WO2017074163A1 - 초저분자 케라틴 펩타이드의 제조 방법 및 그의 이용 - Google Patents

초저분자 케라틴 펩타이드의 제조 방법 및 그의 이용 Download PDF

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WO2017074163A1
WO2017074163A1 PCT/KR2016/012410 KR2016012410W WO2017074163A1 WO 2017074163 A1 WO2017074163 A1 WO 2017074163A1 KR 2016012410 W KR2016012410 W KR 2016012410W WO 2017074163 A1 WO2017074163 A1 WO 2017074163A1
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keratin
peptide
present
skin aging
wrinkles
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PCT/KR2016/012410
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English (en)
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이동우
강남주
이용직
진현수
여인혁
송경섭
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경북대학교 산학협력단
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
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    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ultra-low molecular weight keratin peptides and their use. Specifically, the present invention provides a method for preparing ultra-low molecular weight keratin peptides using culture, ultrafiltration, ion exchange chromatography and gel filtration chromatography of microorganisms having keratinizing activity in a medium containing keratin, peptides prepared by the above method and It relates to a skin aging or skin wrinkle prevention or improvement cosmetics, food composition comprising the same.
  • keratin peptides are natural amino acid polymers (less than 50 amino acids) that form the basis of epidermal structures such as hair, nails, and skin, and have various biological activities because they have excellent interaction with proteins in vivo.
  • Medical peptides which are used for the treatment of diseases of humans or livestock, are mostly expensive products despite their trace amounts. Even if the peptide is very effective, it is mostly a polymer consisting of 15 or more amino acids (molecular weight of 3 kDa or more), so it is not easily absorbed into the skin and permeabilities. Therefore, the most important factors in the development of new peptide materials are selective separation and high purity purification technology to determine 1) efficacy of peptide, 2) peptide size (molecular weight), and 3) production cost.
  • RP-LC reverse phase liquid chromatography
  • RP-LC reverse phase high performance liquid chromatography
  • hydrophobic interactions to purify polymer materials such as peptides and proteins produced by synthetic or recombinant methods.
  • RP-HPLC reverse phase high-performance liquid chromatography
  • the RP-LC and RP-HPLC methods can effectively separate closely related impurities and purify a large number of various molecules, and are particularly used as mass purification processes for preparing industrial scale proteins.
  • C-4, C-8 and C-18 alkyl chains attached to the silica surface are most frequently used as a medium for peptide protein purification in reversed phase chromatography.
  • the core of the purification is the shape and size of the resin particles in the stationary phase, the buffer system, the flow rate, and the pH.
  • the present inventors have developed a process for recovering and separating functional keratin peptides having skin anti-aging effects from hardly degradable keratin degrading products, and ultra-low-molecular molecules that can freely and efficiently penetrate the stratum corneum and cell membranes without the help of a delivery system. Efforts have been made to develop a purification process to selectively separate peptides.
  • an aspect of the present invention provides a method for preparing keratin peptides for skin aging or wrinkle prevention using culturing, filtration, ion exchange chromatography and gel filtration chromatography of microorganisms having keratinizing activity in a medium containing keratin. It is.
  • an aspect of the present invention is to provide a keratin peptide mixture prepared by the above method and a cosmetic composition, food composition for preventing or improving skin aging or wrinkles comprising the same.
  • an aspect of the present invention is a peptide represented by one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 9 and cosmetic composition, food composition for preventing or improving skin aging or skin wrinkles comprising the peptide To provide.
  • step (3) purifying the protein by performing ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, or a combination thereof on the fraction product obtained from step (2);
  • step (3) purifying and desalting the protein by performing gel filtration chromatography on the purified protein obtained from step (3), it provides a method for producing a keratin peptide mixture for skin aging or wrinkle prevention .
  • the inventors of the present invention have obtained keratin peptides having skin anti-aging effects by effectively obtaining keratin degradation products through ultra-high temperature anaerobic fermentation in a minimally-limited medium containing hardly degradable poultry feathers as a nutrient.
  • a large amount of ultra-low molecular weight (less than 1 kDa) keratin peptide was recovered through fractionation by molecular weight using hydrolysis products of feathers.
  • these ultra-low molecular weight keratin peptides were separated and purified using ion exchange chromatography and gel filtration chromatography.
  • the purification step was simplified to separate and purify ultra-low molecular weight keratin peptides using only the gel filtration chromatography method.
  • these peptides do not show cytotoxicity, and have the ability to inhibit the activity and expression of MMP-1, and have anti-aging function and percutaneous permeability of the skin, so it can be used to prevent or improve skin wrinkles or skin aging. It was.
  • Step (1) of the present invention is a step of obtaining a keratin hydrolysis product by culturing a microorganism having keratinizing activity in a medium containing keratin.
  • 'microorganism having a keratinizing activity' includes without limitation a microorganism having an activity capable of degrading keratin, preferably may be an ultra-high temperature microorganism.
  • the term 'super high temperature microorganism' used in the present invention is a kind of extremophile, and means a microorganism having an optimal growth temperature at a relatively high temperature, that is, about 60 ° C. or more, and the type thereof is not limited.
  • it may be of the genus Fervidobacterium .
  • the genus Perbidobacterium may be islandicum , pennivorans , changbaicum , gondwanense species.
  • Fervidobacterium islandicum AW-1 (KCTC4680) can be used.
  • 'keratin' used in the present invention is a kind of structural protein and is a major component of the cytoskeleton. Keratin is divided into soft keratin and hard keratin according to the cysteine content. Soft keratin contains about 10-14% of cysteine, which is a hair, nails, fleece and chicken feathers that have a lot of disulfide bonds. Keratin has a structure of ⁇ -helix ( ⁇ -keratin) or ⁇ -sheet ( ⁇ -keratin) intertwined so that protein chains are very tightly stacked and numerous disulfide bonds and hydrogen bonds and hydrophobic interactions between polypeptide chains. It is very stable in the presence and has a high resistance to proteolytic enzymes.
  • the keratin of the present invention may be derived from feathers, hair, leather, nails, toenails, horns, or hooves of birds or mammals.
  • bird feathers can be included in the medium.
  • the bird feather is preferably contained in the medium of 5 ⁇ 15 g / L, more preferably 8 g / L. If the content is included in the above-described range, the production of keratin peptides through anaerobic culture is possible within 1-2 days, it is better to obtain a functional keratin peptide of the appropriate size.
  • the culture may be a high temperature culture of 60 °C or more.
  • the culture temperature is not limited thereto, and may be preferably 60 ° C to 90 ° C.
  • the culture of step (1) may be anaerobic culture.
  • the method of anaerobic culture is not limited, but may be anaerobic politic culture.
  • the keratin peptide hydrolyzate obtained by adding 8 g / L of chicken's hair as a nitrogen source to the growth medium having the composition shown in Table 1 and anaerobicly cultivating Peridobacterium icelandicum AW-1 at 70 ° C. was filtered. . Subsequently, the filtered keratin peptide hydrolyzate was centrifuged at 10,000 x g to precipitate and recover the cells, and the supernatant was recovered after filtration.
  • Step (2) of the present invention is a step of fractionating a protein having a molecular weight of 100 Da to 1000 Da in the keratin hydrolysis product obtained from the step (1).
  • Step (2) may be carried out by ultrafiltration, the pore size of the ultrafiltration membrane used for ultrafiltration in the present invention may be 10 kDa to 1 kDa, and preferably 1 kDa Filtration membranes can be used.
  • a keratin peptide fraction product in which a peptide of 1 kDa or less remains.
  • Step (3) of the present invention is a step of purifying proteins by performing ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, or a combination thereof on the fraction product obtained from step (2).
  • the protein is purified by ion exchange chromatography or gel filtration chromatography, or a combination thereof, on a protein product having a size of 1 kDa or less that is filtered and eluted in step (2).
  • the ion exchange chromatography may be used as a resin cross-linked polystyrene (dex-linked polystrene) or dextran (dextran). Bead size of the resin is not limited, but may be 20 to 100 ⁇ m preferably 34 to 50 ⁇ m.
  • the buffer is not limited in kind, but Tris solvent may be preferably used.
  • the buffer may have a concentration of 20 mM to 50 mM.
  • step d) eluting the purified product from the column with the same buffer as step a).
  • the buffer is not limited in kind, but Tris solvent may be preferably used.
  • the buffer may have a molar concentration of 20 mM to 50 mM.
  • Step (4) of the present invention is a step of purifying and desalting the protein by performing gel filtration chromatography on the purified protein obtained from the step (3).
  • 'Desalting' in the present invention is to remove the salts contained in the sample, there is no limitation in the manner, ion exchange method, size exclusion chromatography, dialysis or gel filtration liquid chromatography and the like can be used.
  • a gel filtration liquid chromatography method using water was finally used.
  • Another aspect of the present invention provides a keratin peptide mixture produced by the above method.
  • the keratin peptide mixture is used to mean a collection of keratin peptides obtained by the above method or all of one or more keratin peptides that can be identified therefrom.
  • the keratin peptides produced in the present invention have the ability to inhibit the expression of MMP-1, an enzyme that breaks down collagen and causes skin aging, and does not exhibit cytotoxicity, thus preventing the skin aging, skin wrinkles, improving or treating cosmetics, pharmaceuticals, and food compositions. Suitable for use as
  • the keratin peptide of the present invention is a keratin peptide having a molecular weight of 100 Da to 1000 Da or less. Since it is an ultra-low molecular peptide, the keratin permeability is excellent.
  • another aspect of the present invention provides a cosmetic composition for preventing or improving skin aging or wrinkles comprising the keratin peptide mixture.
  • the keratin peptide of the present invention has the ability to inhibit the expression of MMP-1, it shows an effect of preventing skin aging or wrinkles.
  • the keratin peptide of the present invention has the activity of inhibiting the activity of MMP-1, it shows an effect of preventing skin aging or wrinkles.
  • the keratin peptide of the present invention has the effect of preventing skin aging or wrinkles caused by ultraviolet light.
  • the keratin peptide of the present invention is preferably included in 0.001 to 50% by weight relative to the total weight of the cosmetic composition, but is not limited thereto.
  • the cosmetic composition of the present invention may further include conventional auxiliaries and carriers such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, fragrances and the like commonly used in cosmetic compositions in addition to the active ingredient.
  • the cosmetic composition may further include auxiliary ingredients such as glycerin, butylene glycol, polyoxyethylene hardened castor oil, tocopheryl acetate, citric acid, panthenol, squalane, sodium citrate, and allantoin. .
  • the cosmetic composition of the present invention is basically applied to the skin, it can be prepared in any formulation that is conventionally prepared with reference to the cosmetic composition in the art.
  • it may be formulated as a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleansing, oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray, and the like. It is not limited to this. More specifically, it may be prepared in the form of a flexible lotion, nutrition lotion, nutrition cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, mask pack, spray or powder.
  • the carrier component may include animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, trakant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, zinc oxide and the like. have.
  • carrier components may include lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, polyamide powder, and the like, and in particular, in case of spray, additionally chlorofluorohydrocarbon, propane Propellants, such as butane, dimethyl ether, and the like.
  • a carrier component may include a solvent, a solubilizer, an emulsion, and the like, and specifically, water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, and propylene.
  • liquid carrier diluents such as water, ethanol and propylene glycol as carrier components
  • Suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester, and polyoxyethylene sorbitan ester
  • the carrier component is an aliphatic alcohol sulfate, an aliphatic alcohol ether sulfate, a sulfosuccinic acid monoester, an isethionate, an imidazolinium derivative, a methyltaurate, a sarcosinate, a fatty acid amide.
  • another aspect of the present invention provides a food composition for preventing or improving skin aging or wrinkles comprising the keratin peptide compound.
  • the keratin peptide of the present invention When used as a food additive, the keratin peptide may be added as it is, or may be appropriately used according to conventional methods such as being used by mixing with other food or food ingredients.
  • the mixing amount of the keratin peptide as the active ingredient may be appropriately changed depending on the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment), and the keratin peptide is included as 0.001 to 50% by weight relative to the total weight of the food composition. It may be, but is not limited thereto.
  • the keratin peptide of the present invention is added in an amount of 15 wt% or less, preferably 10 wt% or less with respect to the raw material.
  • the active ingredient may be used in an amount above the above range because there is no problem in terms of safety. have.
  • Examples of the food to which the keratin peptide of the present invention can be added include dairy products including meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, ice cream, various soups, beverages, and teas. , Drinks, alcoholic beverages, vitamin complexes and the like, and includes all of the health food in the usual sense.
  • the food composition of the present invention When the food composition of the present invention is made into a beverage, it may contain various ingredients such as various flavoring agents or natural carbohydrates as in the general beverage.
  • natural carbohydrate Monosaccharides, such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose and sucrose; Natural sweeteners such as dextrin and cyclodextrin, and synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame may be used.
  • the natural carbohydrate is 0.01 to 10% by weight, preferably 0.01 to 0.1% by weight based on the total weight of the food composition of the present invention.
  • the food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols. And carbonation agents used in carbonated beverages.
  • the composition of the present invention may include a pulp for the production of natural fruit juices, fruit juice drinks and vegetable drinks. These components can be used independently or in combination.
  • the additive ratio is not particularly limited, but is preferably included within the range of 0.01 to 0.1% by weight based on the total weight of the food composition of the present invention.
  • the present invention may provide a pharmaceutical composition for preventing or treating skin aging or wrinkles, comprising the keratin peptide mixture as an active ingredient.
  • keratin peptides contained in the pharmaceutical composition for skin aging or wrinkle prevention or treatment of the present invention can be appropriately adjusted according to the method of use of the therapeutic agent, the condition of the doser, the type of disease and the severity of the disease.
  • keratin peptide is preferably included in 0.001 to 50% by weight, but is not necessarily limited thereto.
  • composition of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions. It may also be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like in the form of conventional formulations, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions. Suitable formulations known in the art are preferably those disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, recently, Mack Publishing Company, Easton PA.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline Cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxy benzoate, propylhydroxy benzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used.
  • Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid form preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, It is prepared by mixing gelatin.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Preparations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories, and the like.
  • the non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the term "administration" means providing a subject with any of the compositions of the present invention in any suitable manner.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the amount of an active ingredient or pharmaceutical composition that induces a biological or medical response in a tissue system, animal or human, as thought by a researcher, veterinarian, doctor or other clinic, i.e. alleviation of the symptoms of a disease or disorder being treated. It may be administered in a therapeutically effective amount that is an amount that induces. It will be apparent to those skilled in the art that the therapeutically effective dosages and frequency of administrations for the pharmaceutical compositions of the invention will vary depending upon the desired effect. Therefore, the optimal dosage to be administered can be readily determined by one skilled in the art and includes the type of disease, the severity of the disease, the amount of active ingredients and other ingredients contained in the composition, the type of formulation, and the age, weight, general health of the patient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in an amount of 1 to 10,000 mg / kg / day, preferably 1 to 200 mg / kg / day, or may be administered once a day or several times. It can also be divided into.
  • composition of the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or cerebrovascular injections.
  • Another aspect of the present invention provides a peptide represented by one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 9.
  • Peptides represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 9 is an amino acid sequence synthesized by identifying the keratin peptides having an anti-aging ability by the LC-MS / MS method prepared by the keratin peptide production method of the present invention. More specifically, the peptide may be obtained using a database constructed based on the sequence of keratin, which is a target substance, and a strain capable of degrading the same, such as keratin degradation protease of the AW-1 strain and a cleavage site of the peptide. Based on the sequences obtained by identifying peptides by performing LC / MS-MS methods in the database, they can be synthesized using conventional techniques in the art.
  • the peptide has an ultra low molecular weight of 1 kDa or less, and has an effect of inhibiting the expression of MMP-1 induced by ultraviolet light B and an effect of inhibiting the activity of MMP-1, thereby preventing or improving skin aging or wrinkles. It can be useful.
  • another aspect of the present invention provides a cosmetic composition for skin aging or wrinkle prevention or improvement comprising a peptide represented by one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 9.
  • another aspect of the present invention provides a food composition for preventing or improving skin aging or wrinkles comprising a peptide represented by one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 9.
  • the method for preparing keratin peptide of the present invention environmentally friendly biological treatment of waste resources and efficient purification and recovery of anti-aging functional ultra-low molecular weight keratin peptides are possible.
  • the keratin peptide of the present invention has the ability to inhibit the expression and activity of MMP-1, an enzyme that breaks down collagen and causes skin aging, and is excellent in preventing skin aging and improving skin wrinkles and having no toxicity to skin cells.
  • MMP-1 an enzyme that breaks down collagen and causes skin aging
  • Suitable for use as a cosmetic, pharmaceutical and food composition for aging, preventing or improving skin wrinkles it can be usefully used for the efficient and rapid manufacture and development of high value-added functional cosmetic materials.
  • 1 is a schematic of a method for preparing keratin peptides.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of fractionation of ion exchange chromatography and gel filtration chromatography of keratin peptides of 1 kDa or less.
  • Figure 3 is a diagram showing the results of the fraction using the gel filtration chromatography method of keratin peptide below 1 kDa.
  • Figure 4 shows the results of measuring the effect of inhibiting the expression of MMP-1 induced by ultraviolet light B (UVB) in human skin fibroblasts (A) and human skin fibroblasts of the chokeratin peptide of the present invention (A) The figure shown.
  • Lane 1 is untreated control
  • lane 2 is UV B (UVB) 20 mJ / cm 2 alone group
  • lanes 3, 4, 5, 6, 7, 8 are seen with UV B (UVB) 20 mJ / cm 2
  • the experimental keratin peptide mixture No. 2, KP7 was treated with 5, 10, 20 ⁇ g / mL.
  • Figure 5 shows the inhibition of MMP-1 activity of synthetic keratin peptides of Table 3 (A), toxicity test in human skin fibroblasts (B) and the expression of MMP-1 induced by ultraviolet B (UVB) in human skin fibroblasts It is a figure which shows (C) the result of having measured the inhibitory effect.
  • Lane 1 is an untreated control group
  • Lane 2 is a group treated with UV (UVB) 20 mJ / cm 2 alone
  • lanes 3, 4 treated with a synthetic keratin peptide 10 ⁇ M with UV B (UVB) 20 mJ / cm 2 to be.
  • keratin was fermented to anaerobic fertilose bacterium islandicum AW-1 (KCTC4680) by anaerobic culture at 70 ° C. in a growth medium to which chicken hair was added as a nitrogen source as shown in Table 1 below. Hydrolysis products were obtained.
  • the keratin hydrolyzate was first filtered using a filter paper (5 ⁇ m, No. 20, Hyundai Micro, Korea) to decompose the decomposed chicken hair dregs, and then centrifuged at 10,000 ⁇ g for 20 minutes at 4 ° C. to remove the supernatant. Recovered. The recovered supernatant was used as a sample for the separation and purification of functional ultra-low molecular weight keratin peptides.
  • a filter paper 5 ⁇ m, No. 20, Hyundai Micro, Korea
  • Ultrafiltration was used to conveniently fractionate ultra-low molecular weight keratin peptides of less than 1 kDa from the sample.
  • membranes having pore sizes of 10 kDa and 1 kDa were used as filtration membranes.
  • the sample was introduced into a filtration module equipped with a filtration membrane, and a pressure of about 10-30 psi was applied so that the sample was filtered while passing through the filtration membrane.
  • 10 kDa or more proteins were separated using a 10 kDa ultrafiltration membrane, and 1 kDa or more samples and 1 kDa or less samples were fractionated by using a 1 kDa ultrafiltration membrane for protein samples of 10 kDa or less leaked from the filtration module. .
  • the keratin peptides were purified in two ways on fractionated 1 kDa or less keratin peptide samples: i) Purification by ion exchange chromatography. The fractionated samples were separated and purified according to ionicity by ion exchange chromatography using a Biologic duo-flow FPLC system (Bio-rad) and Macro-prep DEAE support (Bio-Rad) (50 mM Tris-HCl buffer , pH 7.5, 0 M-1 M NaCl) and the results are shown in FIG. 2. As shown in FIG. 2, two peaks were observed during 210 nm measurement, and Fr. Lyophilization was performed after pooling 4-47.
  • the lyophilized sample was subjected to gel filtration chromatography using a Bio-rad biologic duo-flow FPLC system, superdex 30 pg (GE) for desalting and molecular weight separation (20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.0, 100 mM NaCl) and four peaks were determined at 210 nm measurement, and Fr. Lyophilization was performed after pooling 16-29.
  • the keratin peptides obtained by the above method were referred to as “No. 2 ”;
  • the absorbance of the sample was measured at 280 nm and 210 nm to determine the amount of protein and peptide when performing chromatography.
  • MTT assay was performed using human dermal fibroblasts.
  • Streptomycin (GIBCO ® Invitrogen, Auckland, NZ ) -; (FBS fetal bovine serum) and penicillin First, 5 ⁇ 10 3 cell / well in a 96-well plate, each dispensed fetal bovine serum 10% to the human fibroblast
  • the culture medium containing Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) was incubated for 6 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • 200 mg of MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) powder was dissolved in 40 mL of PBS and filtered to prepare a 5 mg / mL MTT solution.
  • the medium containing the prepared keratin peptide was added, and after 72 hours, 20 ⁇ l of 5 mg / mL MTT solution was added. After incubation for 3 hours, the medium and the MTT solution were removed, and 200 ⁇ L of DMSO (dimethyl sulfoxide) was added thereto and mixed at room temperature for 30 minutes. The reaction mixture was measured for absorbance at 570 nm using a microplate reader (Sunrise-Basic Tecan, Austria), and cell viability was calculated according to Equation 1 below. The cell viability calculation results are shown in FIG. 4A.
  • the keratin peptide of the present invention was confirmed that no cytotoxicity up to a concentration of 100 ⁇ g / mL.
  • the keratin peptide of the present invention was dissolved in sterile water in human cultured dermal fibroblasts (human dermal fibroblast) at a concentration of 5, 10, 20 ⁇ g / mL. Treated. Subsequently, the cell proteins were recovered after culturing for 24 hours by irradiating ultraviolet B at 20 mJ / cm 2 using Vilber Lourmat (BioLink Crosslinker, France). At this time, the medium was removed prior to ultraviolet irradiation, washed with PBS (phosphate buffered saline) solution to remove serum components in the medium and irradiated with ultraviolet B.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the antibody was used by diluting the Matrix Metalloprotease-1 (MMP-1) monoclonal antibody (Neo Markers, Fremont, CA) in a TBS-T solution at a ratio of 1: 1,000, and reacted overnight at 4 ° C.
  • MMP-1 Matrix Metalloprotease-1
  • the keratin peptide of the present invention is not toxic to skin cells and has an excellent effect of inhibiting the expression of MMP-1 even under UV irradiation conditions, so it can be used in cosmetics or food compositions for the prevention, improvement and treatment of skin aging and wrinkles. It was confirmed that there is. In particular, it was confirmed that UVB can be used to improve skin aging and wrinkles.
  • ESI-Q-TOF Thermo (Dionex) UHPLC Ultimate 3000, ABsciex Triple TOF 5600+
  • KP7 GVPISS 558.3 21 KP7 SGGFGF 570.2 22 KP7 IQPSPV 639.4 23 KP7 GVPISSGG 672.3 24 KP7 SFPQNT 692.3
  • Enzo's MMP-1 Fluorometric Drug Discovery Kit was used to evaluate the inhibitory activity of MMP-1 (Matrix metalloproteinase-1) enzyme in the peptide synthesized in Example 3.
  • MMP-1 Mestrix metalloproteinase-1
  • NNGH N-Isobutyl-N- (4-methoxyphenylsulfonyl) glycyl hydroxamic acid
  • MMP-1 activity inhibitory evaluation results are shown in Figure 5A.
  • the synthetic peptides were present at 2n7-2, 2n7-4, 2n7-5, KP7-1, KP7-2, 2-1 and 2-2 compared to the MMP-1 enzyme alone treatment group at 10 ⁇ M It was confirmed that the MMP-1 enzyme activity was inhibited, and in particular, peptides 2n7-4, KP7-1, KP7-2, 2-1 and 2-2 have a significant inhibitory effect on MMP-1 activity.
  • MTT assay was performed in the same manner as in Example 2 using human dermal fibroblasts, and the experimental results are shown in FIG.
  • the synthetic peptide of the present invention was confirmed that no cytotoxicity up to a concentration of 100 ⁇ g / mL.
  • the synthetic peptides 2-1 and 2-2 were dissolved in DMSO in the human dermal fibroblasts cultured above, and treated at 10 ⁇ M. It carried out similarly to the method of Example 2. The results of measuring MMP-1 expression are shown in Figure 5C.

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Abstract

본 발명은 초저분자 케라틴 펩타이드의 제조 방법 및 그의 이용에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 케라틴을 포함하는 배지에서 케라틴 분해 활성을 갖는 미생물의 배양, 한외여과, 이온교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 이용한 초저분자 케라틴 펩타이드의 제조 방법, 상기 방법에 의하여 제조된 펩타이드 및 이를 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 화장료, 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 케라틴 펩타이드 제조 방법에 따르면 폐자원의 환경친화적인 생물학적 처리 및 항노화 기능성 초저분자 케라틴 펩타이드의 효율적인 정제 및 회수가 가능하다. 또한, 본 발명의 케라틴 펩타이드는 콜라겐을 분해하여 피부노화를 일으키는 효소인 MMP-1의 발현 저해능과 활성 저해능을 가지는 바, 피부노화 방지 및 피부주름 개선 효과가 우수하며, 피부 세포에 독성이 없어 피부노화, 피부주름의 예방, 개선 또는 치료용 화장료, 약학, 식품 조성물로 사용하기에 적합하여 고부가가치 기능성 화장품 소재의 효율적이고 신속한 제조 및 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

초저분자 케라틴 펩타이드의 제조 방법 및 그의 이용
본 발명은 초저분자 케라틴 펩타이드의 제조 방법 및 그의 이용에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 케라틴을 포함하는 배지에서 케라틴 분해 활성을 갖는 미생물의 배양, 한외여과, 이온교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 이용한 초저분자 케라틴 펩타이드의 제조 방법, 상기 방법에 의하여 제조된 펩타이드 및 이를 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 화장료, 식품 조성물에 관한 것이다.
남녀노소 모두 탄력있고 아름다운 피부에 대한 관심이 증가함에 따라 화장품 시장에서는 기존의 건강 중심의 화장품에서 아름다움에 대한 욕구를 만족시킬 수 있는 주름개선에 도움을 주는 기능성 소재의 발굴에 대한 관심이 증대되고 있다. 특히, 케라틴 펩타이드는 머리털·손톱·피부 등 상피구조의 기본을 형성하는 천연의 아미노산 중합체(아미노산 50개 이하)로서 생체 내 단백질과의 상호작용이 매우 우수하기 때문에 다양한 생리활성을 갖는다.
최근 화장품 제조기술의 평준화로 차별화된 천연성분을 함유한 신소재 개발이 화장품 산업에서 핵심적인 이슈이기에 천연소재인 케라틴 펩타이드의 기능성에 큰 관심이 집중되고 있다. 하지만 국내에서는 전량 수입되고 있는 기능성 펩타이드의 원료에 대한 가격 부담(1kg 당 2억~30억)으로 기능성 펩타이드 화장품 개발이 매우 더디며, 펩타이드가 함유되더라도 극소량에 불과한 경우가 대부분이다.
인간 또는 가축의 질병치료 목적으로 사용되는 의료용 펩타이드(백신포함)의 경우도 대부분이 극미량에도 불구하고 고가제품이다. 설령, 효능이 아주 우수한 펩타이드라도 크기가 대부분 15개 이상의 아미노산으로 이루어진 중합체(분자량 3 kDa이상)이기에 피부각질 투과성은 물론 세포내부로의 흡수가 용이하지 않다. 따라서 펩타이드 신소재 개발에 있어서 가장 핵심적인 요소는 1) 펩타이드의 효능, 2) 펩타이드의 크기(분자량), 3) 생산단가를 결정하는 선택적 분리 및 고순도 정제기술이다.
현재, 산업적으로 활용되는 저분자 펩타이드의 분리 및 제조를 위해 한외여과막에 의존하고 있으며, 고가의 의약용 펩타이드의 경우 복잡한 크로마토그래피 방법에 의해 순수 분리하여 사용되고 있다. 흔히, 합성 또는 재조합 방법에 의해 생산된 펩타이드 및 단백질과 같은 고분자 물질을 정제하기 위하여 소수성 상호작용을 이용한 역상 액체 크로마토그래피("RP-LC": reverse phase liquid chromatography) 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피("RP-HPLC": reverse phase high-performance liquid chromatography)가 대표적이다.
RP-LC 및 RP-HPLC 방법은 밀접하게 관련된 불순물을 효과적으로 분리할 수 있고 또 다수의 다양한 분자를 정제할 수 있으며, 특히 산업적 규모의 단백질 제조를 위한 대량정제공정으로 이용되고 있다. 특히, 역상 크로마토그래피 방법에서 펩타이드 단백질 정제를 위해 실리카 표면에 부착된 C-4, C-8 및 C-18 알킬 사슬을 매질로 가장 많이 사용되고 있다. 이러한 RP-LC법에서 정제의 핵심은 정지상의 수지 입자의 형상과 크기, 완충액 계, 유량, pH 등이다. 단백질 정제에서 이러한 기술적 개선에도 불구하고, 일부 정제된 단백질은 상당량의 불순물(가령, 반대이온을 갖는)이 여전히 존재한다. 특히, 의약용이 아닌 기능성 화장품 소재개발을 위해서는 이와 같은 고가의 장비를 활용한 분리방법은 경제성 및 생산성이 매우 낮기에 실질적인 산업으로의 적용에 그 한계가 있다. 따라서, 천연유래의 기능성 화장품 펩타이드 신소재의 개발을 위해서는 효능을 갖는 기능성 초저분자 펩타이드를 효율적으로 신속하게 얻을 수 있으며, 동시에 경제적이고 간단한 크로마토그래피 정제공정의 개발이 매우 필요하다.
이에 본 발명자들은 난분해성 케라틴 분해산물로부터 피부 항노화 효능을 지닌 기능성 케라틴 펩타이드의 회수, 분리공정을 개발하고, 피부각질층과 세포의 막을 전달시스템의 도움없이 효율적으로 자유롭게 투과할 수 있는 수준의 초저분자 펩타이드를 선택적으로 분리하는 정제공정을 개발하고자 예의 노력하였다.
따라서 본 발명의 일 양상은 케라틴을 포함하는 배지에서 케라틴 분해 활성을 갖는 미생물의 배양, 여과, 이온교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피 방법을 이용한 피부노화 또는 피부주름 예방용 케라틴 펩타이드의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 방법에 의하여 제조된 케라틴 펩타이드 혼합물 및 이를 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물, 식품 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 일 양상은 서열번호 1 내지 서열번호 9로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 서열로 표시되는 펩타이드 및 상기 펩타이드를 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물, 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은
(1) 케라틴을 포함하는 배지에서 케라틴 분해 활성을 갖는 미생물을 배양하여 케라틴 가수분해 산물을 얻는 단계;
(2) 상기 (1) 단계로부터 얻은 케라틴 가수분해 산물 중 100 Da 내지 1000 Da의 분자량을 갖는 단백질을 분획하는 단계;
(3) 상기 (2) 단계로부터 얻은 분획 산물에 대하여 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 또는 이의 조합을 수행하여 단백질을 정제하는 단계; 및
(4) 상기 (3) 단계로부터 얻은 정제된 단백질에 대하여 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 단백질을 정제 및 탈염하는 단계;를 포함하는, 피부노화 또는 피부주름 예방용 케라틴 펩타이드 혼합물의 제조 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 발명자는 난분해성 가금류 깃털을 영양원으로 첨가된 최소제한배지에서 초고온성 혐기발효를 통해, 케라틴 분해산물을 효과적으로 얻음으로써, 피부 항노화 효능을 지닌 케라틴 펩타이드를 다량으로 획득하였다. 또한, 깃털의 가수분해산물을 한외여과(ultrafiltration)를 사용한 분자량별 분획을 통하여 초저분자 (1 kDa이하) 케라틴 펩타이드를 다량 회수하였다. 또한, 이러한 초저분자 케라틴 펩타이드를 이온교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 분리 및 정제하였으며 더 나아가, 정제 단계를 간소화시켜 겔 여과 크로마토그래피 방법만을 이용하여 초저분자 케라틴 펩타이드를 분리 및 정제하였다. 또한 이러한 펩타이드가 세포독성을 나타내지 않으며, MMP-1의 활성 저해능과 발현 저해능이 있음을 확인하여, 항노화 기능성을 갖고 피부각질 투과성이 우수하므로 피부주름 또는 피부노화 예방 또는 개선에 활용할 수 있음을 확인하였다.
이하 본 발명의 단계에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명의 (1) 단계는 케라틴을 포함하는 배지에서 케라틴 분해 활성을 갖는 미생물을 배양하여 케라틴 가수분해 산물을 얻는 단계이다.
본 발명에서 '케라틴 분해 활성을 갖는 미생물'은 케라틴을 분해할 수 있는 활성을 갖는 미생물을 제한 없이 포함하는 것으로, 바람직하게는 초고온성 미생물일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 '초고온성 미생물'은 극한생물 (extremophile)의 일종으로 상대적으로 높은 온도, 즉 약 60℃ 이상에서 최적의 생육온도를 갖는 미생물을 의미하며, 그 종류를 제한하지 않는다. 바람직하게는 퍼비도박테리움 (Fervidobacterium) 속일 수 있다. 상기 퍼비도박테리움 속에는 아이슬란디쿰 (islandicum), 페니보란스 (pennivorans), 창바이쿰 (changbaicum), 곤드와넨스 (gondwanense) 종일 수 있다. 가장 바람직하게는 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰(Fervidobacterium islandicum) AW-1 (KCTC4680)이 이용될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 '케라틴(keratin)'은 구조단백의 일종으로 세포 골격을 이루는 주요 구성성분이다. 케라틴은 시스테인 함량에 따라 연성 케라틴(soft keratin)과 경성 케라틴(hard keratin)으로 구분된다. 연성 케라틴은 시스테인이 약 10~14%로 이황화물(disulfide) 결합이 많은 머리카락, 손톱, 양털, 닭깃털 등이다. 케라틴은 α-헬릭스(α-케라틴)나 β-쉬트(β-케라틴)의 구조가 서로 엉켜있어 단백질 사슬이 매우 단단하게 쌓여있으며, 폴리펩타이드 체인 사이에 수많은 이황화물 결합과 수소결합 및 소수성 상호작용이 존재하여 매우 안정하며, 단백질 분해 효소에 대한 저항성이 크다.
본 발명의 케라틴은 조류 또는 포유류의 깃털, 모발, 가죽, 손톱, 발톱, 뿔, 또는 발굽 유래인 것일 수 있다. 바람직하게는 조류의 깃털을 배지에 포함하여 이용할 수 있다.
상기 조류의 깃털은 배지에 5~15 g/L로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 8 g/L로 포함된다. 그 함량이 전술한 범위내로 포함될 경우 혐기배양을 통한 케라틴 펩타이드 생산이 1-2일 이내에 가능하며, 적절한 크기의 기능성 케라틴 펩타이드를 얻기에 있어 더욱 좋다.
상기 배양은 60 ℃ 이상의 고온 배양일 수 있다. 상기 배양 온도는 그 제한이 없으며, 바람직하게는 60 ℃ 내지 90 ℃일 수 있다.
상기 (1) 단계의 배양은 혐기배양일 수 있다. 상기 혐기배양의 방식은 제한이 없으나, 혐기정치배양일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 표 1의 조성을 가지는 생육배지에 질소원으로 닭털 8g/L를 첨가하고 70 ℃에서 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1을 혐기배양하여 얻어진 케라틴 펩타이드 가수분해산물을 여과하였다. 이어서 상기 여과한 케라틴 펩타이드 가수분해산물을 10,000×g 로 원심분리를 실시하여 균체를 침전시켜 회수하고, 여과한 후 상층액을 회수하였다.
본 발명의 (2) 단계는 상기 (1) 단계로부터 얻은 케라틴 가수분해 산물 중 100 Da 내지 1000 Da의 분자량을 갖는 단백질을 분획하는 단계이다.
상기 (2) 단계는 한외여과에 의하여 수행될 수 있고, 본 발명에서 한외여과를 위해 사용하는 한외여과막의 세공(pore) 크기는 10 kDa 내지 1 kDa일 수 있고, 바람직하게는 최종적으로 1 kDa의 여과막이 이용될 수 있다. 이와 같은 여과막을 사용함으로써 1 kDa 이하의 펩타이드가 남은 케라틴 펩타이드 분획 산물을 얻을 수 있다.
본 발명의 (3) 단계는 상기 (2) 단계로부터 얻은 분획 산물에 대하여 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 또는 이의 조합을 수행하여 단백질을 정제하는 단계이다.
상기 (2) 단계에서 여과되어 용출된 1 kDa 이하의 크기의 단백질 산물에 대하여 이온교환 크로마토그래피 또는 겔 여과 크로마토그래피, 또는 이의 조합을 수행하여 단백질을 정제한다.
상기 이온교환 크로마토그래피 (Ion Exchange Chromatography)는 교차결합된 폴리스티렌(cross-linked polystrene) 또는 덱스트란 (dextran)을 수지로 사용할 수 있다. 상기 수지의 비드 크기는 제한이 없으나 20 ㎛ 내지 100 ㎛ 바람직하게는 34 ㎛ 내지 50 ㎛일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 이온교환 크로마토그래피는,
a) 완충액 중의 50 mM 농도의 Tris-HCl (pH 7.5)에 의해 평형화된 아가로스 또는 덱스트란 기반 중합체 수지를 이온교환 크로마토그래피 컬럼에 충전시키는 단계;
b) 케라틴 펩타이드 시료를 분(minute)당 약 1 ml 이하의 유량으로 상기 컬럼상에 반입시키는 단계;
c) 상기 컬럼을 상기 a) 단계에서와 동일한 완충액으로 세척하는 단계; 및
d) 0 M 내지 1 M 농도의 식염(Sodium chloride)의 선형 구배를 실시함으로써 상기 컬럼으로부터 정제된 산물을 용출시키는 단계;를 포함한다.
완충액은 그 종류에 제한은 없으나, 바람직하게 Tris 용매가 이용될 수 있다. 또한, 완충액은 20 mM 내지 50 mM 농도를 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 겔 여과 크로마토그래피는,
a) 완충액 중의 0.1 몰 농도의 식염(Sodium chloride)에 의해 평형화된 아가로스 또는 덱스트란 기반 중합체 수지를 겔 여과 액체 크로마토그래피 컬럼에 충전시키는 단계;
b) 케라틴 펩타이드 시료를 분(minute)당 약 0.7 ml 이하의 유량으로 상기 컬럼상에 반입시키는 단계;
c) 상기 컬럼을 상기 a) 단계와 동일한 완충액으로 세척하는 단계; 및
d) 상기 a) 단계와 동일한 완충액으로 상기 컬럼으로부터 정제된 산물을 용출시키는 단계;를 포함한다.
완충액은 그 종류에 제한은 없으나, 바람직하게 Tris 용매가 이용될 수 있다. 또한, 완충액은 20 mM 내지 50 mM 몰농도를 가질수 있다.
본 발명의 (4) 단계는 상기 (3) 단계로부터 얻은 정제된 단백질에 대하여 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 단백질을 정제 및 탈염하는 단계이다.
본 발명의 구체적인 실시예에서
a) 완충액 중의 물(water)에 의해 평형화된 아가로스 또는 덱스트란 기반 중합체 수지를 겔여과 액체 크로마토그래피 컬럼에 충전시키는 단계;
b) 케라틴 펩타이드 시료를 분(minute)당 약 0.5 ml 이하의 유량으로 상기 컬럼상에 반입시키는 단계;
c) 상기 컬럼을 상기 a) 단계와 동일한 완충액으로 세척하는 단계; 및
d) 상기 a) 단계와 동일한 완충액으로 상기 컬럼으로부터 정제된 산물을 용출시키는 단계로 겔 여과 크로마토그래피를 실시하였다.
본 발명에서 '탈염'은 시료 중에 포함되어 있는 염류를 제거하는 것으로서, 그 방식에 제한은 없으나, 이온 교환법, 사이즈 배제 크로마토그래피, 투석 또는 겔 여과 액체 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서 시료 중에 포함되어 있을 염류의 완전한 제거를 위하여 최종적으로 물을 사용한 겔 여과 액체 크로마토그래피 방법을 사용하였다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 방법에 의하여 생산된, 케라틴 펩타이드 혼합물을 제공한다.
본 발명에서 케라틴 펩타이드 혼합물은 상기 방법에 의해서 얻어지는 케라틴 펩타이드의 집합 또는 이로부터 동정될 수 있는 1개 이상의 케라틴 펩타이드를 모두 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명에서 생산된 케라틴 펩타이드는 콜라겐을 분해하여 피부노화를 일으키는 효소인 MMP-1의 발현 저해능을 가지며, 세포 독성을 나타내지 않아 피부노화, 피부주름의 예방, 개선 또는 치료용 화장료, 약학, 식품 조성물로 사용하기에 적합하다.
특히, 본 발명의 케라틴 펩타이드는 분자량이 100 Da 내지 1000 Da 이하인 케라틴 펩타이드로, 초저분자 펩타이드이므로 피부각질 투과성이 우수한 특징이 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 케라틴 펩타이드 혼합물을 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 케라틴 펩타이드는 MMP-1의 발현 저해능을 가지므로 피부노화 또는 피부주름 예방 효과를 나타낸다.
본 발명의 케라틴 펩타이드는 MMP-1의 활성 저해능을 가지므로 피부노화 또는 피부주름 예방 효과를 나타낸다.
본 발명의 케라틴 펩타이드는 자외선에 의해 유발되는 피부노화 또는 피부주름을 예방하는 효과가 있다.
본 발명의 케라틴 펩타이드는 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001~50 중량%로 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 향료 등과 같은 통상적인 보조제 및 담체가 더 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물에는 글리세린, 부틸렌 글라이콜, 폴리옥시에칠렌 경화피마자유, 토코페릴 아세테이트, 시트릭산, 판테놀, 스쿠알란, 소듐 시트레이트, 알란토인 등의 보조성분이 추가로 더 포함될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 기본적으로 피부에 도포되는 것이므로, 당업계의 화장료 조성물을 참조하여 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 마스크팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 등이 포함될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄, 디메틸 에테르 등의 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로 용매, 용해화제, 유탁화제 등이 포함될 수 있고, 구체적으로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로 물, 에탄올, 프로필렌글리콜 등의 액상 희석제; 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 등의 현탁제; 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라칸트 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린유도체, 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 케라틴 펩타이드 화합물을 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 케라틴 펩타이드가 식품 첨가물로 사용될 경우, 상기 케라틴 펩타이드를 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 사용되는 등 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다.
또한 상기 유효성분인 케라틴 펩타이드의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 변경될 수 있음은 물론이며, 상기 케라틴 펩타이드는 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.001~50 중량%으로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적인 예로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 케라틴 펩타이드는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가되는 것이다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하여 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 양으로 첨가될 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 케라틴 펩타이드를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료, 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품 조성물이 음료로 제조될 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등의 추가 성분을 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등의 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐 등의 합성 감미제 등이 사용될 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01~10 중량%, 바람직하게는 0.01~0.1 중량%로 포함되는 것이다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기의 첨가제 비율은 크게 제한되지는 않으나, 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01~0.1 중량% 범위내로 포함되는 것이 좋다.
또한, 본 발명은 상기 케라틴 펩타이드 혼합물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 치료용 약학 조성물에 포함되는 케라틴 펩타이드의 함량은, 치료제의 사용방법, 복용자의 상태, 질환의 종류 및 중증 정도에 따라 적절히 조절할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에서 케라틴 펩타이드는 0.001~50 중량%로 포함되는 것이 바람직하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명은 약학 조성물은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양, 즉 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양인 치료상 유효량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학 조성물은 1~10,000 ㎎/㎏/day, 바람직하게는 1~200 ㎎/㎏/day 내지 의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회에 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 서열번호 1 내지 서열번호 9로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 서열로 표시되는 펩타이드를 제공한다.
상기 서열번호 1 내지 서열번호 9로 표시되는 펩타이드는 본 발명의 케라틴 펩타이드 제조 방법에 의하여 제조한, 항노화능을 갖는 케라틴 펩타이드에 대해 LC-MS/MS 방법을 통해 동정하여 합성된 아미노산 서열이다. 상기 펩타이드는 보다 구체적으로는 타깃 물질인 케라틴의 서열과 이를 분해할 수 있는 균주, 예컨대 AW-1 균주의 케라틴 분해 프로테아제 및 펩타이드의 절단 부위를 기반으로 구축된 데이터 베이스를 이용하여 얻어질 수 있으며, 상기 데이터 베이스에서 LC/MS-MS 방법을 수행하여 펩타이드를 동정함으로써 얻어지는 서열을 기초로 당 분야의 통상의 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 상기 펩타이드는 1 kDa 이하의 초저분자량을 가지며, 자외선 B에 의해 유도된 MMP-1의 발현을 억제하는 효과 및 MMP-1의 활성을 억제하는 효과를 나타내므로 피부노화 또는 피부주름을 예방 또는 개선하는데 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 서열번호 1 내지 서열번호 9로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 서열로 표시되는 펩타이드를 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 서열번호 1 내지 서열번호 9로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 서열로 표시되는 펩타이드를 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 케라틴 펩타이드 제조 방법에 따르면 폐자원의 환경친화적인 생물학적 처리 및 항노화 기능성 초저분자 케라틴 펩타이드의 효율적인 정제 및 회수가 가능하다. 또한, 본 발명의 케라틴 펩타이드는 콜라겐을 분해하여 피부노화를 일으키는 효소인 MMP-1의 발현 저해능과 활성 저해능을 가지는 바, 피부노화 방지 및 피부주름 개선 효과가 우수하며, 피부 세포에 독성이 없어 피부노화, 피부주름의 예방, 개선 또는 치료용 화장료, 약학, 식품 조성물로 사용하기에 적합하여 고부가가치 기능성 화장품 소재의 효율적이고 신속한 제조 및 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 케라틴 펩타이드 제조 방법의 개략도이다.
도 2는 1 kDa 이하의 케라틴 펩타이드의 이온교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피의 분획 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 1 kDa 이하 케라틴 펩타이드의 겔 여과 크로마토그래피 방법을 이용한 분획 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 초케라틴 펩타이드의 인간 피부 섬유아세포에서의 독성 시험 (A) 및 인간 피부 섬유아세포에서 자외선 B (UVB)로 유도된 MMP-1의 발현 억제 효과를 측정한 결과 (B)를 나타낸 도이다. 레인 1은 무처리 대조군, 레인 2는 자외선 B (UVB) 20 mJ/cm2 단독 처리군, 레인 3, 4, 5, 6, 7, 8은 자외선 B(UVB) 20 mJ/cm2 와 함께 본 발명의 케라틴 펩타이드 혼합물(No. 2, KP7)을 5, 10, 20 μg/mL로 처리한 실험군이다.
도 5는 표 3의 합성 케라틴 펩타이드의 MMP-1 활성 억제 시험 (A), 인간 피부 섬유아세포에서의 독성 시험 (B) 및 인간 피부 섬유아세포에서 자외선 B(UVB)로 유도된 MMP-1의 발현 억제 효과를 측정한 결과 (C)를 나타낸 도이다. 레인 1은 무처리 대조군, 레인 2는 자외선(UVB) 20 mJ/cm2 단독 처리군, 레인 3, 4는 자외선 B(UVB) 20 mJ/cm2 와 함께 합성 케라틴 펩타이드를 10 μM로 처리한 실험군이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 케라틴 펩타이드 제조
1.1 배양 및 케라틴 가수분해산물의 제조
케라틴 펩타이드 혼합물의 제조를 위해 닭털 분해 균주인 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰(Fervidobacterium islandicum) AW-1(KCTC4680)을 하기 표 1과 같이 질소원으로 닭털이 첨가된 생육배지 내 70℃에서 혐기배양하여 케라틴 가수분해산물을 얻었다.
배지성분 첨가량(g/L)
NH4Cl 0.1
NaH2PO4·2H2O 0.9
MgSO4·7H2O 0.16
K2HPO4 1.6
Vitamin solution(DSM 141 ) 10 ml
Trace element solution (DSM 141) 10 ml
0.1% Resazurin 1 ml
효모 추출물 1.0
닭털 8.0
Na2S (25%, w/v) 3 ml
이후, 상기 케라틴 가수분해산물을 여과지(5 ㎛, No.20, Hyundai Micro, Korea)를 사용해 분해된 닭털 찌꺼기를 일차적으로 걸러 낸 후, 4 ℃에서 20분간 10,000×g으로 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액을 시료로 기능성 초저분자 케라틴 펩타이드 분리 및 정제과정에 사용하였다.
1.2 케라틴 가수분해산물의 정제
상기 시료로부터 1 kDa 이하 초저분자 케라틴 펩타이드를 간편하게 분획하기 위해 한외여과법 (Ultrafiltration)을 사용하였다. 한외여과에는 여과 멤브레인으로 10 kDa 및 1 kDa의 세공(pore) 크기를 가지는 멤브레인을 사용하였다. 구체적으로, 시료를 여과 멤브레인이 구비된 여과 모듈로 유입시키고, 약 10~30 psi의 압력을 가하여 시료가 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되도록 하였다. 먼저 10 kDa의 한외여과막을 사용하여 10 kDa 이상의 단백질을 분리하였고 여과모듈로부터 유출된 10 kDa 이하의 단백질 시료에 대해 1 kDa의 한외여과막을 사용하여 1 kDa 이상의 시료와 1 kDa 이하의 시료로 분획하였다.
분획한 1 kDa 이하 케라틴 펩타이드 시료에 대해 두 가지 방법으로 케라틴 펩타이드를 정제하였다: i) 이온교환 크로마토그래피를 통한 정제. 상기 분획한 시료를 Biologic duo-flow FPLC system (Bio-rad), Macro-prep DEAE support (Bio-Rad)를 이용한 이온교환 크로마토그래피를 통해 이온성에 따라 분리·정제를 수행(50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, 0 M-1 M NaCl)하였으며 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 210 nm 측정 시 두 개의 피크(peak)를 확인하였으며 상대적으로 양이온성이 강한 Fr. 4-47을 풀링(pooling)한 후 동결건조를 수행하였다. 동결건조한 상기 시료에 대하여 탈염 및 분자량에 따른 분리를 위하여 Bio-rad biologic duo-flow FPLC system, superdex 30 pg (GE)를 사용하여 겔 여과 크로마토그래피를 수행(20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.0, 100 mM NaCl)하였으며 210 nm 측정 시 네 개의 피크를 확인하였고 표준물질과 비교하여 케라틴 펩타이드를 포함할 것으로 예상된 Fr. 16-29을 풀링한 후 동결건조를 수행하였다. 이하 상기 방법에 의하여 얻은 케라틴 펩타이드를 “No. 2”로 지칭한다;
ii) 겔 여과 크로마토그래피를 이용한 정제. 상기 분획한 시료에 대해 상기 i)에 기재된 것과 동일한 방법으로 겔 여과 크로마토그래피를 수행하였다. 수행 결과를 도 3에 나타내었으며, 도 3에 나타낸 바와 같이 Fr. 17-26을 풀링한 후 동결건조를 수행하였다. 이하 상기 방법에 의하여 얻은 케라틴 펩타이드를 “KP7”로 지칭한다.
크로마토그래피 수행 시 단백질 및 펩타이드의 양을 측정하기 위해 280nm 및 210 nm로 시료의 흡광도를 측정하였다.
이와 같이 최종적으로 분리 및 정제된 No. 2, KP7 시료의 탈염 및 분자량 확인을 위하여, Superdex peptide 10/300 GL (GE)를 이용하여 겔 여과 크로마토그래피를 수행하였으며 1 kDa이하의 분자량을 지닌 초저분자 케라틴 펩타이드임을 확인한 후 (도 2 및 도 3), 하기의 실시예에 사용하였다.
실시예 2. 케라틴 펩타이드의 인간 피부 섬유아세포에서의 세포독성 검사 및 자외선 B에 의해 유도된 MMP-1의 발현 억제 효과
상기 실시예 1의 방법을 통해 제조된 케라틴 펩타이드의 세포독성을 검사하기 위해 인간 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)를 이용하여 MTT 분석법을 수행하였다.
먼저, 인간 섬유아세포를 5×103 cell/well이 되도록 96-웰 플레이트에 분주하고 각각 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum;FBS)과 페니실린-스트렙토마이신 (GIBCO® Invitrogen, Auckland, NZ)을 함유하고 있는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)이 혼합된 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2의 조건 하에서 6시간 동안 배양하였다. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) 분말 200 mg을 PBS 40 mL에 녹인 후 여과하여 5 mg/mL의 MTT 용액을 준비하였다. 분주 6시간 후, 제조된 케라틴 펩타이드를 포함된 배지를 첨가하고, 72시간 후 5 mg/mL의 MTT 용액을 20 μl씩 첨가하였다. 3 시간 동안 배양 한 후 배지와 MTT 용액을 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 200 μL씩 넣어 실온에서 30분간 혼합시켰다. 반응혼합물을 마이크로 플레이트 리터(microplate reader; Sunrise-Basic Tecan, Austria)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였고, 하기의 수학식 1에 따라 세포생존률을 계산하였다. 세포생존률 계산 결과를 도 4A에 나타내었다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2016012410-appb-I000001
도 4A 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 케라틴 펩타이드는 100 μg/mL 의 농도까지 세포독성이 나타나지 않음을 확인하였다.
또한, 세포에서 MMP-1의 발현 수준을 측정하기 위해 상기 배양한 인간 유래의 피부 섬유아세포 (human dermal fibroblast)에 본 발명의 케라틴 펩타이드를 멸균수에 용해하여 5, 10, 20 μg/mL농도로 처리하였다. 그 다음, Vilber Lourmat (BioLink Crosslinker, France)를 이용하여 20 mJ/cm2로 자외선 B를 조사하여 24시간 동안 배양한 후 세포 단백질을 회수하였다. 이때, 자외선 조사에 앞서 배지를 제거한 후 PBS (phosphate buffered saline) 용액으로 세척하여 배지 내 혈청 성분을 제거한 후 자외선 B를 조사하였다. 단백질을 회수하기 위해 PBS 용액으로 2회 세척한 후, 세포용해액 (lysis buffer)을 이용하여 바닥에 부착된 세포를 회수하여 14,000 rpm에서 10분 동안 원심분리를 수행하였다. 각각의 상층액을 회수한 후, 각 세포 상층액의 단백질 농도를 BSA (bovine serum albumin)를 표준물질로 사용하여 단백질 어세이 키트 (protein assay kit, Bio-Rad, USA)로 그 사용방법에 따라 정량하였다. 각각의 단백질 추출물들로부터 약 10mg에 해당하는 단백질을 8% SDS-PAGE (gel sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis)겔로 변성 분리하여 PVDF 막 (Polyvinylidene fluoride membrane)에 120 mA로 2시간 동안 전이시켰다. 그 후 5% 스킴 밀크 (skim milk)를 함유한 TBS-T 용액에 담궈 6시간 동안 반응시켜 비특이적인 단백질들에 대한 블록킹 (blocking)을 실시하고 증류수로 1회, TBS-T로 2회 각각 세척하였다. 이때, 항체로는 Matrix Metalloprotease-1 (MMP-1) 모노클론 항체 (Neo Markers, Fremont, CA)를 TBS-T용액에 1:1,000의 비율로 희석하여 사용하였으며, 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 후 TBS-T로 15분씩 2회 세척하여 HRP (horseradishperoxidase)가 결합된 anti-rabbit IgG (Santacruz, USA)를 1:5,000의 비율로 희석하여 2차 항체로 사용하였으며, 상온에서 1시간 30분 동안 반응하였다. 반응이 끝난 후, TBS-T로 5분간 4회 세척하여 ECL 기질 (Amersham TM, UK)과 5분 동안 반응시킨 후 X-ray 필름에 감광시켜 각 세포의 세포노화 관련 단백질의 발현 변화를 분석하였다. 상기 실험 결과를 도 4B에 나타내었다.
도 4B에 나타낸 바와 같이, No.2를 10 μg/mL 농도 이상, KP7을 5 μg/mL 농도 이상으로 처리하였을 때 UVB 단독 처리군 대비 MMP-1의 발현을 유의적으로 억제하였음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 케라틴 펩타이드는 피부 세포에 독성이 없고 자외선 조사 조건에서도 MMP-1의 발현을 억제시키는 우수한 효과가 있으므로 피부노화 및 피부주름에 대한 예방, 개선 및 치료용 화장료 또는 식품 조성물에 사용할 수 있음을 확인하였다. 특히 UVB에 의한 피부노화 및 피부주름의 개선에 사용할 수 있음을 확인하였다.
또한, 기존 특허 (출원번호: 10-2014-0092000)에서는 1kDa 이하 케라틴 펩타이드를 200, 400 μg/ml 농도로 각각 처리한 군에서는 UVB 단독 처리군 대비 약 12%, 41%의 MMP-1의 발현 억제 효능을 나타내었으나, 이전과 비교하여 No.2, KP7이 MMP-1의 발현을 더 낮은 농도에서 억제함을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 실시예 1을 이용한 초저분자 케라틴 펩타이드의 정제방법으로 제조된 케라틴 펩타이드가 피부노화 및 피부주름에 대한 예방, 개선 및 치료 효과가 높음을 나타낸다.
실시예 3. 케라틴 펩타이드의 아미노산 서열 동정 및 합성
상기와 같이 항노화능 및 주름개선능이 확인된 No. 2, KP7 시료 중 이와 같은 활성을 보이는 케라틴 펩타이드의 아미노산 서열을 규명하기 위하여 LC-MS/MS 방법을 이용한 펩타이드 동정을 수행하였다.
구체적으로, 케라틴 펩타이드 맵핑(mapping)을 위한 데이터베이스 구축을 위하여 Genbank로부터 닭 (Gallus gallus ver. 5.0)의 깃털 케라틴 서열(feather keratin sequence)을 획득하였고 AW-1 균주의 전사체 분석을 통하여 닭털 분해에 관여하는 프로테아제의 선정 및 펩타이드 절단 부위를 확인하였으며 이를 기반으로 LC-MS/MS 결과 분석을 위한 데이터베이스를 구축하였다. 질량분석기기로는 ESI-Q-TOF (Thermo (Dionex) UHPLC Ultimate 3000, ABsciex Triple TOF 5600+)를 이용하였으며 상기 방법을 통해 분리, 정제 및 항노화능이 평가된 케라틴 펩타이드의 동정을 수행하여 1 kDa 이하(최소 445.3 Da 내지 최대 710.3 Da)의 분자량을 가지는 초저분자 펩타이드로써 No. 2 유래 16종, KP7 유래 8종을 규명하고 하기 표 2에 나타내었다.
No. 시료 서열 이론적 분자량
1 No. 2, KP7 GGFGL 449.2
2 No. 2 GGFGI 449.2
3 No. 2 FGGFG 483.2
4 No. 2 GFGGF 483.2
5 No. 2 GPTPL 483.3
6 No. 2 GLGSR 488.3
7 No. 2 PISGGF 576.3
8 No. 2 SFPQN 591.3
9 No. 2 GGFGGFG 597.3
10 No. 2 FPQNT 605.3
11 No. 2 SSGGFGI 623.3
12 No. 2 SSGGFGL 623.3
13 No. 2 SGGFGGF 627.3
14 No. 2 GFGGFGL 653.3
15 No. 2 PISSGGF 663.3
16 No. 2 GGFGGFGL 710.3
17 KP7 GLSGL 445.3
18 KP7 SGGFGI 536.3
19 KP7 GGFGGF 540.2
20 KP7 GVPISS 558.3
21 KP7 SGGFGF 570.2
22 KP7 IQPSPV 639.4
23 KP7 GVPISSGG 672.3
24 KP7 SFPQNT 692.3
또한, 항노화능을 갖는 펩타이드 서열을 규명하기 위하여 펩타이드 동정 결과를 바탕으로 9종의 펩타이드를 하기 표 3과 같이 합성하였다.
No. 명칭 서열
1 2n7-1 SGGFG
2 2n7-2 PISS
3 2n7-3 GGFGGFGI
4 2n7-4 GFGGF
5 2n7-5 FPQN
6 KP7-1 GLSGL
7 KP7-2 IQPSPV
8 2-1 GPTPL
9 2-2 GLGSR
실시예 4. 합성 펩타이드의 시험관 내 분석법인 MMP-1 효소 활성 저해 평가,
상기 실시예 3에서 합성한 펩타이드에서 MMP-1 (Matrix metalloproteinase-1) 효소의 활성 억제능을 평가하기 위해 Enzo사의 MMP-1 Fluorometric Drug Discovery Kit를 사용하였다. 양성 대조군으로는 MMP-1 활성을 저해 하는 것으로 알려진 NNGH (N-Isobutyl-N-(4-methoxyphenylsulfonyl)glycyl hydroxamic acid)를 사용하였으며 NNGH는 0.65 μM 농도로 처리하였다. 시료첨가군으로는 MMP-1 효소와 케라틴 펩타이드를 1, 5, 10 μg/mL 로 섞은 혼합액을 37°C에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 반응 혼합물에 기질을 넣어주고 Ex/Em=540/590 nm에서 형광을 측정하였고, 하기의 수학식1에 따라 MMP-1 활성 억제능을 평가하였다. MMP-1 활성 억제능 평가 결과를 도 5A에 나타내었다.
[수학식 2]
Figure PCTKR2016012410-appb-I000002
도 5A에 나타낸 바와 같이, 합성 펩타이드는 10 μM 농도에서 MMP-1 효소 단독 처리군 대비 2n7-2, 2n7-4, 2n7-5, KP7-1, KP7-2, 2-1 및 2-2에서 MMP-1 효소 활성을 억제하였음을 확인하였고, 특히 펩타이드 2n7-4, KP7-1, KP7-2, 2-1 및 2-2가 유의적인 MMP-1 활성 억제 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 5. 인간 섬유아세포에서의 세포독성 검사 및 자외선 B에 의해 유도된 MMP -1의 발현 억제 효과
상기 실시예 3에서 합성한 펩타이드들의 세포독성을 검사하기 위해 인간 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast를 이용하여 MTT 분석법을 상기 실시예 2의 방법과 동일하게 수행하였다. 실험 결과를 도 5B에 나타내었다.
도 5B에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 합성 펩타이드는 100 μg/mL 의 농도까지 세포독성이 나타나지 않음을 확인하였다.
또한, 세포에서 MMP-1의 발현을 측정하기 위해 상기 배양한 인간 유래의 피부 섬유아세포 (human dermal fibroblast)에 합성 펩타이드 2-1과 2-2를 DMSO에 용해하여 10 μM 농도로 처리하고 상기 실시예 2의 방법과 동일하게 수행하였다. MMP-1 발현을 측정한 결과를 도 5C에 나타내었다.
도 5C에 나타낸 바와 같이, 합성 펩타이드 2-1, 2-2를 10 μM 농도로 처리하였을 때 UVB 단독 처리군 대비 MMP-1의 발현을 약 24% 및 35% 억제하였음을 확인하였다.
Figure PCTKR2016012410-appb-I000003
Figure PCTKR2016012410-appb-I000004

Claims (14)

  1. (1) 케라틴을 포함하는 배지에서 케라틴 분해 활성을 갖는 미생물을 배양하여 케라틴 가수분해 산물을 얻는 단계;
    (2) 상기 (1) 단계로부터 얻은 케라틴 가수분해 산물 중 100 Da 내지 1000 Da의 분자량을 갖는 단백질을 분획하는 단계;
    (3) 상기 (2) 단계로부터 얻은 분획 산물에 대하여 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 또는 이의 조합을 수행하여 단백질을 정제하는 단계; 및
    (4) 상기 (3) 단계로부터 얻은 정제된 단백질에 대하여 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 단백질을 정제 및 탈염하는 단계;를 포함하는, 피부노화 또는 피부주름 예방용 케라틴 펩타이드 혼합물의 제조 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 (1) 단계의 미생물은 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰(Fervidobacterium islandicum) AW-1(KCTC4680)인, 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 (1) 단계의 케라틴은 조류 또는 포유류의 깃털, 모발, 가죽, 손톱, 발톱, 뿔, 또는 발굽 유래인, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 (1) 단계의 배양은 60 내지 90 ℃의 온도 조건 하에서 수행되는 혐기 배양인, 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 (2) 단계의 분획은 한외여과에 의한 것인, 방법.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 방법에 의하여 생산된, 케라틴 펩타이드 혼합물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 케라틴 펩타이드는 분자량이 100 Da 내지 1000 Da 이하인 것인, 케라틴 펩타이드 혼합물.
  8. 청구항 6의 케라틴 펩타이드 혼합물을 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 피부노화 또는 피부주름은 자외선에 의해 유발되는 것인, 화장료 조성물.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 케라틴 펩타이드는 MMP-1 (Matrix metalloproteinase-1) 발현 저해능 또는 활성 저해능을 갖는 것인, 화장료 조성물.
  11. 청구항 6의 케라틴 펩타이드 혼합물을 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  12. 서열번호 1 내지 서열번호 9로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 서열로 표시되는, 펩타이드.
  13. 청구항 12의 펩타이드를 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  14. 청구항 12의 펩타이드를 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017049361A (ja) * 2015-08-31 2017-03-09 日東電工株式会社 光学補償層付偏光板およびそれを用いた有機ｅｌパネル

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0665044A (ja) * 1992-08-17 1994-03-08 Kose Corp 皮膚外用剤
JP2008247925A (ja) * 2004-03-31 2008-10-16 Nokodai Tlo Kk 可溶化ケラチンの製造方法
JP2010155859A (ja) * 2002-01-28 2010-07-15 Keraplast Technologies Ltd 生物活性ケラチンタンパク質
WO2014140176A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Vaccibody As Targeting vaccines for veterinary use

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0665044A (ja) * 1992-08-17 1994-03-08 Kose Corp 皮膚外用剤
JP2010155859A (ja) * 2002-01-28 2010-07-15 Keraplast Technologies Ltd 生物活性ケラチンタンパク質
JP2008247925A (ja) * 2004-03-31 2008-10-16 Nokodai Tlo Kk 可溶化ケラチンの製造方法
WO2014140176A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Vaccibody As Targeting vaccines for veterinary use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NAM ET AL.: "Native-feather Degradation by Fervidobacterium Island icum AW-1, a Newly Isolated Keratinase-producing Thermophilic Anaerobe", ARCHIVES OF MICROBIOLOGY, vol. 178, 2002, pages 538 - 547, XP055089077 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017049361A (ja) * 2015-08-31 2017-03-09 日東電工株式会社 光学補償層付偏光板およびそれを用いた有機ｅｌパネル
US10816708B2 (en) 2015-08-31 2020-10-27 Nitto Denko Corporation Polarizing plate having optical compensation layer, and organic EL panel using same

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