KR101617197B1

KR101617197B1 - 피부노화 또는 피부주름 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101617197B1
Application number: KR1020140092000A
Authority: KR
Inventors: 이동우; 강남주; 이용직; 박상희
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2014-07-21
Filing date: 2014-07-21
Publication date: 2016-05-03
Also published as: KR20160011297A

Abstract

본 발명은 피부노화 또는 피부주름 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰(Fervidobacterium islandicum) AW-1을 배양하여 얻어진 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 포함하여 피부노화를 일으키는 중요한 효소인 MMP-1의 발현을 억제하여 피부 콜라겐 분해를 저해함으로써 피부노화를 방지하거나 피부주름을 개선하는 효과가 우수한 피부노화 또는 피부주름 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

피부노화 또는 피부주름 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for treating, improving or preventing of anti-skin aging and wrinkle}

본 발명은 피부노화 또는 피부주름 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰(Fervidobacterium islandicum) AW-1을 배양하여 얻어진 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

피부는 신체 외부를 덮고 있는 하나의 막으로, 여러 가지 환경요소로부터 신체를 보호하는 동시에 외적으로 비추어지는 미적기능을 담당한다. 이러한 피부는 노화가 진행됨에 따라 피부면역기능이 저하될 뿐만 아니라 피부탄력 감소, 피부색 변화, 피부주름 형성 등의 외형적인 변형 또한 함께 수반된다. 이러한 피부 노화 과정은 내인성 노화와 외인성 노화로 분류될 수 있다. 내인성 노화는 나이가 들어감에 따라 자연적으로 일어나는 자연 노화로, 주로 유전적 요인에 의해 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 어려운 반면, 외인성 노화의 경우 자외선과 같은 환경적 요인에 의해 영향을 받으므로 인위적인 조절을 통한 예방이 가능하다고 할 수 있겠다. 따라서 외인성 노화를 중심으로 피부노화 예방 및 치료를 위한 기능성 소재 발굴 연구가 활발히 이루어지고 있다.

외인성 노화를 일으키는 환경적 요인에는 자외선 노출, 대기오염, 스트레스 등이 있으며, 이러한 유해환경으로부터 산화적 스트레스에 계속하여 노출이 되면 체내의 활성산소(oxygen free radical)가 증가되고, 진피의 결합조직인 콜라겐, 엘라스틴, 히아루론산 등이 파괴되어 주름이 생성된다. 특히, 이러한 요인들 중 외인성 노화를 일으키는 가장 주요한 요인은 반복적인 자외선의 노출로 자외선(UV)은 320~400㎚ 파장의 자외선 A(UVA)와 290~320㎚ 파장의 자외선 B(UVB), 200~290㎚ 파장의 자외선 C(UVC)로 분류되며, 이 중 자외선 B(UVB)가 피부에 가장 많은 영향을 주어 광노화를 일으키는 것으로 보고되고 있다.

콜라겐은 피부를 구성하고 있는 주요한 성분으로 이 중 typeⅠ 콜라겐이 80%, type Ⅲ 콜라겐이 15%를 차지하고 있다. 자외선에 피부가 장시간 노출될 경우 피부 내 활성산소가 다량 생성되고, 이로 인해 기질 금속단백질분해효소(matrix metalloproteinases, MMPs)들 중에서 콜라겐을 분해하는 효소인 MMP-1(matrix metalloproteinase-1)의 발현 또는 활성이 촉진되어 콜라겐 합성이 저하되며, 결국 이로 인해 피부 탄력이 감소하고 주름이 생성된다. 따라서, 피부노화 예방 및 치료를 위한 신소재를 발굴하는데 있어 MMP-1의 발현 및 활성을 억제하고 콜라겐 합성을 촉진시키는 물질을 찾는 것이 좋은 전략이 될 수 있다.

현재 피부 노화 예방 및 치료제로 사용되고 있는 레티노인산은 지용성의 물성으로 인하여 피부 흡수력이 미약하여 콜라겐 합성의 증진기능 및 엘라스틴 분해 방지효과를 크게 기대하기 어렵고 자극성이 있으며, 또한 생체 내에서의 빠른 효소분해로 인해 안정성 문제가 대두되고 있다. 따라서 외피로부터의 흡수력이 우수하며 생체 내에서의 세포 재생 기능이 극대화되고, 안정성이 향상된 새로운 피부 노화 예방 및 치료제의 개발이 요구되고 있다.

한편, 최근에는 노화예방 기능성 성분으로 펩타이드가 주목받고 있다. 펩타이드는 화장품, 식료품, 의약품 등 여러 연구영역에서 주목받는 소재이다. 펩타이드는 20개의 필수 아미노산 약 2~50개가 아미드 결합(amide bond)을 통해 연결되어 있는 중합체로서 단백질보다 그 크기와 구조는 단순하나 생체 내 단백질과의 상호작용이 매우 커 생체 내 대사과정 등에서 중요한 역할을 하고 있다고 알려져 있다. 따라서, 펩타이드는 그 자체가 생체물질일 뿐만 아니라 생체 내에 유입되어 일정 기간 활성을 띈 다음 아미노산으로 분해되기 때문에 보다 안전성이 뛰어나고, 단백질의 구성 성분으로 피부 재생 활성에 도움을 준다.

국내공개특허 제10-2012-0012904호

상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명은 콜라겐 분해하는 효소인 MMP-1의 발현 저해능을 가지는 피부노화 또는 피부주름 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 피부노화를 일으키는 중요한 효소인 MMP-1의 발현을 억제하여 피부노화 방지 및 피부주름 개선 효과가 뛰어나며, 세포 독성이 없는 피부노화 또는 피부주름 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 케라틴 펩타이드는 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰(Fervidobacterium islandicum) AW-1을 배양하여 얻어진 것이 바람직하다.

또한 상기 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1은 닭털을 포함하는 배지에서 배양되는 것이 좋다.

상기 케라틴 펩타이드는 분자량이 1kDa 미만인 케라틴 펩타이드, 분자량이 1~10kDa인 케라틴 펩타이드, 분자량이 10kDa를 초과하는 케라틴 펩타이드 등을 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.

상기 케라틴 펩타이드는 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001~50중량%로 포함되는 것이 바람직하다.

상기 케라틴 펩타이드는 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1) 발현 저해능을 갖는다.

또한 본 발명은 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면 콜라겐 분해하여 피부노화를 일으키는 효소인 MMP-1의 발현 저해능을 가져 피부노화 방지 및 피부주름 개선 효과가 우수하며, 피부 세포에 독성이 없어 피부노화, 피부주름의 예방, 개선 또는 치료용 화장료, 약학, 식품 조성물로 사용하기에 적합하다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰(Fervidobacterium islandicum) AW-1을 이용하여 케라틴 펩타이드를 분리하는 과정을 도시한 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제조한 케라틴 펩타이드의 단백질 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 제조한 케라틴 펩타이드의 사람 유래 피부 각질세포에서의 세포 생존률을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 제조한 분자량이 1kDa 미만인 케라틴 펩타이드의 사람 유래 피부 각질세포에서 자외선 B에 의해 유도된 MMP-1의 발현 억제율을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 제조한 분자량이 1~10kDa인 케라틴 펩타이드의 사람 유래 피부 각질세포에서 자외선 B에 의해 유도된 MMP-1의 발현 억제율을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제조한 분자량이 10kDa를 초과하는 케라틴 펩타이드의 사람 유래 피부 각질세포에서 자외선 B에 의해 유도된 MMP-1의 발현 억제율을 나타낸 도이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 안전하고 독성이 없는 천연물로부터 피부노화를 예방, 치료할 수 있는 기능성 소재를 찾던 중, 케라틴 펩타이드가 피부 세포에 독성을 나타내지 않으면서 피부노화 및 주름방지에 우수한 효과를 나타냄을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

이러한 본 발명은 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 케라틴 펩타이드는 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰(Fervidobacterium islandicum) AW-1을 배양하여 얻을 수 있다.

상기 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰(Fervidobacterium islandicum) AW-1(KFCC 11115)은 극한성 미생물로, 40~80℃의 고온에서 생육되는 고도호열성 균이며, 닭깃털, 모발 등을 분해하는 효소를 생산하다.

상기 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1은 질소원으로 닭털을 포함하는 생육배지에서 배양하여 얻을 수 있다.

닭털은 닭의 총중량의 5~7%를 차지하는 절연체로서, 90% 이상이 자연계에 가장 풍부한 불용성 단백질인 케라틴(keratin)으로 구성되어 있다. 케라틴은 시스테인 함량에 따라 연성 케라틴(soft keratin)과 경성 케라틴(hard keratin)으로 구분되며, 연성 케라틴은 시스테인이 약 10~14%로 이황화물(disulfide) 결합이 많은 머리카락, 손톱, 양털, 닭깃털 등이다. 케라틴은 α-헬릭스(α-케라틴)나 β-쉬트(β-케라틴)의 구조가 서로 엉켜있어 단백질 사슬이 매우 단단하게 쌓여있으며, 폴리펩타이드 체인 사이에 수많은 이황화물 결합과 수소결합 및 소수성 상호작용이 존재하여 매우 안정하며, 단백질 분해 효소에 대한 저항성이 크다. 따라서, 본 발명에서는 닭털로부터 케라틴 펩타이드를 분리하기 위하여 질소원으로 닭털을 포함하는 배지를 이용하여 배양하는 것이 좋다.

상기 질소원인 닭털은 배지에 5~15g/L로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 8g/L로 포함되는 것이다. 그 함량이 전술한 범위내로 포함될 경우 혐기배양을 통한 케라틴 펩타이드 생산이 1~2일 이내에 가능하게 되며, 적절한 크기의 기능성 케라틴 펩타이드를 얻는데 있어 더욱 좋다.

구체적으로, 하기 표 1의 조성을 가지는 생육배지에 질소원으로 닭털 5~15g/L, 바람직하게는 8g/L를 첨가하고 70℃에서 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1을 혐기발효배양하여 얻어진 배양상등액을 여과한다. 이어서 상기 여과한 배양상등액을 10,000×g로 원심분리를 실시하여 균체를 침전시켜 회수하고, 여과한 후 농축하여 분자량이 서로 다른 케라틴 펩타이드를 얻을 수 있다. 또한 필요에 따라 침전 또는 여과를 반복실시할 수도 있다.

배지성분	첨가량(g/L)
NaCl	2.0
CaCl₂ㅇ2H₂O	0.5
MgSO₄ㅇ7H₂O	0.5
MgCl₂ㅇ6H₂O	0.5
KH₂PO₄	0.5
K₂HPO₄	0.1
(NH4)₂SO₄	0.5
KCl	0.1
KBr	0.1
H₃BO₃	0.03
SrCl₂ㅇ6H₂O	0.03
Na₂WO₄	0.033㎎
Na₂SeO₃	0.026㎎
효모 추출물	1.0
닭털	8.0
Na₂S(25%, w/v)	3㎖/L

상기와 같은 케라틴 펩타이드 제조과정을 통해 케라틴 펩타이드를 얻을 수 있으며, 분자량이 1kDa 미만인 것부터 10KDa를 초과하는 것까지 다양한 분자량을 가지는 케라틴 펩타이드를 제조할 수 있다.

특히, 본 발명의 유효성분인 상기 케라틴 펩타이드는 분자량이 1kDa 미만이거나, 분자량이 1~10kDa이거나, 분자량이 10kDa를 초과하는 것을 사용하는 것이 바람직하며, 또한 상기 분자량 범위의 케라틴 펩타이드는 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 유효성분인 상기 케라틴 펩타이드는 콜라겐 분해하여 피부노화를 일으키는 주원인 효소인 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1)의 발현 저해능을 가지며, 따라서 콜라겐 분해를 억제하여 피부노화 방지 및 피부주름 개선 효과가 우수하다.

상기 케라틴 펩타이드는 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001~50중량%로 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 케라틴 펩타이드의 함량이 0.001중량% 미만일 경우에는 항피부노화 효과가 미미할 수 있으며, 50중량%를 초과할 경우에는 사용량 대비 효과 상승률이 낮아 비경제적일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 향료 등과 같은 통상적인 보조제 및 담체가 더 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물에는 글리세린, 부틸렌 글라이콜, 폴리옥시에칠렌 경화피마자유, 토코페릴 아세테이트, 시트릭산, 판테놀, 스쿠알란, 소듐 시트레이트, 알란토인 등의 보조성분이 추가로 더 포함될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 기본적으로 피부에 도포되는 것이므로, 당업계의 화장료 조성물을 참조하여 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 마스크팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 등이 포함될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄, 디메틸 에테르 등의 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로 용매, 용해화제, 유탁화제 등이 포함될 수 있고, 구체적으로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로 물, 에탄올, 프로필렌글리콜 등의 액상 희석제; 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 등의 현탁제; 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라칸트 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린유도체, 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 포함될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 치료용 약학 조성물에 포함되는 케라틴 펩타이드의 함량은, 치료제의 사용방법, 복용자의 상태, 질환의 종류 및 중증 정도에 따라 적절히 조절할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에서 케라틴 펩타이드는 0.001~50중량%로 포함되는 것이 바람직하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 케라틴 펩타이드의 함량이 0.001중량% 미만일 경우에는 항피부노화 효과가 미미할 수 있으며, 50중량%를 초과하는 경우 사용량 대비 효과 상승률이 낮아 비경제적일 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명은 약학 조성물은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양, 즉 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양인 치료상 유효량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학 조성물은 1~10,000㎎/㎏/day, 바람직하게는 1~200㎎/㎏/day 내지 의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회에 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한 본 발명은 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 케라틴 펩타이드가 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 케라틴 펩타이드를 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 사용되는 등 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

또한 상기 유효성분인 케라틴 펩타이드의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 변경될 수 있음은 물론이며, 상기 케라틴 펩타이드는 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.001~50중량%으로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 함량이 0.001중량% 미만일 경우에는 항피부노화 작용이 미미할 수 있으며, 50중량%를 초과할 경우 사용량 대비 효과 상승률이 낮아 비경제적일 수 있다.

구체적인 예로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 케라틴 펩타이드는 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10중량% 이하의 양으로 첨가되는 것이다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하여 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 양으로 첨가될 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 케라틴 펩타이드를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료, 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품 조성물이 음료로 제조될 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등의 추가 성분을 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등의 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐 등의 합성 감미제 등이 사용될 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01~10중량%, 바람직하게는 0.01~0.1중량%로 포함되는 것이다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기의 첨가제 비율은 크게 제한되지는 않으나, 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01~0.1중량% 범위내로 포함되는 것이 좋다.

이하에서는 실시예를 들어 본 발명에 관하여 더욱 상세하게 설명할 것이나. 이들 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것으로 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1. 케라틴 펩타이드 제조

도 1에 도시한 바와 같이 케라틴 펩타이드 혼합물의 제조를 위해 닭털 분해 균주인 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰(Fervidobacterium islandicum) AW-1을 질소원으로 닭털(8 g/L)을 첨가된 생육배지에 70℃에서 혐기배양하여 배양상등액(1.7 L)을 얻었다. 상기 배양상등액을 여과지(5㎛, No.20, Hyundai Micro, Korea)를 사용하여 분해된 닭털 찌거기를 일차적으로 걸러 낸 후, 4℃에서 20분간 10,000×g으로 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액을 실린지 필터(0.45㎛, Millipore, USA)를 사용하여 여과한 후, 최종적으로 단백질 농축기(Amicon stirred cell unit, Millipore, USA)와 10kDa, 1kDa M/W CO 필터를 사용하여 분자량이 1kDa 미만인 케라틴 펩타이드를 얻었다. 또한 분자량이 1~10KDa인 케라틴 펩타이드와, 10kDa를 초과하는 케라틴 펩타이드를 얻기 위하여 다시 원심분리하여 상층액만 회수하여 분자량이 1~10KDa이거나, 10kDa를 초과하는 케라틴 펩타이드를 얻었다. 상기 제조한 케라틴 펩타이드는 단백질 전기영동을 통하여 확인하여 도 2에 나타내었다.

실험예 1. 인간 피부 각질 세포에서의 세포독성 검사

상기 실시예 1에서 제조한 케라틴 펩타이드들의 세포독성을 검사하기 위해 사람 유래의 피부 각질세포를 이용하여 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay을 수행하였다.

먼저 사람 유래의 피부 각질세포인 HaCaT 세포를 96-웰 플레이트에 1×10⁵cells/mL로 100μL씩 분주한 다음, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 5시간 동안 안정화시켰다. 배양된 세포에 상기 실시예 1에서 제조한 케라틴 펩타이드를 1, 10, 100, 500㎍/mL의 농도별로 첨가한 후 동일한 조건으로 3일간 배양하였다. 여기에 5㎎/mL의 농도로 제조한 MTT(3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl- tetrazolium bromide) 시약을 20μL씩 첨가하여 37℃, 5% CO₂, 암조건 하에서 2시간 동안 배양한 후 포마잔(formazan) 형성을 관찰하였다. 이어서, MTT 시약을 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide) 200μL를 첨가하여 생성된 포마잔을 용해시킨 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader, Sunrise-Basic Tecan, Austria)를 이용하여 570㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 아무것도 처리하지 않은 대조군의 세포 생존율을 100%로 하여 상기 실시예 1에서 제조한 케라틴 펩타이드 처리군의 세포 생존율을 하기 수학식 1에 따라 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

[수학식 1]

도 3에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제조한 케라틴 펩타이드는 분자량에 무관하게 모두 사람 피부 각질세포에서의 독성은 눈에 띄게 나타나지 않았으나, 분자량이 10kDa를 초과하는 케라틴 펩타이드의 경우에는 500㎍/mL의 농도에서 3일간 처리하였을 때 세포 생존률이 약 70% 정도로 나타남을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 자외선 B에 의해 유도된 MMP-1 발현 억제 효과

인간 피부 각질세포(HaCaT)는 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)과 페니실린-스트렙토마이신(GIBCO^®Invitrogen, Auckland, NZ)을 함유하고 있는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)으로 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다.

세포에서 MMP-1의 발현을 측정하기 위해 상기 배양한 인간 유래의 피부 각질세포에 상기 실시예 1에서 제조한 분자량이 1kDa 미만, 1~10kDa, 10kDa를 초과하는 케라틴 펩타이드를 각각 20mM TrisHCl(pH 6.8)에 용해하여 각 농도별로 처리하였다. 그 다음, Vilber Lourmat(BioLink Crosslinker, France)를 이용하여 30mJ/㎠로자외선 B를 조사하여 6시간 동안 배양한 후 세포 단백질을 회수하였다. 이때, 자외선 조사에 앞서 배지를 제거한 후 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하여 배지 내 혈청 성분을 제거한 후 자외선 B를 조사하였다. 단백질을 회수하기 위해 PBS로 2번 세척한 후, 세포용해액(lysis buffer)을 이용하여 바닥에 부착된 세포를 회수하여 14,000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 각각의 상층액을 취한 후, 각 세포 상층액의 단백질 농도를 BSA(bovine serum albumin)를 표준물질로 사용하여 단백질 어세이 키트(protein assay kit, Bio-Rad, USA)로 그 사용방법에 따라 정량하였다. 각각의 단백질 추출물들로부터 약 20㎎에 해당하는 단백질을 10% SDS-PAGE(gel sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) 겔로 변성 분리하여 PVDF 막(Polyvinylidene fluoride membrane)에 100mA로 2 시간 동안 전이시켰다. 그 후 5% 스킴 밀크(skim milk)를 함유한 TBST 용액에 담궈 2 시간 동안 반응시켜 비 특이적인 단백질들에 대한 블록킹(blocking)을 실시하고 TBST로 1회 세척하였다. 이때, 항체로는 Matrix Metalloprotease-1(MMP-1) 모노클론 항체(Neo Markers, Fremont, CA)를 TBST 용액에 1:1,000의 비율로 희석하여 사용하였으며, 반응은 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 2차 항체로는 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 anti-rabbit IgG(Santacruz, USA)와 anti-mouse IgG(Santacruz, USA)를 각각 1:5,000의 비율으로 희석하여 사용하였으며, 반응은 상온에서 1시간 동안 진행하였다. 그 후 다시 TBST로 4 회 세척하여 ECL 기질(Amersham^TM, UK)과 1~3분 동안 반응시킨 후 X-ray 필름에 감광시켜 각 세포의 세포사멸 관련 단백질의 발현 변화를 분석하였다.

실험 결과, 도 4 내지 6에 나타낸 바와 같이 인간 피부 각질세포에서 상기 실시예 1에서 제조한 케라틴 펩타이드는 분자량에 무관하게 모두 자외선 B 의해 유도된 MMP-1의 발현을 효율적으로 억제함을 확인할 수 있었다. 특히, 분자량이 1~10kDa인 케라틴 펩타이드와 10kDa를 초과하는 케라틴 펩타이드를 처리한 경우 분자량이 1kDa 미만인 케라틴 펩타이드를 처리한 경우와 비교하여 보다 낮은 농도에서 MMP-1의 발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

이같은 결과를 통하여, 본 발명의 유효성분인 케라틴 펩타이드는 자외선 B에 의해 유도된 MMP-1의 생합성을 저해함으로서 피부 내 콜라겐 감소를 억제하여 피부노화 및 피부주름에 대한 예방, 개선 및 치료 효과를 가짐을 알 수 있었다.

제제예 1. 화장료 제제의 제조

유연화장수 제조

분자량이 1~10kDa인 케라틴 펩타이드 0.1중량%, 1,3-부틸렌글리콜 5.2중량%, 올레일알코올 1.5중량%, 에탄올 3.2중량%, 폴리솔베이트 20 3.2중량%, 벤조페논-9 2.0중량%, 카르복실비닐폴리머 1.0중량%, 글리세린 3.5중량%, 미량의 향, 미량의 방부제 및 잔량의 정제수를 혼합하여 통상의 방법으로 유연화장수를 제조하였다.

밀크로션 제조

분자량이 1~10kDa인 케라틴 펩타이드 0.1중량%, 글리세린 5.1중량%, 프로필렌글리콜 4.2중량%, 토코페릴아세테이트 3.0중량%, 유동파라핀 4.6중량%, 트리에탄올아민 1.0중량%, 스쿠알란 3.1중량%, 마카다미아너트오일 2.5중량%, 폴리솔베이트 60 1.6중량%, 솔비탄세스퀴롤레이트 1.6중량%, 프로필파라벤 0.6중량%, 카르복실비닐폴리머 1.5중량%, 미량의 향, 미량의 방부제, 잔량의 정제수를 혼합하여 통상의 방법으로 밀크로션을 제조하였다.

영양크림 제조

분자량이 1~10kDa인 케라틴 펩타이드 0.5중량%, 글리세린 4.0중량%, 바셀린 3.5중량%, 트리에탄올아민 2.1중량%, 유동파라핀 5.3중량%, 스쿠알란 3.0중량%, 밀납 2.6중량%, 토코페릴아세테이트 5.4중량%, 폴리솔베이트 60 3.2중량%, 카르복실비닐폴리머 1.0중량%, 솔비탄세스퀴올레이트 3.1중량%, 미량의 향, 미량의 방부제 및 잔량의 정제수를 혼합하여 통상의 방법으로 영양크림을 제조하였다.

마사지크림 제조

분자량이 1~10kDa인 케라틴 펩타이드 0.5중량%, 글리세린 4.0중량%, 바셀린 3.5중량%, 트리에탄올아민 0.5중량%, 유동파라핀 24.0중량%, 스쿠알란 3.0중량%, 밀납 2.1중량%, 토코페릴아세테이트 0.1중량%, 폴리솔베이트 60 2.4중량%, 카르복실비닐폴리머 1.0중량%, 솔비탄세스퀴올레이트 2.3중량%, 미량의 향, 미량의 방부제 및 잔량의 정제수를 혼합하여 통상의 방법으로 마사지크림을 제조하였다.

세정용 바디클렌저 제조

분자량이 1~10kDa인 케라틴 펩타이드 1g, 음이온계면활성제 18g, 비이온계면활성제 5g, 글리세린 7g, 소듐클로라이드 3g, 천연올리브액상비누 1.5g, 향료 1g 및 물 100g을 혼합하여 통상의 방법으로 세정용 바디클렌저를 제조하였다.

제제예 2. 약학 제제의 제조

산제 제조

분자량이 1~10kDa인 케라틴 펩타이드 20㎎, 유당 100㎎ 및 탈트 10㎎을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

정제 제조

분자량이 1~10kDa인 케라틴 펩타이드 10㎎, 옥수수전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2㎎을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

캡슐제 제조

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 분자량이 1~10kDa인 케라틴 펩타이드 10㎎, 결정성 셀룰로오스 3㎎, 락토오스 14.8㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 0.2㎎을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

주사제 제조

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1앰플당(2mL) 분자량이 1~10kDa인 케라틴 펩타이드 10㎎, 만니톨 180㎎, 주사용 멸균 증류수 2,974㎎ 및 Na₂HPO₄· 2H₂O 26㎎으로 제조하였다.

액제 제조

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 분자량이 1~10kDa인 케라틴 펩타이드 20㎎, 이성화당 10g 및 만니톨 5g을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합하였다. 그 다음 정제수를 더 가하여 전체 100mL로 조절한 후 갈색병에 충진하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.

제제예 3. 식품 제제의 제조

건강식품 제조

분자량이 1~10kDa인 케라틴 펩타이드 100㎎, 비타민 혼합물 적량, 비타민 A 아세테이트 70g, 비타민 E 1.0㎎, 비타민 B1 0.13㎎, 비타민 B2 0.15㎎, 비타민 B6 0.5㎎, 비타민 B12 0.2g, 비타민 C 10㎎, 비오틴 10g, 니코틴산아미드 1.7㎎, 엽산 50g, 판토텐산 칼슘 0.5㎎, 무기질 혼합물 적량, 황산제1철 1.75㎎, 산화아연 0.82㎎, 탄산마그네슘 25.3㎎, 제1인산칼륨 15㎎, 제2인산칼슘 55㎎, 구연산칼륨 90㎎, 탄산칼슘 100㎎ 및 염화마그네슘 24.8㎎을 혼합한 다음, 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다. 이때, 상기 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

건강음료 제조

통상의 건강음료 제조방법에 따라 분자량이 1~10kDa인 케라틴 펩타이드 100㎎, 비타민 C 15g, 비타민 E(분말) 100g, 젖산철 19.75g, 산화아연 3.5g, 니코틴산아미드 3.5g, 비타민 A 0.2g, 비타민 B1 0.25g, 비타민 B2 0.3g 및 정량의 물을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하여 건강음료를 제조하였다. 이때, 상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

Claims

퍼비도박테리움 아이슬란디쿰(Fervidobacterium islandicum) AW-1을 배양하여 얻어진 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1은 닭털을 포함하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 케라틴 펩타이드는 분자량이 1kDa 미만인 케라틴 펩타이드, 분자량이 1~10kDa인 케라틴 펩타이드 및 분자량이 10kDa를 초과하는 케라틴 펩타이드 중 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 케라틴 펩타이드는 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001~50중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 케라틴 펩타이드는 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1) 발현 저해능을 갖는 것을 특징으로 하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 또는 스프레이의 제형인 것을 특징으로 하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
삭제
퍼비도박테리움 아이슬란디쿰(Fervidobacterium islandicum) AW-1을 배양하여 얻어진 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부노화 또는 피부주름 예방 또는 개선용 식품 조성물.