в которых нитрозо группа присоединена к вторичному амину, и известно несколько сотен их типов. Многие из них проявляют канцерогенную активность на животных путем повреждения ДНК. Считается, что нитрозамины в значительной мере связаны с канцерогенезом у человека и обычно продуцируются путем реакции нитрита и амина в желудке. N0 также участвует в продуцировании нитрозамина путем реакции с амином в физиологических условиях при нейтральной рН. Продуцирование N0 ускоряется у больного, страдающего клонорхозом или циррозом, которые имеют большое отношение к эпидемиологии рака. Из этого, в частности, следует, что канцерогенез в группе высокого риска может быть предупрежден путем применения ингибитора продуцирования N0 настоящего изобретения для предупреждения ускорения продуцирования N0. Как было обсуждено выше, ингибитор продуцирования N0 настоящего изобретения проявляет свою канцеростатическую активность в два этапа, а именно супрессия канцерогенеза и подавление васкуляризации в раковых тканях.
N0 также вызывает отек, наличие которого характерно для воспалительного повреждения, как проявление активности в усилении сосудистой проницаемости [Маеба с1 а1., 1арапеа5е 1оитпа1 οί Сапсег Кскеатей, Уо1. 85, р. 331-334 (1994)] и ускорении биосинтеза простагландинов, которые являются медиаторами воспаления [8а1уеш1ш е1 а1., Ртосеебшдк οί №Шопа1 Лсабешу οί 8с1епсе5, И8Л, Уо1. 90, р. 7240-7244 (1993)]. С другой стороны, N0 быстро взаимодействует с супероксидным радикалом для продуцирования иона пероксонитрита, и считается, что этот ион пероксонитрита вызывает воспалительное повреждение клеток и тканей.
Продуцирование N0 индуцируется, когда активированные иммунные клетки попадают в орган и высвобождают цитокины. Инсулинзависимые диабеты вызываются специфической деструкцией островковых β-клеток, и считается, что эта деструкция вызывается N0. Синовиальная жидкость при повреждении больного, страдающего ревматоидным артритом, остеоартрозом, падагрическим артритом и артритом, связанным с болезнью Бехчета, содержит N0 в более высоких концентрациях, чем в нормальном суставе того же самого больного или в суставе здорового человека. Когда такой больной получает ингибитор продуцирования N0 данного изобретения, продуцирование N0 в месте повреждения подавляется, улучшая условия протекания заболевания.
Продуцирование N0 повышается во время церебральной ишемии и после реперфузии, что вызывает повреждение в тканях мозга. Применение больным ингибитора продуцирования N0 данного изобретения во время церебральной ишемии облегчает повреждение тканей мозга и улучшает прогноз.
Иммунорегулятор настоящего изобретения обладает иммунорегуляторной активностью, такой как активность в подавлении бластогенеза лимфоцитов и активность в подавлении реакции смешанных лимфоцитов. Таким образом, иммунорегулятор настоящего изобретения применим в качестве фармацевтической композиции для лечения или предупреждения заболеваний, вызванных аномалией этих иммунных систем или иммунных факторов.
Бластогенез лимфоцитов представляет собой реакцию, в которых митоген связывается с рецептором на поверхности лимфоцита для активации лимфоцита и способствует его делению и пролиферации. Реакция смешанных лимфоцитов представляет собой реакцию, в которой лимфоциты, полученные от аллогенных животных, смешиваются и культивируются, вызывая таким образом активацию лимфоцитов благодаря несовместимости главных антигенов гистосовместимости, что способствует делению и пролиферации лимфоцитов. Иммунорегулятор настоящего изобретения подавляет эти реакции и пригоден в качестве фармацевтической композиции для лечения и предупреждения хронических заболеваний, вызванных аномальной аксегерацией лимфоцитов, например, аутоиммунных заболеваний, таких как хронический нефрит, язвенный колит, диабет I типа и ревматоидный артрит, и также пригоден для подавления отторжения трансплантата.
В клетках-хозяевах, сенсибилизированных антителом 1дЕ, дегрануляция индуцируется путем связывания антигена, причем высвобождается химический медиатор. Эта реакция 1 типа, то есть аллергическая реакция немедленного типа, играет важную роль в аллергических заболеваниях, характерными примерами которых являются астма и атонический дерматит, и считают, что вещества, которые подавляют высвобождение химических медиаторов из клетокхозяев, очень эффективны для лечения и предупреждения подобных аллергических заболеваний.
Пассивная кожная анафилаксия (РСА) у крыс, которая является моделью аллергических реакций 1 типа, инициируется дегрануляцией клеток-хозяев, с последующим высвобождением химических медиаторов, содержащихся в гранулах, таких как гистамин и серотонин, вызывая повышение проницаемости сосудов и в конце концов приводя к локальному просачиванию пигмента в кожу. Эта модель наиболее часто применяется в качестве модели для оценки противоаллергических соединений ίη νί\Ό.
Соединения, выбранные из соединений формул с 1 по 6, и растворимые сахариды, содержащие эти соединения на своих восстанавливающих концах, обладают активностью по подавлению РСА, и настоящим изобретением также предлагается противоаллергическая композиция, содержащая в качестве своего активного ингредиента по крайней мере один член, выбранный из группы, состоящей из соединений, выбранных из соединений формул с 1 по 6, и растворимых сахаридов, содержащих эти соединения на своих восстанавливающих концах.
Противоаллергическая композиция весьма пригодна для лечения и предупреждения заболеваний, которые можно лечить путем подавления аллергической реакции 1 типа, таких как бронхиальная астма, атонический дерматит, аллергический ринит, поллиноз, крапивница, контактный дерматит, аллергический конъюнктивит и им подобные.
Вышеприведенная фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения заболеваний настоящего изобретения, например, композиция для индуцирования апоптоза, может быть получена при использовании по край21 ней мере одного члена, выбранного из группы, состоящей из соединений, выбранных из соединений формул с 1 по 6, и растворимых сахаридов, содержащих эти соединения на своих восстанавливающих концах, в качестве активного ингредиента, и может быть оформлена в готовую препаративную форму с известным фармацевтически приемлемым носителем.
В общем случае, соединение объединяют с фармацевтически приемлемым жидким или твердым носителем и при необходимости к ним добавляют растворитель, диспергирующий агент, эмульгатор, буферный агент, стабилизатор, эксципиент, связывающий агент, дезинтегрирующий агент, смазывающее вещество и им подобные для получения препарата в форме твердого препарата, такого как таблетка, гранула, порошок, ер1ра8Йс, капсула и им подобные, и жидкие препараты, такие как обычный раствор, суспензия, эмульсия и им подобные. Кроме того, могут быть получены сухие препараты, которые могут быть превращены в жидкий препарат путем добавления перед использованием подходящего носителя.
Композиция для индуцирования апоптоза настоящего изобретения может назначаться как препарат для перорального применения, так и как парентеральный препарат, такой как препарат для инъекций, капель и им подобных.
Фармацевтический носитель может быть выбран в соответствии с вышеприведенным конкретным путем применения и дозированной формой. Для перорального препарата могут быть использованы например, крахмал, лактоза, сахароза, манит, карбоксиметилцеллюллоза, кукурузный крахмал, неорганические соли и им подобные. В препараты для перорального применения также могут быть добавлены связывающий агент, дезинтегрирующий агент, ПАВ, смазывающее вещество, агент, способствующий текучести, вкусовой агент, красящий агент, ароматизатор и им подобные.
Препараты для парентерального применения могут быть приготовлены в соответствии с общепринятыми способами путем растворения или суспендирования активного ингредиента настоящего изобретения, а именно, сахарида, имеющего активность по индуцированию апоптоза, в разбавителе, таком как дистиллированная вода для инъекций, физиологический раствор, водный раствор глюкозы, растительные масла для инъекций, масло кунжута, масло бобов, кукурузное масло, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и им подобные, и при необходимости добавляя стерилизатор, стабилизатор, осмотический регулятор, агент, способствующий однородности и им подобные к полученным в результате раствору или суспензии.
Композиция для индуцирования апоптоза настоящего изобретения может вводиться подходящим путем в определенной дозированной форме данной композиции. Способ применения не имеет ограничений, и композиция может применяться внутрь или наружно (или местно), или путем инъекций или подобным им способом. Инъекционные препараты могут вводиться внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрикожно и подобным им путем. Препараты для наружного применения включают суппозитории и им подобные.
Доза композиции для индуцирования апоптоза настоящего изобретения может быть соответствующим образом определена и варьируется в зависимости от конкретной дозированной формы, пути введения и назначения, а также возраста, веса и состояния больного составляет от 10 мкг до 200 мг/кг в расчете на активный ингредиент, содержащийся в композиции. Так как дозы, конечно, могут варьироваться в зависимости от различных факторов, в некоторых случаях может быть достаточной наименьшая доза из вышеприведенных, но в других случаях может требоваться доза большая, чем приведено выше. Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может применяться перорально сама по себе или может применяться ежедневно путем смешивания с соответствующей пищей и напитками.
Канцеростатическая композиция настоящего изобретения может быть получена путем использования по крайней мере одного члена, выбранного из группы, состоящей из соединений, выбранных из соединений формул с 1 по 6, и растворимых сахаров, содержащих эти соединения на своих восстанавливающих концах, в качестве активного ингредиента и оформленного в готовую препаративную форму с известным фармацевтическим носителем. Карциностатическая композиция может вводиться способом, подходящим для стандартной дозированной формы данной композиции. Способ применения не имеет ограничений, и композиция может применяться внутрь или наружно (или местно) или путем инъекций и т.д. Инъекционные препараты могут применяться, например, внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрикожно и т.д. Препараты для наружного применения включают суппозитории и им подобные.
Доза канцеростатической композиции настоящего изобретения может быть определена и варьируется в зависимости от конкретной дозированной формы, пути введения и назначения, а также от возраста, веса и состояния больного, нуждающегося в лечении. В общем случае дневная доза для взрослого больного составляет от 10 мкг до 200 мг/кг, считая по количеству активного ингредиента, содержащегося в композиции. Так как дозы, конечно, могут варьироваться в зависимости от различных факторов, в некоторых случаях может быть достаточной наименьшая доза из вышеприведенных, но в других случаях может требоваться доза большая, чем приведено выше. Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может применяться перорально сама по себе или может применяться ежедневно путем смешивания с соответствующей пищей и напитками.
Антиоксидант, ингибитор продуцирования активного кислорода, ингибитор продуцирования липид-пероксидного радикала, ингибитор продуцирования N0, иммунорегулятор и противоаллергическая композиция настоящего изобретения могут быть получены в соответствии с таким же способом, который описан выше относительно композиции для индуцирования апоптоза. Могут быть использованы такие же дозы и пути введения, как описаны выше для композиции для индуцирования апоптоза. Антиоксидант, ингибитор продуцирования активного кислорода, ингибитор продуцирования липидпероксидного радикала, ингибитор продуцирования N0, иммунорегулятор и противоаллергическая композиция настоящего изобретения вводятся подходящим путем для конкретной дозированной формы данной композиции. Способ применения не имеет ограничений, и композиция может применяться внутрь или наружно (или местно) или путем инъекций и т.д. Инъекционные препараты могут применяться, например, внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрикожно и т.д. Препараты для наружного применения включают суппозитории и им подобные.
Доза антиоксиданта, ингибитора продуцирования активного кислорода, ингибитора продуцирования липид-пероксидного радикала, ингибитора продуцирования N0, иммунорегулятора и противоаллергической композиции настоящего изобретения может быть определена и варьируется в зависимости от конкретной дозрованной формы, пути введения и назначения, а также от возраста, веса и состояния больного, нуждающегося в лечении. В общем случае дневная доза для взрослого больного составляет от 10 мкг до 200 мг/кг, считая по количеству активного ингредиента, содержащегося в композиции. Так как дозы, конечно, могут варьироваться в зависимости от различных факторов, в некоторых случаях может быть достаточной наименьшая доза из вышеприведенных, но в других случаях может требоваться доза большая, чем приведено выше. Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может применяться перорально сама по себе или может применяться ежедневно путем смешивания с соответствующей пищей и напитками.
Пищевые продукты и напитки настоящего изобретения представляют собой такие, которые получают путем добавления и/или путем растворения по крайней мере одного члена, выбранного из группы, состоящей из соединений, выбранных из соединений формул с 1 по 6, и растворимых сахаридов, содержащих эти соединения, например, сахариды, полученные путем кислотного разложения в кислотных условиях при рН ниже 7 и/или путем ферментатив ного переваривания исходных, сырых веществ, таких как агаробиоз, агаротетраоз, агарогексаоз, агарооктаоз, к-карабиоз, β-Ό-галактопиранозил-3,6-ангидро-2-О-мектил-Ь-галактоза и им подобные. Таким образом подобные пищевые продукты обладают активностью по индуцированию апоптоза, канцеростатической активностью, антиоксидантной активностью, иммунорегуляторной активностью и им подобной. Поэтому они очень пригодны для улучшения болезненных состояний и предупреждения заболеваний, чувствительных к по крайней мере одному члену, выбранному из группы, состоящей из соединений, выбранных из соединений формул с 1 по 6, и растворимых сахаридов, содержащих эти соединения на своих восстанавливающих концах, таких как заболевания, требующие для своего лечения или предупреждения индуцирования апоптоза, канцероматозные заболевания, заболевания, которые требуют для своего лечения и предупреждения подавления продуцирования активного кислорода, заболевания, которые требуют для своего лечения и предупреждения подавления продуцирования N0, заболевания, которые требуют для своего лечения и предупреждения иммунорегуляции, аллергические заболевания и им подобные.
Процесс производства пищевых продуктов и напитков настоящего изобретения не ограничен одним конкретным способом, и приготовление, и другие общие процессы для получения пищевых продуктов и напитков могут быть использованы, чтобы полученные в результате пищевые продукты и напитки содержали в качестве активных ингредиентов по крайней мере один член, выбранный из группы, состоящей из соединений, выбранных из соединений формул с 1 по 6, и растворимых сахаридов, содержащих эти соединения на своих восстанавливающих концах, приготовленные, например, путем кислотного разложения в кислотных условиях при рН 7 и/или ферментативного переваривания грубых веществ, таких как агаробиоз, агаротетраоз, агарогексаоз, агарооктаоз, к-карабиоз, β-Όгалактопиранозил-3,6 -ангидро -2-О-метил-Ьгалактоза и им подобные.
Пищевые продукты и напитки настоящего изобретения не ограничены каким-то одним конкретным видом, и их примеры включают продукты, полученные из злаков (например, продукты из пшеничной муки, продукты, полученные из крахмала, предварительно смешанные продукты, лапша, макароны, хлеб, соевый джем, гречичная лапша, & (хлеб из пшеничной клейковины), рисовая лапша, желатиновая лапша, упакованный рисовый пирог и т.д.), продукты, полученные из жира и масла (например, пластичный жир и масло, темпурное масло, масло для салата, майонез, соусы т.д.), продукты из сои (тофу, мисо, ферментированные соевые бобы), продукты, полученные из мяса (на пример, ветчина, бэкон, прессованная ветчина, сосиски и т.д.), продукты, приготовленные из морских продуктов (например, замороженное измельченное мясо рыбы, паста из вареной рыбы, рулеты и паста из вареной рыбы, пирожки из измельченной рыбы, замороженные палочки из рыбного фарша, рыбные шарики, ветчина из мяса рыбы, сосиски, сухой Ьоийо, продукты, полученные из икры, консервированные морские продукты, рыба, сваренная в сладком соевом соусе и т.д.), диетические продукты (например, сырое молоко, сметана, йогурт, масло, сыр, конденсированное молоко, порошковое молоко, мороженое и т.д.), продукты, приготовленные из овощей и фруктов (например, пасты, джемы, пикули, фруктовый сок, овощные напитки, смешанные напитки и т. д.), кондитерские изделия (например, шоколад, бисквиты, сладкие сдобные булочки, сладкие пирожные из риса, рисовые конфеты и т.д.), алкогольные напитки (например, сакэ, китайские ликеры, вина, виски, 511ос11и. водка, бренди, джин, ром, пиво, слабо алкогольные напитки, фруктовые воды, ликеры и т.д.), дорогие напитки (например, зеленый чай, чай, черный китайский чай, кофе, безалкогольные напитки, кисломолочные напитки и т.д.), приправы (например, соевый соус, соус, уксус, сладкий сакэ, и т.д.), консервированный продукты, продукты в бутылках и банках (например, различные вареные продукты, такие как рис, покрытый вареным мясом и овощами, рис, сваренный вместе с мясом и овощами в маленьком горшочке, паровой рис с красными бобами, карри и т. д.), полусухие и конденсированные продукты (например, печеночный паштет, другие намазывающиеся продукты, суп из гречневой лапши или «ибоп», конденсированные супы и т.д.), сухие продукты (например, лапша быстрого приготовления, карри быстрого приготовления, растворимый кофе, сок в порошке, суп в порошке суп быстрого приготовления шДо, готовые продукты, готовые напитки, готовый суп и т.д.), замороженные продукты (например, 8и1буак1, сйтеап-шшЫ, запеченый угорь, мясо для гамбургера, шао-ма, китайские мясные клецки, различные палочки, фруктовый коктейль и т.д.), твердые продукты, жидкие продукты (например, суп и т.д.), приготовленные сельскохозяйственные продукты и лесные продукты, такие как специи, приготовленные продукты из домашнего скота, приготовленные морские продукты и им подобные.
Поскольку продукты и напитки настоящего изобретения включают в процессе их приготовления путем добавления в них и/или путем разбавления по крайней мере одного члена, выбранного из группы, состоящей из соединений, выбранных из соединений формулы с 1 по 6, и растворимых сахаридов, содержащих эти соединения на своих восстанавливающих концах, например, сахариды, полученные путем кислотного разложения в кислотных условиях при рН ниже 7 и/или ферментативного переваривания исходных веществ, таких как агаробиоза, агаротетраоза, агарогексаоза, агарооктаоза, к-карабиоза, в-О-галактопиранозил-3,6-ангидро-2-Ометил-Ь-галактоза и им подобные, в количестве, необходимом для проявления их физиологических функций, их формы не ограничиваются какой-то одной формой, и могут иметь вид любой съедобной формы, такой как таблетки, гранулы, капсулы и им подобные.
3,6-ангидрогалактопираноза, ее 2-О-метилированное производное и сахариды, содержащие эти соединения на своих восстанавливающих концах, имеют тенденцию раскрываться на своем полуацетальном кольце с образованием альдегидной группы на концах. Эти альдегидные группы, так же как и альдегидная группа альдегида 3,6-ангидрогалактопиранозы, имеют тенденцию взаимодействовать с соединениями, которые взаимодействуют с альдегидной группой, например, с нуклеофилами, такими как аминокислоты. Соединения формул с 1 по 6 или сахариды, например, олигосахариды, реагирующие подобным образом, находятся в таком состоянии, что они теряют соединения, выбранные из соединений формул с 1 по 6 на своих восстанавливающих концах. Следовательно, они теряют различные виды физиологической активности тех членов, которые выбраны из соединений формул с 1 по 6 и олигосахаидов, содержащих эти соединения на своих восстанавливающих концах. Таким образом, с целью сохранения членов, выбранных из соединений, выбранных из соединений формул с 1 по 6, и сахаридов, содержащих эти соединения на своих восстанавливающих концах, в пищевых продуктах или напитках стабильными, молярная концентрация соединения, взаимодействующего с альдегидом, должно сохраняться ниже, чем концентрация альдегида.
В производстве пищевых продуктов или напитков настоящего изобретения возможно предложить пищевые продукты или напитки, которые содержат член, выбранный из группы, состоящей из соединений, выбранных из соединений формул с 1 по 6 и олигосахаридов, содержащих эти соединения на своих восстанавливающих концах, в большом количестве без соответствующего снижения этого количества путем контроля за количеством соединения, которое взаимодействует с альдегидом. Подобный контроль не был ранее известен в известном уровне техники.
Также обнаружено, что члены, выбранные из группы, состоящей из соединений формул с 1 по 6, и сахариды, содержащие эти члены на своих восстанавливающих концах, являются стабильными в условиях кислой среды. Затем, кислые продукты и кислые напитки, которые содержат по крайней мере один член, выбранный из группы, состоящей из соединений, выбранных из соединений формул с 1 по 6, и раство римые сахариды, содержащие эти соединения на своих восстановленных концах, в больших концентрациях могут быть получены путем проведения всех стадий получения пищевых продуктов и напитков настоящего изобретения в кислотных условиях для получения кислых продуктов и кислых напитков.
В приготовлении кислых пищевых продуктов и напитков настоящего изобретения применяются такие виды кислот, которые используются для кислотного разложения исходных веществ, и не ограничиваются какой-то одной кислотой, но могут быть использованы как органические, так и неорганические кислоты. Однако наилучший вкус продукта, полученного в результате кислотного разложения, из агара получают при использовании органической кислоты. Кроме того, органические кислоты предпочтительно используются для получения продуктов кислотного разложения, имеющих новый вкус. Органические кислоты могут быть выбраны в зависимости от конкретной цели. Они могут использоваться сами по себе, или могут быть объединены две или большее их количество. Предпочтительные примеры органических кислот включают уксусную кислоту, лимонную кислоту, яблочную кислоту, молочную кислоту, винную кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту и им подобные. Условия разложения не имеют конкретного ограничения. Например, когда в качестве органической кислоты используется лимонная кислота, кислотное разложение агара в качестве исходного вещества проводится при 60-130°С в течение 3300 мин, предпочтительно от 30 до 200 мин, и таким образом изменяется кислый вкус органической кислоты с получением композиции, имеющей хорошо сбалансированный вкус, мягкую структуру и приятный кислый вкус. Подкислитель, обладающий необходимым кислым вкусом, может быть получен путем тепловой обработки композиции, содержащей от 0,05 до 30 вес.%, предпочтительно от 0,2 до 10 вес.% органической кислоты и от 1 до 20 вес.%, предпочтительно от 5 до 15 вес.% по крайней мере одного члена, выбранного из группы, состоящей из соединений, выбранных из соединений формул с 1 по 6, и растворимых сахаридов, содержащих эти соединения на своих восстанавливающих концах. Таким образом полученный подкислитель весьма пригоден для получения слабых напитков, кислых приправ, кислых пищевых продуктов и им подобных.
Кислые пищевые продукты и кислые напитки настоящего изобретения содержат большое количество по крайней мере одного члена, который обладает физиологической активностью, выбранного из группы, состоящей из соединений, выбранных из соединений формул с 1 по 6, и растворимых сахаридов, содержащих эти соединения, например, сахариды, полученные путем кислотного разложения при кислых усло виях при рН ниже 7 и/или ферментативного переваривания исходных веществ, таких как агаробиоза, агаротетраоза, агарогексаоза, агарооктаоза, к-карабиоза, Р-Э-галактопиранозил-3,6ангидро-2-О-Ь-галактоза и им подобных. Физиологические функции этих соединений, такие как активность по индуцированию апоптоза, канцеростатическая активность и им подобные, определяют эффект предупреждения канцерогенеза, эффект подавления рака или им подобные при употреблении пищевых продуктов и напитков. Таким образом, кислые продукты и напитки настоящего изобретения представляют собой целебные продукты и напитки, обладающие эффектом по улучшению болезненных состояний или предупреждению заболеваний, чувствительных к по крайней мере одному члену, выбранному из группы, состоящей из соединений, выбранных из соединений формул с 1 по 6, и растворимых сахаридов, содержащих эти соединения, и в частности применимы для поддержания здоровья желудочно-кишечного тракта.
Соединения, выбранные из соединений формул с 1 по 6, растворимые сахариды, содержащие названные соединения настоящего изобретения, например, сахариды, полученные путем кислотного разложения в кислых условиях при рН ниже 7 и/или ферментативного переваривания исходных веществ, таких как агаробиоза, агаро-тетраоза, агарогексаоза, агарооктаоза к-карабиоза, в-Э-галактопиранозил-3,6-ангидро-2-О-Ь-галактоза и им подобных обладают антиоксидантной активностью, такой как активность по подавлению продуцирования активного кислорода, активность по подавлению продуцирования липидпероксидного радикала и им подобных, и могут быть использованы в получении антиоксиданитных пищевых продуктов или антиоксидантных напитков, как антиоксиданта, такого как ингибитор продукции активного кислорода, ингибитор продукции липидпероксидного радикала, ингибитор продуцирования N0 и им подобного.
Так, в соответствии с настоящим изобретением, предлагается антиоксидант, в частности антиоксидант для пищевых продуктов и напитков, который содержит по крайней мере один член, выбранный из группы, состоящей из соединений, выбранных из соединений формул с 1 по 6 и растворимых сахаридов, содержащих эти соединения в качестве активного ингредиента.
Форма актиоксиданта настоящего изобретения не ограничивается какой-то одной конкретной формой, и может быть выбрана в соответствии с применяемым пищевым продуктом или напитком, например, порошок, паста, эмульсия и им подобные. Антиоксидантные пищевые продукты и напитки, которые содержат член, выбранный из соединений и сахаридов, используемых в настоящем изобретении, в качестве активного ингредиента могут быть легко и просто получены путем использования антиоксиданта настоящего изобретения.
В соответствии с настоящим изобретением, также предлагается сахарид для антиоксиданта, выбранный из группы, состоящей из соединений, выбранных из соединений формул с 1 по 6, и растворимых сахаридов, содержащих эти соединения. Например, сахарид для антиоксиданта может быть получен в виде продукта, полученного при кислотном разложении в кислых условиях при рН ниже 7 и/или ферментативного переваривания исходных веществ. Кроме того, может быть использован их очищенный или частично очищенный продукт. Примеры неочищенных веществ включают производные красных водорослей, такие как агар, агароза, карагенан и им подобные. Они могут использоваться сами по себе, или может использоваться сочетание двух или большего их количества. Примеры характерных сахаридов для антиоксиданта, не имея конкретных ограничений, представляют собой растворимые полисахариды, содержащие соединения, выбранные из соединений формул с 1 по 6, например, агаробиоза, агаротетраоза, агарогексаоза, агарооктаоза, ккарабиоза, в-О-галактопиранозил-3,6-ангидро2-О-Ь-галактоза и им подобные.
Сахариды для антитоксидантов настоящего изобретения полезны для исключения или подавления продукции окислителей в живом организме, таких как активный кислород. Кроме того, сахарид для антиоксиданта полезны для улучшения болезненных состояний или предупреждения заболеваний, вызванных продукцией избыточного количества активного кислорода.
Как было обсуждено выше, оксидативный стресс, который происходит вследствие оксидативного повреждения живого организма в случае, когда система продуцирования активного кислорода преобладает над системой удаления, включает различные заболевания. Так, живой организм всегда подвергается условиям, которые приводят к заболеваниям, вызванным оксидитизным стрессом, или страдает от болезненных состояний. Поэтому является желательным принимать ежедневно подходящее количество антиоксиданта для предупреждения, лечения или предупреждения страданий от заболеваний, вызванных оксидативным стрессом. Для дневного употребления подходящего количества антиоксиданта желательно принимать его с пищей или напитками. Пища или напитки настоящего изобретения, которые содержат полученные путем добавления в них и/или полученные путем добавления сахаридов для антиоксиданта, очень полезны для использования в антиокислительных продуктах или напитках или продуктах или напитках против оксидативного стресса.
Член, выбранный из соединений и сахаридов, используемых в настоящем изобретении, также обладает способностью удерживать воду, и по крайней мере один из них может быть использован в качестве ингредиента для получения композиции против запоров, пищевых продуктов против запоров и напитков против запоров.
Более того, в соответствии с настоящим изобретением предлагается косметическая композиция, которая содержит в качестве активного ингредиента растворимый сахарид, содержащий соединение, выбранное из соединений формул с 1 по 6 на своем восстанавливающем конце, олигосахарид, такой как агаробиоза, агаротетраоза, агарогексаоза, агарооктаоза, к-карабиоза, β-Όгалактопиранозил-3,6-ангидро-2-О-метил-Ьгалактозу и им подобные. Этот сахарид может быть получен в кислотных условиях при рН ниже 7 и/или ферментативном переваривании исходных веществ. Также может быть использован очищенный или частично очищенный продукт разложения. В качестве исходных веществ могут быть отдельно использованы производные из красных водорослей, например, агар, агароза, карагенан или им подобные, или можно использовать сочетание двух из них или большего их количества.
Вышеупомянутое соединение может быть использовано в качестве активного ингредиента для получения косметической композиции, включающей основные косметические композиции, такие как крем, молочный лосьон, лосьон, жидкость для очищения лица или уменьшения морщин, средства макияжа, такие как губная помада и основа под грим, мыло для тела, мыло и им подобные. Соединение также эффективно для волос, и косметическая композиция настоящего изобретения может быть получена в виде средств для ухода за волосами, например, таких средств, как тоник для волос, жидкость для волос, лосьон для укладки волос, агент для завивки волос, крем для волос, покрытие для волос и им подобные, и средства для ухода за волосами, такие как шампунь, лак для волос, средство для лечения волос и им подобные. Количество соединения, смешанного с косметической композицией, может быть соответствующим образом определено в соответствии с его активностью по улучшению внешнего вида/обесцвечивания, увлажняющей или смачивающей активности, антиоксидантной активности и им подобных. Как и другие косметические компоненты, их можно использовать в смеси с общепринятыми косметическими композициями. Активность по улучшению состояния кожи/обесцвечивания и активность по увлажнению и смачиванию может быть измерена обычными способами, например, способом, описанным в ΙΡ-Α 8-310937.
Косметическая композиция настоящего изобретения обладает отличными свойствами, основанными на активности по улучшению состояний кожи/обесцвечиванию, увлажняющей и смачивающей активности, антиоксидантной активности, активности по подавлению продукции активного кислорода и активностью против оксидативного стресса по отношению к коже; увлажняющей и смачивающей активности, антиоксидантной активности, активности по подавлению продукции активного кислорода и активности против оксидативного стресса по отношению к волосам; и им подобные.
Настоящее изобретение также предлагает консервирующие композиции для сохранения свежести пищевых продуктов и напитков, которые содержат в качестве активного ингредиента по крайней мере один член, выбранный из группы, состоящей из соединений, выбранных из соединений формул с 1 по 6, и растворимых сахаридов, содержащих эти соединения на своих восстанавливающих концах, например, олигосахариды, такие как агаробиоза, агаротетраоза, агарогексаоза, агарооктаоза, к-карабиоза, в-О-галактопиранозил-3,6-ангидро-2-О-метилЬ-галактозу и им подобные. Этот сахарид может быть получен в кислотных условиях при рН ниже 7 и/или ферментативном переваривании исходных веществ. Также может быть использован очищенный или частично очищенный продукт разложения. В качестве исходных веществ, производных из красных водорослей, которые включают соединение, выбранное из соединений формул с 1 по 6, например, агар, агароза, карагенан или им подобные, или можно использовать сочетание двух из них или большего их количества.
По крайней мере один член, выбранный из группы, состоящей из соединений, выбранных из соединений формул с 1 по 6, и растворимых сахаридов, содержащих эти соединения на своих восстанавливающих концах, например, сахарид, такой как агаробиоза агаротетраоза, агарогексаоза, агарооктаоза, к-карабиоза, β-0-галактопиранозил-3,6-ангидро-2-О-метил-Ь-галактозу и им подобные обладают антиоксидантной активностью, активностью по сохранению свежести продуктов и активностью по подавлению тирозиназы. Консервирующие композиции для сохранения свежести пищевых продуктов и напитков настоящего изобретения, которые эффективно предохраняют от изменения цвета, гниения, окисления и им подобных процессов в пище, могут быть получены при использовании этого соединения в качестве активного ингредиента в соответствии с известными способами получения готовых препаративных форм. Консервирующая композиция настоящего изобретения очень полезна для сохранения запаха и свежести различных пищевых продуктов, скоропортящихся продуктов и готовых продуктов.
При ведении мышам любого из членов, выбранного из группы, состоящей из соединений, выбранных из соединений формул с 1 по 6, и растворимых сахаридов, содержащих соединения, используемые в настоящем изобретении, в дозе 1 г/кг перорально или внутрибрюшинно, не наблюдалось острой токсичности.
Следующие примеры дополнительно и детально проиллюстрируют настоящее изобретение, причем следует считать, что они никак не ограничивают объем настоящего изобретения.
Пример 1.
(1) Суспензию из 400 мг коммерчески доступного порошка агара (производства Уако Риге СйетЧсаЧ Чпбийпек, Пб.) в 20 мл 1н. НС1 нагревают в микроволновой печи для получения раствора. Полученный раствор охлаждают и доводят до рН 4 гидроксидом натрия. К раствору добавляют 384 мг лимонной кислоты, и раствор доводят до рН 3 гидроксидом натрия. Туда же добавляют воду до получения общего объема 40 мл, и раствор нагревают при 120°С в течение 4 ч. Полученный в результате раствор кислотного разложения доводят до рН 6,5 гидроксидом натрия и фильтруют через 0,2 мкм фильтр (производства Согшпд).
Клетки промиелоцитной лейкемии человека НЬ-60 (АТСС ССЬ-240) инкубируют при 37°С в среде ЕРМ1 1640 (производства 61Ьсо), дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой (ЧЕН Вюкаепсе), которая подверглась обработке при 56°С в течение 30 мин, и суспендируют в той же среде при концентрации 500 клеток/90 мкл. Порции суспензии по 90 мкл распределяют в каждую лунку 96-луночной планшеты (производства Еа1соп). К суспензии в каждой лунке добавляют 10 мкл вышеупомянутого раствора кислотного разложения и 10-кратное разведение раствора с водой, и инкубируют с 5% СО2 при 37°С. Через 24 ч и 48 ч после начала инкубации наблюдают клеточную морфологию в оптическом микроскопе. Затем, в соответствии со способом МЕЕ, описанном в «АрорЮ515 Ч1ккеп РгоЧосо1» (Зуихуип-Ша, Тапита, 8епсЫ еб., рр. 156 (1994)), 5 мг/мл бромида 3-(4,5диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразола (производства 81§та) и 10 мкг фосфатного буферного физиологического раствора добавляют к культуре и продолжают инкубировать еще 4 ч. Затем 100 мкл 2-пропанола, содержащего 0,04н. хлористо-водородную кислоту добавляют к среде, и смесь тщательно перемешивают. Измеряют поглощение при 590 нм, и количество живых клеток подсчитывают исходя из измеренного поглощения для каждой лунки, результаты по каждой лунке сравнивают.
Результат показал, что количество жизнеспособных клеток в культуральной среде, к которой добавляли раствор кислотного разложения или 10-кратное разведение этого раствора, значительно уменьшилось по сравнению с той культуральной средой, к которой добавляли воду. Кроме того, в погибших клетках наблюдались гранулы (корпускулы) апоптоза.
(2) Суспензию из 400 мг порошка агара в 20 мл 1н. НС1 нагревают в микроволновой печи для получения раствора. После охлаждения к раствору кислотного разложения добавляют 20 мл 50 мМ цитратного буфера (рН 3), и раствор доводят до рН 6,5 гидроксидом натрия. Полученный в результате раствор фильтруют через 0,2 мкм фильтр (производства Согшпд) для получения раствора кислотного разложения.
В соответствии со способом, описанным выше в примере 1-(1), раствор с кислотным разложением и его 10-кратное разведение подвергают анализу в тестах на антипролиферацию с НЬ-клетками и на индуцирование апоптоза. В результате обнаружено, что раствор с кислотным разложением показал почти такую же антипролиферативную активность против опухолевых клеток и апоптоз-индуцирующую активность, как и раствор с кислотным разложением из примера 1-(1).
(3) Суспензию из 400 мг порошка в 40 мл 1н. НС1 помешают на водяную баню для получения раствора. Раствор делят на 8 равных частей. Каждую часть кипятят на водяной бане в течение 0, 30, 60, 90, 120, 180 или 210 мин и, после охлаждения доводят рН до 6,5 с помощью 2н. гидроксида натрия.
В соответствии со способом, описанным выше в примере 1-(1), каждый раствор подвергают анализу на антипролиферацию с НЬ-60 клетками и анализу на индуцирование апоптоза. В результате обнаружено, что раствор, обработанный в течение 0 и 30 мин показывает такую же активность, как и раствор с кислотным разложением, описанный в примере 1-(1). Однако, раствор, обработанный в течение 60 мин или дольше, не показывает ни той, ни другой активности.
(4) Суспензию из 300 мг порошка агара в 30 мл 1н.; 0,5н., 0,25н., 0,13н.; 0,063н., 0,031н., 0,016н. и 0,0078н. хлористо-водородной кислоты помещают на кипящую водяную баню на 10 мин для получения раствора. После охлаждения рН раствора доводят до 6,5 с помощью 2н. гидроксида натрия.
В соответствии со способом, описанным выше в примере 1-(1), каждый обработанный таким образом раствор подвергают анализу на антипролиферацию с НЬ-60 клетками и анализу на индуцирование апоптоза. В результате обнаружено, что раствор, обработанный хлористоводородной кислотой с 1н. (рН 0,05) до 0,063н. (рН 1,3) показывает такую же активность, как и раствор с кислотным разложением, описанный в примере 1-(1). В растворах, обработанных хлористо-водородной кислотой с концентрацией менее 0,063н., активность снижалась со снижением концентрации хлористо-водородной кислоты. Однако оба вида активности определялись даже в растворе, обработанном 0,078н. хлористо-водородной кислотой.
(5) К 40 мл 1н. хлористо-водородной кислоты или 40 мл 0,12н. хлористо-водородной кислоты добавляют 400 мг порошка агара, и полученную в результате смесь выдерживают на кипящей водяной бане в течение 10 мин для получения раствора. После нейтрализации до рН 6,5 с помощью 2н. гидроксида натрия каждый раствор подвергают гель-фильтрации с использованием в качестве элюента Сс11и1оПпс ОСЬ-25 с 0,2М №С1, содержащим 10% этанола. В соответствии с таким же способом, который описан в примере 1-(1), каждый элюат подвергают анализу на антипролиферацию с НЬ-60 клетками и анализу на индуцирование апоптоза. Антипролиферативная активность, выраженная в относительной активности, измеряется следующим образом.
Каждый элюат добавляют к НЬ-60 клеткам, и клетки культивируют в течение 3 дней. Затем измеряют поглощение при 590 нм (АЬкТ) в сответствии со способом МТТ, описанным в примере 1-(1).
Аналогично к НЬ-60 клеткам вместо элюата добавляют элюент для гель-фильтрации, и клетки культивируют. Затем измеряют поглощение при 590 нм (АЬкС) в соответствии со способом МТТ, описанным в примере 1-(1).
Относительная активность: АЬкС - АЬкТ
Фиг. 1 иллюстрирует график элюции при гель-фильтрации продукта разложения агара, полученного с помощью 0,12н. хлористоводородной кислоты. На фиг. 1 вертикальная ось представляет содержание сахаридов в элюате, измеренное с помощью фенолсульфатного способа (поглощение при 480 нм: незакрашенный круг) или относительная активность (закрашенный круг), и на горизонтальной оси представлен номер фракции (12 мл/фракцию).
Фиг. 2 иллюстрирует график элюции гельфильтрации продукта разложения агара, подвергнутого разложению с помощью 1н. хлористо-водородной кислоты. На фиг. 2 вертикальная ось представляет содержание сахарила в элюате, измеренное фенолсульфатным способом (поглощение при 480 нм: незакрашенный круг) или относительная активность (закрашенный круг), и на горизонтальной оси представлен номер фракции (12 мл/фракцию).
Как показано на фиг. 1 и 2, продукты кислотного разложения агара проявляют антипролиферативную активность против опухолевых клеток, и гранулы апоптоза наблюдались в погибших клетках.
Элюаты фракции № 51-64 и фракций № 65-84 на фиг. 1 соответственно объединяют для получения апоптозиндуцирующих и/или карциностатических сахаридов.
Элюаты фракций №№ 60-78 и фракций №№ 79-95 на фиг. 2 объединяют соответственно для получения апоптозиндуцирующих и/или карциностатических сахаридов.
Пример 2.
(1) Суспензию 1г коммерчески доступного агара (Адаг №Ь1с. производства ΌίΓοο) в 100 мл
0,1н. хлористо-водородной кислоты нагревают в микроволновой печи до кипения для получения раствора. После охлаждения до комнатной температуры и доведения рН до 6, раствор фильтруют через фильтр Соктошсе (производства Ναοαίαί Текцие) и 2 мл фильтрата отделяют с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой при следующих условиях. Колонка: Т8К-гель 0Ό8 80Тк (20мм х 250 мм, производства Токо) Т8К предколонка ОЛ8-80Тк (20 мм х 50 мм, производства Токо). Подвижная фаза: водный 0,1% раствор трифторуксусной кислоты (ТЕЛ)
Скорость потока: 9 мл/мин.
Определение: поглощение при 215 нм.
Каждый пик элюции фракционируют, собирают, выпаривают до сухого состояния при пониженном давлении и затем растворяют в 300 мкл воды. Каждую фракцию стерилизуют и его 10 мкл порцию помещают в лунку 96-луночной микротитровальной планшеты. Затем туда же добавляют 90 мкл среды ΒΡΜΙ 1640 (производства Νίκκιιί). содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки (производства 61Ьсо) и 5,000 НЬ60 клеток (АТСС ССЬ-240) с последующим инкубированием при 37°С в течение 48 ч с 5% СО2. Клеточную морфологию наблюдают в оптическом микроскопе. Затем туда же добавляют 5 мг/мл бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)2,5-дифенилтетразола и 10 мкл фосфатного буферного физиологического раствора и продолжают инкубировать еще 4 ч. К среде добавляют 100 мкл 2-пропанола, содержащего 0,04Ν хлористо-водородную кислоту, и полученную смесь тщательно перемешивают. Поглощение при 590 нм измеряют для определения скорости клеточной пролиферации.
В результате обнаружено, что гранулы апоптоза наблюдаются в группе, к которой добавляли фракцию пика на 8,26 мин. И при сравнении с контрольной группой, к которой добавляли воду, поглощение при 590 нм ниже, а также наблюдается подавление клеточной пролиферации.
(2) 100 мкл фракции из пика, полученного на 8,26 мин, описанного в примере 2-(1) отделяют с помощью ВЭЖХ с исключением по размерам следующим образом.
Колонка: Т8К-гель α-2500 (7,8 мм х 300 мм, производства Токо) Т8К предколонка α (6 мм х 40 мм, производства Токо)
Подвижная фаза: водный 0,01% раствор ТЕА.
Скорость потока: 0,8 мл/мин.
Определение: дифференциальный рефрактометр.
График разделения ВЭЖХ с исключением по размерам иллюстрируется на фиг. 3. Фиг. 3 иллюстрирует хроматограмму ВЭЖХ с исключением по размерам продукта кислотного разложения агара. Горизонтальная ось представляет время элюции (мин) и вертикальная ось представляет данные дифференциальной рефрактометрии.
Каждый выделенный пик фракционируют, собирают и выпаривают до сухого состояния при пониженном давлении. Каждую фракцию растворяют в воде в концентрации 10 мг/мл, стерилизуют фильтрацией и затем, в соответствии с таким способом, который описан выше в примере 2-(1), измеряют апоптоз-индуцирующую активность и антипрофилиративную активность против опухолевых клеток. В результате обнаружено, что пики элюции полученные на 8,87 мин и 9,40 мин, обладают обеими видами активности.
Вещества, полученные при элюции на 8,87 мин и 9,40 мин, раздельно растворяют в фосфатном буферном физиологическом растворе, и выдерживают при 37°С в течение 1 ч. Затем в соответствии с описанным выше способом их анализируют с помощью ВЭЖХ с исключением по размерам. В результате обнаружено, что пики на 8,87 мин и 9,40 мин наблюдаются в обоих образцах, и соотношение площади пиков в этих образцах почти идентично. Это показывает, что вещества, полученные при времени элюции 8,87 мин и 9,40 мин, находятся в состоянии равновесия, когда они растворяются в водном фосфатном буфере.
Фракции из пиков, полученных при элюции на 8,87 мин и 9,40 мин, объединяют и выпаривают до сухого состояния при пониженном давлении для получения апоптоз-индуцирующего и канцеростатического вещества.
(3) Апоптоз-индуцирующее и канцеро статическое вещество, описанное в примере 2-(2) подвергают масс-спектрометрии на массспектрофотометре ΌΧ302 (производства Жррои ЛеикЫ). Измерение проводят с использованием глицерина в качестве матрикса отрицательных ионов.
Масс-спектрометрия ЕАВ (с бомбардировкой быстрыми атомами) τ/ζ 323 [М-Н]-,
415 (М+глицерин-Н)-,
507 [М+2глицерин-Н]-.
Результаты показаны на фиг. 4. Фиг. 4 иллюстрирует масс-спектр апоптоз-индуцирующего и канцеростатического вещества. Горизонтальная ось представляет значение т/ζ и вертикальная ось представляет относительную интенсивность (%).
Спектр ядерно-магнитного резонанса апоптоз-индуцирующего и канцеростатического вещества, описанный в примере 2-(2), измеряют с помощью ЯМР аппарата 1ΝΜ-Α500 (производства Жррои ЛеикЫ).
Ή-ЯМР: δ 3,36 (1Н, дд, 1=8,0; 10,0 Гц),
3,51 (1Н, дд, 1=3,0; 10,0 Гц), 3,56 (1Н, м), 3,58 (1Н, м), 3,63 (1Н, м), 3,67 (1Н, м), 3,70 (1Н, ДД,
1=3,0; 10,0 Гц), 3,77 (1Н, д, 1=3,0 Гц), 3,83 (1Н, дд, 1=4,5; 10,0Гц), 3,93 (1Н, дд, 1=5,0; 3,5 Гц),
4,23 (1Н, м) , 4,25 (1Н, м) , 4,41 (1Н, д, 1=8,0 Гц),
4,85 (1Н, д, 1=6,0 Гц).
Образцы растворяют в тяжелой воде, и значение химического ΗΟΌ равно 4,65 м.д.
13С-ЯМР: δ 61,9; 69,4; 71,5; 73,37; 73,42; 73,8; 76,0; 76,1; 83,7; 86,5; 90,7; 103,3.
Образцы растворяют в тяжелой воде, и значение химического сдвига диоксана равно 67,4 м.д.
1 Н-ЯМР спектр апоптоз-индуцирующего и канцеростатического вещества показан на фиг. 5. На фиг. 5 горизонтальная ось представляет значение химического сдвига (м.д.), и вертикальная ось представляет интенсивность сигнала.
Образец также растворяют в тяжелом диметилсульфоксиде и измеряют 1Н-ЯМР спектр.
Ή-ЯМР: δ 9,60 (1Н, н-альдегида).
1 Н-ЯМР спектр апоптоз-индуцирующего и канцеростатического вещества в таком растворителе, как тяжелый диметилсульфоксид, показан на фиг. 6 На фиг. 6 горизонтальная ось представляет значение химического сдвига (м.д.) и вертикальная ось представляет интенсивность сигнала.
Апоптоз-индуцирующее и канцеростатическое вещество, описанное в примере 2-(2), на основе аналитических результатов масс-спектрометрии, 'Н-ЯМР и 13С-ЯМР определяется, как агаробиоз. И 1 Н-ЯМР в тяжелом диметилсульфоксиде в качестве растворителя показывает, что 3,6-ангидрогалактоза на восстанавливающем конце агаробиоза в основном представляет собой альдегид, кольцо которого раскрыто в неводном растворителе. Кроме того, Ή-ЯМР в тяжелой воде в качестве растворителя показывает, что в водном растворе он присутствует в виде гидрата альдегида.
Результаты, как обсуждалось выше, обнаруживают, что апоптоз-индуцирующее и карциностатическое вещество, полученное в примере 2-(2), представляет собой агаробиоз.
(4) Апоптоз-индуцирующее и канцеростатическое вещество, полученное в примере 2-(2), то есть агаробиоза растворяют в воде в концентрации 0,78 мг/мл, и каждую порцию по 10 мкл помещают в лунку 96-луночной микротитровальной планшеты для измерения апоптозиндуцирующей активности и антипролиферативной активности, в отношении клеток, в соответствии со способом, описанным в примере 2(1). В результате показано, что гранулы апоптоза наблюдаются в оптическом микроскопе и по сравнению с контрольной группой, к которой добавляли воду, клеточная пролиферация подавляется на 86% в группе, к которой добавляли агаробиоз. А именно, агаробиоз в концентрации 78 мкг/мл индуцирует апоптоз в НЬ-60 клетках и подавляет клеточную пролиферацию.
Пример 3.
(1) Суспензию из 2,5 г коммерчески доступного агара (Адаг №Ые) в 50 мл 0,1н. НС1 нагревают при 100°С в течение 13 мин для по- лучения раствора. После охлаждения до комнатной температуры и нейтрализации до нейтральной рН с помощью ΝαΟΗ, раствор фильтруют через фильтр Соктошсе и разделяют с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой следующим образом.
Колонка Т8к-гель Ат1бе-80 (21,5 мм х 300 мм, производства Тою).
Растворитель А: водный 90% раствор ацетонитрила.
Растворитель В: водный 50% раствор ацетонитрила.
Скорость потока: 5 мл/мин.
Элюция: линейный градиент от растворителя А до растворителя В (80 мин) растворитель В (20 мин).
Определение: поглощение при 195 нм. Величина наносимого образца: 2 мл.
Пики при времени удерживания 66,7 мин, 78,5 мин и 85,5 мин фракционируют, собирают и подвергают масс-спектрометрии. Результаты показали, что эти вещества представляют собой агаробиозу, агаротетраозу и агарогексаозу соответственно. Разделение с помощью ВЭЖХ, как было описано выше, повторяют 8 раз, и таким образом собранные фракции выпаривают до сухого состояния при пониженном давлении с получением 122 мг агаробиоза 111 мг агаротетраоза и 55 мг агарогексаоза, соответственно.
Результаты показаны на фиг. с 7 по 10. Фиг. 7 иллюстрирует график элюции агаробиоза, агаротетраоза и агарогексаоза при ВЭЖХ с нормальной фазой. Горизонтальная ось представляет время удерживания (мин), и вертикальная ось представляет поглощение при 195 нм. Фиг. 8 иллюстрирует масс-спектр пика на 66,7 мин. Горизонтальная ось представляет значение т/ζ, и вертикальная ось представляет относительную интенсивность (%). Фиг. 9 иллюстрирует масс-спектр пика на 78,5 мин. Горизонтальная ось представляет значение т/ζ, и вертикальная ось представляет относительную интенсивность (%). Фиг. 10 иллюстрирует массспектр пика на 88,5 мин. Горизонтальная ось представляет значение т/ζ, и вертикальная ось представляет относительную интенсивность (%).
(2) К 450 мкл 100 мМ водного раствора агаробиоза, полученного в примере 3-(1) добавляют 50 мкл 10-кратно концентрированного фосфатного буферного физиологического раствора (Т900, производства Такага 81ιιιζο) и 50 мкл 10 единиц/мкл β-галактозидазы (С5635 производства 81дта) в фосфатном буферном физиологическом растворе. Полученную в результате смесь инкубируют при 37° в течение 1 ч.
К реакционной смеси добавляют 5 мл смеси (1) бутанола : этанола = 1 : 1, и затем нерастворимые вещества удаляют центрифугированием. Полученный в результате раствор наносят на силикагель В№-3008Р для колоночной хро39 нии. Клетки и используемая культуральная среда показаны в табл. 1 и 2.
Таблица 1 матографии (3 х 50 см, производства Ецц 311ук1а Сбеш1са1 Ь1б.) и разделяют с использованием 1бутанола : этанола : воды = 5 : 5 : 1 в качестве элюента при прокачивании при 0,3 кг/см2 с помощью компрессора. При фракционировании проводится сбор 7 мл фракций, и каждая порция каждой фракции собирается и анализируется с помощью тонкослойной хроматографии. В результате определено, что фракции номеров с 14 по 17 содержат 3,6-ангидро-Ь-галактозу с высокой степенью чистоты. Эти фракции объединяют и выпаривают до сухого состояния при пониженном давлении, получая 3,8 мг 3,6ангидро-Ь-галактозы. Структура этого вещества подтверждается масс-спектрометрией и ядерномагнитным резонансом.
Результаты показаны на фиг. с 11 по 13. Так, фиг. 11 иллюстрирует масс-спектр 3,6ангидро-Ь-галактозы. Горизонтальная ось представляет значения т/ζ и вертикальная ось представляет относительную интенсивность (%). Фиг. 12 иллюстрирует Ή-ЯМР спектр 3,6ангидро-Ь-галактозы в тяжелой воде, и фиг. 13 иллюстрирует Ή-ЯМР спектр 3,6-ангидро-Ьгалактозы в растворе тяжелого диметилсульфоксида. На этих фигурах горизонтальные оси представляют значения химического сдвига, и вертикальные оси представляют интенсивность сигнала.
Для 3,6-ангидро-Ь-галактозы 1 Н-ЯМР спектр в тяжелом диметилсульфоксиде в качестве растворителя также показывает сигнал от протона альдегида при 9,60 м.д. Это показывает, что она присутствует в виде альдегида, кольцо которого открыто в неводном растворителе. Кроме того, из Ή-ЯМР спектра в тяжелой воде видно, что она присутствует в виде гидрата альдегида в водном растворе.
Пример 4.
(1) 20 мМ раствор 3,6-ангидро-Ь-галактозы, полученный в примере 3, разбавляют 2-, 4- и 8-кратно стерилизованной водой, и в соответствии со способом, описанным в примере 2-(1) измеряется апоптоз-индуцирующая активность и антипролиферативная активность в отношении опухолевых клеток в соответствующем разведении. В результате показано, что в группе, к которой добавляли 2-кратное разведение 3,6ангидро-Ь-галактозы (в конечной концентрации 1 мМ), наблюдались гранулы апоптоза, и поглощение при 590 нм становилось меньше, чем в половине случаев контрольной группы, к которой добавляли воду.
(2) 50 мМ раствор агаробиозы, агаротетраозы и агарогексаозы, полученных в примере 3-(1), стерилизуют фильтрацией и разбавляют 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64- и 128-кратно стерилизованной водой. В соответствии с таким же способом, который описан в примере 2-(1) измеряется антипролиферативная активность в отношении различных клеток в конечном разведе-
Клетки Среда
Промиелоцитной лейкемии человека НЬ-60 (АТСС ССЬ240) Среда Κ.ΡΜΙ 1640(№з8ш), содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки (01Ьсо)
Периферийные лимфоциты человека КРМ1 1778 (АТСС ССЬ 156) Такая же, как и выше
Моноциты мыши ЬА\\' 264,7 (АТСС ΤΙΒ 71) Среда ЭМЕМ, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки (№88Ш)
Клетки рака желудка человека ΜΚΝ 45 (К1кеп генный банк, К.СВ 1001) Среда К.РМ1 1640, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки
Клетки рака печени человека НерО2 (АТСС НВ 8065) Среда ЭМЕМ, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки
Аденокарциномы ободочной кишки человека НТ-29(АТСС НТВ 38) Среда МсСоу' 8, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки (Βίο ^ЫИакег)
Аденокарциномы ободочной кишки человека НСТ 116 (АТСС ССЬ-247) Среда МсСоу'8, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки (Βίο ^ЫИакег)
Фибросаркома НТ-1080 (АТСС ССЬ-121) Такая же, как выше
Среда ЭМЕМ, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки
Таблица 2
Клетки Среда
Глиальные властные клетки А- 172 (АТСС СОЬ 1620) Среда ЭМЕМ, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки
Рак груди человека МСЕ7 (АТСС НТВ-22) Среда ЭМЕМ, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки
Рак груди человека Т-47Э (АТСС НТВ-133) Среда К.РМ1 1640, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки
Карцинома мочевого пузыря человека Т24 (АТСС НТВ-4) Среда МсСоу'8, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки
Клетки рака шейки матки человека НеЬа83(АТСС ССЬ-22) Среда ЭМЕМ, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки
Рак легких человека А549 (АТСС ССЬ-185) Такая же, как выше
Аденокарценома толстой кишки человека (АТСС ССЬ- 218) Среда К.РМ1 1640, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки
Результаты показывают, что агаробиоза, агаротетраоза и агарогексаоза проявляют антипролиферативную активность против данных клеток. Результаты представлены в табл. 3.
Цифры в табл. 3 представляют степень добавленного разбавления, поглощение которого при 590 нм ниже, чем у половины контрольной группы, к которой добавляли воду. Степень разбавления 1 относится к концентрации 5 мМ в клеточной культуральной среде. Затем, для агаробиозы, агаротетраозы и агарогексаозы концентрация, необходимая для степени подавления пролиферации в 50% (1С50), подсчитывается, основываясь на изменениях в поглощении при 590 нм, и показана в табл. 4.
Таблица 3
Клетки Агаробиоза Агаротетраоза Агарогексаоза
НЬ-60 32 64 64
КРМ11788 64 128 128
КЛА264,7 16 32 32
ΜΚΝ45 8 16 16
НерО2 8 8 16
НТ-29 8 16 32
НСТ116 16 32 32
НТ-1080 8 16 16
А-172 16 16 16
МСЕ7 16 16 16
Т-470 16 16 16
Т24 8 8 8
ЕеЬа 83 8 8 16
А549 8 8 16
ΑίϋΓ 8 8 16
Таблица 4
Клетки 1С50(мкМ)
Агаробиоза Агаротетраоза Агарогексаоза
НЬ-60 170 97 78
КРМ11788 44 28 22
КЛ^264,7 179 133 109
ΜΚΝ45 344 196 166
НерО2 652 413 430
НТ-29 622 208 144
НСТ116 244 158 136
НТ-1080 317 216 185
А-172 289 185 151
МСР7 274 276 238
Т-47Э 210 183 158
Т24 352 399 365
НеЬа 83 353 400 334
А549 570 494 279
\Ь11Ж 405 399 334
Пример 5.
Суспензию 5 г коммерчески доступного агара в 50 мл 0,1н. НС1 нагревают при 100°С в течение 13 мин. После охлаждения до комнатной температуры раствор нейтрализуют до около нейтральной рН с помощью ЫаОН, и 2 мл раствора наносят на колонку (10 х 255 мм), заполненную активированным углеродом (60-150 меш 079-21, производства Ыаса1а1 Те5С|ие). промытым водой. Колонку промывают 200 мл воды, и затем элюируют с порциями по 200 мл 2,5%, 5%, 7,5%, 10%, 12,5%, 15%, 17,5%, 20%, 22,5%, 25%, 27,5%, 30%, 35%, 40%, 45% и 50% водного этанола.
Каждую элюированную фракцию 10кратно концентрируют при пониженном давлении и наносят на пластинку силикагеля 60Р254 (производства Мегк) и проявляют 1-бутанолом : этанолом : водой 5:5:1. Орциноловый реагент (полученный путем растворения 400 мг моногидрата орцинола (производства Ыаса1а1 Теэдие) в 22,8 мл серной кислоты и добавляя туда воду до конечного объема 200 мл) распыляют для наблюдения полученных в результате пятен.
Результаты показали, что агаробиоза с высокой чистотой содержится во фракциях, элюированных при 5 и 7,5% водного этанола; агаротетраоза с высокой чистотой содержится во фракциях, элюированных 15 и 17,5% водным этанолом; агарогексаоза с высокой чистотой содержится во фракциях, элюированных 22,5 и 25% водным этанолом; агарооктаоза с высокой чистотой содержится во фракциях, элюированных 27,5 и 30% водным этанолом.
Пример 6.
Агаробиозу, агаротетраозу, агарогексаозу и агарооктаозу (здесь далее иногда эти олигосахариды называются агароолигосахариды), полученные в примере 5, растворяют в воде при концентрациях 2,5 мМ или 1,25 мМ раздельно и стерилизуют фильтрацией. НЬ-60 клетки суспендируют в среде РВМ1 1640, содержащих 10% фетальной бычьей сыворотки при концентрации 2,5 х 105 клеток/4,5 мл, и к этой суспензии добавляют 0,5 мл каждого раствора олигосахарида. Полученную в результате смесь инкубируют с 5% СО2 при 37°С в течение 24 ч или 48 ч. Часть клеточной среды забирают с последующим добавлением туда Тгурап В1ие, и наблюдают в микроскоп для подсчета числа живых клеток. Результаты показали, что число жизнеспособных клеток в каждой группе снижено по сравнению с группой, к которой добавляли воду (контроль), и наблюдались гранулы апоптоза.
Результаты показаны на фиг. 14 и 15. Фиг. 14 иллюстрирует соотношения между временем инкубации и числом живых клеток, когда НЬ-60 клетки культивируются с добавлением одного из олигосахаридов с конечной концентрацией 250 мкМ. Фиг. 15 иллюстрирует соотношение между временем инкубации и числом живых клеток, когда НЬ-60 клетки культивируются с добавлением одного из олигосахаридов с конечной концентрацией 125 мкМ. На фиг. 14 и 15 горизонтальные оси представляют время инкубации (часы) и вертикальные оси - число живых клеток (х 105/5 мл). Закрашенный круг представляет добавление воды (контроль), незакрашенный ромб представляет добавление агаробиозы, незакрашенный круг представляет добавление агаротетраозмы, незакрашенный треугольник представляет добавление агарогексаозы, и незакрашенный квадрат представляет добавление агарооктаозмы.
Пример 7.
(1) Суспензию 0,2 г к-карагенана (производства 81дта, С-1263) или λ-карагенана (производства Аако Риге Скетюа1 1пйи51г1е5, Ый., 038-14252) в 20 мл 0,1н. НС1 нагревают при 95°С в течение 10 мин. После нейтрализации 1н. ЫаОН полученную смесь разбавляют 1,5-, 2,25-, 3,38- и 5,06-кратно водой, и антипролиферативную активность против клеток НЬ-60 измеряют в соответствии со способом, описанным в примере 2-(1). Результаты показали, что в группах, к которым добавляли 1,5-, 2,25- и 3,38кратное разбавление нагретого к-карагенана и 1,5- и 2,25-кратное разбавление нагретого λкарагенана, поглощение при 590 нм меньше, чем в половине контрольной группы, к которой добавляли воду, и наблюдаются гранулы апоптоза.
(2) Коммерчески доступный агар (Адаг №Ь1е), агарозу Ь03 (производства Такага 811ихо) и коммерчески доступный агар в брикетах суспендируют в 1н. НС1 в концентрации 1%, соответственно, и нагревают при 100°С в течение 15 мин. После охлаждения нагретые смеси нейтрализуют 1н. ΝηΟΗ и разбавляют 2-, 4-, 8- и 16кратно водой, соответственно. Антипролиферативную активность против клеток НЬ-60, полученную в результате разведения, измеряют таким же способом, который описан в примере 2(1). Результаты показали, что в группах, к которым добавляли с 2- по 8-кратное разведение продуктов кислотного разложения агара и агарозы и 2- и 4-кратное разведение продуктов кислотного разложения агара в брикетах, поглощение при 590 нм ниже, чем в половине контрольной группы, к которой добавляли воду, и наблюдаются гранулы апоптоза.
При анализе каждого из продукта кислотного разложения с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой, агароолигосахариды, такие как агаробиоз и т.д. определяются во всех продуктах разложения.
Пример 8.
(1) Коммерчески доступный агар суспендируют в каждом из следующих водных растворов при концентрации 1%.
0,5М, 1М или 2М лимонной кислоты; 0,1М, 0,5М, 1М или 2М азотной кислоты; 0,1М или 0,5М серной кислоты; 0,1М, 0,5М или 1М фосфорной кислоты; 0,1М хлористо-водородной кислоты.
Полученную в результате суспензию агара нагревают в микроволновой печи до растворения агара, с последующей нейтрализацией с помощью ΝηΟΗ. Растворы разбавляют 2-, 4-, 8-, 16- или 32-кратно дистиллированной водой. Затем апоптоз-индуцируюшую активность и антипролиферативную активность в отношении НЬ-60 клеток измеряют в соответствии со способом, описанным в примере 2-(1).
Результаты показали, что агар, нагретый в различных вышеперечисленных кислотах, индуцирует апоптоз в НЬ-60 клетках и подавляет клеточную пролиферацию. Результаты представлены в табл. 5. Цифры в табл. 5 означают степень разбавления, добавленного к группе, поглощение которой при 590 нм ниже, чем его половинное значение в контрольной группе, к которой добавляли воду. Кроме того, цифра в скобках обозначает степень разбавления раствора (полученного без добавления агара путем нейтрализации наивысшей концентрации кислоты, используемой в примере с помощью ΝηΟΗ и разбавления полученного в результате раствора дистиллированной водой), добавленного к группе, поглощение которой при 590 нм ниже, чем его половинное значение в контрольной группе, к которой добавляли воду.
Таблица 5
0,1М 0,5М 1М 2М
Лимонная кислота 4 8 16(8)
Азотная кислота 8 16 16(2)
Серная кислота 8 16(2)
Фосфорная кислота 4 8 16(1)
Хлористо-водородная кислота 16
(2) Вещества, полученные путем нагревания агара в кислотах в примере 8-(1) анализируют с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой следующим образом.
Колонка: РАЬРАК типа 8 (4,6 х 250 мм, производства Такага 8Нихо, СА8300).
Растворитель А: водный 90% раствор ацетонитрила.
Растворитель В: водный 50% раствор ацетонитрила.
Скорость потока: 1 мл/мин.
Элюация: растворитель А (10 мин) линейный градиент от растворителя
А до растворителя В (40 мин) растворитель В (10 мин).
Определение: поглощение при 195 нм.
Температура колонки: 40°С.
Результаты показали, что образцы, нагретые в 0,5М, 1М и 2М лимонной кислоте, 0,1М, 0,5 М, 1М и 2М азотной кислоте, 0,1М и 0,5М серной кислоте, 0,1 М, 0,5М и 1 М фосфорной кислоте и 0,1М хлористо-водородной кислоте содержат агароолигосахариды, такие как агаробиоз и т. д.
Характерные результаты представлены на фиг. 16. Так, фиг. 16 иллюстрирует и график элюции ВЭЖХ с нормальной фазой агара в 0,5 М фосфорной кислоте. На фиг. 16 горизонтальная ось представляет время удерживания (мин) и вертикальная ось представляет поглощение при 195 нм.
Пример 9.
Суспензию 5 г коммерчески доступного агара (агар 1па типа 8-7, производства 1па 81окиЫи Кодуо) в 45 мл 20, 50 или 100 мМ лимонной кислоте нагревают при 95°С. Образцы получают после нагревания в течение определенных промежутков времени, как описано выше.
Для 20 мМ лимонной кислоты, 310 мин, 350 мин, 380 мин, 440 мин и 530 мин.
Для 50 мМ лимонной кислоты 100 мин, 120 мин, 140 мин, 160 мин, 180 мин, 200 мин, 220 мин, 240 мин, 260 мин, 290 мин и 320 мин.
Для 100 мМ лимонной кислоты 60 мин, 70 мин, 80 мин, 90 мин, 100 мин, 120 мин, 140 мин, 160 мин, 180 мин, 200 мин, 220 мин и 240 мин.
мкл 10-кратного разведения каждого образца помещают на пластинку силикагеля Е254 (производства Мегк), проявленную 1-бутанолом : этанолом : водой = 5 : 5 : 1 и определяют орцинолсульфатным способом.
Результаты показали, что каждый образец содержит агароолигосахариды, такие как агаробиоз, агаротетраоз и агарогексаоз, и т.д.
В каждом образце, обработанном 20 мМ лимонной кислотой, содержание агароолигосахарида повышается в процессе нагревания в течение 350 мин, и после этого сохраняется почти постоянным.
Для образцов, обработанных 50 мМ лимонной кислотой, содержание агароолигосахарида повышается в процессе нагревания в течение 200 мин и после этого сохраняется почти постоянным.
Для образцов, обработанных 100 мМ лимонной кислотой, содержание агароолигосахарида повышается в процессе нагревания в течение 160 мин и после этого сохраняется почти постоянным.
Конечное содержание агароолигосахарида повышается при повышении концентрации лимонной кислоты.
Каждый образец анализировали с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой таким же образом, как описано в примере 8-(2). Полученные результаты согласуются с результатами, полученными путем тонкослойной хроматографии. Однако образцы обработанные 100 мМ лимонной кислотой содержат более чистый продукт, чем обработанные 50 мМ лимонной кислотой, и чистота повышается при увеличении времени нагревания.
Пример 10.
(1) Агаробиозу, полученную в примере 3(1), растворяют в воде в концентрации 0,05 мМ, 0,1 мМ, 0,2 мМ, 0,4 мМ, 0,6 мМ, 0,8 мМ или 1 мМ. Один микролитр каждого образца наносят на пластинку силикагеля Е254, трижды проявленную хлороформом : метанолом : уксусной кислотой = 7 : 2 : 2, и цвет проявляют орцинолсульфатным способом. Данные изображений пластинок с проявленным цветом получали с использованием ЕОТОЭУЫЕ ЕОТО\Апа1ук1 АгсЫуег Еспрке (поставляемые Сеп1га1 Кадаки Воиек1кка). Изображение обрабатывали с использованием программного обеспечения для анализа изображений ΙΌ Ваис (производства Абуапсеб Ашепсап Вю1ес1то1оду) , и интенсивность пятна агаробиозы при каждой концентрации переводили в цифровые значения для построения калибровочной кривой.
График калибровочной кривой показан на фиг. 17. Так, фиг. 17 иллюстрирует калибровочную кривую для агаробиозы, и график получен путем нанесения каждой концентрации агаробиозы против интенсивности каждого пятна. На фиг.17 горизонтальная ось представляет концентрацию агаробиозы (мМ) и вертикальная ось представляет интенсивность пятна. Уравнение на фиг. 17 представляет отношение интенсивности пятна (у) и концентрации агаробиозы (х). Для образцов, в которых концентрация агаробиоза неизвестна, концентрация агаробиозы может быть подсчитана из уравнения путем определения интенсивности пятна.
Подобным образом, строится калибровочная кривая для агаротетраозы, агарогексаозы и агарооктаозы, полученных в примере 5.
(2) Суспензию 0,2 г коммерчески доступного агара (Адаг №Ь1е) в 90 мл воды нагревают в микроволновой печи и охлаждают до около комнатной температуры. К полученному в результате раствору добавляют 10 мл 1М НС1 или 1М лимонной кислоты для получения 0,2 % раствора агара в 0,1М НС1 или 0,2 % раствора агара в 0,1 М лимонной кислоте. Раствор нагревают при 90°С, и образцы получают на 5 мин, 10 мин, 20 мин, 30 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 8 ч и 21 ч после начала нагревания. Каждый образец подвергают тонкослойной хроматографии в соответствии с таким же способом, который описан в примере 10-(1), и определяют интенсивность пятна для определения концентрации агаробиозы. Каждый образец соответствующим образом разбавляют для получения концентрации агаробиозы в пределах от 0,05 мМ до 1 мМ.
На фиг. 18 и 19 показано соотношение между временем нагревания и количеством агаробиозы, полученного в 0,2% растворе агара в 0,1М НС1 и 0,2% растворе агара в 0,1М лимонной кислоты. Фиг. 18 иллюстрирует соотношение между временем нагревания и количеством образованного агаробиозы в 0,2% растворе агара в 0,1М НС1. Фиг. 19 иллюстрирует соотношение между временем нагревания и количеством агаробиозы, полученного в 0,2% растворе агара в 0,1М лимонной кислоты. На фиг. 18 и 19 каждая горизонтальная ось представляет время нагревания (часы), и вертикальная ось представляет концентрацию агаробиозы (мМ).
Как показано на фиг. 18, в 0,2 % растворе агара в 0,1М НС1 концентрация агаробиозы достигает максимума при нагревании в течение одного часа и затем снижается. И, как показано на фиг. 19, в 0,2% растворе агара в 0,1М лимонной кислоты концентрация агаробиозы постепенно повышается при нагревании в течение 8
4, и снижение наблюдается на 21 ч. Концентрация агаробиозы в образце, полученном путем нагревания 0,2% раствора агара в 0,1М НС1 в течение 5 мин, или при нагревании 0,2% раствора агара в 0,1М лимонной кислоте в течение
5, 10 или 20 мин, была ниже границы определения.
(3) Адаг №Ь1е суспендируют в 5,50 и 500 мМ лимонной кислоте в концентрации 10%, нагревают при 65, 80 или 95°С. Образцы получают через 30 мин, 1, 2, 4, 8 или 24 ч после начала нагревания и, в соответствии со способом, описанном в примере 10-(1), измеряют количество.
В результате, когда агар растворяют в 5 мМ лимонной кислоте, при 80°С образуется лишь небольшое количество агароолигосахаридов, и они едва образуются при 65°С.
При 95°С образуется большое количество агаробиозы при нагревании от 8 до 24 ч, и большое количество агаротетраозы также образуется при нагревании от 8 до 24 ч. Когда агар растворяют в 50 мМ лимонной кислоте, агароолигосахариды едва образуются при 65°С. При 80°С большое количество агаробиозы образуется при нагревании в течение 24 ч, большое количество агаротетраозы, агарогексаозы и агарооктаозы образуется при нагревании в течение от 4 до 8 ч. При 95°С большое количество агаробиозы образуется при нагревании в течение 24 ч, большое количество агаротетраозы, агарогексаозы и агарооктаозы образуется при нагревании от 4 до 8 ч. Когда агар растворяют в 500 мМ лимонной кислоте, небольшое количество агароолигосахаридов образуется при нагревании при 65°С в течение от 4 до 24 ч. При 80°С большое количество агаробиозы образуется при нагревании в течение от 2 до 24 ч, и большое количество агаротетраозы и агарогексаозы образуется при нагревании в течение от 1 до 6 ч. Большое количество агарооктаоза образуется при нагревании в течение от 1 до 2 ч. При 95°С большое количество агаробиозы образуется при нагревании в течение 1-24 ч, большое количество агаротетраозы образуется при нагревании в течение 1-2 ч. Большое количество агарогексаозы и агарооктаозы образуется при нагревании в течение от 30 мин до 1 ч.
Примеры гидролиза с помощью 500 мМ лимонной кислоты показаны на фиг. 20 и 21. Так, фиг. 20 иллюстрирует агароолигосахарид, образованный в 500 мМ лимонной кислоте путем нагревания при 80°С. На фиг. 20 вертикальная ось представляет количество образованных агароолигосахаридов (незакрашенный круг: агаробиоза, незакрашенный треугольник: агаротетраоза, незакрашенный квадрат: агарогексаоза, символ х: агарооктаоза, и горизонтальная ось представляет время. Фиг. 21 иллюстрирует количество агароолигосахарида, образованного в 500 мМ лимонной кислоте путем нагревания при 95°С. На фиг. 21 вертикальная ось представляет количество образованных агароолигосахаридов (незакрашенный круг: агаробиоза, незакрашенный треугольник: агаротетраоза, незакрашенный квадрат: агарогексаоза, символ х: агарооктаоза, и горизонтальная ось представляет время.
(4) В соответствии со способом, описанным в примере 10-(3), измеряется количество агароолигосахарида, образованного в 50, 500 или 1000 мМ уксусной кислоте.
Результаты показали, что когда агар растворен в 50 мМ уксусной кислоте, небольшое количество агароолигосахаридов образуется при 80°С, в то время как агароолигосахариды едва образуются при 65°С. Когда агар растворен в 500 мМ уксусной кислоте, агароолигосахариды едва образуются при 65°С. При 80 и 95°С образуется небольшое количество агароолигосахаридов. Когда агар растворяют в 1000 мМ уксусной кислоте, агароолигосахариды едва образу ются при 65°С. При 80°С большое количество агаробиозы образуется при нагревании в течение 24 ч, небольшое количество агаротетраозы, агарогексаозы и агарооктаозы образуется при нагревании в течение 8 ч. При 95°С большое количество агаробиоза образуется при нагревании в течение 8 ч, большое количество агаротетраозы, агарогексаозы и агарооктаозы образуется при нагревании в течение 8 ч.
(5) В соответствии со способом, описанным в примере 10-(3), измеряется образование агароолигосахаридов в 60, 600 или 1200 мМ молочной кислоте.
Результаты показали, что когда агар растворяют в 60 мМ молочной кислоте, небольшое количество агароолигосахаридов образуется при 95°С, в то время как агароолигосахариды едва образуются при 65 и 80°С. Когда агар растворяют в 600 мМ молочной кислоте, большое количество агаробиозы образуется при нагревании при 80°С в течение 8-24 ч, и большое количество агаротетраозы и агарогексаозы образуется при нагревании в течение 4-8 ч. Большое количество агарооктаозы образуется при нагревании в течение 4 ч. При 95°С большое количество агаробиозы образуется при нагревании в течение 4-8 ч, и большое количество агаротетраозы и агарогексаозы образуется при нагревании в течение 2-6 ч. Когда агар растворяют в 1200 мМ молочной кислоте, большое количество агаробиозы образуется при нагревании при 80°С в течение 4-24 ч, и большое количество агаротетраоз и агарогексаозы образуется при нагревании в течение 2-6 ч. Большое количество агарооктаозы образуется при нагревании в течение 2 ч. При 95°С большое количество агаробиозы образуется при нагревании в течение 2-8 ч, большое количество агаротетраозы и агарогексаозы образуется при нагревании в течение 1-2 ч.
Примеры гидролиза с помощью 1200 мМ молочной кислоты показаны на фиг. 22 и 23. Так, фиг. 22 иллюстрирует образование агароолигосахарида в 1200 мМ молочной кислоте путем нагревания при 80°С. На фиг. 22 вертикальная ось представляет количество образованных агароолигосахаридов (незакрашенный круг: агаробиоза, незакрашенный треугольник: агаротетраоза, незакрашенный квадрат: агарогексаоза, символ х: агарооктаоза), и горизонтальная ось представляет время. Фиг. 23 иллюстрирует агароолигосахариды, образованные в 1200 мМ лимонной кислоте путем нагревания при 95°С. На фиг. 23 вертикальная ось представляет количество образованных агароолигосахаридов (незакрашенный круг: агаробиоза, незакрашенный треугольник: агаротетраоза незакрашенный квадрат: агарогексаоза, символ х: агарооктаоза), и горизонтальная ось представляет время.
(6) В соответствии со способом, описанным в примере 10-(3), измеряется образование агароолигосахаридов в 20, 200 или 1000 мМ яблочной кислоте.
Результаты показали, что когда агар растворяют в 20 мМ яблочной кислоте, небольшое количество агароолигосахаридов образуется при 95°С, но агароолигосахариды едва образуются при 65 и 80°С. Когда агар растворяют в 200 мМ яблочной кислоте, небольшое количество агаробиоза образуется при нагревании при 65°С в течение 24 ч. При 80°С большое количество агаробиоза образуется при нагревании в течение 8-24 ч, и большое количество агаротетраозы образуется при нагревании в течение 4-8 ч. Большое количество агарогексаозы образуется при нагревании в течение 4 ч. Большое количество агарооктаозы образуется при нагревании в течение 4 ч. При 95°С большое количество агаробиозы образуется при нагревании в течение 48 ч, большое количество агаротетраозы образуется при нагревании в течение 4 ч. Когда агар растворяют в 1000 мМ яблочной кислоте, при 65°С большое количество агароолигосахаридов образуется при нагревании в течение 24 ч. При 80°С и большое количество агаробиозы образуется при нагревании в течение 2-24 ч, и большое количество агаротетраозы образуется при нагревании в течение 2-6 ч. Большое количество агарогексаозы и агарооктаозы образуется при нагревании в течение 2 ч. При 95°С большое количество агаробиозы образуется при нагревании в течение 1-8 ч, большое количество агаротетраозы образуется при нагревании в течение 1-2 ч. Большое количество агарогексаоза образуется при нагревании в течение 1 ч.
Примеры гидролиза с помощью 1000 мМ яблочной кислоты показаны на фиг. 24 и 25. Так, фиг. 24 иллюстрирует образование агароолигосахаридов в 1000 мМ яблочной кислоте путем нагревания при 80°С. На фиг. 24 вертикальная ось представляет количество образованных агароолигосахаридов, незакрашенный круг: агаробиоза, незакрашенный треугольник: агаротетраоза, незакрашенный квадрат: агарогексаоза, символ х: агарооктаоза, и горизонтальная ось представляет время. Фиг. 25 иллюстрирует агароолигосахариды, образованные в 1000 мМ яблочной кислоте путем нагревания при 95°С. На фиг. 25 вертикальная ось представляет количество образованных агароолигосахаридов (незакрашенный круг: агаробиоза, незакрашенный треугольник: агаротетраоза, незакрашенный квадрат: агарогексаоза символ х: агарооктаозы), и горизонтальная ось представляет время.
(7) №оЫе Адаг суспендируют в 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 мМ яблочной кислоте в концентрации 10%, и суспензию нагревают при 70, 80 или 90°С. Образцы получают через 30 мин, 1, 2, 3, 4, 8 или 24 ч после начала нагревания, и образование агароолигосахарида измеряют таким же способом, который описан в примере 10-(3).
При концентрации яблочной кислоты 300 мМ и больше большое количество агароолигосахаридов образуется даже при нагревании при 70°С в течение 8 ч и дольше. Примеры гидролиза в 1000 мМ яблочной кислоте при 70°С показаны на фиг. 26. Так, фиг. 26 иллюстрирует образование агароолигосахаридов в 1000 мМ яблочной кислоте путем нагревания при 70°С. На фиг. 26 вертикальная ось представляет количество образованных агароолигосахаридов (незакрашенный круг: агаробиоза, незакрашенный треугольник: агаротетраоза и горизонтальная ось представляет время.
Основываясь на результатах, полученных в обсужденных выше примерах с 10-(3) по (7), агароолигосахариды предпочтительно получают при использовании таких кислот, как лимонная кислота, молочная кислота или яблочная кислота при концентрации от нескольких десятков мМ до нескольких М и нагревая при 70-95°С в течение от нескольких десятков минут до 24 ч.
(8) Агаробиоз определяется с использованием Е-набора лактоза/галактоза (производства Воекппдег МаппНепп. код 176303). В вышеприведенном способе агаробиозу определяют путем измерения концентрации галактозы, полученной из агаробиозы под воздействием β-галактозидазы в Е-наборе.
Определение проводится в соответствии с инструкциями, приложенными к набору, за исключением того, что β-галактозидаза реагирует при 37°С в течение 1 ч. Калибровочную кривую строят используя лактозу. Молярная концентрация (мМ) подсчитывается по отношению к лактозе, которая затем переводится в концентрацию агаробиоза (мг/мл).
В соответствии с вышеприведенным способом проводят определение агаробиозы агаротетраозы и агарооктаозы, полученных в вышеприведенном примере. Результаты показали, что подсчитанное количество совпадает с действительно определенным уровнем. С другой стороны, агаротетраоза, агарогексаоза и агарооктаоза вышеприведенным способом в значительной степени не определяются. А именно, в частности обнаружено, что агароолигосахариды, за исключением агаробиозы, не определяются вышеприведенным способом, и что концентрация агаробиозы в агароолигосахаридах может быть измерена с использованием вышеприведенного способа.
(9) Смесь 100 г коммерчески доступного агара (1па агар типа 8-7: производства 1На 8НокиЫп Кодуо) и 10 г Н-типа сильной катионобменной смолы (О1аюп 8К104Н: производства МйъиЫкЫ СНеш1са1) получают путем их перемешивания в 900 г дистиллированной воды при 95°С. Смесь перемешивают при 95°С в течение 180 мин для проведения кислотного разложения агара. Затем полученную в результате смесь охлаждают до комнатной температуры, фильт51 руют через слой 1% вес/вес активированного угля и 0,5% Целита 545 (производства СеШе) для получения фильтрата.
В соответствии со способом, описанным в примере 8-(2), полученный фильтрат анализируют с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой для подтверждения того, что агаробиоза, агаротетраоза и агарооктаоза в основном образуются как агароолигосахариды.
Фильтрат имеет рН 2,4, и он обладает кислотностью 1,7, Ьпх 9,4%, и содержание агаробиозы 7,4%, как измерено с использованием Рнабора лактоза/галактоза, описанного в примере 10-(8).
(10) К 100 г обессоленной воды добавляют 18,5 г сильной катион-обменной смолы Н-типа (Эшуаюп 8К104Н), и смесь перемешивают при 95°С. С 10-минутными интервалами 5 раз добавляют 10 г агара (агар 1па типа 8-7), затем 15 г агара добавляют 2 раза, 20 г агара добавляют 3 раза, наконец добавляют 30 г агара. После добавления агара в общем количестве 185 г, смесь перемешивают при 95°С в течение 150 мин и затем охлаждают до комнатной температуры. Полученную в результате смесь декантируют для отделения смолы от жидкой фазы. Затем отделенную жидкую фазу фильтруют через слой 3% вес\вес активированного угля и 0,5% Целита 545 (производства СеШе) для получения фильтрата.
В соответствии с таким же способом, который описан в примере 8-(2), фильтрат анализируют с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой для подтверждения того, что агаробиоза, агаротетраоза, агарогексаоза и агарооктаоза в основном образуются как олигосахариды.
Фильтрат имеет рН 1,2, и кислотность 11,9, Ьпх 64% и содержание агаробиоза 24,4%, как измерено при использовании Р-набора лактоза/галактоза, описанного в примере 10-(8).
(11) Ожижение агара проводится путем получения суспензии, содержащей 100 г коммерчески доступного агара (1па агар типа 8-7) в деионизированой воде, имеющей различные концентрации фосфорной кислоты, добавленной к объему 1 л, и перемешивая полученную в результате суспензию при 95°С.
В соответствии со способом, описанным для суспензии, содержащей фосфорную кислоту, ожижение агара проводится путем получения суспензии, содержащей агар в деионизированной воде, содержащей 1% вес/объем лимонной кислоты в объеме 1 л. Термин «ожижение», используемый здесь, означает состояние, в котором не происходит желатинирования даже в точке замерзания. Измеряется время, необходимое для достижения такого состояния (время ожижения). Кроме того, содержание агаробиоза при сжижении и после него измеряют с использованием Р-набора лактоза/галактоза, описанного в примере 10-(8).
Результаты показаны в табл. 6 и 7.
Таблица 6
Конц. фосфата вес.%/объем Время ожижения (мин) Время выдержки при 95°С (мин) Агаробиоза (г/л)
150 2,57
0,2 150 180 3,80
300 7,97
120 4,88
0,3 120 180 7,07
300 13,90
110 6,09
0,5 110 180 8,48
300 21,40
1,0 90 90 7,58
120 18,80
Таблица 7
Конц. лимонной кислоты % вес/объем Время ожижения (мин) Время выдержки при 95°С (мин) Агаробиоза (г/л)
1,0 90 90 0,95
120 3,40
150 4,09
300 5,70
360 14,80
Пример 11.
(1) Смесь 150 г коммерчески доступного агара (агар 1па типа 8-7, производства 1па 81юкиШп Кодуо) и 15 г пищевой лимонной кислоты (безводной) (производства 8ап-Е1 Сеп Р.Р.1.) готовят в 1,5 л деионизированной воды. Смесь нагревают до 92°С и затем выдерживают при 92-95°С в течение 130 мин при перемешивании. Затем смесь охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через слой 5% Целита 545 (производства СеШе) для получения фильтрата (раствор олигосахаридов, полученных в результате кислотного разложения). В соответствии со способом, описанным в примере 8-(2), полученный фильтрат анализируют с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой для подтверждения того, что агаробиоза агаротетраоза, агарогексаоза и агарооктаоза в основном образуются как соединения сахаридов.
Фильтрат имеет рН около 2,6, кислотность 0,92, Ьпх 9,2% и содержание агаробиоза 43,1 мМ при измерении способом, описанным в примере 10-(8).
(2) Фильтрат (раствор олигосахаридов, полученных в результате кислотного разложения), полученный в примере 11-(1), разбавляют 20кратно, и к этому раствору добавляют подкислитель, подсластитель и ароматизатор, для получения безалкогольного напитка, содержащего 2,25 мМ агаробиоза.
Готовая препаративная форма показана в табл. 8 и 9. Табл. 8 представляет готовую препаративную форму грейпфрутового безалкогольного напитка, и табл. 9 представляет готовую препаративную форму периллового ароматизированного безалкогольного напитка.
Компоненты, представленные в каждой таблице, добавляются к воде и растворяются с получением безалкогольного напитка, и этот напиток распределен по 20 мл банкам. Безалко53 гольный напиток, показанный в табл. 8, газирован для получения газированного напитка, давление газа в котором составляет 0,8 кг/см2 (20°С).
Аналитическое количество компонентов для каждого напитка показано в нижней колонке табл. 8 и 9.
Таблица 8
Раствор олигосахаридов, полученных при кислотном разложении агара 1/7 грейпфрута Витамин С Лимонная кислота Мальтоза Грейпфрутовый ароматизатор Обессоленная вода 50 мл 20 г 0,2 г 0,2 г 1,25 г 1 г Остальное
Общее количество 1000 мл
РН 3,2
Кислотность 0,23
Впх 2,2
Кислотность : 0,1Ν ΝαΟΗ мл/10мл (и далее так же)
Таблица 9
Раствор олигосахаридов, полученных при кислотном разложении агара Экстракт перилла Витамин С Лимонная кислота Перилловый ароматизатор Обессоленная вода 50 мл 20 г 0,2 г 0,2 г 10,5 г Остальное
Общее количество 1000 мл
РН 2,9
Кислотность 0,10
Вг1х 0,6
Каждый газированный напиток настоящего изобретения тестировали с помощью 10 дегустаторов в сенсорном тесте с присвоением одной из 5 оценок (5 : хорошо, 1 : плохо). В качестве контроля готовили безалкогольный напиток с использованием водного раствора лимонной кислоты, имеющей такую же кислотность, вместо раствора олигосахаридов кислотного разложения агара.
Средние значения, полученные в сенсорном тесте для напитка из самого грейпфрута и напитка с перилловым ароматизатором показаны в табл. 10 и 11.
Таблица 10
Продукт настоящего изобретения Контроль
Текстура Мягкость 4,6 3,1
Однородность 4,8 3,0
Букет вкуса 4,5 2,9
Общая оценка 4,6 3,1
Таблица 11
Продукт настоящего изобретения Контроль
Текстура Мягкость 4,5 2,5
Однородность 4,3 2,4
Букет вкуса 4,2 2,5
Общая оценка 4,4 2,4
дающие лучшим вкусовым букетом, а также мягкостью и однородностью текстуры. Таким образом, продукты представляют собой напитки, имеющие новые вкусовые качества. Так же, безалкогольные негазированные напитки настоящего изобретения обладают новыми вкусовыми качествами.
(3) Этиловый спирт добавляют к каждому из безалкогольных напитков, описанных в табл. 8 и 9 при концентрации этилового спирта 6% об./об. или 8% об./об., и полученные в результате смеси распределяют по 200-миллилитровым банкам. Алкогольные напитки газируют для получения газированных алкогольных напитков настоящего изобретения, в которых давление газа составляет 0,8 кг/см (20°С).
По сравнению с контролем, который не содержал раствор олигосахаридов, полученных в результате кислотного разложения, газированные алкогольные напитки настоящего изобретения обладают лучшим букетом вкуса, а также мягкостью и однородностью текстуры. Таким образом, газированные алкогольные напитки настоящего изобретения обладают новыми вкусовыми качествами.
Пример 12.
(1) Напиток, содержащий продукт кислотного разложения агара с помощью лимонной кислоты, готовят следующим образом. Готовая препаративная форма представлена в табл. 12. Конкретно, для продукта 1 настоящего изобретения в табл. 12 используется 0,1% вес/объем фильтрата, полученного в примере 11-(1) (раствор олигосахаридов агара), 0,25% вес/объем агара (ИНга Адаг ΑΧ-30: производства 1па 8ЬокиЫи Кодуо) и 0,07% в/о лимонной кислоты. Для продукта 2 настоящего изобретения используется 0,25% вес/объем агара и 0,08% в/о лимонной кислоты без добавления раствора олигосахаридов агара. Как в случае продукта 1, так и продукта 2 настоящего изобретения напитки, содержащие продукты разложения агара, полученные при разложении с помощью лимонной кислоты, получают путем растворения агара горячей водой, смешивания их с другими компонентами и нагревания в кислотных условиях при 93°С в течение 10 с, при 93-80°С в течение 20 мин и при 80-75°С в течение 15 мин. С другой стороны, контроль получали в соответствии с такой же препаративной формой, как и продукт 2 настоящего изобретения, за исключением того, что нагревание проводилось при 93°С в течение 10 с.
Каждый напиток, обладающий густотой, содержащий продукт разложения агара, полученный в результате разложения лимонной кислотой, исследовали с помощью 10 дегустаторов по 5-балльной системе.
Данные основных оценок, полученные в сенсорном тесте, представлены в табл. 13.
По сравнению с контролем продукты настоящего изобретения были оценены, как обла55
Таблица 12
Продукт 1 Продукт 2
Агар (г) 2,5 2,5
Раствор олигосахарида агара (мл) 1,0 0
1/7 грейпфрутовый сок (г) 1,5 1,5
Гранулированный сахар (г) 66,0 66,0
Лимонная кислота (г) 0,7 0,8
Цитрат натрия (г) 0,5 0,5
Отдушка (г) 2,0 2,0
Обессоленная вода Остальное Остальное
Общее количество 1000 мл 1000 мл
рН 3,68 3,67
Кислотность 1,53 1,57
Впх 7,5 7,4
Агаробиоз (мМ) 0,06 0,02
Агаробиоз (мМ) измеряется способом, описанным в примере 10-(8).
Таблица 13
Продукт 1 Продукт 2 Контроль
Текстура Мягкость 4,4 4,1 3,6
Однородность 4,5 4,3 3,8
Букет вкуса 4,4 4,2 3,6
Общая оценка 4,5 4,3 3,7
По сравнению с контролем продукты 1 и 2 настоящего изобретения оценены, как обладающие лучшим букетом вкуса, подходящей плотностью, а также мягкостью и однородностью текстуре. Таким образом, эти продукты являются продуктами с новыми вкусовыми качествами. Известно, что в продукты 1 и 2 настоящего изобретения добавляют олигосахарид для антиоксиданта, агаробиозу, полученную путем обработки нагреванием в присутствии лимонной кислоты. Таким образом предлагается новый напиток, содержащий олигосахарид в качестве антиоксиданта.
В соответствии с таким же способом, который описан в примере 10-(8), измеряют количество агаробиозы, образованной в условиях нагревания при 75°С в течение 1 дня; при 85°С в течение 5 мин; при 103°С в течение 5 мин; или при 122°С в течение 45 с вместо 80-75°С в течение 15 мин. Результат подтвердил, что количество образованной агаробиозы составило 0,03 мМ, 0,02 мМ, 0,04 мМ и 0,05 мМ, соответственно, что агаробиоза образуется при тепловой обработке, и что при более жестких условиях нагревания образуется большее количество агаробиозы.
(2) Этиловый спирт добавляют к продукту 1 и продукту 2 настоящего изобретения и контролю, описанному в примере 12-(1) в концентрации этилового спирта 2% об./об. или 4% об./об. До общего объема доводят добавлением обессоленной воды, которая соответствует добавленному этиловому спирту. Таким образом, получают алкогольные напитки.
По сравнению с контролем алкогольные напитки, соответствующие продуктам 1 и 2, исследуются на обладание лучшим балансом вкуса, подходящей плотностью, а также мягкостью и однородностью текстуры. Таким обра- зом, эти продукты являются напитками, обладающими новыми вкусовыми качествами.
В дополнение к этому, замороженные продукты из вышеописанных алкогольных продуктов демонстрируют хорошую щербето-подобную структуру.
Пример 13. (1) Коммерчески доступный агар (Адаг ЫоЫе) суспендируют в 0,1н. хлористо-водородной кислоте в концентрации 1%, и суспензию обрабатывают при 37°С в течение 5, 16 или 48 ч. Таким образом обработанную суспензию разбавляют 10-кратно дистиллированной водой и анализируют с помощью тонкослойной хроматографии, как описано в примере 9. Результаты показали, что образование небольшого количества агароолигосахаридов наблюдается при обработке в течение 5 ч. Их количество повышается при обработке в течение 126 ч и еще более повышается при обработке в течение 48 ч.
(2) Коммерчески доступный агар (Адаг ЫоЫе) суспендируют в фосфатном буферном физиологическом растворе или дистиллированной воде в концентрации 1%, и суспензию нагревают при 121°С в течение 4 ч. Таким образом нагретую суспензию разбавляют 10-кратно дистиллированной водой и анализируют с помощью тонкослойной хроматографии, как описано в примере 9. Результаты показали, что в образцах, подвергнутых тепловой обработке в присутствии фосфатного физиологического раствора, наблюдается образование следового количества агароолигосахаридов. В образцах, подвергнутых тепловой обработке в присутствии дистиллированной воды, наблюдается образование несколько большего количества агароолигосахаридов. Первое происходило при около рН 7 после тепловой обработки, в то время как последнее при рН около 5. После охлаждения до комнатной температуры первый состав желатинировался, а последний нет.
Пример 14.
(1) Агар (Адаг ЫоЫе) суспендируют в 0,1н. НС1 в концентрации 10% и нагревают при 100°С в течение 19 мин. Колонку Т0У0РЕАКЬ Н\У40С (производства Т080) (4,4 см х 85 см) уравновешивают водой и наносят на эту колонку 10 мл вышеприведенного образца. Проводят гель-фильтрационную хроматографию с использованием воды в качестве подвижной фазы со скоростью потока 1,4 мл/мин. Элюированные вещества определяют, используя дифференциальный рефрактометр, и собирают все фракции по 7 мл.
Пики наблюдаются во время элюции на 406, 435, 471 и 524 мин. Анализ фракций, соответствующих соответствующим пикам, с помощью тонкослойной хроматографии, как описано в примере 9, продемонстрировал, что там присутствуют агарооктаоза, агарогексаоза, агаротетраоза и агаробиоза в таком порядке. Фракции лиофилизируют для получения 30 мг агароок57 таозы, 100 мг агарогексаозы, 150 мг агаротетраозы и 140 мг агаробиозы.
(2) Агаробиоз и агарогексаоз, полученные в примере 14-(1), растворяют в воде, получая их 100 мМ водные растворы. К каждым 25 мкл этих растворов добавляют 50 мкл водного 100мМ раствора Ь-цистеина, с последующим добавлением 925 мкл фосфатного буферного физиологического раствора. Затем смесь обрабатывают при 37°С в течение 1 ч или 16 ч. Повторяют такую же реакцию, за исключением того, что используется водный раствор, содержащий Ь-лизин в такой же концентрации вместо водного раствора Ь-цистеина.
мкл образца из каждой реакционной смеси наносят на пластинку силикагеля 60 Е254, проявленную 1-бутанолом : этанолом : водой = 5 : 5 : 1, и проводят определение с помощью орцинол-сульфатного способа.
Результаты показали, что пятна агаробиоза и агаротетраоза исчезали из образца при взаимодействии с Ь-цистеином в течение 1 ч. В образцах, где взаимодействие с Ь-цистеином и Ьлизином проводилось в течение 16 ч, пятна агаробиозы и агаротетраозы не наблюдались.
Когда каждый образец анализировали с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой, как описано в примере 8-(2), результаты соответствовали результатам, полученным с помощью тонкослойной хроматографии.
(3) В соответствии с таким же способом, который описан в примере 2-(1), измеряли антипролиферативную активность в отношении НЬ-60 клеток путем помещения 10 мкл каждого образца из реакционной смеси, полученной в примере 14-(2), в лунку 96-луночной планшеты.
В результате наблюдали, что активность исчезала в тех же образцах, в которых исчезали пятна агаробиозы и агаротетраозы. Таким образом, антипролиферативная активность в образцах, где происходило взаимодействие агаробиоза и агаротетраоза с Ь-цистеином в течение 1 ч и из образца взаимодействия агаробиозы и агаротетраозы с Ь-цистеином или Ь-лизином в течение 16 ч, снижалась до около 1/10 относительно таких же концентраций агробиозы и агаротетраозы.
Пример 15.
(1) Суспензию 2,5 г к-карагенана (производства 81дта, С1263) в 50 мл 0,1Ν НС1 нагревают при 100°С в течение 16 мин. Полученный в результате раствор охлаждают до комнатной температуры, нейтрализуют до около нейтральной рН с помощью ΝαΟΗ, фильтруют через фильтр Соктошсе, разделяют с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой следующим образом.
Колонка: РАЬРАК типа 8 (4,6 х 250 мм, производства Такага δΐιιιζο, СА8300).
Растворитель А: водный 90% раствор ацетонитрила.
Растворитель В: водный 50% раствор ацетонитрила.
Скорость потока: 1 мл/мин.
Элюция: растворитель А (10 мин) линейный градиент от растворителя А до растворителя В (40 мин) растворитель В (10 мин)
Определение: поглощение при 215 нм.
Температура колонки: 40°С.
Количество нанесенного образца: 50 мкл.
График разделения ВЭЖХ с нормальной фазой показан на фиг. 27. Так фиг. 27 иллюстрирует хроматограмму ВЭЖХ с нормальной фазой продукта кислотного разложения ккаргенана. Горизонтальная ось представляет время удерживания (мин), и вертикальная ось представляет поглощение при 215 нм.
Каждый пик элюции фракционируют, собирают, выпаривают до сухого состояния при пониженном давлении и растворяют в 100 мкл воды. Каждую фракцию стерилизуют фильтрацией, в соответствии со способом, описанным в примере 2-(1), и измеряют антипролиферативную активность в отношении НЬ-60 клеток. Результаты показали, что в группах, к которым добавляли фракции из пиков, полученных на 27,797; 33,905 - 34,784 и 36,226-36,654 мин, наблюдались гранулы апоптоза. Поглощение в них при 590 нм было ниже, чем в контрольной группе, к которой добавляли воду, и клеточная пролиферация подавлялась.
Фракцию из пика, полученного на 27,797 мин элюции, разделяли 12 раз с помощью ВЭЖХ при вышеприведенных условиях, и фракции объединяли, выпаривали до сухого состояния при пониженном давлении для получения апоптоз-индуцирующего и канцеростатического вещества.
(2) Масс-спектрометрию апоптозиндуцирующего и карциностатического вещества, описанного в примере 15-(1) проводили с использованием масс-спектрометра ΌΧ302 (производства Νίρροη ЬегМи). Глицерин использовали в качестве матрицы и измерения проводили для отрицательных ионов.
ЕАБ-М8;
т/ζ 403 [М-Н]-;
495 [М+глицерин-Н]-.
Результаты показаны на фиг. 28. Так фиг. 28 иллюстрирует масс-спектр апоптозиндуцирующего и канцеростатического вещества. Горизонтальная ось представляет значение т/ζ, и вертикальная ось представляет относительную интенсивность.
Спектр ядерно-магнитного резонанса апоптоз-индуцирующего и канцеростатического вещества, полученного в примере 15-(1), измеряют с помощью ЯМР прибора 1ΝΜ-Λ500 (производства Νίρροη ЬегМи).
На фиг. 29 показан 1Н-ЯМР спектр апоптоз-индуцирующего и канцеростатического вещества. На фиг. 29 горизонтальная ось пред59 ставляет значения химического сдвига, и вертикальная ось представляет интенсивность сигнала.
Основываясь на аналитических результатах масс-спектрометрии и Ή-ЯМР, апоптозиндуцирующее и канцеростатическое вещество, описанное в примере 15-(1), идентифицировали, как к-карабиоз [р-Э-галактопиранозил-4-сульфат-( 1-4)-3,6-ангидро-О-галактоза].
С точки зрения вышесказанного, установлено, что апоптоз-индуцирующее и канцеростатическое вещество, полученное в примере 15(1), представляет собой к-карабиоз.
(3) К-карабиоз, полученный в примере 15(1), растворяют в воде в концентрации 1,56 мМ, 10 мкл раствора помещают в лунку 96-луночной микротитровальной планшеты и, в соответствии со способом, описанным в примере 2-(1), измеряют апоптоз-индуцирующую и канцеростатическую активность. Результат показал, что в оптическом микроскопе наблюдаются гранулы апоптоза, и что по сравнению с контрольной группой, к которой добавляли воду, клеточная пролиферация в группе, к которой добавляли ккарабиозу, снижена на 70%. Из этого следует, что к-карабиоза индуцирует апоптоз в НЬ-60 клетках и подавляет клеточную пролиферацию при 156 мкМ.
Пример 16.
(1) Суспензию 4,5 г коммерчески доступного порошка агара (производства Аако Риге Скеш1са1 1пбиЧпе5, Ыб.) в 150 мл 0,1н. НС1 нагревают в микроволновой печи. Полученный в результате раствор выдерживают на водяной бане в течение 10 мин. После нагревания раствору дают охладиться до комнатной температуры, и нерастворимые вещества удаляют центрифугированием. Супернатант собирают, и рН доводят до 6,8 с помощью 1н. гидроксида натрия. К 150 мл супернатанта добавляют эквивалентный объем этилацетата, и смесь тщательно перемешивают и распределяют между этилацетатной фазой и водной фазой. Отделенную водную фазу выпаривают до сухого состояния в испарителе, и остаток снова растворяют в 150 мл воды. Нерастворимые вещества удаляют центрифугированием для получения супернатанта. Этилацетатную фазу выпаривают до сухого состояния в испарителе, растворяют в 100 мл ион-обменной воды, и доводят рН до 6,5 с помощью 1н. гидроксида натрия.
Этилацетатную фазу и водную фазу стерилизуют фильтрацией с помощью фильтра с размером пор 0,2 мкм (производства Сошшд), разбавляют 10-, 20- и 30-кратно водой и, в соответствии со способом, описанным в примере 2-(1), измеряют антипролиферативную активность в отношении НЬ-60 клеток. Результаты показали, что антипролиферативная активность наблюдалась в водной фазе, но не наблюдалась в этилацетатной фазе.
мл раствора водной фазы, полученной таким способом, подвергают гель-фильтрации на колонке Се11и1оГте ОСЬ-25 (41 х 905 мм). Элюент представляет собой 0,2М №С1, содержащий 10% этанола. Элюационный график показан на фиг. 30. Так, фиг. 30 иллюстрирует результат гель-фильтрации на колонке Се11и1оГше ОСЬ-25. На фиг. 30 вертикальная ось представляет содержание сахарида в элюате, определенное фенол-сульфатным способом (поглощение при 490 нм: закрашенный круг), и горизонтальная ось представляет номер фракции (10 мл/фракцию).
мкл каждой элюированной фракции наносят на пластинку силикагеля 60 Р254 (производства Мегк) и проявляют 1-бутанолом уксусной кислотой : водой = 4 : 1 : 2. Орциноловый реагент [полученный растворением 400 мг гидрата орцинола (производства Аако Риге Скеш1са1 1пби51пе5, Ыб.) в 22,8 мл серной кислоты и добавляя туда воду до конечного объема в 200 мл] распрыскивают, и пластину нагревают на горячей тарелке при 150°С для наблюдения пятна.
Каждые 5 фракций из фракций №№ 40120, пятна которых подтверждены вышеупомянутым анализом с помощью ТСХ, объединяют и стерилизуют фильтрацией. Затем измеряют антипролиферативную активность в отношении НЬ-60 клеток. Результаты показали, что фракции №№ 86-90 обладают сильной антипролиферативной активностью.
(2) Фракции №№ 86-88 выделяют и выпаривают до сухого состояния в испарителе для получения 0,94 г порошка. Полученный порошок растворяют в 30 мл 90% этанола, и затем белый осадок удаляют с использованием фильтра 5С (производства АИУАКТЕС). Полученное в результате подвергают гель-фильтрации на колонке с 8еркабех ЬН-20 (35 х 650 мм). Элюент представляет собой 90% этанол. График элюции показан на фиг. 31. Так, фиг. 31 иллюстрирует результаты гель-фильтрации на колонке с 8ер11абех ЬН-20. На фиг. 31 вертикальная ось представляет содержание сахаридов в элюате, измеренное фенол-сульфатным способом (поглощение 490 нм : закрашенный круг) и горизонтальная ось представляет номер фракции (10 мл/фракцию).
Каждую элюированную фракцию анализировали с помощью пластинки силикагеля, как описано выше.
Компоненты, определенные с помощью анализа с ТСХ, приблизительно делят на пять групп, т.е. №№ фракций 30-35, 36-40, 41-44, 4548 и 49-53. Для каждой группы, 12 мкл порции из фракций, соответствующих данной группе, объединяют и выпаривают до сухого состояния в испарителе.
Остаток растворяют в 500 мкл йонобменой воды и изменяют его антипролиферативную активности в отношении клеток НЬ-60.
Фракции №№ 36-40, которые обладают сильной антипролиферативной активностью в отношении клеток НЬ-60, выпаривают до сухого состояния в испарителе и растворяют в 5 мл 1-бутанола : уксусной кислоты : воды = 4:1:2. Раствор наносят на колонку (20 х 710 м), заполненную силикагелем 60 Е254 и промывают 1бутанолом : уксусной кислотой : водой = 4 : 1 : 2. В качестве элюента используется 1-бутанол : уксусная кислота : вода = 4 : 1:2 (3 мл/ фракцию).
Каждую элюированную фракцию анализируют с использованием пластинки силикагеля, как описано выше. Результаты показали, что компоненты, грубо разделенные на 5 групп, представляют собой следующие: 46-52 (группа 1), 60-70 (группа 2), 72-84 (группа 3), 86-94 (группа 4) и 96-120 (группа 5).
Каждую группу выпаривают до сухого состояния в испарителе, растворяют в 5 мл ионобменной воды и фильтруют через фильтр, имеющий размер пор 0,45 мкм (производства 1УАК1). Измеряют антипролиферативную активность в отношении клеток НЬ-60 каждого полученного раствора. Результаты показали, что антипролиферативная активность наблюдается в группах 3, 4 и 5.
Что касается структуры вещества, содержащегося в группах 4 и 5, то с помощью ТСХ и масс-спектрометрии установлено, что оно представляет собой агаробиоз.
Что касается структуры вещества, содержащегося в группе 3, то с помощью масс-спектрометрии и ЯМР установлено, что оно представляет собой в-О-галактопиранозил-(1-4)-3,6ангидро-2-О-метил-Ь-галактозу. Фиг. 32 иллюстрирует масс-спектр собой β-Ό-галактопиранозил-( 1-4)-3,6-ангидро-2-О-метил-Ь-галактозы. Горизонтальная ось представляет значение химического сдвига (м.д.), и вертикальная ось представляет интенсивность сигнала (%).
Установлено, что, как и агаробиоз, β-Όгалактопиранозил-( 1-4)-3,6-ангидро-2-О-метилЬ-галактоза обладает сильной антипролиферативной активностью в отношении НЬ-60 клеток.
Пример 17.
(1) Подавляющая активность сахаридов, производных агара, полученных в примере 3, в отношении продукции липид-пероксидного радикала измеряется следующим образом.
81арЬу1ососси5 аигеик 3А (Национальная коллекция типов культур ΝΟΌ 8319) инкубируют в 5 мл в инфузионной среде из тканей мозга и сердца (производства Ийсо, 0037-17-8) и культивируют при 37°С в течение ночи. Бактериальные клетки собирают центрифугированием, промывают фосфатным буферным физиологическим раствором 3 раза и затем суспендируют в фосфатном буферном физиологической растворе в концентрации 1 х 107 колониеобра зующих единиц/мл. Смесь 100 мкл клеточной суспензии, 100 мкл водного раствора образца, 10 мкл водного раствора 1 мг/мл метгемоглобина (производства 8щта М9250), 600 мл фосфатного буферного физиологического раствора и 100 мл водного 50 мМ раствора трет-бутилового гидропероксида (производства Ка1ауата Кадаки, 03-4990) взаимодействуют при 37°С в течение 30 мин. К реакционной смеси добавляют 1 мл 2 х ΝΜΡ среды [полученной путем растворения 8 г питательного бульона (производства Ийсо, 0003-01-6), 5 г триптона (производства Ийсо, 0123-17-3), 5 г №С1, 10 г манитта (производства №1са1а1 Тещие, 213-02) и 0,035 г фенольного красного (производства №1са1а1 Теэдие, 268-07) в дистиллированной воде, получая конечный объем 500 мл, рН доводят до 7,5 с помощью №1ОН, и затем смесь стерилизуют фильтрацией] для прекращения реакции. Полученную в результате смесь разбавляют 3-кратно ΝΜΡ средой (полученной путем разбавления 2 х ΝΜΡ среды 2-кратно стерилизованной водой) для получения 12 серийных разведений, и 160 мкл каждого разведения помещают в каждую лунку 96-луночной микротитровальной планшеты. Планшету инкубируют при 37°С в течение ночи. Наблюдают цвет среды невооруженным глазом, и образец, содержащийся в лунке, в которой цвет среды изменился с красного на желтый из-за роста бактерии, определяют как тот, который обладает активностью по подавлению продуцирования липид-пероксидного радикала.
Результаты показаны в табл. 14. В табл. 14 + представляет образец, в котором наблюдается рост бактерий и - представляет образец, в котором рост бактерий не наблюдается. Концентрация, которая указана над верхней линией таблицы, представляет концентрацию образца в реакционной среде, в которой образец взаимодействовал с трет-бутиловым гидропероксидом и бактериальными клетками при 37°С в течение 30 мин.
Таблица 14
0, 1 мМ 1 мМ
Агаробиоза + +
Агаротетраоза - +
Галактоза - -
Как видно из вышеприведенных результатов, сильная активность по подавлению продукцирования липид-пероксидного радикала обнаружена у агаробиозы и агаротетраозы. Наличие подобной же активности подтверждено у карабиоза и 3,6-ангидро-2-О-метил-Ь-галактозы.
(2) Суспензию 5 г коммерчески доступного агара (1па агар типа 8-7, производства 1па 81окиЫп Кодуо) в 45 мл 50 мМ лимонной кислоты нагревают при 93 °С в течение 155 мин и доводят рН до 6 с помощью №1ОН для получения образца (образец, обработанный лимонной кислотой). Таким же образом суспензию такого же агара в 45 мл 100 мМ хлористо-водородной ки63 слоте нагревают при 95°С в течение 13 мин и доводят рН до 6 с помощью Ν;·ιΟΗ для получения образца (образец, обработанный хлористоводородной кислотой). Оба образца разбавляют водой, получая 1-, 2-, 4-, 8-, 10 и 100-кратное разведение и, в соответствии со способом, описанным в примере 17-(1), определяют активность по подавлению продуцирования липидпероксидного радикала. Результаты показали, что как в образце, обработанном лимонной кислотой, так и в образце, обработанном хлористводородной кислотой, подтверждается наличие активности до 10-кратного разведения, и оба образца обладают эквивалентной активностью по подавлению продуцирования липид-пероксидного радикала.
Пример 18. Ингибирующая активность агаробиозы в отношении бластогенеза лимфоцитов, вызванного конкавалином А (Кон А).
От ббУ мыши (Νίρροη 8ЬС; самцы, в возрасте 7 недель) получают селезенку, мелко измельчают и суспендируют в среде КРМ1-1640 (61Ьсо), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (НуС1опе) для получения однородной клеточной суспензии. Клеточную суспензию высевают в пластиковые чашки Петри, инкубируют при 37°С в течение 2 ч в камере с атмосферой углекислого газа. Адгезивные клетки, прикрепившиеся к чашке Петри, удаляют, неадгезивные клетки используют как селезеночные лимфоциты. 200 мкл суспензии из 2 х 106 клеток/мл селезеночных лимфоцитов высевают в каждую лунку 96-луночной микротитровальной планшеты. Агаробиозу в различной концентрации добавляют в лунки, за исключением контрольной лунки. Затем во все лунки добавляют 5 мкг КонА (№са1а1 Теэдие). Планшету инкубируют при 37°С в течение одного дня в камере с атмосферой углекислого газа. После инкубации 1 мкКи 3Н-тимидина добавляют в каждую лунку и продолжают инкубировать еще один день. Затем измеряют его поглощение клетками, используя жидкостной сцинцилляционный счетчик.
Результаты показаны на фиг. 34. Фиг. 34 иллюстрирует соотношение между концентрацией агаробиозы и поглощением 3Н-тимидина при бластогенезе лимфоцитов, вызванное КонА. Горизонтальная ось представляет концентрацию агаробиозы, и вертикальная ось представляет поглощение 3Н-тимидина (число распадов в минуту). Незакрашенная полоса и закрашенная полоса представляют поглощение 3Н-тимидина без стимуляции и со стимуляцией КонА, соответственно. Как видно из фиг. 34, агаробиоза проявляет доза-зависимую подавляющую активность против пролиферации лимфоцитов мыши, стимулированной мутагеном, почти полностью подавляет пролиферацию при 100 мкг/мл. Таким образом, определена подавляющая активность агаробиозы, направленная против активации лимфоцитов. Такая же активность определена для 3,6-ангидрогалактопиранозы, агаротетраозы, агарогексаозы, агарооктаозы, карабиозы и 3,6-ангидро-2-О-метил-Ьгалактозы.
Пример 19. Подавляющая активность агаробиозы в отношении реакции лимфоцитов.
Селезенку получали от мыши ВАЬВ\с (№рроп 8ЬС; самец, в возрасте 6 недель) и мыши С57ВБ/6 (№рроп 8ЬС; самец, в возрасте 6 недель), и получали селезеночные лимфоциты вышеописанным способом. Каждую клеточную суспензию доводили до концентрации 2 х 106 клеток/мл, 100 мкл порции из соответствующих суспензий смешивали вместе и высевали в 96луночную микротитровальную планшету. Агаробиозу различных концентрациях добавляли в лунки, за исключением контрольных лунок, и планшету инкубировали при 37°С в течение 4 дней в камере с атмосферой углекислого газа. После инкубирования 1мкКи 3Н-тимидина добавляли в каждую лунку, планшету инкубировали еще 1 день. Его поглощение клетками измеряли, используя жидкостной сцинцилляционный счетчик.
Результаты представлены на фиг. 35. Так фиг. 35 иллюстрирует соотношение между концентрацией агаробиозы и поглощением 3Нтимидина в смешанной лимфоцитарной реакции. Горизонтальная ось представляет концентрацию агаробиозы, и вертикальная ось представляет поглощение 3Н-тимидина (число распадов в минуту). Незакрашенный прямоугольник и заштрихованный прямоугольник представляют поглощение 3Н-тимидина в случае, когда клетки из каждой линии использовались по отдельности, и в случае, когда использовалась смесь клеток обеих линий, соответственно. Как видно на фиг. 35, агаробиоза обладает дозазависимой активностью против активации лимфоцитов при стимуляции аллоантигеном, и почти полностью подавляет лимфоцитарную активацию при 10 мкг/мл. Таким образом, определена подавляющая активность против активации лимфоцитов агаробиоза. Для 3,6-ангидрогалактопиранозы, агаротетраоза, агарогексаоза, агарооктаоза, карабиоза и 3,6-ангидро-2-Ометил-Ь-галактозы выявлена такая же активность.
Пример 20.
(1) КА№ 264,7 клетки (АТСС ТВ 71) суспендируют в среде Еад1е, модифицированной ОЫЬессо'к. не содержащей фенолового красного, и содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (производства 61Ьсо) и 2 мМ Ьглютамина (производства ЫГе Тесйпо1од1ек Опеп!а1, 25030-149) в концентрации 3 х 105 клеток/мл, и 500 мкл порции высевают в соответствующие лунки 48-луночной микротитровальной планшеты и инкубируют при 37°С в течение 12 ч в присутствии 5% СО. В каждую лунку добавляют 10 мкл 25 мкг/мл липополисахарида (ЬР8, производства 81дта, Ь-2012) и 10 мкл водного
5000, 1500, 500, 150 или 50 мкМ раствора агаробиоза или неоагаробиоза (производства 81дта С4410), и планшету инкубируют еще 12 ч. Затем измеряют концентрацию ΝΟ- 2, продуцированного путем окисления ΝΟ в среде. В качестве контрольных групп служит группа, в которую не добавляли ЬР8, и группа, к которой не добавляли агаробиозу и неоагаробиозу.
После инкубирования, как описано выше, 100 мкл 4% реагента Гриса (производства 8фта) добавляют к 100 мкл среды, и смеси дают постоять в течение 15 мин при комнатной температуре.
Затем измеряют поглощение при 490 нм. Концентрацию ΝΟ- 2 подсчитывают по калибровочной кривой, полученной при использовании NаNΟ2 при таких же концентрациях, полученных при растворении в той же среде, какая была описана выше. Все измерения проводились трижды.
Результаты показали, что агаробиоз подавляет продуцирование NО, индуцированное ЬР8, доза-зависимым образом тогда как неоагаробиоз не подавляет. Результаты показаны на фиг. 36 и 37. Так, фиг. 36 иллюстрирует концентрацию ΝΟ-2 в среде при инкубации в соответствующих условиях инкубации с добавлением агаробиозы. Фиг. 37 иллюстрирует концентрацию ΝΟ-2 в среде при инкубации в соответствующих условиях инкубации с добавлением неоагаробиозы. На фиг. 36 и 37 горизонтальные оси представляют условия инкубации, и вертикальные оси представляют концентрацию ΝΟ-2 (мкМ).
Когда вместо агаробиоза использовали 3,6ангидрогалактопиранозу, карабиозу, агаротетраозу, агарогексаозу, агарооктаозу и 3,6ангидро-2-О-метил-Ь-галактозу, были получены такие же результаты.
(2) Суспензию 5 г коммерчески доступного агара (1иа адаг типа 8-7, производства 1иа 81окиЫи Кодуо) в 45 мл 0,1н. НС1 обрабатывают при 95°С в течение 13 мин. После охлаждения до комнатной температуры суспензию нейтрализуют №ОН и фильтруют через 0,22 мкм фильтр М1ЬЬЕХ-СР (производства МШроге, 8ЕСРВ25Ь8). Для этого образца (продукт разложения агара хлористо-водородной кислотой) и раствора олигосахарида, полученного в результате разложения агара, как описано в примере 11-(1) (продукт разложения агара лимонной кислотой), в соответствии с таким же способом, какой описан в примере 20-(1), измеряют активность по подавлению продуцирования ΝΟ. А именно, 10 мкл 25 мкг/мл ЬР8 и 10 мкл 20кратного разведения упомянутого выше образца добавляют в лунки 48-луночной микротитровальной планшеты, содержащей клетки ВАА264,7, которые были проинкубированы в лунках. Измерение проводят с культуральной средой. В качестве контрольных групп используют группу, к которой не добавляют ЕР8, и группу, к которой не добавляют образец, и группу, к которой добавляют 2,5 мМ лимонную кислоту. Все измерения проводят дважды.
Результаты показали, что продукт разложения агара хлористо-водородной кислотой и продукт разложения агара лимонной кислотой подавляют продуцирование ΝΟ, вызванное ЬР8. Результаты показаны на фиг. 38. Так, фиг. 38 иллюстрирует концентрацию ΝΟ2- в культуральной среде с добавлением продукта разложения агара хлористо-водородной кислотой или продукта разложения агара лимонной кислотой. На фиг. 38 горизонтальная ось представляет условия инкубации, и вертикальная ось представляет концентрацию ΝΟ- 2 (мкМ).
(3) В соответствии с таким же способом, который описан в примере 20-(2), определяют подавляющую активность, направленную против продуцирования NО с использованием водной 100 мМ галактозы (производства №1са1а1 Текдие, код 165-11) или 100 мМ раствора 3,6ангидро-О-галактозы (производства ЕииакокЫ. Код С0002).
Результаты показали, что 3,6-ангидро-Огалактоза подавляет продуцирование ΝΟ, тогда как галактоза не подавляет. Результаты показаны на фиг.39. Так, фиг. 39 иллюстрирует концентрацию ΝΟ-2 в культуральной среде с добавлением 3,6-ангидро-О-галактозы или галактозы. На фиг. 39 горизонтальная ось представляет условия инкубации и вертикальная ось представляет концентрацию ΝΟ-2 (мкМ).
(4) Клетки ЕЛА 264,7 суспендируют в среде Еад1е, модифицированной ОЫЬессо, описанной в примере 20-(1) в концентрации 3 х 105 клеток/мл, и 500 мкл порции этой суспензии помещают в соответствующие лунки 48-луночной микротитровальной планшеты. Планшету инкубируют при 37°С в течение 10 ч в присутствии 5% диоксида углерода. В лунки добавляют 10 мкл водного 5000 мкМ раствора агаробиозы, инкубируют еще 1, 2, 4 или 6 ч. Затем культуральный супернатант удаляют из лунок и в каждую лунку добавляют свежую среду Еад1е, модифицированную ОЫЬессо, затем 10 мкл водного 2,5 мкг/мл ЬР8 и водного раствора 800 ед/мл интерферона-γ (ΙΕΝ-γ, приобретенный у СоктоЬю, ΟΖΜ-ΜΟ-ΙΕΝ). Планшету инкубируют в течение 1 ч. Затем культуральный супернатант удаляют из лунки и в каждую лунку добавляют 500 мкл свежей среды Еад1е, модифицированной ОЫЬессо, и планшету инкубируют еще 16 ч. Концентрацию NО- 2 в среде, полученную в результате окисления ΝΟ, измеряют в соответствии с таким же способом, который описан в примере 20-(1). В качестве контрольных групп используют группу, к которой не добавляли ни ЬР8, ни ΙΕΝ-γ, и группу, к которой не добавляли агаробиозу. Все измерения проводят по два раза.
Результаты показали, что чем дольше время предварительной инкубации, тем выше подавление продуцирования NО агаробиозом. А именно, при предварительном добавлении агаробиозы к клеточной культуральной среде продуцирование N0, вызванное ЬР8 и ΙΕΝ-γ, может быть подавлено и предупреждено. Результаты показаны на фиг. 40. Фиг. 40 иллюстрирует концентрацию Ν0- 2 в культуральной среде при соответствующих условиях инкубации. На фиг.
горизонтальная ось представляет условия инкубации, и вертикальная ось представляет концентрацию Ν0- 2. Для 3,6-ангидрогалактопиранозы, агаротетраозы, агарооктаозы, карабиозы и 3,6-ангидро-2-0-метил-Ь-галактозы обнаружена такая же активность.
Пример 21.
(1) Порошок агара (производства Аако Риге С.’бет1са1 ипбийпек, Ыб.) добавляют к 50 мМ раствору лимонной кислоты в конечной концентрации 3%. Полученный раствор подвергают тепловой обработке при 95°С в течение 160 мин для получения раствора для теста на карциностатический эффект.
Самцы мыши (8ΡΕ/VΑΕВа1Ь/сΑηNС^^-ηи, 4 недельные) были получены от №рроп Сбаг1ек Кгуег и предварительно содержались в течение 1 недели. Клетки рака ободочной кишки человека НСТ116 (АТСС ССЬ-247) трансплантировали мышам подкожно при 1,5 х 106 клеток/мышь.
Через 2 недели после трансплантации клеток линии рака ободочной кишки вышеприведенный раствор олигосахарида для канцеростатического теста, который доведен до рН 6,5 перед использованием, дается мышам с питьевой водой 5 дней в неделю. Среднее дневное потребление на мышь составляет 3,5 мл. Кроме этого в качестве пищи мыши получали 0пеп1а1 Уеай без ограничения. Через 4 недели после начала приема олигосахаридов твердую раковую опухоль удаляли у каждой мыши, получавшей олигосахариды, и вес каждой твердой раковой опухоли сравнивали контролем, которым давали обычную воду. Этот тест проводили, используя 10 мышей на 1 группу.
Результаты показали, что значительная подавляющая рост раковых клеток активность наблюдалась в группе, которая получала перорально образец для канцеростатического теста, и сильная канцеростатическая активность наблюдалась в группе, которая перорально получала олигосахариды, производные агара.
Результаты показаны на фиг. 41. Так, фиг.
иллюстрирует канцеростатическую активность олигосахаридов настоящего изобретения. Вертикальная ось представляет вес твердой раковой опухоли (г) , и горизонтальная ось представляет контрольную группу и группу, получавшую олигосахарид.
У одной мыши в группе, которая получала перорально нейтрализованный образец для кан- церостатического теста, раковая опухоль полностью исчезла.
(2) Канцеростатический тест проводился против асцитной карциномы Эрлиха, с использованием раствора олигосахарида, полученного в результате разложения агара, как описано в примере 11-(1).
Клетки карциномы Эрлиха вводились самкам мышей ббу линии (5 недельным, с весом около 25 г) внутрибюшинно (1,2 х 106 клеток/мышь), и подсчитывали среднее значение дней выживания и удлинения этого срока.
Мышей делили на 3 группы, каждая из которых состояла из 8 мышей. Одна группа была контрольной, а другие две группы получали 3,3кратное разведение и 16,7-кратное разведение раствора олигосахаридов, полученных в результате разложения агара, описанного в примере 11-(1), соответственно. А именно, каждое водное разведение раствора олигосахаридов, продукта разложения агара, полученного в примере 11-(1), готовили и свободно давали мышам за 3 дня до введения раковых клеток. Для группы, которой давали раствор олигосахаридов, продукта разложения агара, 3-кратного разведения, дневное потребление разведения составляло 5 мл/день/мышь. Для группы, которая получала 16,7-кратное разведение раствора олигосахарида, продукта разложения агара, дневное потребление этого разведения составляло 6 мл/день/ мышь. И для контрольной группы, дневное потребление воды составляло 7 мл/день.
Результаты показали, что среднее количество дней жизни в контрольной группе составляло 11,8 дней для контрольной группы, среднее количество дней жизни для группы, получавшей 3,3-краткое разведение и 16,7-кратное разведение составляло 19,8 дней и 14,4 дня, и степень удлинения жизни составила 168% и 122% соответственно. Таким образом обнаружен значительный эффект удлинения жизни.
Пример 22.
Крысам линии А1к1аг (самцы, 5 недельные, весом около 150 г; Жрроп 8ЬС) вводили 100 мкг яичного альбумина (ОА; 81дта) и 1 мл квасцов (торговая название: 1п)ес1 А1ит;Р1асе) внутрибрюшинно для сенсибилизации крысы. Через 14 дней производили забор периферической крови из брюшной аорты крысы, и сыворотку использовали в качестве анти-ОА антител.
Спинную часть крыс линии А1к!аг (самцы, 7-дневные, с весом около 200 г; Жрроп 8ЬС) выбривали и в это место подкожно вводили 100 мкл анти-ОА антител для получения пассивной сенсибилизации. Через сорок восемь часов после сенсибилизации, 4 мышам из каждой группы внутрибрюшинно вводили 2 мл раствора олигосахарида, продукта разложения агара, описанного в примере 11-(1) в его 10-кратном разведении. Крысам контрольной группы внутрибрюшинно вводили 2 мл воды.
Через тридцать минут после введения, РСА повышали путем введения 1 мл физиологического раствора, содержащего 0,1% ОА и 0,5% голубого Эванса (Ν;·κ;·ι1;·ιί Тексще) в хвостовую вену. Через тридцать минут после индуцирования антигеном, крыс забивали декапитацией, обескровливали, и кожу со спины в месте проникновения пигмента удаляли и собирали.
Собранную кожу замачивали в 1 мл 1н. КС1 (№-1са1а1 Тексще) и оставляли на ночь. Затем пигмент экстрагировали добавлением 9 мл раствора ацетона (№-1са1а1 Тексще), содержащего 0,6Ν НзРΟ4 (Мегск), и измеряли поглощение при 620 нм, используя считывающее устройство для ЕЛ18А. Количество пигмента, поступившего из кожи, подсчитывали с использованием калибровочной кривой, построенной с помощью голубого Эванса.
Результаты показаны на фиг. 42. Так, фиг. 42 иллюстрирует подавление РСА олигосахаридами настоящего изобретения. На фиг. 42 вертикальная ось представляет количество поступившего пигмента (мкг/место), и горизонтальная ось представляет использование раствора олигосахарида, продукта разложения агара.
Как показано на фиг. 42, половина и более пигмента, поступившего при РСА, подавляется путем применения раствора олигосахарида, продукта разложения агара, и по сравнению с контрольной группой продемонстрировано существенное различие (р < 0,05).
Для 3,6-ангидрогалактопиранозы, агаротетраозы, агарооктаозы, карабиозы и 3,6ангидро-2-О-метил-Ь-галактозы обнаружена такая же активность.
Пример 23.
Клетки миеломы В16ВЬ6 мыши суспендировали в ВРМ1-1640, содержащей 10% ФБС, помещали в 6-луночную планшету в концентрации 5 х 104 клеток/2 мл среда/лунка, и инкубировали при 37°С. На 2 день туда же добавляли 100 мкл раствора агаробиозы (2 мг/мл - 0,2 мг/мл), и на 7 день заменяли среду, и в то же время добавляли туда же 100 мкл раствора агаробиозы (2 мг/мл - 0,2 мг/мл). На 8 день клетки собирали, ДНК, РНК и белки подвергали разложению, и затем измеряли поглощение при 400 нм для определения активности по подавлению продукции меланина.
Более конкретно, после удаления среды отсасыванием, 0,3 мл 0,25% трипсина, растворенного в 20 мМ растворе ЕЛТА, добавляли в каждую лунку, и планшету инкубировали при 37°С в течение 10 мин. Затем 2 мл свежей среды добавляли в лунку, и клетки суспендировали. Суспензию собирали в пробирку для тестирования. Затем среду удаляли центрифугированием, и клетки суспендировали в 2 мл фосфатного буферного раствора и снова центрифугировали. После удаления супернатанта 30 мкл 50 мМ буфера с ацетатом натрия (рН 5,0), содержащего мМ хлорида магния и 1 мкл 70000 ед/мл ДНКазы I (производства Такага 81шхо), добавляли к клеткам и тщательно перемешивали. Смесь инкубировали при 37°С в течение 2 ч для расщепления ДНК. Затем 1 мкл 10 мг/мл рибонуклеазы А (производства 81дта) добавляли к смеси, и полученную в результате смесь инкубировали при 50°С в течение 1 ч для расщепления РНК. Наконец, 100 мМ буфера Трисхлористо-водородная кислота (рН 7,8), содержащего 100 мкг/мл протеиназы К (производства 81дта), 0,1 % Тритона х и 10 мМ ЭДТА добавляли туда же для получения общего объема 200 мкл для 2 х 106 клеток, и смесь инкубировали при 37°С в течение 16 ч, и затем измеряли поглощение при 400 нм.
Результат показан в табл. 15. Как показано в табл. 15, активность по подавлению продукции меланина установлена при концентрации агаробиоазы 50 и 100 мкг/мл, и определен эффект агаробиозы по улучшению состояния кожи/осветлению. Для агаротетраозы, агарооктаозы, карабинозы и 3,6-ангидро-2-О-метил-Егалактозы обнаружена такая же активность.
Таблица 15
Агаробиоз, мкг/мл Поглощение при 400 нм
значение ± СКО
100 0,383 ± 0,007
50 0,392 ± 0,172
10 0,521 ± 0,256
Контроль 0,487 ± 0,038
Примечание: Измерения проводились трижды; к контролю добавляли 100 мкл среды
Как было обсуждено выше, в соответствии с настоящим изобретением предлагаются функциональные вещества, которые пригодны в качестве активных ингредиентов для композиций для индукции апоптоза, карциностатических композиций, антиоксидантов, таких как ингибитор продуцирования активного кислорода, ингибитор продуцирования липидпероксидногорадикала и ингибитор продуцирования ΝΟ, и иммунорегуляторов, и которые являются членами, выбранными из группы, состоящей из соединений, выбранных из 3,6-ангидрогалактопиранозы, ее альдегида и гидрата и 2Ю-метилированных производных 3,6-ангидрогалактопиранозы, ее альдегида и гидрата, и растворимых сахаридов, содержащих названные соединения, например, агаробиоз, агаротетраоз, агарогексаоз, агарооктаоз, карабиоз, 3,6-ангидро-2-О-Ьгалактозу и т.д., полученные путем кислотного разложения в кислотных условиях при рН ниже 7 и/или ферментативного переваривания веществ, содержащих вышеупомянутые соединения.
Эти вещества полезны в качестве активных ингредиентов фармацевтических композиций, таких как композиции для индуцирования апоптоза, канцеростатические композиции, антиоксиданты для использования в медицине, такие как ингибитор продуцирования активного кислорода, ингибитор продуцирования N0 и т.д., иммунорегуляторы и противоаллергические агенты. И пищевые продукты и напитки, полученные путем добавления и/или растворения сахаридов, выбранных из данных сахаридов, пригодны для функциональных продуктов или напитков, обладающих такой активностью, как активность по индуцированию апоптоза, канцеростатической активностью, антиоксидантной активностью, такой как активность по подавлению продуцирования активного кислорода, активность по подавлению продуцирования N0, иммунорегуляторной активностью и противоаллергической активностью. Таким образом, предлагаются пищевые продукты и напитки, которые индуцируют апоптоз в клетках мест поражения у больных, страдающих от раковых заболеваний или вирусных заболеваний и, вследствие этого, эффективные в предупреждении или облегчении болезненных состояний при данных заболеваниях. Среди прочих, в случае рака органов пищеварения, таких как рак ободочной кишки и рак желудка, поскольку апоптоз может быть индуцирован в опухолевых клетках при пероральном приеме вышеперечисленных соединений настоящего изобретения с пищей или напитками, пищевые продукты или напитки настоящего изобретения обладают отличным эффектом по предупреждению или улучшению состояния при раке органов пищеварения. Кроме того, вышеперечисленные пищевые продукты и напитки являются пригодными пищевыми продуктами и напитками, направленными против оксидативного стресса на основе своей антиоксидантной активности, такой как активность по подавлению продуцирования активного кислорода.
Кроме того, функциональные вещества настоящего изобретения также пригодны в качестве сахаридов для антиоксидантов для ингибирования продуцирования активного кислорода, и пищевые продукты или напитки, содержащие, полученные путем добавления и/или полученные путем разбавления, сахариды для антиоксиданта настоящего изобретения, пригодны для улучшения болезненного состояния при заболеваниях, вызванных в живом организме окисляющими веществами, такими как активный кислород. Кроме того, пищевые продукты и напитки настоящего изобретения эффективны для улучшения или предупреждения запоров с помощью активности своих активных ингредиентов, то есть членов, выбранных из группы, состоящей из соединений, выбранных из группы, состоящей из 3,6-ангидрогалактопиранозы, ее альдегида и 2-О-метилированного производного и/или сахарида, содержащего названное соединение.
Сахариды для антиоксиданта, предлагаемые настоящим изобретением, полезны в качестве функциональных сахаридов, которые обеспечивают антиоксидантную активность, такую как активность по подавлению продуцирования активного кислорода, для пищевых продуктов или напитков.
Функциональные вещества настоящего изобретения обладают активностью по сохранению свежести продуктов и очень полезны для сохранения вкуса и свежести пищевых продуктов или скоропортящихся продуктов.
Кроме того, косметические композиции, содержащие сахариды настоящего изобретения, применимые как косметические обесцвечивающие или увлажняющие.
В соответствии с настоящим изобретением также предлагаются кислые продукты или напитки, содержащие полученные путем добавления и/или разбавления функциональные вещества. При получении подобных продуктов или напитков факторы, которые влияют на содержание функциональных веществ, в значительной степени исключаются, и таким образом получают очень полезные пищевые продукты или напитки, имеющие высокое содержание функциональных веществ.
Более того, подкислитель, полученный в настоящем изобретении из органической кислоты, также пригоден как новый подкислитель, обладающий хорошим вкусом и функциями.

Claims (11)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из 3,6-ангидрогалактопиранозы, представленной формулой I ее альдегида и гидрата и 2-0-метилированных производных 3,6-ангидрогалактопиранозы, ее альдегида и гидрата; и растворимого сахарида, содержащего данное соединение на восстанавливающем конце.
  2. 2. Фармацевтическая композиция по п.1, где сахарид представляет собой продукт, полученный с помощью кислотного разложения и/или ферментативного расщепления веществ, содержащих по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из 3,6-ангидрогалактопиранозы, представленной формулой I, ее альдегида и гидрата и 2-0-метилированных производных 3,6-ангидрогалактопиранозы, ее альдегида и гидрата.
  3. 3. Фармацевтическая композиция по п.2, где указанное вещество, содержащее по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из 3,6-ангидрогалактопиранозы, представленной формулой I, ее альдегида или гидрата и 2-0-метилированных производных
    3,6-ангидрогалактопиранозы, ее альдегида и гидрата, представляет собой по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из агара, агарозы и карагенана.
  4. 4. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, где сахарид представляет собой по меньшей мере один сахарид, выбранный из группы, состоящей из агаробиозы, агаротетраозы, агарогексаозы, агарооктаозы, к-карабиозы и в-О-галактопиранозил-3,6-ангидро-2-О-метилЬ-галактозы.
  5. 5. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-4, проявляющая апоптоз-индуцирующую, антипролиферативную, канцеростатическую, антиаллергическую, иммуномодулирующую и подавляющую образование липидпероксидного радикала, образование оксида азота (ИО) и образование меланина активность.
  6. 6. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.1-5 для лечения или предупреждения канцероматозных заболеваний, а также заболеваний, при которых требуется иммунорегуляция, индуцирование апоптоза, подавление образования липид-пероксидного радикала, подавление образования активного кислорода, подавление образования оксида азота.
  7. 7. Пищевой продукт, который включает по меньшей мере одну из композиций по пп.1-5.
  8. 8. Пищевой продукт по п.7, представляющий собой напиток.
  9. 9. Применение пищевого продукта по пп.78 для облегчения болезненного состояния или предупреждения канцероматозных заболеваний, а также заболеваний, при которых требуется иммунорегуляция, индуцирование апоптоза, подавление образования липид-пероксидного радикала, подавление образования активного кислорода, подавление образования оксида азота.
  10. 10. Применение по меньшей мере одного соединения, выбранного из группы, состоящей из 3,6-ангидрогалактопиранозы, представленной формулой I, как определено в п.1, ее альдегида и гидрата и 2-О-метилированных производных
    3,6-ангидрогалактопиранозы, ее альдегида и гидрата; и растворимого сахарида, содержащего данное соединение на восстанавливающем конце, для получения фармацевтической композиции для лечения или предупреждения канцероматозных заболеваний, а также заболеваний, при которых требуется иммунорегуляция, индуцирование апоптоза, подавление образования липид-пероксидного радикала, подавление образования активного кислорода, подавление образования оксида азота.
  11. 11. Применение по меньшей мере одного соединения, выбранного из группы, состоящей из 3,6-ангидрогалактопиранозы, представленной формулой I, как определено в п.1, ее альдегида и гидрата и 2-О-метилированных производных
    3,6-ангидрогалактопиранозы, ее альдегида и гидрата; и растворимого сахарида, содержащего данное соединение на восстанавливающем конце, для получения пищевого продукта для облегчения болезненного состояния или предупреждения канцероматозных заболеваний, а также заболеваний, при которых требуется иммунорегуляция, индуцирование апоптоза, подавление образования липид-пероксидного радикала, подавление образования активного кислорода, подавление образования оксида азота.
EA200000512A 1997-11-11 1998-11-11 Фармацевтическая композиция на основе 3,6-ангидрогалактопиранозы, и/или ее производных, и/или растворимого сахарида, содержащего данное соединение, применение композиции и входящих в ее состав ингредиентов, пищевой продукт, содержащий указанную композицию, и применение пищевого продукта EA004148B1 (ru)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP32391797 1997-11-11
JP2014698 1998-01-19
JP13097398 1998-04-27
JP16441098 1998-05-29
JP21204198 1998-07-13
PCT/JP1998/005065 WO1999024447A1 (fr) 1997-11-11 1998-11-11 Medicaments, aliments ou boissons renfermant des substances physiologiquement activees derivees d'algues

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200000512A1 EA200000512A1 (ru) 2000-12-25
EA004148B1 true EA004148B1 (ru) 2004-02-26

Family

ID=27520204

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200000512A EA004148B1 (ru) 1997-11-11 1998-11-11 Фармацевтическая композиция на основе 3,6-ангидрогалактопиранозы, и/или ее производных, и/или растворимого сахарида, содержащего данное соединение, применение композиции и входящих в ее состав ингредиентов, пищевой продукт, содержащий указанную композицию, и применение пищевого продукта

Country Status (12)

Country Link
US (4) US6475990B1 (ru)
EP (1) EP1038879B1 (ru)
JP (2) JP4007760B2 (ru)
KR (1) KR100544856B1 (ru)
CN (1) CN1160364C (ru)
AT (1) ATE427314T1 (ru)
AU (1) AU753435B2 (ru)
CA (1) CA2309691A1 (ru)
DE (1) DE69840706D1 (ru)
EA (1) EA004148B1 (ru)
TW (2) TWI244923B (ru)
WO (1) WO1999024447A1 (ru)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI244923B (en) * 1997-11-11 2005-12-11 Takara Bio Inc Whitening or moisturizing cosmetics
CN1210285C (zh) 1999-01-20 2005-07-13 宝生物工程株式会社 带取代基的3,6－脱水半乳糖及组合物、食品
CN1304008C (zh) * 1999-01-20 2007-03-14 宝生物工程株式会社 医药组合物
TWI247585B (en) * 1999-05-14 2006-01-21 Takara Bio Inc Agarobiose-containing composition
DE60102083D1 (de) * 2000-05-26 2004-03-25 Nihon Starch Co Ltd Neuartiges saccharid, verfahren zu dessen herstellung und anwendung desselben
JPWO2002029099A1 (ja) * 2000-10-03 2004-02-12 タカラバイオ株式会社 生理活性物質のスクリーニング方法
AU2003236239A1 (en) * 2002-04-17 2003-10-27 Takara Bio Inc. Remedies
JP4815588B2 (ja) * 2005-09-26 2011-11-16 国立大学法人高知大学 海藻由来の免疫抑制物質を製造する方法
JP5290562B2 (ja) * 2007-10-25 2013-09-18 株式会社コーセー 抗シワ剤およびシワ形成防止用皮膚外用剤
CN103054118B (zh) * 2008-04-30 2014-05-07 悠哈味觉糖有限公司 饮料组合物及其制造方法
JP4506880B2 (ja) * 2008-06-17 2010-07-21 ユーハ味覚糖株式会社 美容飲料及びその製造方法
WO2013109096A1 (ko) * 2012-01-18 2013-07-25 고려대학교 산학협력단 3,6-안하이드로-l-갈락토오스의 제조방법 및 이의 용도
CN111544437A (zh) * 2012-01-18 2020-08-18 高丽大学校产学协力团 3,6-脱水-l-半乳糖的制备方法及其用途
CN102823641A (zh) * 2012-09-18 2012-12-19 国家海洋局第三海洋研究所 一种海藻寡糖在制备水果保鲜剂的应用及其方法
KR101489732B1 (ko) * 2013-03-15 2015-02-04 고려대학교 산학협력단 3,6-안하이드로-l-갈락토오스를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 조성물
JP6241644B2 (ja) * 2013-06-05 2017-12-06 伊那食品工業株式会社 ＰＰＡＲγ発現向上剤、並びにそれを含む基礎代謝向上剤、筋肉疲労回復向上剤、ＰＰＡＲγ発現向上用医薬組成物及びＰＰＡＲγ発現向上用飲食品
WO2015041498A1 (ko) * 2013-09-23 2015-03-26 다인바이오 주식회사 네오아가로올리고당을 포함하는 면역 증강용 또는 항암용 조성물
KR101521711B1 (ko) 2013-10-14 2015-05-19 고려대학교 산학협력단 신규한 아가로올리고당 분해효소 및 이를 이용한 아가로오스로부터 3,6-안하이드로-l-갈락토오스와 갈락토오스의 생산방법
CN104886228A (zh) * 2015-06-25 2015-09-09 集美大学 一种罗非鱼片保鲜剂及其使用方法
JP7244977B2 (ja) * 2016-03-11 2023-03-23 シオノギヘルスケア株式会社 腸内細菌叢調整用組成物
KR101960503B1 (ko) * 2016-11-15 2019-03-21 고려대학교 산학협력단 항충치 활성을 갖는 아가로바이오스 또는 아가로올리고당의 용도
KR101864800B1 (ko) * 2016-12-07 2018-06-07 고려대학교 산학협력단 해조류 유래 무수갈락토오스의 생산방법
JP7190792B2 (ja) * 2017-05-22 2022-12-16 シオノギヘルスケア株式会社 体調維持用、体調増進用、又は体調調節用の組成物
KR102011721B1 (ko) * 2017-11-28 2019-08-19 고려대학교 산학협력단 포도상구균의 생육을 억제하는 한천 유래 올리고당의 용도
CN108410632A (zh) * 2018-05-18 2018-08-17 中国海洋大学 一种具有保健功能海洋琼胶低聚糖黄酒的制备方法
KR20220084109A (ko) * 2019-11-11 2022-06-21 프로그래스 가부시키가이샤 항암제 노출 방지 방법
JP7487987B1 (ja) 2023-12-21 2024-05-21 伊那食品工業株式会社 アガロオリゴ糖の分析方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6035101B2 (ja) * 1977-03-10 1985-08-13 協同飼料株式会社 食品保存料の製造法
EP0181351A4 (en) * 1984-05-09 1989-06-21 Univ Australian METHOD FOR MODULATING IMMUNE REACTION.
JPS62210958A (ja) * 1986-03-13 1987-09-17 Meiji Seika Kaisha Ltd 澱粉含有組成物の老化防止方法
JPS62210965A (ja) 1986-03-13 1987-09-17 Shokuhin Sangyo Baioriakutaa Syst Gijutsu Kenkyu Kumiai 低カロリ−飲食品およびその製造方法
JPH0673442B2 (ja) * 1986-03-13 1994-09-21 明治製菓株式会社 食品の老化防止方法
US5041541A (en) * 1988-05-05 1991-08-20 The Procter & Gamble Company Functional sugar substituted with reduced calories
JP2803000B2 (ja) 1989-03-18 1998-09-24 マルハ株式会社 フロロタンニン類を有効成分とする抗酸化剤
FR2656874B1 (fr) 1990-01-11 1992-04-03 Commissariat Energie Atomique Procede de production et d'extraction d'anti-oxydants a partir d'une culture de micro-organismes et photobioreacteur pour la mise en óoeuvre de ce procede.
JP3223038B2 (ja) 1993-07-20 2001-10-29 一丸ファルコス株式会社 寒天オリゴ糖のエステル化物を含有する化粧料
JPH07322886A (ja) 1994-06-01 1995-12-12 Japan Tobacco Inc オリゴ糖及び単糖の製造方法
JPH0892303A (ja) * 1994-09-20 1996-04-09 Showa Sangyo Co Ltd 新規な糖、その製造方法および免疫賦活剤
JPH08151313A (ja) * 1994-11-25 1996-06-11 Kanebo Ltd 化粧料
JPH08208435A (ja) 1995-02-02 1996-08-13 Shiseido Co Ltd 固型水系化粧料
TWI244923B (en) * 1997-11-11 2005-12-11 Takara Bio Inc Whitening or moisturizing cosmetics
CN1304008C (zh) * 1999-01-20 2007-03-14 宝生物工程株式会社 医药组合物
CN1210285C (zh) * 1999-01-20 2005-07-13 宝生物工程株式会社 带取代基的3,6－脱水半乳糖及组合物、食品

Also Published As

Publication number Publication date
EP1038879A1 (en) 2000-09-27
WO1999024447A1 (fr) 1999-05-20
US6475990B1 (en) 2002-11-05
US20030105029A1 (en) 2003-06-05
CN1160364C (zh) 2004-08-04
JP4486064B2 (ja) 2010-06-23
US20050119191A1 (en) 2005-06-02
TW577743B (en) 2004-03-01
EP1038879B1 (en) 2009-04-01
AU753435B2 (en) 2002-10-17
CN1285838A (zh) 2001-02-28
TWI244923B (en) 2005-12-11
CA2309691A1 (en) 1999-05-20
US6911432B2 (en) 2005-06-28
AU1051799A (en) 1999-05-31
KR20010031895A (ko) 2001-04-16
JP4007760B2 (ja) 2007-11-14
EA200000512A1 (ru) 2000-12-25
US20090099101A1 (en) 2009-04-16
EP1038879A4 (en) 2004-06-16
DE69840706D1 (de) 2009-05-14
US20100137228A2 (en) 2010-06-03
US7417031B2 (en) 2008-08-26
US20100048491A2 (en) 2010-02-25
TW200404555A (en) 2004-04-01
JP2006282675A (ja) 2006-10-19
ATE427314T1 (de) 2009-04-15
KR100544856B1 (ko) 2006-01-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA004148B1 (ru) Фармацевтическая композиция на основе 3,6-ангидрогалактопиранозы, и/или ее производных, и/или растворимого сахарида, содержащего данное соединение, применение композиции и входящих в ее состав ингредиентов, пищевой продукт, содержащий указанную композицию, и применение пищевого продукта
TW577744B (en) Medicinal compositions containing 3,6-anhydrogalactopyranose as active ingredient
JP2006117662A (ja) 治療剤
JP4713324B2 (ja) ヒアルロニダーゼ阻害剤
JP2010184886A (ja) 新規化合物
JP2007326864A (ja) 医薬組成物
JP3710854B2 (ja) 水易溶性ヤマモモ科植物抽出物
KR100641968B1 (ko) 생리활성 추출물
KR101630439B1 (ko) 물오리나무 잎으로부터 분리된 신규 화합물 및 이를 포함하는 항산화용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU