WO2013109096A1 - 3,6-안하이드로-l-갈락토오스의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

3,6-안하이드로-l-갈락토오스의 제조방법 및 이의 용도 Download PDF

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WO2013109096A1
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galactose
acid
anhydro
agarose
pharmaceutical composition
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PCT/KR2013/000423
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Inventor
김경헌
최인걸
강남주
윤은주
이세영
김지혜
김영아
김보배
백은지
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고려대학교 산학협력단
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    • A61K8/60—Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides

Definitions

  • the present invention relates to 3,6-anhydro-L-galactose prepared according to chemical and enzymatic methods and to industrial use using the physiological efficacy thereof.
  • Agar or agarose
  • Agar the major polysaccharide of red algae, has two monosaccharides, 3,6-anhydro-L-galactose and D-galactose, in which alpha 1,3 and beta 1,4 bonds are cross-linked.
  • Polymer Agaro-oligosaccharides produced by non-specific hydrolysis using agarose with chemical catalysts such as hydrochloric acid, sulfuric acid, and acetic acid are widely known to have excellent physiological activities such as antioxidant, anti-inflammatory, anti-cancer, whitening, and anti-allergic functions. Due to these various physiological activities, agaro oligosaccharides and disaccharides, neoagarobiose, are widely used as functional substances in the food industry and the beauty industry.
  • hydrolysis through chemical treatment has the advantage that it can be applied to commercialization because of low production cost and simple processing conditions, but the yield is very low when decomposing the specific bond to obtain the desired product because the non-specifically cleaved bond is obtained.
  • There are disadvantages Choen et al (2005) Food Technol Biotechnol. 43 (1) 29-36).
  • enzymes that produce monosaccharides by specifically cleaving 3,6-anhydro-L-galactose bonds have recently been reported, but studies to isolate, purify and quantify 3,6-anhydro-L-galactose only from reaction products have been reported. It is inadequate.
  • Another object of the present invention is to identify the physiological activity of the 3,6- anhydro-L-galactose and to use it industrially.
  • the present invention by reacting agarose with a weak acid of 0.5 to 60% (w / v) concentration for 30 minutes to 6 hours at a temperature of 100 to 200 rpm in the temperature range of 40 to 150 °C Preparing agar oligosaccharides; And reacting the agar oligosaccharide with agarose degrading enzyme and neoagarobiose hydrolase for 30 minutes to 7 days at 0 to 200 rpm in a temperature range of 20 to 40 ° C. 3,6- Provided is a method for preparing anhydro-L-galactose.
  • the agarose degrading enzyme may be an enzyme that cleaves ⁇ -1,4-glycosidic bonds between D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose of agarose. Specifically, it may be represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • the neoagarobiose hydrolase may be represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3.
  • the agarose degrading enzyme and neoagarobiose hydrolase may be derived from Saccharophagus degradans 2-40.
  • adsorption chromatography and gel permeation chromatography are sequentially performed on 3,6-anhydro-L-galactose to give 3,6-anhydro-L-galactose.
  • the method may further include separating and purifying L-galactose.
  • the present invention also provides a cosmetic composition for skin whitening or moisturizing comprising 3,6-anhydro-L-galactose.
  • the present invention also provides cosmetic uses for skin whitening or moisturizing 3,6-anhydro-L-galactose.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of skin pigmentation diseases, including 3,6-anhydro-L-galactose.
  • the present invention also provides the use of 3,6-anhydro-L-galactose for the preparation of a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of skin pigmentation diseases.
  • the present invention also provides a mammal, preferably a human, in need of a whitening or moisturizing comprising administering an effective amount of 3,6-anhydro-L-galactose in the form of a pharmaceutical or cosmetic composition containing the same.
  • a cosmetic or medical method for whitening or moisturizing the skin is provided.
  • the present invention also relates to conditions, diseases and / or lesions, preferably skin conditions associated with the control of pigmentation, comprising applying to the skin a pharmaceutical or cosmetic composition containing 3,6-anhydro-L-galactose Occurs locally on the skin with an increased synthesis of melanin pigments, and to treat one or more selected from blemishes, freckles, black spots, birthmarks, pigmentation by drugs, pigmentation after inflammation, and hyperpigmentation occurring in dermatitis Provide cosmetic or medical methods.
  • the invention also provides a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of inflammatory diseases comprising 3,6-anhydro-L-galactose.
  • the present invention also provides a method of treating inflammatory disease in an animal comprising administering to the individual a composition for the prevention or treatment of an inflammatory disease comprising a pharmaceutically effective amount of 3,6-anhydro-L-galactose.
  • the present invention also provides the use of 3,6-anhydro-L-galactose for the preparation of a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of an inflammatory disease.
  • the present invention has the effect of producing a high yield of monosaccharide 3,6-anhydro-L-galactose through the enzymatic treatment after the oligosaccharide is prepared under mild chemical treatment conditions to minimize the overdegradation effect of the chemical treatment .
  • the present invention also identifies the first physiological activity of 3,6-anhydro-L-galactose, such as whitening, moisturizing, antioxidant, anti-inflammatory, so that it can be used in the food, cosmetics, and pharmaceutical fields. Therefore, 3,6-anhydro-L-galactose, which is considered as a by-product or fermentation inhibitor in the production of red algae-derived bioenergy, can be applied to generate high value-added substances in the bioenergy industry.
  • FIG. 1 illustrates a process for preparing 3,6-anhydro-L-galactose in agarose according to the present invention, in which DP denotes a degree of polymerization of polysaccharides.
  • Figure 2 is a TLC result showing the process for preparing and purifying 3,6-anhydro-L-galactose in agarose, in the processing step (lane 1 is agarose, lane 2 is acetic acid hydrolyzate) , Lane 3 is Aga50D reaction product, lane 4 is sdNABH reaction product, lane 5 is 3,6-anhydro-L-galactose separated by silica gel chromatography, lane 6 is 3,6 purified by biogel P2 chromatography. -Anhydro-L-galactose, AHG on the Y axis is 3,6-anhydrogalactose, and NAB refers to neoagarobiose.
  • Figure 3 shows the silica gel chromatography TLC results of the first step of 3,6-anhydro-L-galactose purification, AHG in the figure refers to 3,6-anhydrogalactose.
  • FIG. 4 shows GC / MS total ion chromatograms of D-form 3,6-anhydrogalactose standard (a) and 3,6-anhydro-L-galactose (b) purified through the present invention. will be.
  • Figure 6 shows the results of 2D-HSQC NMR analysis of the purified purified 3,6- anhydro-L-galactose.
  • FIG. 7 shows the whitening effect of 3,6-anhydro-L-galactose, neoagarobiose, D-galactose and 3,6-anhydro-D-galactose, in which ⁇ -MSG is ⁇ -melanocyte.
  • -stimulating hormones, NAB, neoagarobiose, D-AHG and L-AHG refer to 3,6-anhydrogalactose of D-form and L-form, respectively.
  • Figure 9 shows the effect of L-AHG on tyrosinase expression induced by ⁇ -MSH in HEMs
  • A is the result of tyrosinase expression of cells exposed to ⁇ -MSH after treatment by concentration of L-AHG
  • B is a graph showing the result of A as the relative intensity of tyrosinase to ⁇ -actin.
  • Figure 10 shows the effect of L-AHG on TRP-1 expression induced by ⁇ -MSH in HEMs
  • A is the result of TRP-1 expression of cells exposed to ⁇ -MSH after the concentration-dependent treatment of L-AHG
  • B is a graph showing the result of A as the relative intensity of TRP-1 to ⁇ -actin.
  • Figure 11 shows the effect of L-AHG on tyrosinase activity in vitro.
  • Figure 12 shows the effect of L-AHG on HAS2 expression in human keratinocytes
  • A is the HAS2 expression level after the hourly treatment of L-AHG of 100 ⁇ g / mL
  • B is HAS2 after treatment by concentration of L-AHG Expression level.
  • Figure 13 shows the effect of L-AHG on the phosphorylation of ERK in human keratinocytes
  • A is the result of ERK phosphorylation after hourly treatment of L-AHG of 100 ⁇ g / mL
  • B after treatment by concentration of L-AHG ERK phosphorylation results.
  • Figure 14 shows the effect of L-AHG on the phosphorylation of AKT in human keratinocytes
  • A is the result of AKT phosphorylation after hourly treatment of L-AHG of 100 ⁇ g / mL
  • B after treatment by concentration of L-AHG AKT phosphorylation results.
  • agarose oligosaccharide is prepared by reacting agarose with a weak acid having a concentration of 0.5 to 60% (w / v) for 30 minutes to 6 hours at a temperature of 40 to 150 ° C. under a condition of 100 to 200 rpm. ; And reacting the agar oligosaccharide with agarose degrading enzyme and neoagarobiose hydrolase for 30 minutes to 7 days at 0 to 200 rpm in a temperature range of 20 to 40 ° C. 3,6- It relates to a method for preparing anhydro-L-galactose.
  • the method for preparing 3,6-anhydro-L-galactose of the present invention is an exo-type of hydrolyzing agarose under mild conditions using a weak acid, and producing a disaccharide of the agar oligosaccharide obtained from the acid hydrolysis product. Reacts with agarose degrading enzymes to produce neoagarobiose, and further reacts with neoagarobiose hydrolase to produce monosaccharide galactose and 3,6-anhydro-L-galactose. .
  • the 3,6-anhydro-L-galactose may have a structure of Formula 1:
  • the first step is to prepare agarose oligosaccharides by treating agarose with a weak acid.
  • the weak acid may include acetic acid, formic acid, succinic acid, citric acid, citric acid, malic acid, maleic acid, or oxalic acid. More than one species can be used.
  • the weak acid may be used at a concentration of 0.5 to 60% (w / v) in consideration of production cost and separation of salts generated after neutralization of the weak acid. More specifically, it may be used at a concentration of 20 to 40% (w / v).
  • the reaction of the agarose and the weak acid may be carried out for 30 minutes to 6 hours under conditions of 100 to 200 rpm in the temperature range of 40 to 150 °C. If it is in the above range can be minimized the degradation products of the agarose by weak acid.
  • the reaction product obtained after the reaction can be obtained by washing and drying in order to remove the weak acid and peroxide products remaining in the agar oligosaccharide.
  • the lower alcohol having 1 to 6 carbon atoms may be used as the washing solvent, but is not particularly limited thereto.
  • the second step is to prepare 3,6-anhydro-L-galactose by enzymatic digestion of agaro oligosaccharides.
  • the enzymatic digestion is a disaccharide, neoagar, by treating an exo type agarose degrading enzyme.
  • the bios are produced, and then treated with neoagarobiose hydrolase to decompose D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose.
  • the enzyme reaction may be carried out for 30 minutes to 7 days at 0 to 200 rpm conditions in a temperature range of 20 to 40 °C.
  • the enzyme reaction is described in more detail as follows.
  • the agarose degrading enzyme that decomposes agao oligosaccharides to produce a disaccharide, neoagarobiose, is ⁇ -1,4-glyco between D-galactose of agarose and 3,6-anhydro-L-galactose.
  • An enzyme that cleaves side bonds hereinafter referred to as 'Aga50D' can be used.
  • the agarose degrading enzyme has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and sequence identity with the sequence of 80% or more, 85% or more, 90% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more , At least 97%, at least 98%, and at least 99%.
  • the polypeptide has a certain ratio (eg, 80%, 85%, 90%, 95%, or 99%) of sequence identity with respect to another sequence, when aligning the two sequences, By comparison it is meant that the amino acid residues in this ratio are identical.
  • the alignment and percent homology or identity may be determined by any suitable software program known in the art, such as those described in CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (FM Ausubel et al. (Eds) 1987 Supplement 30 section 7.7.18). Can be determined using Preferred programs include the GCG Pileup program, FASTA (Pearson et al. 1988 Proc. Natl Acad.
  • BLAST BLAST Manual, Altschul et al., Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med
  • NCIB NLM NIH Bethesda
  • ALIGN Plus Alternativeific and Educational Software, PA
  • Another sequence software program that can be used is the TFASTA Data Searching Program available from Sequence Software Package Version 6.0 (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.).
  • protein and “polypeptide” are used interchangeably herein. Conventional one or three letter codes are used herein for amino acid residues.
  • the enzyme may be derived from Saccharophagus degradans 2-40, but is not particularly limited thereto.
  • the enzyme can be transcribed and translated through DNA segments, ie coding genes, involved in producing polypeptides comprising the intervening sequences between individual coding segments as well as regions before and after the coding region of the enzyme.
  • DNA segments ie coding genes, involved in producing polypeptides comprising the intervening sequences between individual coding segments as well as regions before and after the coding region of the enzyme.
  • it may be a sequence set forth in SEQ ID NO: 2, but is not particularly limited thereto.
  • trehalose degrading enzyme is saccharide as a wave Gus de gras thiooxidans separated from the water, the supernatant or the supernatant culture of the (Saccharophagus degradans) and can be purified, and genetically engineered using recombinant techniques saccharide par Gus de gras thiooxidans (Saccharophagus degradans ) can be produced and separated by strains or artificial chemical synthesis.
  • the agarose degrading enzyme of the present invention may be used as a supernatant or supernatant of Saccharophagus degradans culture or by transforming an edible strain, such as yeast, to culture supernatant or supernatant. Can be used as a substitute.
  • the term “recombinant” means that the cell, nucleic acid, protein or vector has been modified by introduction of a heterologous nucleic acid or protein or alteration of the original nucleic acid or protein, or The cell refers to a cell derived from such a modified cell. That is, for example, a recombinant cell expresses a gene that is not found within the original (non-recombinant) form of the cell, or alternatively expresses an original gene that is abnormally expressed or not expressed at all upon expression. Expression.
  • nucleic acid encompasses single- or double-stranded DNA, RNA, and chemical variants thereof.
  • Nucleic acid and polynucleotide can be used interchangeably herein. Because the genetic code is degenerate, one or more codons can be used to encode a particular amino acid, and the invention encompasses polynucleotides encoding a particular amino acid sequence.
  • introduction of inserting a nucleic acid sequence into a cell means “transfection”, or “transformation” or “transduction” and refers to the integration of the nucleic acid sequence into eukaryotic or prokaryotic cells. Mention is included, wherein the nucleic acid sequence is integrated into the cell's genome (eg, chromosome, plasmid, pigment, or mitochondrial DNA), converted to autonomic replicon, or transiently expressed.
  • the cell's genome eg, chromosome, plasmid, pigment, or mitochondrial DNA
  • the reaction of the agar oligosaccharide and agarose degrading enzyme may be carried out for 30 minutes to 7 days at 0 to 200 rpm conditions in a temperature range of 20 to 40 °C. More specifically, it may be carried out for 1 day to 4 days at 100 to 150 rpm conditions in a temperature range of 25 to 35 °C.
  • the agar oligosaccharide When the agar oligosaccharide is in a powder state, it may be used in a conventional buffer solution, but is not particularly limited thereto.
  • neoagarobiose hydrolase capable of decomposing neoagarobiose produced through the enzymatic reaction into D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose is the amino acid sequence of SEQ ID NO.
  • a protein having the neoagarobiose hydrolytic activity is also included in the scope of the enzyme of the present invention.
  • Amino acid sequences having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% and at least 99% sequence identity with the sequence ( Hereinafter referred to as 'sdNABH').
  • the enzyme may be derived from Saccharophagus degradans 2-40, but is not particularly limited thereto.
  • the enzyme can be transcribed and translated through DNA segments, ie coding genes, involved in producing polypeptides comprising the intervening sequences between individual coding segments as well as regions before and after the coding region of the enzyme.
  • DNA segments ie coding genes, involved in producing polypeptides comprising the intervening sequences between individual coding segments as well as regions before and after the coding region of the enzyme.
  • sequence as set forth in SEQ ID NO: 4, but is not particularly limited thereto.
  • the neo-agar in BIOS hydrolase is Saccharomyces par Gus de Jerusalem thiooxidans separated from the water, the supernatant or the supernatant culture of the (Saccharophagus degradans) and can be purified, and genetically engineered using recombinant techniques saccharide par Gus de gras thiooxidans (Saccharophagus degradans ) can be produced and separated by strains or artificial chemical synthesis.
  • the neoagarobiose hydrolase of the present invention is supernatant or supernatant of Saccharophagus degradans culture, or culture supernatant of yeast transformed by transforming edible strains such as yeast. Alternatively, supernatant can be used.
  • neoagarobiose and neoagarobiose hydrolase may be carried out for 30 minutes to 7 days at a temperature of 0 to 200 rpm in the temperature range of 20 to 40 °C. More specifically, it may be carried out for 1 day to 4 days at 100 to 150 rpm conditions in a temperature range of 25 to 35 °C.
  • the method for preparing 3,6-anhydro-L-galactose of the present invention may be further carried out by separating and purifying only 3,6-anhydro-L-galactose in the decomposition product of neoagarobiose.
  • the 3,6-anhydro-L-galactose may be separated and purified to a high purity of approximately 96% by sequentially performing silica gel chromatography, which is an adsorption chromatography, and bio gel P2 chromatography, which is a gel permeation chromatography.
  • the purified product was analyzed by 1 H-NMR and 2D-Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) NMR analysis to compare the structure of 1 H ppm and 13 C ppm of 3,6-anhydro-L-galactose. I can sympathize.
  • HSQC 2D-Heteronuclear Single Quantum Coherence
  • the method of the present invention produces 76 g of agaoligosaccharides through chemical hydrolysis from 100 g of agarose, and 37.55 g of neoagarobiose and 15.21 using Aga50D and sd NABH enzymes. g of 3,6-anhydro-L-galactose is produced respectively, and 3.98 g of pure 3,6-anhydro-L-galactose can be purified through two chromatographic purification processes.
  • the present invention also relates to a skin whitening or moisturizing cosmetic composition comprising 3,6-anhydro-L-galactose.
  • the present invention also provides cosmetic uses for skin whitening or moisturizing 3,6-anhydro-L-galactose.
  • the 3,6-anhydro-L-galactose has a higher whitening activity than arbutin, which is most widely known as a conventional whitening substance, and in a concentration-dependent manner expresses the expression of tyrosinase, TRP-1, etc., which are involved in promoting melanin synthesis. There is a characteristic to suppress.
  • 3,6-anhydro-L-galactose exhibits a whitening effect by inhibiting the expression of enzymes rather than inhibiting tyrosinase activity.
  • 3,6-anhydro-L-galactose is characterized by promoting the expression of HAS2 protein, a moisturizing marker involved in the synthesis of hyaluronic acid.
  • HAS2 expression is regulated by various inflammatory signaling pathways, such as ERK and AKT, wherein 3,6-anhydro-L-galactose increases the phosphorylation of ERK and AKT and increases phosphorylation.
  • ERK and AKT can increase HAS2 expression.
  • the 3,6-anhydro-L-galactose may be synthesized or used without limitation, prepared according to the method for preparing 3,6-anhydro-L-galactose according to the present invention.
  • a cosmetic or cosmetic comprising a composition containing the 3,6- anhydro-L-galactose itself or a cosmetically acceptable carrier as a functional ingredient, in the form of a general emulsion formulation and solubilized formulation It can be prepared as.
  • Cosmetics of the emulsified formulations include nutrient cosmetics, creams, essences, etc., and cosmetics of the solubilized formulations are flexible cosmetics.
  • Suitable cosmetic formulations include, for example, emulsions, suspensions, microemulsions, microcapsules, microgranules or ionic (liposomes), nonionic vesicles obtained by dispersing an oil phase in a solution, gel, solid or pasty anhydrous product, aqueous phase, for example. It may be provided in the form of a dispersant, cream, skin, lotion, powder, ointment, spray or cone stick.
  • It may also be prepared in the form of a foam or in the form of an aerosol composition further containing a compressed propellant.
  • the cosmetics in addition to the 3,6- anhydro-L-galactose of the present invention, fatty substances, organic solvents, solubilizers, thickening and gelling agents, emollients, antioxidants, suspending agents, stabilizers, foaming agents (foaming agents) ), Fragrances, surfactants, water, ionic or nonionic emulsifiers, fillers, metal ion sequestrants and chelating agents, preservatives, vitamins, blockers, wetting agents, essential oils, dyes, pigments, hydrophilic or lipophilic active agents, lipids It may contain adjuvants commonly used in the field of cosmetics such as vesicles or any other ingredients conventionally used in cosmetics.
  • the 3,6-anhydro-L-galactose When used as a food or food additive, the 3,6-anhydro-L-galactose may be added as it is or may be used with other food or food ingredients, and a conventional method It can be suitably used according to.
  • the mixed amount of the active ingredient can be suitably determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the composition of the present invention in food production is added in an amount of up to 15% by weight, preferably up to 10% by weight relative to the raw material.
  • the amount may be below the above range, and the active ingredient may be used in an amount above the above range because there is no problem in terms of safety. .
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of skin pigmentation disorders comprising 3,6-anhydro-L-galactose.
  • the present invention also provides the use of 3,6-anhydro-L-galactose for the preparation of a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of skin pigmentation diseases.
  • compositions of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • compositions of the present invention can be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, and other external preparations and sterile injectable solutions, respectively, in accordance with conventional methods, preferably creams. , Gels, patches, sprays, ointments, warnings, lotions, linings, pasta or cataplasma.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical compositions of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharides, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate , Calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents and surfactants that are commonly used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, or the like.
  • excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose, or the like.
  • lactose, gelatin and the like are preferably mixed.
  • lubricants such as magnesium styrate talc may also be used.
  • Oral liquid preparations include suspending agents, liquid solutions, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. .
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories, and the like.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a skin external preparation formulation that can be applied to the skin, and is used in the form of a skin external preparation of a cream, gel, patch, spray, ointment, warning, lotion, linen, pasta or cataplasma. It may be prepared by using the composition, but is not limited thereto.
  • compositions of the present invention vary depending on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the composition of the present invention is preferably administered at 0.0001 to 100 mg / kg, preferably 0.001 to 10 mg / kg per day.
  • Topical administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the present invention also provides a mammal, preferably a human, in need of a whitening or moisturizing comprising administering an effective amount of 3,6-anhydro-L-galactose in the form of a pharmaceutical or cosmetic composition containing the same. It relates to a cosmetic or medical method for whitening or moisturizing the skin.
  • the present invention relates to skin conditions, diseases and / or lesions, preferably associated with the regulation of pigmentation, comprising applying to the skin a pharmaceutical or cosmetic composition containing 3,6-anhydro-L-galactose.
  • a pharmaceutical or cosmetic composition containing 3,6-anhydro-L-galactose preferably containing 3,6-anhydro-L-galactose.
  • the increase in the synthesis of melanin pigment occurs locally on the skin and treats one or more selected from blemishes, freckles, black spots, birthmarks, pigmentation by drugs, pigmentation after inflammation, and hyperpigmentation occurring in dermatitis.
  • blemishes blemishes, freckles, black spots, birthmarks, pigmentation by drugs, pigmentation after inflammation, and hyperpigmentation occurring in dermatitis.
  • the frequency of application of the pharmaceutical or cosmetic composition containing 3,6-anhydro-L-galactose can vary significantly depending on the needs of each subject, the frequency of application being monthly to 10 times a day, preferably weekly to 1 Four times a day, more preferably three to three times a week, even more preferably once or twice a day are proposed.
  • the present invention provides for the treatment, care and / or treatment of the skin, preferably of the skin of the face, neck, neckline, hands, armpits, groin, elbows and / or knees, more preferably of the facial, neck and / or hands. It relates to the use of 3,6-anhydro-L-galactose in the manufacture of a pharmaceutical or cosmetic composition for cleaning.
  • the invention also provides a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of inflammatory diseases comprising 3,6-anhydro-L-galactose.
  • the present invention also provides a method of treating inflammatory disease in an animal comprising administering to the individual a composition for the prevention or treatment of an inflammatory disease comprising a pharmaceutically effective amount of 3,6-anhydro-L-galactose.
  • the present invention provides the use of 3,6-anhydro-L-galactose for the preparation of a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of an inflammatory disease.
  • the 3,6-anhydro-L-galactose has an antioxidant activity that inhibits the production of nitrite (nitrite, NO 2 ), which is neo-agarobiose, galactose, and D-form, other disaccharides and monosaccharides constituting seaweeds.
  • nitrite nitrite, NO 2
  • NO 2 nitrite
  • 3,6- anhydrogalactose of the highest it can be used as a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases (see Figure 8).
  • the individual capable of administering the pharmaceutical composition for preventing or treating the inflammatory disease includes all animals.
  • it may be an animal other than a human such as a dog, a cat, and a mouse.
  • An effective amount of the active ingredient of the pharmaceutical composition means an amount required to achieve treatment of the disease.
  • Treatment also includes, but is not limited to, alleviating the symptom, removing the cause of the symptom temporarily or permanently, or preventing or slowing the appearance of the symptom and the progression of the disease, disorder or condition described above.
  • Agarose a representative polysaccharide constituting seaweed
  • acetic acid 5% (w / v) of agarose was reacted with 3M acetic acid at 80 ° C. for 70 minutes and then dried to remove acetic acid.
  • 3M acetic acid 3M acetic acid
  • ethanol ethanol to remove the residual acetic acid and hydrolyzate that can be produced during the hydrolysis to produce agarose oligosaccharide in the pure powder state (Fig. 2).
  • Aga50D an exo-type disaccharide-producing enzyme, in order to decompose into monosaccharides D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose from the acid hydrolyzate produced in Example 1 -0040438) to produce neoagarobiose as a reaction product.
  • the reaction product of Aga50D with sd NABH enzyme (see Korean Patent Publication No. 2010-0108241) to produce monosaccharides D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose from neoagarobiose after completion of the Aga50D reaction I was.
  • Enzyme reaction was performed by dissolving 5% (w / v) agatooligosaccharide in 100 mL of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) and reacting at 30 ° C. at 150 rpm for 3 days.
  • the amount of enzyme used in the enzyme reaction was Amg50D 10mg, sd NABH 2.5mg (Fig. 2).
  • Biogel P2 chromatography can purify only 3,6-anhydro-L-galactose from disaccharides and low agarose oligosaccharides.
  • the mobile phase used was water and the volume per fraction was 2 mL. Only fractions showing only 3,6-anhydro-L-galactose spot on TLC of each fraction were collected to obtain high purity 3,6-anhydro-L-galactose (FIG. 2).
  • agaoligosaccharide was produced by chemical hydrolysis from 100 g of agarose through Examples 1 to 3, and 37.55 g of neoagarobiose and 15.21 using Aga50D and sd NABH enzymes. g of 3,6-anhydro-L-galactose were produced, respectively. Also, 3.98 g of pure 3,6-anhydro-L-galactose was purified through two chromatographic purification procedures.
  • High purity 3,6-anhydro-L-galactose produced in Example 3 was quantified by analysis by GC / MS.
  • the derivatization process for GC / MS analysis is as follows. The purified sample was dried with a speed bag, and 50 ⁇ l of 2% (w / v) O-methylhydroxylamine hydrochloride in pyridine was added thereto and reacted at 75 ° C. for 30 minutes. In addition, 80 ⁇ l of N-methyl-N- (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (N-methyl-N- (trimethylsilyl) trifluoroacetamide) was added thereto and reacted at 40 ° C. at 150 rpm for 30 minutes.
  • the instrument conditions for GC / MS analysis are as follows.
  • the column used for analysis was a DB5-MS capillary column, and the GC column temperature conditions were first maintained at 100 ° C. for 3.5 minutes, and then heated up to 160 ° C. for 20 minutes. Thereafter, the temperature was raised to 200 ° C. and maintained for 15 minutes. Finally, the temperature was maintained at 280 ° C. for 5 minutes. 1 ⁇ l of sample was analyzed at a split ratio of 9.6 (FIG. 4).
  • Neo-agarobiose and D-galactose the sugars that make up albutin and red algae, are the most widely used whitening agents before the treatment of the ⁇ -melanosite-stimulatine hormone, a hormone that promotes melanin production.
  • 3,6-anhydro-D-galactose, and 3,6-anhydro-L-galactose at 1, 10, and 100 ⁇ g / mL, respectively, followed by reaction with ⁇ -melatosite-stimulin hormone. was carried out. After incubating for 4 days, the melanin content was analyzed by measuring the absorbance at 475 nm.
  • the concentration of nitrite (NO 2 ) in RAW264.7 cell culture was measured by the Griess reaction method.
  • the cells were treated with lipopolysaccahrides at a concentration of 2 ⁇ g / mL, while neoagarobiose, galactose, 3,6-anhydro-D-galactose, and 3,6-anhydro-L-galactose were 50 , 100, 200 ⁇ g / mL concentration and then treated together to measure the antioxidant activity. After culturing together for 24 hours, 540 nm absorbance was measured and analyzed for antioxidant activity.
  • Melanin is a natural pigment that determines the color of skin and hair.
  • the main known function of melanin is to protect against DNA damage by ultraviolet radiation by absorbed and scattered ultraviolet radiation.
  • excessive melanogenesis or abnormal distribution can cause irregular skin hyperpigmentation, such as blemishes, freckles, senile sunspots, and the like.
  • Ultraviolet irradiation increases tyrosinase and tyrosinase related proteins (TRPs) by increasing the levels of ⁇ -melanocyte-stimulating hormone (ACH), ACTH and their related receptor, melanocortin 1 receptor (MC1R).
  • ACH ⁇ -melanocyte-stimulating hormone
  • M1R melanocortin 1 receptor
  • melanin biosynthesis enzymes is a copper-containing glycoprotein, tyrosinase, which is an important rate-regulating step enzyme for melanin synthesis in melanocytes produced only in certain organelles, i.e. Therefore, reduction of tyrosinase expression is considered a good strategy for inhibiting skin pigmentation.
  • TRP-1 is structurally associated with tyrosinase, shares ⁇ 40% amino acid homology, and is present in the melanin bodies like tyrosinase. Previous studies have reported that mutations in TRP-1 result in pale skin or hair color, and in certain types of ocular scleroderma. It is also suggested that TRP-1 plays a role in melanin biosynthesis because inhibition of TRP-1 expression is associated with hypopigmentation.
  • Human epidermal melanocytes derived from neonatal foreskin Human epidermal melanocytes, HEMs, Cascade Biologics (Oregon, USA) were used as cells for this purpose.
  • the cells were cultured at 37 ° C. in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 .
  • the growth medium for HEMs is Medium 254 (Cascade Biologics (Oregon, USA)) with HMGS.
  • HEM (1 ⁇ 10 5 ) was incubated for 24 hours in 6-cm dishes. Before exposure to 100 nM ⁇ -MSH (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) for several days, 3,6-anhydro- L- galactose (L- at concentrations of 0, 25, 50, and 100 ⁇ g / mL was applied to the cells. AHG was treated for 1 hour.
  • ⁇ -MSH Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
  • Lysis buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM Na 2 EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM ⁇ -glycerophosphate, 1 mM Na 3 VO 4 , 1 g / mL Cells were lysed with leupeptin, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), and a protease inhibitor cocktail tablet. Protein concentration was measured according to the manufacturer's instructions using a dye-bound protein assay kit (Bio-Rad Laboratories Inc. Hercules, CA, USA).
  • TRP-1 expression was reduced in an L-AHG concentration dependent manner in HEMs (FIG. 10).
  • L-AHG did not induce any significant reduction in tyrosinase activity of the mushrooms.
  • Arbutin reduced tyrosinase activity by 40% at a concentration of 200 ⁇ M.
  • L-AHG is a novel hypopigmentation agent that inhibits the expression of tyrosinase and TRP-1.
  • Hyaluronan is a glycosaminoglycan composed of D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine. Because of its ability to store large amounts of water, HA plays an important role in regulating water balance and osmotic pressure.
  • AH is synthesized in the cell membrane by HAS 1, 2 and 3, in particular HAS2 is present in normal human tissues.
  • HAS2 genetic deficiency of HAS2 causes prenatal lethality in mouse models and shows reduced HAS2 gene expression in the epidermis and dermis of the skin of adult humans. Thus, increasing HAS2 expression may be a good strategy for maintaining skin homeostasis.
  • Western blot analysis was performed to determine the timing and concentration of L-AHG induction for HAS2 expression.
  • the cells used are cultured at 37 °C under 5% CO 2 atmosphere using Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM , GIBCO ® Invitrogen, Auckland, NZ) of a 10% FBS and penicillin / streptomycin was added to HaCaT cells.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • Lysis buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM Na 2 EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM ⁇ -glycerophosphate, 1 mM Na 3 VO 4 , 1 g / mL Cells were lysed with leupeptin, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), and a protease inhibitor cocktail tablet. Protein concentration was measured according to the manufacturer's instructions using a dye-bound protein assay kit (Bio-Rad Laboratories Inc.).
  • L-AHG increased HAS2 expression after 3 hours of treatment.
  • L-AHG also increased HAS2 expression in a concentration dependent manner.
  • HAS2 expression is regulated by various inflammatory signaling pathways such as MAPKs and AKT.
  • various inflammatory signaling pathways such as MAPKs and AKT.
  • the present invention may use 3,6-anhydro-L-galactose as a whitening or moisturizer, antioxidant, hypopigmentation agent, or anti-inflammatory agent.

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Abstract

본 발명은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 한천을 구성하는 단당류인 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 화학적, 효소적 방법을 통해 고수율로 생산하고, 이의 미백, 보습, 항산화, 항염증 등의 생리학적 활성을 입증함으로써 산업적으로 이용할 수 있다.

Description

3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 제조방법 및 이의 용도
본 발명은 화학적, 효소적 방법에 따라 제조된 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 이의 생리학적 효능을 이용한 산업적 용도에 관한 것이다.
홍조류를 구성하는 주요한 다당체인 한천(또는 아가로오스)은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 D-갈락토오스 두 가지 단당체가 알파 1,3 결합과 베타 1,4 결합이 교차로 연결되어 있는 중합체이다. 아가로오스를 염산과 황산과 아세트 산과 같은 화학적 촉매를 이용한 비특이적인 가수분해를 통해 생산한 아가로올리고당은 항산화, 항염증, 항암, 미백, 항알러지 기능 등 생리학적 활성이 우수한 것으로 널리 알려져 있다. 이런 다양한 생리 활성으로 인하여 아가로올리고당 및 이당체인 네오아가로바이오스는 식품 산업 분야 및 미용 산업 분야에서 기능성 물질로 널리 사용되고 있다.
상기 아가로올리고당을 구성하는 단당 중의 하나인 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 경우, 환원 말단이 불안정하여 고 농도의 강산 및 고온 반응 조건에서 하이드록시 메틸 펄퍼럴로 빠르게 전환이 되므로 기존의 화학적 처리를 통해 단당체인 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 생산하는 것은 수율이 매우 낮고 쉽게 과분해가 되는 문제점이 있다(Jol et al (1999) Anal Biochem. 268, 213-222, Kim et al (2010) Bull Korean Soc. 31(2) 511-514). 또한 화학적 처리를 통한 가수분해는 생산 비용이 낮고 처리 조건이 단순하므로 상업화에 많이 응용할 수 있다는 장점이 있으나 비특이적으로 결합을 절단하기 때문에 특이적인 결합을 분해하여 원하는 생산물을 얻을 시에는 수율이 매우 낮아진다는 단점이 있다(Chen et al (2005) Food Technol Biotechnol. 43(1) 29-36). 또한, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 결합을 특이적으로 절단하여 단당을 생산하는 효소도 최근 보고되고 있지만 반응 산물로부터 3,6-안하이드로-L-갈락토오스만을 분리 정제 및 정량화하는 연구는 미비한 실정이다.
본 발명의 목적은 화학적 처리에 따른 과분해 효과를 최소화하면서 효소적 분해를 통해 고 수율로 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 생리학적 활성을 규명하여 이를 산업적으로 이용하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아가로오스와 0.5 내지 60%(w/v) 농도의 약산을 40 내지 150℃의 온도 범위에서 100 내지 200 rpm의 조건으로 30분 내지 6시간 동안 반응시켜 아가로올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 아가로올리고당과 아가로오스 분해효소 및 네오아가로바이오스 가수분해효소를 20 내지 40℃의 온도 범위에서 0 내지 200 rpm 조건으로 30분 내지 7일 동안 반응시키는 단계를 포함하는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 제조방법을 제공한다.
상기 아가로오스 분해효소는 아가로오스의 D-갈락토스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 사이의 β-1,4-글리코사이드 결합을 절단하는 효소일 수 있다. 구체적으로, 서열목록 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
상기 네오아가로바이오스 가수분해효소는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 아가로오스 분해효소 및 네오아가로바이오스 가수분해효소는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 2-40에서 유래한 것일 수 있다.
본 발명에 따른 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 제조방법은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스에 대해 흡착 크로마토그래피 및 젤 투과 크로마토그래피를 순차적으로 실시하여 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 분리 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 피부 미백 또는 보습용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 피부 미백 또는 보습을 위한 미용적 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 피부 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 피부 색소 침착 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 유효량을 바람직하게는 이를 함유하는 약제학적 또는 화장료 조성물 형태로 투여하는 단계를 포함하는 미백 또는 보습을 필요로 하는 포유동물, 바람직하게는 인간 피부의 미백 또는 보습을 위한 미용 또는 의료방법을 제공한다.
본 발명은 또한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 함유하는 약제학적 또는 화장료 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는 색소침착의 조절과 관련되는 피부의 병태, 질환 및/또는 병변, 바람직하게는 멜라닌 색소의 합성 증가로 피부에 국소적으로 발생하고, 기미, 주근깨, 흑색점, 모반, 약물에 의한 색소 침착, 염증 후 색소 침착, 및 피부염에 발생하는 과색소 침착에서 선택된 하나 이상을 치료하는 미용 또는 의료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약제학적 유효량의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 동물의 염증성 질환 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 용도를 제공한다.
본 발명은 화학적 처리에 따른 과분해 효과를 최소화한 마일드한 화학적 처리 조건에서 올리고당을 제조한 후 효소적 처리를 통해 단당인 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 높은 수율로 생산하는 효과가 있다.
본 발명은 또한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 미백, 보습, 항산화, 항염증 등의 생리학적 활성을 최초로 규명함으로써 이를 식품, 화장품, 제약 분야에서 이용할 수 있도록 한다. 따라서, 홍조류 유래 바이오 에너지 생산 시 부산물 또는 발효저해제로 여겨지는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 바이오에너지 산업에서 고부가가치 물질을 창출해내는 데에 응용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 아가로오스에서 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 제조하는 공정을 도시한 것으로, 도면 내 DP는 다당류의 중합도(Degree of polymerization)을 뜻한다.
도 2는 아가로오스에서 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 제조 및 정제하는 과정을 도시한 TLC 결과로서, 진행 단계(Processing step)에서 레인 1은 아가로오스, 레인 2는 아세트산 가수분해물, 레인 3은 Aga50D 반응산물, 레인 4는 sdNABH 반응산물, 레인 5는 실리카 젤 크로마토그래피로 분리한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스, 레인 6은 바이오젤 P2 크로마토그래피로 정제한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스이고, Y축의 AHG는 3,6-안하이드로 갈락토오스, NAB는 네오아가로바이오스를 지칭한다.
도 3은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 정제 첫 단계인 실리카 젤 크로마토그래피 TLC 결과를 나타낸 것으로, 도면 내 AHG는 3,6-안하이드로 갈락토오스를 지칭한다.
도 4는 D-형태의 3,6-안하이드로갈락토오스의 표준물질(a)과 본 발명을 통해 정제한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(b)의 GC/MS total ion chromatogram를 도시한 것이다.
도 5는 분리 정제한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 1H NMR 분석결과를 나타낸 것이다.
도 6은 분리 정제한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 2D-HSQC NMR 분석결과를 나타낸 것이다.
도 7은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스, 네오아가로바이오스, D-갈락토오스 및 3,6-안하이드로-D-갈락토오스의 미백활성 효과를 나타낸 것으로, 도면 내 α-MSG는 α-melanocyte-stimulating hormones, NAB는 네오아가로바이오스, D-AHG 및 L-AHG는 각각 D-form과 L-form의 3,6-안하이드로 갈락토오스를 지칭한다.
도 8은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스, 네오아가로바이오스, D-갈락토오스 및 3,6-안하이드로-D-갈락토오스의 항산화 활성 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 HEMs에서 α-MSH에 의해 유도된 티로시나아제 발현에 대한 L-AHG의 효과를 나타낸 것으로, A는 L-AHG의 농도 별 처리 후 α-MSH에 노출된 세포의 티로시나아제 발현 결과이고, B는 상기 A의 결과를 β-액틴에 대한 티로시나아제의 상대 강도로 표시한 그래프이다.
도 10은 HEMs에서 α-MSH에 의해 유도된 TRP-1 발현에 대한 L-AHG의 효과를 나타낸 것으로, A는 L-AHG의 농도별 처리 후 α-MSH에 노출된 세포의 TRP-1 발현 결과이고, B는 상기 A의 결과를 β-액틴에 대한 TRP-1의 상대 강도로 표시한 그래프이다.
도 11은 인 비트로에서 티로시나아제 활성에 대한 L-AHG의 효과를 나타낸 것이다.
도 12는 사람 각질세포에서 HAS2 발현에 대한 L-AHG의 효과를 나타낸 것으로, A는 100㎍/mL의 L-AHG의 시간별 처리 후 HAS2 발현 수준이고, B는 L-AHG의 농도 별 처리 후 HAS2 발현 수준이다.
도 13은 사람 각질세포에서 ERK의 인산화에 대한 L-AHG의 효과를 나타낸 것으로, A는 100㎍/mL의 L-AHG의 시간별 처리 후 ERK 인산화 결과이고, B는 L-AHG의 농도 별 처리 후 ERK 인산화 결과이다.
도 14는 사람 각질세포에서 AKT의 인산화에 대한 L-AHG의 효과를 나타낸 것으로, A는 100㎍/mL의 L-AHG의 시간별 처리 후 AKT 인산화 결과이고, B는 L-AHG의 농도 별 처리 후 AKT 인산화 결과이다.
이하 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 아가로오스와 0.5 내지 60%(w/v) 농도의 약산을 40 내지 150℃의 온도 범위에서 100 내지 200 rpm의 조건으로 30분 내지 6시간 동안 반응시켜 아가로올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 아가로올리고당과 아가로오스 분해효소 및 네오아가로바이오스 가수분해효소를 20 내지 40℃의 온도 범위에서 0 내지 200 rpm 조건으로 30분 내지 7일 동안 반응시키는 단계를 포함하는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 제조방법은 약산을 이용한 마일드 조건에서 아가로오스를 가수분해하고, 산가수분해 산물로부터 얻은 아가로올리고당을 이당체를 생산하는 엑소-타입의 아가로오스 분해효소와 반응시켜 네오아가로바이오스를 생산하며, 네오아가로바이오스 가수분해효소와의 추가 반응을 통해 단당체인 갈락토오스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 생산하는 것을 특징으로 한다.
상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 하기 화학식 1의 구조를 가질 수 있다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2013000423-appb-I000001
도 1에 도시된 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 제조공정을 참조하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
제1단계는 아가로오스에 약산을 처리하여 아가로올리고당을 제조하는 단계이다.
상기 약산은 아세트산(Acetic acid), 포름산(Formic acid), 숙신산(Succinic acid), 시트르산(Citric acid), 말산(Malic acid), 말레산(Maleic acid) 또는 옥살산(Oxalic acid) 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
상기 약산은 생산단가 및 약산 중화 후 생성되는 염의 분리를 고려하여 0.5 내지 60%(w/v)의 농도로 사용하는 것이 좋다. 보다 구체적으로 20 내지 40% (w/v)의 농도로 사용할 수 있다.
상기 아가로오스 및 약산의 반응은 40 내지 150℃의 온도 범위에서 100 내지 200 rpm의 조건으로 30분 내지 6시간 동안 실시할 수 있다. 상기 범위 내일 경우 약산에 의한 아가로오스의 과분해산물을 최소화할 수 있다.
상기 반응 후 얻은 반응산물은 아가로올리고당으로 잔존하는 약산과 과분해산물을 제거하기 위해 세척 후 건조하여 분말상태로 수득할 수 있다.
상기 세척 용매로 탄소 수 1 내지 6의 저급 알코올을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
제2단계는 아가로올리고당의 효소적 분해를 통해 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 제조하는 단계로, 상기 효소적 분해는 엑소 타입의 아가로오스 분해효소를 처리하여 이당체인 네오아가로바이오스를 생산하고, 이어서 네오아가로바이오스 가수분해효소를 처리하여 D-갈락토오스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스로 분해하는 것이다.
상기 효소 반응은 20 내지 40℃의 온도 범위에서 0 내지 200 rpm 조건으로 30분 내지 7일 동안 실시할 수 있다.
상기 효소 반응을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
우선, 아가로올리고당을 분해하여 이당체인 네오아가로바이오스를 생산하는 아가로오스 분해효소는 아가로오스의 D-갈락토스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 사이의 β-1,4-글리코사이드 결합을 절단하는 효소(이하, 'Aga50D'라 함)를 사용할 수 있다.
상기 아가로오스 분해효소는 서열목록 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열 및 상기 서열과 서열 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 폴리펩티드가 또 다른 서열에 대하여 특정 비율 (예컨대, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%)의 서열 동일성을 가진다는 것은, 상기 두 서열을 정렬시킬 때, 상기 서열들의 비교시에 상기 비율의 아미노산 잔기가 동일함을 의미한다. 상기 정렬 및 백분율 상동성 또는 동일성은, 당업계에 공지된 임의의 적당한 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌[CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel 등 (eds) 1987 Supplement 30 section 7.7.18)]에 기재된 것들을 사용하여 결정할 수 있다. 바람직한 프로그램으로는, GCG Pileup 프로그램, FASTA(Pearson 등 1988 Proc. Natl Acad. Sci USA 85:2444-2448), 및 BLAST (BLAST Manual, Altschul 등, Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, MD, 및 Altschul 등 1997 NAR25:3389-3402)이 있다. 또 다른 바람직한 정렬 프로그램은 ALIGN Plus(Scientific and Educational Software, PA)로서, 바람직하게는 기본 매개변수를 사용하는 것이다. 사용 가능한 또 다른 서열 소프트웨어 프로그램은 Sequence Software Package Version 6.0 (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)에서 이용 가능한 TFASTA Data Searching Program 이다.
본 명세서에서 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 본원에서는 아미노산 잔기에 대하여 통상의 1문자 또는 3문자 코드가 사용된다.
상기 효소는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 2-40에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 효소는 효소의 코딩 영역 전 및 후의 영역뿐만 아니라 개별 코딩 분절 사이의 개재 서열이 포함된 폴리펩티드를 생산하는데 연관된 DNA 분절, 즉 코딩 유전자를 통해 전사 및 번역될 수 있다. 예컨대, 서열번호 2에 기재된 서열일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 아가로오스 분해효소는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans)의 배양물의 상등액 또는 상청액으로부터 분리 및 정제할 수 있으며, 유전공학적 재조합 기술을 이용하여 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 이외 균주 또는 인공적인 화학적 합성법 등에 의하여 생산 및 분리할 수 있다.
재조합 기술을 이용하는 경우, 통상적인 재조합 단백질 발현의 용이함을 위하여 사용되는 인자들, 예컨대 항생제 저항성 유전자, 친화성 컬럼 크로마토그래피에 사용될 수 있는 리포터 단백질 또는 펩타이드를 사용할 수 있으며, 이러한 기술은 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시 가능한 범주에 해당된다. 또한 본 발명의 아가로오스 분해효소는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 배양물의 상등액 또는 상청액을 대체 이용하거나 또는 식용균주, 예컨대 효모에 형질전환시켜 형질전환된 효모의 배양물 상등액 또는 상청액을 대체하여 이용할 수 있다.
본 발명에서 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터와 관련하여 사용될 때 용어 "재조합"은, 상기 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입 또는 본래적 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었거나, 또는 상기 세포가 이렇게 변형된 세포로부터 유래한 것을 가리킨다. 즉, 예를 들어, 재조합 세포는 상기 세포의 본래적 (비(非)재조합) 형태 내에서는 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 또는, 다르게는 발현 시 비정상적으로 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는 본래적 유전자를 발현한다.
본 명세서에서 "핵산"은 단일가닥 또는 이중가닥의 DNA, RNA, 및 이들의 화학적 변형체를 포괄한다. "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 유전 암호가 축퇴되어 있기 때문에, 특정 아미노산을 인코딩하기 위해서 하나 이상의 코돈을 사용할 수 있으며, 본 발명은 특정 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.
핵산 서열을 세포 내로 삽입하는 용어 "도입"은 "트랜스펙션 (transfection)", 또는 "형질전환" 또는 "형질도입(transduction)"을 의미하며, 핵산 서열의 진핵 또는 원핵 세포 내로의 통합에 대한 언급이 포함되고, 이때 상기 핵산 서열은 세포의 게놈 (예컨대, 염색체, 플라스미드, 색소체, 또는 미토콘드리아 DNA) 내로 통합되어, 자율 레플리콘으로 전환되거나, 또는 일시적으로 발현된다.
상기 아가로올리고당 및 아가로오스 분해효소의 반응은 20 내지 40℃의 온도 범위에서 0 내지 200 rpm 조건으로 30분 내지 7일간 실시할 수 있다. 보다 구체적으로, 25 내지 35℃의 온도 범위에서 100 내지 150 rpm 조건으로 1일 내지 4일 동안 실시할 수 있다.
상기 아가로올리고당이 분말상태인 경우 통상의 완충용액에 녹여 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
다음으로, 상기 효소 반응을 통해 생산된 네오아가로바이오스를 D-갈락토오스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스로 분해할 수 있는 네오아가로바이오스 가수분해효소는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 효소의 하나 이상의 치환, 결손, 전위, 첨가 등의 변이 단백질로서 상기 네오아가로바이오스 가수분해 활성을 가지는 단백질도 본 발명의 효소의 권리범위에 포함되며, 바람직하게는 서열번호 3에 개시된 아미노산 서열과 서열 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상인 아미노산 서열을 포함한다(이하, 'sdNABH'라 함).
상기 효소는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 2-40에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 효소는 효소의 코딩 영역 전 및 후의 영역뿐만 아니라 개별 코딩 분절 사이의 개재 서열이 포함된 폴리펩티드를 생산하는데 연관된 DNA 분절, 즉 코딩 유전자를 통해 전사 및 번역될 수 있다. 예컨대, 서열번호 4에 기재된 서열일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 네오아가로바이오스 가수분해효소는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans)의 배양물의 상등액 또는 상청액으로부터 분리 및 정제할 수 있으며, 유전공학적 재조합 기술을 이용하여 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 이외 균주 또는 인공적인 화학적 합성법 등에 의하여 생산 및 분리할 수 있다.
재조합 기술을 이용하는 경우, 통상적인 재조합 단백질 발현의 용이함을 위하여 사용되는 인자들, 예컨대 항생제 저항성 유전자, 친화성 컬럼 크로마토그래피에 사용될 수 있는 리포터 단백질 또는 펩타이드를 사용할 수 있으며, 이러한 기술은 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시 가능한 범주에 해당된다. 또한 본 발명의 네오아가로바이오스 가수분해효소는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 배양물의 상등액 또는 상청액을 대체 이용하거나 또는 식용균주, 예컨대 효모에 형질전환시켜 형질전환된 효모의 배양물 상등액 또는 상청액을 대체하여 이용할 수 있다.
상기 네오아가로바이오스와 네오아가로바이오스 가수분해효소의 반응은 20 내지 40℃의 온도 범위에서 0 내지 200 rpm의 조건으로 30분 내지 7일 동안 실시할 수 있다. 보다 구체적으로 25 내지 35℃의 온도 범위에서 100 내지 150 rpm 조건으로 1일 내지 4일 동안 실시할 수 있다.
또한, 본 발명의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 제조방법은 네오아가로바이오스의 분해 산물 중 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 만을 분리 정제하는 단계를 더 실시할 수 있다.
상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 흡착 크로마토그래피인 실리카 젤 크로마토그래피 및 젤 투과 크로마토그래피인 바이오 젤 P2 크로마토그래피를 순차적으로 실시하여 대략 96%의 고순도로 분리 정제할 수 있다.
정제한 산물은 1H-NMR과 2D-Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) NMR 분석을 시행하여 기존에 보고된 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 1H ppm와 13C ppm을 비교하여 구조를 동정할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 본 발명의 제조방법을 통해 100g의 아가로오스로부터 화학적 가수분해를 통해 76g의 아가로올리고당을 생산하며, Aga50D와 sdNABH 효소를 이용하여 37.55g의 네오아가로바이오스와 15.21g의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 각각 생산하며, 또한 2가지 크로마토그래피를 이용한 정제 과정을 통해 3.98g의 순수한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 정제할 수 있다.
본 발명은 또한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 피부 미백 또는 보습용 화장료 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 피부 미백 또는 보습을 위한 미용적 용도를 제공한다.
상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 기존 미백물질로 가장 널리 알려져 있는 알부틴보다 미백 활성이 더 높으며, 멜라닌 합성을 촉진하는 것과 관련된 티로시나아제, TRP-1 등의 발현을 농도 의존적 방식으로 억제하는 특징이 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 인 비트로 티로시나아제 활성 실험에서, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 티로시나아제 활성을 억제하는 것이 아니라 효소의 발현을 억제함으로써 미백 효과를 나타낸다.
또한, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 히알루론산의 합성에 관여하는 보습 마커인 HAS2 단백질의 발현을 촉진하는 특징이 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, HAS2 발현은 ERK 및 AKT 등의 다양한 염증 신호 전달 경로에 의해 조절되는데, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 ERK 및 AKT의 인산화를 증가시키고, 증가된 인산화된 ERK 및 AKT는 HAS2 발현을 증가시킬 수 있다.
상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 합성하여 이용하거나, 본 발명에 따른 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 제조방법에 따라 제조된 것을 제한 없이 사용할 수 있다.
유효량을 기준으로, 상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 자체 또는 화장품학적으로 허용된 담체를 혼합한 조성물을 기능성 성분으로 포함하는 화장료 또는 화장품을 제공하는데, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다.
또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
이때, 상술한 형태의 화장품 제조방법과 담체는 당업자에게 자명한 사항으로 구체적인 제조방법의 기재는 생략하기로 한다.
또한, 상기 화장품은 본 발명의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 식품 또는 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 제조 시 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 피부 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 피부 색소 침착 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 용도를 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제하는 것이 바람직하다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제하는 것이 바람직하다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witePSol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 피부에 적용할 수 있는 피부 외용제 제형으로서 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약제학적 조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 100㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 외용투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 또한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 유효량을 바람직하게는 이를 함유하는 약제학적 또는 화장료 조성물 형태로 투여하는 단계를 포함하는 미백 또는 보습을 필요로 하는 포유동물, 바람직하게는 인간 피부의 미백 또는 보습을 위한 미용 또는 의료방법에 관한 것이다.
마찬가지로, 본 발명은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 함유하는 약제학적 또는 화장료 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는 색소침착의 조절과 관련되는 피부의 병태, 질환 및/또는 병변, 바람직하게는 멜라닌 색소의 합성 증가로 피부에 국소적으로 발생하고, 기미, 주근깨, 흑색점, 모반, 약물에 의한 색소 침착, 염증 후 색소 침착, 및 피부염에 발생하는 과색소 침착에서 선택된 하나 이상을 치료하는 미용 또는 의료 방법을 제공한다.
3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 함유하는 약제학적 또는 화장료 조성물의 도포 빈도는 각각의 피험자의 필요에 따라 상당히 변할 수 있고, 도포 빈도는 매달 내지 1일 10회, 바람직하게는 매주 내지 1일 4회, 더 바람직하게는 1주당 3회 내지 1일 3회, 훨씬 더 바람직하게는 1일 1회 또는 2회가 제안된다.
또한, 본 발명은 피부 바람직하게는 얼굴, 목, 목선, 손, 겨드랑이, 사타구니, 팔꿈치 및/또는 무릎의 피부, 더 바람직하게는 얼굴, 목 및/또는 손의 국소 부위의 치료, 관리 및/또는 세정을 위한 약제학적 또는 화장료 조성물의 제조에서 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약제학적 유효량의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 동물의 염증성 질환 치료 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명은 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 용도를 제공한다.
상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 아질산염(nitrite, NO2)의 생성을 억제하는 항산화 활성이 있으며, 이는 해조류를 구성하는 다른 이당 및 단당인 네오아가로바이오스와 갈락토오스, 그리고 D-형태의 3,6-안하이드로 갈락토오스와 비교하였을 때 가장 높게 나타나 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로 사용할 수 있다(도 8 참조).
상기 염증성 질환 치료 방법에 사용되는 약제학적 조성물 및 투여 방법은 상기에서 설명하였으므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다. 한편, 상기 염증성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 투여할 수 있는 개체는 모든 동물을 포함한다. 예를 들어, 개, 고양이, 마우스와 같은 인간을 제외한 동물일 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 치료를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
또한 '치료'는 증상을 경감시키거나, 증상의 원인을 일시적 또는 영구적으로 제거하거나 증상의 출현 및 상기한 질병, 장애 또는 질환의 진행을 예방 또는 둔화시키는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 아세트산을 이용한 아가로오스의 가수분해
해조류를 구성하는 대표적인 다당체인 아가로오스를 아세트산을 사용하여 가수분해하였다. 5% (w/v)의 아가로오스를 3M 아세트산과 80℃에서 70분 동안 반응시킨 후 건조시켜 아세트산을 제거하였다. 또한 에탄올을 사용한 세척과정을 통해 건조 후 잔존해 있는 아세트산 및 가수분해시 생성될 수 있는 과분해물들을 제거하여 순수한 분말상태의 아가로올리고당을 생산하였다(도 2).
<실시예 2> Aga50D, sdNABH를 이용한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 생산
실시예 1로부터 생산한 산 가수분해물로부터 단당체인 D-갈락토오스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스로 분해하기 위하여 엑소형(exo-type)의 이당체 생산 효소인 Aga50D(대한민국 공개특허 제2010-0040438호 참조)와 반응시켰으며, 반응산물로 네오아가로바이오스를 생산하였다.
Aga50D 반응이 끝난 후에 네오아가로바이오스로부터 단당체인 D-갈락토오스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 생산하기 위하여 Aga50D 반응 산물을 sdNABH 효소(대한민국 공개특허 제2010-0108241호 참조)와 반응시켰다. 효소 반응 조건은 100mL의 50mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.4)에 5%(w/v) 아가로올리고당을 녹인 후 30℃에서 150 rpm 조건으로 3일간 반응시켰다. 효소 반응 시 사용한 효소의 양은 Aga50D는 10mg, sdNABH는 2.5mg이었다(도 2).
<실시예 3> 실리카 젤 크로마토 그래피와 바이오 젤 P2 크로마토그래피를 이용한 분리 정제
실시예 1과 2로부터 생산한 반응산물 중에서 3,6-안하이드로-L-갈락토오스만을 분리 정제하기 위하여 크로마토그래피를 실시하였다. 반응 산물을 셀라이트에 흡착시켜 파우더 형태의 샘플을 만든 후에 흡착 크로마토그래피인 실리카 젤 크로마토그래피를 실시하였다. 이동상은 클로로포름: 메탄올: 물을 각각 78:20:2(v/v/v)의 비율로 혼합한 용매를 사용하였으며 전체 이동상의 용매의 부피는 3L였다. 한 분획의 부피는 20mL였으며 총 150 분획의 샘플을 TLC로 분석한 후 그 중 3,6-안하이드로-L-갈락토오스가 있는 분획을 모았다. 추가로 진행할 바이오 젤 P2 크로마토그래피는 분자량에 따라 물질이 분리되므로 3,6-안하이드로-L-갈락토오스가 있는 분획 중에서 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 분자량이 비슷한 D-갈락토오스가 있는 분획은 제외하였다(도 3).
바이오 젤 P2 크로마토그래피를 통하여 이당체 및 중합도가 낮은 아가로올리고당으로부터 3,6-안하이드로-L-갈락토오스만을 순수하게 할 수 있다. 이때에 사용한 이동상은 물이었으며 한 분획 당 부피는 2mL이었다. 각 분획들 중 TLC 상에서 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 스팟만을 나타내는 분획만을 모아서 고순도의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 얻었다(도 2).
도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1 내지 3을 통해 100g의 아가로스로부터 화학적 가수분해를 통해 76g의 아가로올리고당을 생산하였으며, Aga50D와 sdNABH 효소를 이용하여 37.55g의 네오아가로바이오스와 15.21g의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 각각 생산하였다. 또한 2가지 크로마토그래피를 이용한 정제 과정을 통해 3.98g의 순수한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 정제하였다.
또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 용출 부피(Elution volume) (L)의 0.25-067에서는 아무것도 나타나지 않고, 0.77-1.77에서는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 갈락토오스를 제외한 다른 당이 나타나며(농축한 후 바이오 젤 P2 크로마토그래피에 사용한 샘플), 1.87-2.67에서는 갈락토오스와 다른 당이 나타났다.
<실시예 4> GC/MS 분석을 통한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 정성 및 정량
실시예 3을 통해 생산한 고순도의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 GC/MS로 분석하여 정량하였다. GC/MS 분석을 위한 유도체화 과정은 다음과 같다. 정제한 샘플을 스피드 백으로 건조한 후에 50㎕의 2%(w/v)의 O-메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드/피리딘(O-methylhydroxylamine hydrochloride in pyridine)을 넣고 75℃에서 30분간 반응시켰다. 그리고 80㎕의 N-메틸-N-(트리메틸실릴)트리플루오로아세타마이드(N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide)를 넣고 40℃에서 150rpm에서 30분간 반응시켰다. GC/MS 분석을 위한 기기 조건은 다음과 같다. 분석 시 사용한 컬럼은 DB5-MS capillary column이며 GC 컬럼 온도 조건은 먼저 100℃에서 3.5분간 유지하고 160℃까지 승온시킨 후 20분간 유지하였다. 그 후 200℃까지 승온한 후 15분간 유지하고 마지막으로 280℃까지 승온한 후에 5분간 유지하였다. 1㎕의 샘플을 9.6의 분할비(split ratio)로 분석하였다(도 4).
<실시예 5> 1H-NMR과 2D HSQC NMR 분석을 통한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 구조 규명
실시예 1 내지 3을 통해 생산한 고순도의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 화학 구조의 규명을 위하여 NMR 분석을 하였다. 2mg의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 샘플을 D2O에 녹였으며 화학적 이동(chemical shift)을 계산하기 위해 내부 표준(internal standard)으로 3-(트리메틸실릴)-프로피오닉-2,2,3,3-d4 애시드(3-(trimethylsilyl)-propionic-2,2,3,3-d4 acid)를 넣어주었다. 1H-NMR와 2D HSQC NMR의 화학적 이동은 이 전에 보고된 문헌의 결과 값과 비교하여 구조를 규명하고 확인하였다(Sugano et al (1994) J Bacteriol. 176(22) 6812-6818, Miller et al (1982) Aust J Chem. 35(4) 853-856)(도 5 및 6).
<실시예 6> 분리, 정제한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 미백효과 및 항산화 활성 조사
실시예 1 내지 3으로부터 생산한 고순도의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 미백활성을 측정하기 위하여 흑색종 세포(melanoma cell)인 B16F10을 배양하였다. 멜라닌 생성을 촉진하는 호르몬인 α-멜라노사이트-스티뮬라틴 호르몬(α-melanocyte-stimulatine hormone)을 처리하기 전에 미백제로 가장 널리 사용하는 알부틴과 홍조류를 구성하는 당류인 네오아가로바이오스, D-갈락토오스, 3,6-안하이드로-D-갈락토오스, 그리고 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 각각 1, 10, 100㎍/mL로 처리한 후에 α-멜라토사이트-스티뮬라틴 호르몬과 반응을 실시하였다. 4일을 함께 배양한 후에 475 nm 흡광도를 측정하여 멜라닌 함량을 분석하였다.
그 결과 3,6-안하이드로-L-갈락토오스가 다른 처리군보다 미백활성이 매우 뛰어났으며, 실제 미백활성 기능성 물질로 잘 알려진 알부틴보다 활성이 높게 나타났다(도 7).
<실시예 7> 분리, 정제한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 항산화 활성
실시예 1 내지 3으로부터 생산한 고순도의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 항산화 활성을 측정하기 위하여 RAW264.7 세포 배양액의 nitrite(NO2)의 농도를 Griess 반응 방법으로 측정하였다. 2㎍/mL 농도의 리포폴리사카라이드(lipopolysaccahrides)를 세포에 처리하면서 네오아가로바이오스, 갈락토오스, 3,6-안하이드로-D-갈락토오스, 그리고 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 각각 50, 100, 200 ㎍/mL 농도로 처리한 후에 함께 처리하여 항산화 활성 측정을 하였다. 24시간을 함께 배양한 후에 540 nm 흡광도를 측정하여 항산화 활성 분석하였다.
그 결과 3,6-안하이드로-L-갈락토오스가 다른 처리군보다 항산화 활성이 매우 뛰어났으며, 이는 이미 보고된 3,6-안하이드로-D-갈락토오스의 활성보다 높게 나타났다(도 8).
<실시예 8> 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 사람 표피 멜라닌 세포에서 미백 효과 실험
멜라닌은 피부 및 머리카락의 색을 결정하는 천연 색소이다. 멜라닌의 알려진 주요 기능은 흡수 및 산란된 자외선 조사에 의한 자외선에 의한 DNA 손상으로부터 보호하는 것이다. 그러나, 과량의 멜라닌 생성 또는 비정상적인 분포는 기미, 주근깨, 노인성 흑점 등의 불규칙적인 피부 과색소침착을 유발할 수 있다. 자외선 조사는 α-MSH(α-melanocyte-stimulating hormone), ACTH 및 그들의 관련 수용체인 melanocortin 1 receptor(MC1R)의 수준을 증가시켜 티로시나아제 및 티로시나아제 관련 단백질(tyrosinase related proteins (TRPs)를 포함하여 멜라닌 생합성 효소의 발현을 촉진함이 선행 연구에서 밝혀졌다. 구리 함유 당단백질인 티로시나아제는 특정 세포 기관, 즉, 멜라닌 세포에서만 생성되는 멜라닌소체에서 멜라닌 합성을 위한 중요한 속도-조절 단계 효소이다. 따라서, 티로시나아제 발현의 감소는 피부 착색을 억제하기 위한 좋은 전략인 것으로 간주한다.
또한, TRP-1은 구조적으로 티로시나아제와 연관되어 있고, ~ 40% 아미노산 상동성을 공유하며, 티로시나아제와 같이 멜라닌 소체에 존재한다. 선행 연구의 보고에 따르면, TRP-1의 돌연변이 결과 창백한 피부 또는 머리카락 색이 나타나며, 안피부백피증의 특정 타입에서 나타난다. 또한, TRP-1은 TRP-1발현 억제는 저색소침착증과 연관되어 있기 때문에 멜라닌 생합성에서 역할을 담당한다고 제시되어 있다.
따라서, L-AHG의 피부 미백 활성 가능성을 평가하기 위해, α-MSH에 의해 유도된 티로시나아제 및 TRP-1 발현에 대한 L-AHG의 효과를 조사하였다.
이를 위한 세포로 적당히 착색된 신생아 포피 유래의 사람 표피 멜라닌 세포(Human epidermal melanocytes, HEMs, Cascade Biologics (Oregon, USA))를 사용하였다. 세포는 5% CO2를 포함하는 가습 분위기에서 37℃의 온도 조건에서 배양하였다. HEMs에 대한 생장 배지는 HMGS를 첨가한 Medium 254(Cascade Biologics (Oregon, USA))이다.
HEM(1×105)를 6-cm 디쉬에서 24시간 동안 배양하였다. 며칠 동안 100nM α-MSH(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 노출하기 전에 상기 세포에 0, 25, 50 및 100㎍/mL 농도의 3,6-anhydro-L-galactose(L-AHG)를 1시간 동안 처리하였다. 라이시스 버퍼[20mM Tris-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM Na2EDTA, 1mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5mM sodium pyrophosphate, 1mM β-glycerophosphate, 1mM Na3VO4, 1g/mL leupeptin, 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 및 protease inhibitor cocktail tablet]로 세포를 용해하였다. 단백질 농도는 염료가 결합된 단백질 분석 키트(Bio-Rad Laboratories Inc. Hercules, CA, USA)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 측정하였다. 용해된 단백질(20-40㎍)에 대해 10% SDS-PAGE를 실시하고, 전기영동에 의해 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF) 멤브레인으로 트랜스퍼하였다(Millipore Corp., Bedford, MA, USA). 블랏팅 후, 5% 스킴 밀크(MB cell, Los Angeles, CA, USA)로 2시간 동안 멤브레인을 블록킹하고 1차 항체(goat anti-mouse IgG-HRP)와 함께 4℃에서 오버나이트 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 상기 멤브레인을 2차 항체(goat anti-rabbit IgG HRP-conjugated secondary antibody)와 함께 인큐베이션 하고, 화학발광 검출 키트(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)를 이용하여 항체가 결합된 단백질을 검출하였다. 대조군으로 β-액틴의 발현 수준을 측정하였다. 데이터는 2회 독립 실험의 대표값을 나타낸 것이다.
인 비트로 티로시나아제 분석은 기 보고된 방법(Ishihara Y et al., The journal of antibiotics (Tokyo) 1991;44:25-32; An SM, Koh JS, Boo YC, Phytotherapy Research 2010;24:1175-1180)을 약간 변형하여 수행하였다. 간단히 말해, 250㎕의 0.1M 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 6.8)를 24-웰 플레이트 상에 넣고, 25㎕의 버섯 유래의 티로시나아제(2000unit/mL), 25㎕의 시료 및 225㎕의 증류수를 상기 웰에 부가하였다. 상기 플레이트는 25℃에서 10분간 인큐베이션하고, 25㎕의 1 mM L-티로신을 상기 웰에 부가하여 기질로 사용하였다. 25℃에서 10분간 인큐베이션한 후, microplate reader (Sunrise-Basic Tecan, Austria)를 이용하여 475 nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다. 각 측정치는 대조군 대비 변화율(%)로 표시하였다. L-티로신을 기질로 사용하였고, 알부틴을 양성 대조군으로 사용하였다. 결과는 미처리 대조군에 대해 티로시나아제 상대 활성으로 표현하였다.
도 9에 나타난 바와 같이, α-MSH에 의해 유도된 티로시나아제 발현을 비교하면, 100㎍/mL의 L-AHG를 처리한 경우 HEMs에서 α-MSH에 의해 유도된 티로시나아제 발현이 유의적으로 감소하였다.
또한, L-AHG 처리에 의한 티로시나아제 발현 감소와 유사하게(도 9A), TRP-1 발현은 HEMs에서 L-AHG 농도 의존적 방식으로 감소하였다(도 10).
다음으로, 무세포 분석 시스템을 이용하여 티로시나아제 활성에 대한 L-AHG의 효과를 조사하였다. 많은 보고들에서 버섯 유래의 티로시나아제는 정제 형태로 바로 이용할 수 있어 모델로서 일차적으로 사용하였다고 기재되어 있다. L-티로신의 경쟁적 억제제인 알부틴(Arbutin)은 양성 대조군으로 사용하였고, 이는 버섯의 티로시나아제 활성을 억제한다(도 11). 결과는 미처리 대조군에 대한 티로시나아제의 상대 활성으로 표시하였다. 데이터는 3회 독립 실험으로부터 평균±S.D.로 나타내었고, 단일 통계 비교를 위해 스튜던츠 t 테스트를 사용하였다. 통계적 의의에 대한 기준으로 p < 0.05의 유의성 값을 사용하였다. 별표는 미처리 대조군과 비교하여 유의적인 차이(p < 0.05)를 나타내는 것이다.
도 11에 나타난 바와 같이, L-AHG는 버섯의 티로시나아제 활성에서 어떠한 유의적인 감소도 유도하지 않았다. 알부틴은 200μM의 농도에서, 40%까지 티로시나아제 활성을 감소시켰다.
상기 결과를 종합하면, L-AHG는 티로시나아제 및 TRP-1의 발현을 억제하는 신규한 저색소침착제임을 시사한다.
<실시예 9> 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 사람 각질세포에서 보습 효과 실험
히알루로난(Hyaluronan, HA)은 D-글루쿠론산 및 N-아세틸-D-글루코사민으로 구성된 글리코사미노글리칸이다. 다량의 물을 보관할 수 있는 능력으로 인해, HA는 수분 밸런스 및 삼투압을 조절하는 데 있어 중요한 역할을 담당한다. AH는 HAS 1, 2 및 3에 의해 세포막에서 합성되고, 특히 HAS2는 사람의 정상 조직에서 나타난다. 선행 연구에서, HAS2의 유전자 결핍은 마우스 모델에서 태아기 치사율을 유발하고, 성인 사람의 피부의 표피 및 진피에서 감소된 HAS2 유전자 발현을 보인다. 따라서, HAS2 발현 증가는 피부 항상성을 유지하기 위한 좋은 전략일 수 있다. HAS2 발현에 대한 L-AHG의 유도 시점 및 농도를 측정하기 위해, 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.
이를 위해 사용된 세포는 HaCaT 세포로 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, GIBCO® Invitrogen, Auckland, NZ)을 이용하여 5% CO2 분위기 하에서 37℃에서 배양하였다.
세포(1×105)를 6-cm 디쉬에서 24시간 동안 배양한 후, 무혈청 배지에서 추가로 24시간 동안 굶겨 키나아제의 활성화에 대한 FBS의 영향을 제거하였다. 그 후, 일정 시간 및 농도로 3,6-anhydro-L-galactose (L-AHG)를 처리하였다. 라이시스 버퍼[20mM Tris-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM Na2EDTA, 1mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5mM sodium pyrophosphate, 1mM β-glycerophosphate, 1mM Na3VO4, 1g/mL leupeptin, 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 및 protease inhibitor cocktail tablet]로 세포를 용해시켰다. 단백질 농도는 염료가 결합된 단백질 분석 키트(Bio-Rad Laboratories Inc.)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 측정하였다. 용해된 단백질(20-40㎍)에 대해 10% SDS-PAGE를 실시하고, 전기영동에 의해 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride(PVDF)) 멤브레인으로 트랜스퍼하였다(Millipore Corp., Bedford, MA, USA). 블랏팅 후, 5% 스킴 밀크로 2시간 동안 멤브레인을 블록킹하고 1차 항체(goat anti-mouse IgG-HRP)와 함께 4℃에서 오버나이트 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 상기 멤브레인을 2차 항체(goat anti-rabbit IgG HRP-conjugated secondary antibody)와 함께 인큐베이션 하고, 화학발광 검출 키트(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)를 이용하여 항체가 결합된 단백질을 검출하였다. 데이터는 2회 독립 실험의 대표값을 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, L-AHG는 처리 3시간 후 HAS2 발현을 증가시켰다. 또한, L-AHG는 농도 의존적인 방식으로 HAS2 발현을 증가시켰다.
HAS2 발현은 MAPKs 및 AKT 등의 다양한 염증 신호 전달 경로에 의해 조절됨이 이미 밝혀져 있다. 따라서, 다양한 염증 신호 전달 경로에서 L-AHG의 효과를 측정하였다.
도 13A에 나타난 바와 같이, 100㎍/mL의 L-AHG는 처리 3시간 후 ERK의 인산화를 유의적으로 증가하였다. ERK의 인산화에 대한 L-AHG의 농도 의존적인 효과를 측정하기 위해, 25, 50 및 100㎍/mL의 L-AHG를 처리하였다. L-AHG에 의해 유도된 HAS2 발현과 유사하게(도 13B), ERK의 인산화는 L-AHG 농도 의존적인 방식으로 증가하였다.
도 14A에 나타난 바와 같이, 100㎍/mL의 L-AHG는 처리 3시간 후 AKT의 인산화를 유의적으로 증가시켰다. AKT의 인산화에 대한 L-AHG의 농도 의존적인 효과를 측정하기 위해, 25, 50 및 100㎍/mL의 L-AHG를 처리하였다. L-AHG는 농도 의존적인 방식으로 AKT의 인산화를 증가시켰다(도 14B).
상기 결과를 종합하면, L-AHG에 의해 유도된 ERK 및 AKT의 인산화는 L-AHG에 의한 HAS2 발현 증가에 기여하는 것으로 보인다.
본 발명은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 미백 또는 보습제, 항산화제, 저색소침착제, 또는 항염증제로 사용할 수 있다.

Claims (20)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 피부 미백 또는 보습용 화장료 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2013000423-appb-I000002
  2. 제1항에 있어서, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는
    아가로오스와 0.5 내지 60%(w/v) 농도의 약산을 40 내지 150℃의 온도 범위에서 100 내지 200 rpm의 조건으로 30분 내지 6시간 동안 반응시켜 아가로올리고당을 제조하는 단계; 및
    상기 아가로올리고당과 아가로오스 분해효소 및 네오아가로바이오스 가수분해효소를 20 내지 40℃의 온도 범위에서 0 내지 200 rpm 조건으로 30분 내지 7일 동안 반응시키는 단계를 거쳐 제조되는 것인 피부 미백 또는 보습용 화장료 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    약산은 아세트산(Acetic acid), 포름산(Formic acid), 숙신산(Succinic acid), 시트르산(Citric acid), 말산(Malic acid), 말레산(Maleic acid) 및 옥살산(Oxalic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 피부 미백 또는 보습용 화장료 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    아가로오스 분해효소는 서열목록 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 피부 미백 또는 보습용 화장료 조성물.
  5. 제2항에 있어서,
    네오아가로바이오스 가수분해효소는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 피부 미백 또는 보습용 화장료 조성물.
  6. 하기 화학식 1로 표시되는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 피부 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2013000423-appb-I000003
  7. 제6항에 있어서,
    피부 색소 침착 질환은 멜라닌 색소의 합성 증가로 피부에 국소적으로 발생하고, 기미, 주근깨, 흑색점, 모반, 약물에 의한 색소 침착, 염증 후 색소 침착, 또는 피부염에 발생하는 과색소 침착 중 어느 하나인 피부 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는
    아가로오스와 0.5 내지 60%(w/v) 농도의 약산을 40 내지 150℃의 온도 범위에서 100 내지 200 rpm의 조건으로 30분 내지 6시간 동안 반응시켜 아가로올리고당을 제조하는 단계; 및
    상기 아가로올리고당과 아가로오스 분해효소 및 네오아가로바이오스 가수분해효소를 20 내지 40℃의 온도 범위에서 0 내지 200 rpm 조건으로 30분 내지 7일 동안 반응시키는 단계를 거쳐 제조되는 것인 피부 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    약산은 아세트산(Acetic acid), 포름산(Formic acid), 숙신산(Succinic acid), 시트르산(Citric acid), 말산(Malic acid), 말레산(Maleic acid) 및 옥살산(Oxalic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 피부 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    아가로오스 분해효소는 서열목록 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 피부 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  11. 제8항에 있어서,
    네오아가로바이오스 가수분해효소는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 피부 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  12. 하기 화학식 1로 표시되는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2013000423-appb-I000004
  13. 제12항에 있어서, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는
    아가로오스와 0.5 내지 60%(w/v) 농도의 약산을 40 내지 150℃의 온도 범위에서 100 내지 200 rpm의 조건으로 30분 내지 6시간 동안 반응시켜 아가로올리고당을 제조하는 단계; 및
    상기 아가로올리고당과 아가로오스 분해효소 및 네오아가로바이오스 가수분해효소를 20 내지 40℃의 온도 범위에서 0 내지 200 rpm 조건으로 30분 내지 7일 동안 반응시키는 단계를 거쳐 제조되는 것인 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    약산은 아세트산(Acetic acid), 포름산(Formic acid), 숙신산(Succinic acid), 시트르산(Citric acid), 말산(Malic acid), 말레산(Maleic acid) 및 옥살산(Oxalic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    아가로오스 분해효소는 서열목록 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  16. 제13항에 있어서,
    네오아가로바이오스 가수분해효소는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  17. 아가로오스와 0.5 내지 60%(w/v) 농도의 약산을 40 내지 150℃의 온도 범위에서 100 내지 200 rpm의 조건으로 30분 내지 6시간 동안 반응시켜 아가로올리고당을 제조하는 단계; 및
    상기 아가로올리고당과 아가로오스 분해효소 및 네오아가로바이오스 가수분해효소를 20 내지 40℃의 온도 범위에서 0 내지 200 rpm 조건으로 30분 내지 7일 동안 반응시키는 단계를 포함하는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서,
    약산은 아세트산(Acetic acid), 포름산(Formic acid), 숙신산(Succinic acid), 시트르산(Citric acid), 말산(Malic acid), 말레산(Maleic acid) 및 옥살산(Oxalic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 제조방법.
  19. 제17항에 있어서,
    아가로오스 분해효소는 서열목록 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 제조방법.
  20. 제17항에 있어서,
    네오아가로바이오스 가수분해효소는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 제조방법.
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