WO2017135556A1 - Gdf11을 포함하는 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

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김윤진
이승희
서광원
강경선
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    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
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    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
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    • C12N2502/1382—Adipose-derived stem cells [ADSC], adipose stromal stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a composition comprising GDF11 and its use. More specifically, the present invention relates to a pharmaceutical composition for skin regeneration, including a human-derived adult stem cell culture comprising GDF11 or the same, a pharmaceutical composition for improving wrinkles, and a wound treatment Pharmaceutical compositions, quasi-drugs for skin regeneration, quasi-drugs for wrinkle improvement, quasi-drugs for wound treatment, cosmetic compositions for skin rejuvenation, cosmetic compositions for wrinkle improvement, cosmetic compositions for wound improvement, skin regeneration comprising administering the composition The present invention relates to a method for improving wrinkles, a wound treatment method, a fibroblast culture medium composition, a method for culturing fibroblasts using the medium composition, and a method for producing GDF11 by culturing the stem cells.
  • Skin aging is a complex biological phenomenon that can be divided into two factors. It can be divided into natural aging (endogenous aging) that progresses over time and photo aging that is particularly sensitive to the external environment, especially ultraviolet light. The skin is always exposed to oxygen and the sun's rays, so oxidative stress from it promotes skin aging.
  • ROS free radical species
  • Elastase present in human neutrophil granulocytes is an enzyme that breaks down elastin, a substrate protein important for maintaining skin elasticity in the dermis, and a nonspecific hydrolase that can break down collagen, another important substrate protein.
  • the inhibitor of the elastase exhibits an effect of improving skin wrinkles, and ursolic acid is used as an elastase inhibitor, but ursolic acid is difficult to be formulated because it has a property of being insoluble in solvents such as water or oil. There is a problem that is difficult to use.
  • Collagen is mostly present in the dermal layer of the skin and accounts for about 70-80% of the total dry weight of the skin.
  • Collagen a major component of the extracellular matrix, is the major substrate protein produced by the fibroblasts of the skin. Synthesis and degradation of collagen is properly controlled, but its synthesis decreases as aging progresses, and the expression of collagenase, a collagen degrading enzyme, is promoted by UV irradiation, which is known to be closely related to wrinkle formation of the skin.
  • the deficiency of the matrix protein is one of the important factors in photoaging, and the expression of various matrix protease increases when the synthesis of collagen and elastic material, which is a component that fills the cells by ultraviolet rays, decreases. Therefore, it is degraded by collagen and elastin degrading enzymes collagenase and elastase, which are the main causes of skin aging, and the dermis layer plays an important role in nourishing capillaries and epidermis by determining the physicochemical properties of skin. Therefore, it is closely related to aging of the skin.
  • collagen synthesis promoters include vitamin C, retinoic acid, transforming growth factor (TGF), and protein derived from placenta (JP8). -231370), betulinic acid (betulinic acid, JP8-208424), chlorella extract (JP9-40523, JP10-36283, fibroblast proliferation).
  • Korean Patent Publication No. 2009-0116659 discloses a cosmetic composition for anti-wrinkle, whitening or anti-aging comprising a stem cell culture.
  • a cosmetic composition for anti-wrinkle, whitening or anti-aging comprising a stem cell culture.
  • a stem cell culture solution contains a myriad of components, it has not been confirmed what the components exhibit a substantial wrinkle improvement effect so far. If an effective ingredient capable of exhibiting the wrinkle improvement effect is identified, a product that can effectively improve wrinkles is expected to be developed, but there are no results.
  • the present inventors earnestly researched to find an effective ingredient capable of improving skin wrinkles from human stem cell cultures derived from humans known to have an anti-wrinkle effect on the skin.
  • the GDF11 contained in the culture medium increased the growth of fibroblasts. Not only to promote, but also to increase the level of synthesis of collagen that can improve skin wrinkles, inhibit the activity of collagenase, confirmed that it is an active ingredient exhibiting skin wrinkle improvement effect, and completed the present invention.
  • One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for skin regeneration comprising GDF11 or human-derived adult stem cell culture containing the same.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for improving wrinkles comprising GDF11 or a human-derived adult stem cell culture comprising the same.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for wound treatment comprising GDF11 or human-derived adult stem cell culture comprising the same.
  • Still another object of the present invention is to provide a quasi-drug composition for skin regeneration comprising GDF11 or an adult-derived adult stem cell culture containing the same.
  • Still another object of the present invention is to provide a quasi-drug composition for improving wrinkles comprising GDF11 or human-derived adult stem cell culture containing the same.
  • Still another object of the present invention is to provide a quasi-drug composition for improving wounds comprising GDF11 or human-derived adult stem cell culture containing the same.
  • Still another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for skin regeneration comprising a human-derived adult stem cell culture solution containing GDF11 or the same.
  • Still another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for improving wrinkles comprising GDF11 or an adult-derived adult stem cell culture containing the same.
  • Still another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for wound improvement comprising GDF11 or an adult-derived adult stem cell culture containing the same.
  • Still another object of the present invention is to provide a fibroblast culture medium composition comprising GDF11 or an adult-derived adult stem cell culture containing the same.
  • Still another object of the present invention is to provide a method of culturing fibroblasts using the medium composition.
  • Another object of the present invention to provide a method for producing GDF11 comprising the step of culturing the human-derived adult stem cells.
  • Still another object of the present invention is to provide a skin regeneration method comprising administering to a subject a composition comprising GDF11 or an adult-derived adult stem cell culture comprising the same.
  • Still another object of the present invention is to provide a wrinkle improvement method comprising administering to a subject a composition comprising GDF11 or an adult-derived adult stem cell culture comprising the same.
  • GDF11 provided by the present invention is included in the adult stem cell culture derived from humans and has an effect of promoting the proliferation of fibroblasts, and thus can be widely used for the development of various skin regeneration, wrinkle improvement or wound treatment products. will be.
  • CTL control
  • HDF CM fibroblast culture
  • AD-MSC CM human adipose derived stem cell culture
  • UB-MSC CM human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell culture
  • FIG. 2 shows the control (CTL), fibroblast culture medium (HDF CM), human adipose derived stem cell culture (AD-MSC CM) or human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell culture (UCB-MSC CM) on the mobility of fibroblasts It is a microscope photograph showing the result of comparing an effect.
  • CTL control
  • HDF CM fibroblast culture medium
  • AD-MSC CM human adipose derived stem cell culture
  • UMB-MSC CM human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell culture
  • Figure 3a shows a variety of control (CTL), fibroblast culture (HDF CM), human adipose derived stem cell culture (AD-MSC CM) or human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell culture (UCB-MSC CM) is expressed in fibroblasts Western blot analysis showing the results of comparing the effect on the protein expression level of the substrate protein.
  • CTL control
  • HDF CM fibroblast culture
  • AD-MSC CM human adipose derived stem cell culture
  • UMB-MSC CM human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell culture
  • Figure 3b shows a variety of control (CTL), fibroblast culture (HDF CM), human adipose derived stem cell culture (AD-MSC CM) or human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cell culture (UCB-MSC CM) is expressed in fibroblasts RT-PCR analysis picture showing the result of comparing the effect on the expression level of the substrate protein.
  • CTL control
  • HDF CM fibroblast culture
  • AD-MSC CM human adipose derived stem cell culture
  • UB-MSC CM human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cell culture
  • Figure 4a compares the effect of wound treatment on control (CTL), fibroblast culture (HDF CM), human adipose derived stem cell culture (AD-MSC CM) or human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cell culture (UCB-MSC CM) Graphs and photos showing the results.
  • CTL control
  • HDF CM fibroblast culture
  • AD-MSC CM human adipose derived stem cell culture
  • UMB-MSC CM human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cell culture
  • Figure 4b is a wound animal model treated with a control (CTL), fibroblast culture (HDF CM), human adipose derived stem cell culture (AD-MSC CM) or human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cell culture (UCB-MSC CM) It is a tissue photograph showing the result of comparing the area of the wound.
  • CTL control
  • HDF CM fibroblast culture
  • AD-MSC CM human adipose derived stem cell culture
  • UMB-MSC CM human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cell culture
  • FIG. 5A shows GDF11 mRNA levels expressed in fibroblasts (HDF), human adipose derived stem cells (AD-MSC) or human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells (UCB-MSC) by RT-PCR and realtime qPCR. It is a graph which shows the result of a comparison, and b of FIG. 5 is a photograph which shows the result of performing RT-PCR.
  • HDF fibroblasts
  • AD-MSC human adipose derived stem cells
  • UMB-MSC human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells
  • Figure 6a is a human bone marrow-derived stem cell culture (BM-MSC CM), human fat-derived stem cell culture (AD-MSC CM) or human umbilical cord blood-derived stem cell culture (UCB-MSC CM) used as a control (CTL)
  • BM-MSC CM human bone marrow-derived stem cell culture
  • AD-MSC CM human fat-derived stem cell culture
  • UB-MSC CM human umbilical cord blood-derived stem cell culture
  • Figure 7a is a graph showing the effect of GDF11 on the proliferation of human cord blood-derived mesenchymal stem cells
  • Figure 7b is comparing the expression level of collagen according to the suppression of GDF11 expression in the human cord blood-derived mesenchymal stem cells It is a photograph showing the result.
  • FIG. 8 shows expression levels of GDF11 according to treatment time and concentration in human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells treated with control group (a), EGF (b), bFGF (c), TGF-beta1 (d) or vEGF (e). It is a graph showing the result of comparing changes of.
  • Figure 9 shows the proliferation level (figure 9a) of fibroblasts in the fibroblasts treated with GDF11, the expression level of collagen type 1 (figure 9b and f) in the fibroblasts, expressed in the fibroblasts Expression level of type 3 collagen (c and f of Figure 9), the expression level of elastin expressed in the fibroblasts (d and f of Figure 9) and the expression level of MMP1 expressed in the fibroblasts (Fig. 9e And f) graphs and photographs showing the results of the comparison.
  • the present inventors conducted various studies to find an effective ingredient that can improve skin wrinkles from an adult stem cell culture derived from a human body, which is known to have an anti-wrinkle effect on the skin, and GDF11 (which is known to be effective in preventing or treating dementia) Attention was paid to growth differentiation factor.
  • the GDF11 is known as a protein for restoring exercise ability and regenerating degenerative cerebrovascular vessels, and is a human-derived adult stem cell culture medium which has an effect of promoting fibroblast proliferation, enhancing mobility, and increasing expression of stromal protein.
  • GDF11 was detected and compared with other stem cell cultures, and it was confirmed that a large amount of the culture medium obtained by culturing human cord blood-derived mesenchymal stem cells among various adult stem cells.
  • the proliferation rate of adult stem cells derived from humans decreases, and the expression level of type 3 collagen expressed therefrom decreases.
  • Expression of various growth factors (EGF, bFGF, TGF-beta1 or vEGF) is not only involved, but treatment of GDF11 to fibroblasts promotes the proliferation of the fibroblasts and increases the expression of collagen and elastin in the fibroblasts. Confirmed. Therefore, it was analyzed that GDF11 may promote a wound treatment effect, a skin regeneration effect, an anti-wrinkle effect, and the like, which may be induced by the proliferation of fibroblasts.
  • GDF11 is involved in the proliferation of fibroblasts and the resulting wound healing, wrinkle improvement, and skin regeneration is not known at all, and was first identified by the present inventors.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for skin regeneration, wrinkle improvement or wound treatment comprising GDF11 or human-derived adult stem cell culture comprising the same as one embodiment.
  • growth differentiation factor 11 of the present invention is also referred to as "bone morphogenetic protein 11 (BMP-11)", and means a protein expressed by the GDF11 gene present on chromosome 12 of human.
  • the GDF11 is known as a myostatin analogue protein, and is known to act as an inhibitor of nerve tissue growth. Recently, GDF11 has a dementia prevention or therapeutic effect that restores exercise ability and regenerates degenerated cerebrovascular vessels. Has been reported.
  • the sequence information of GDF11 of the present invention can be obtained from a known database such as the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the human-derived GDF11 gene (NM_005811), the human-derived GDF11 protein (NP_005802), the mouse-derived GDF11 gene (NM_010272), the mouse-derived GDF11 protein (NP_034402), and the like.
  • the GDF11 may exhibit effects such as promoting skin regeneration, promoting wrinkle improvement, and promoting wound healing through promoting the proliferation of fibroblasts, and thus may be used as an active ingredient of a composition exhibiting these effects.
  • human-derived adult stem cell culture solution means a culture obtained by culturing human adult stem cells, or a culture supernatant obtained by removing stem cells from the culture.
  • the culture medium obtained by culturing the adult stem cells contains various substances secreted by culturing the adult stem cells (for example, GDF1), and promotes the proliferation of fibroblasts when the adult stem cell culture derived from humans is used. Promote skin regeneration, promote wrinkle improvement, and promote wound healing.
  • the human-derived adult stem cell culture solution may be interpreted as a culture supernatant obtained by culturing human adult stem cells, and adult stem cells used therein are particularly limited thereto as long as they can secrete GDF11 into the culture solution.
  • adult stem cells used therein are particularly limited thereto as long as they can secrete GDF11 into the culture solution.
  • the present invention is a culture medium of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells as a human-derived mesenchymal stem cell culture medium Used.
  • human cord blood-derived mesenchymal stem cell culture (UCB-MSC CM) is derived from fibroblast culture medium (HDF CM) or human fat It was confirmed that the proliferation of fibroblasts and the total amount of protein secreted from the cells can be increased more than the stem cell culture (AD-MSC CM) (FIG. 1), and the fibroblast mobility (FIG. 2). ).
  • the expression level of various matrix proteins (collagen, fibronectin, elastin, etc.) expressed in fibroblasts was improved to a relatively high level (FIGS. 3A and 3B), and it was confirmed that they exhibit relatively superior wound treatment effects in animal models. (FIGS. 4A and 4B).
  • GDF11 growth differentiation factor 11
  • GDF11 may promote a wound treatment effect, a skin regeneration effect, an anti-wrinkle effect, and the like, which may be induced by the proliferation of fibroblasts.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in the form of a pharmaceutical composition for skin regeneration, wrinkle improvement and wound treatment further comprising a suitable carrier, excipient or diluent commonly used in the manufacture of the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition may be formulated in the form of oral dosage forms, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, and aerosols, respectively, according to conventional methods. Can be.
  • carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, Calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, It may be prepared by mixing sucrose or lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate and talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral use may include various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc., in addition to water and liquid paraffin, which are simple diluents commonly used in suspensions, solutions, emulsions, and syrups. have.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized formulations, suppositories, and the like.
  • the non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the content of the GDF11 included in the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but may be included in an amount of 1 X 10 -9 to 50% by weight, more preferably 0.01 to 20% by weight, based on the total weight of the final composition. have.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount, the term "pharmaceutically effective amount" of the present invention to treat or prevent a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment or prevention
  • Sufficient amount means an effective dose level means the severity of the disease, the activity of the drug, the age, weight, health, sex, sensitivity of the patient to the drug, the time of administration of the composition of the invention used, the route of administration and the rate of excretion treatment Period of time, factors including drugs used in combination or coincidental with the compositions of the invention used, and other factors well known in the medical arts.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered alone or in combination with known pharmaceutical compositions for skin rejuvenation, wrinkle improvement and wound treatment. In consideration of all the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be determined by those skilled in the art in consideration of the purpose of use, the degree of addiction of the disease, the age, weight, sex, history, or type of substance used as an active ingredient of the patient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered at about 0.1 ng to about 100 mg / kg, preferably 1 ng to about 10 mg / kg, per adult, and the frequency of administration of the composition of the present invention is specifically Although not limited, it can be administered once a day or several times in divided doses.
  • the dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the present invention provides a method for treating a wound, comprising administering the pharmaceutical composition to a subject in a pharmaceutically effective amount.
  • the term "individual” of the present invention may include, without limitation, mammals, farmed fish, and the like, including rats, livestock, and the like, which require skin regeneration, wrinkle improvement or wound treatment.
  • treatment of the present invention means that a pharmaceutical composition comprising GDF11 of the present invention as an active ingredient is administered to an individual in need of skin regeneration, wrinkle improvement or wound treatment so that skin regeneration, wrinkle improvement or wound treatment is performed or beneficial. It means all the acts of doing.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition for skin regeneration, wrinkle improvement or wound treatment of the present invention may be administered via any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited to this, but as desired, routes of intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, intranasal administration, pulmonary administration, rectal administration, etc. It can be administered through.
  • oral administration may denature or degrade the GDF11 by gastric acid
  • oral compositions should be formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach.
  • the composition may be administered by any device in which the active substance may migrate to the target cell.
  • the present invention provides a quasi-drug composition for skin regeneration, wrinkle improvement or wound treatment comprising the GDF11 or a human-derived adult stem cell culture containing the same.
  • improvement refers to any action that at least reduces the parameters associated with the condition being treated, for example, the extent of symptoms.
  • quasi drug used in the present invention refers to articles that have a lesser action than drugs among those used for the purpose of diagnosing, treating, ameliorating, alleviating, treating or preventing diseases of humans or animals.
  • quasi-drugs are products that are used for the purpose of medicines, and are used for the treatment or prevention of diseases of humans and animals. These include sterilizing and insecticides to prevent infectious diseases.
  • the kind or formulation of the quasi-drug composition of the present invention is not particularly limited, but may preferably be a disinfectant cleaner, a shower foam, a gagreen, a wet tissue, a detergent soap, a hand wash, a humidifier filler, a mask, an ointment, or a filter filler.
  • the present invention provides a cosmetic composition for skin regeneration, wrinkle improvement or wound improvement comprising the GDF11 or an adult-derived adult stem cell culture comprising the same.
  • the GDF11 may promote the proliferation of fibroblasts
  • the GDF11 may be used in the manufacture of functional cosmetics exhibiting skin regeneration, wrinkle improvement or wound improvement effect caused by the proliferation of fibroblasts.
  • the term "functional cosmetics (cosmedical, cosmeceutical)" of the present invention is a product that has a professional therapeutic function of the drug is introduced in cosmetics, unlike the general cosmetics has a professional functionality that emphasizes the bioactive effect, the effect, on the whitening of the skin Means cosmetics prescribed by Ordinance of Health and Welfare among products that help to improve skin wrinkles, products that help to burn skin finely or protect skin from ultraviolet rays.
  • the functional cosmetics refers to a product that helps to prevent skin aging by exhibiting skin regeneration, wrinkle improvement, and wound improvement effect among various functional cosmetics, and as an example, GDF11 or human-derived adult stem cell culture solution containing the same. It may be a functional cosmetic containing as an active ingredient, but is not particularly limited thereto, and the content of GDF11 included in the functional cosmetic is not particularly limited.
  • Functional cosmetics of the present invention comprises the GDF11 or human-derived adult stem cell culture containing the same as an active ingredient, and may further contain a cosmetic commonly used, for example, glycerol, propylene glycol for water-soluble skin preparation , 1,3-butylene glycol, sorbitol, polyethylene glycol, carboxyvinyl polymer, xanthan gum, carboxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, locust bean gum, allantoin, carrageenan, and the like; Beeswax, paraffin wax, stearyl alcohol, carnauba wax, candelilla wax and calcium stearate, aluminum stearate, zinc stearate, witchhazel and the like as viscosity and hardness modifiers; Butylmethoxydibenzoylmethane, octylmethoxycinnamate and the like can be used as the ultraviolet absorber; As pigments, extender pigments such as titanium dioxide, fine
  • moisturizers natural moisturizing substances such as 1,3-butylene glycol, concentrated glycerin, ethylene glycol and the like, chitin, chitosan, hyaluronic acid, hyaluronic acid, lactic acid, glycolic acid, etc. may be used;
  • preservative not only paraoxybenzoic acid esters, imidazolidinyl urea and the like can be used, but also the above-described components may be mixed in one kind or two or more kinds according to product characteristics.
  • the functional cosmetics of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansing , Oils, powder foundations, emulsion foundations, wax foundations and sprays, and the like, but are not limited thereto. More specifically, it may be prepared in the form of a flexible lotion, nutrition lotion, nutrition cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder.
  • the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, animal oils, vegetable oils, waxes, paraffins, starches, trachants, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silicas, talc or zinc oxide may be used as carrier components.
  • animal oils, vegetable oils, waxes, paraffins, starches, trachants, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silicas, talc or zinc oxide may be used as carrier components.
  • animal oils vegetable oils, waxes, paraffins, starches, trachants, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silicas, talc or zinc oxide
  • cellulose derivatives polyethylene glycols
  • silicones bentonites
  • silicas talc or zinc oxide
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used, in particular in the case of a spray, additionally chlorofluorohydrocarbon, propane Propellant such as butane or dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizer or emulsifier is used as the carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1 Fatty acid esters of, 3-butylglycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan.
  • liquid carrier diluents such as water, ethanol or propylene glycol
  • suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, microcrystals Soluble cellulose, aluminum metahydroxy, bentonite, agar or tracant and the like can be used.
  • the carrier component is an aliphatic alcohol sulfate, an aliphatic alcohol ether sulfate, a sulfosuccinic acid monoester, an isethionate, an imidazolinium derivative, a methyltaurate, a sarcosinate, a fatty acid amide.
  • Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters and the like can be used.
  • the present invention provides a fibroblast culture medium composition comprising the GDF11 or a human-derived adult stem cell culture medium comprising the same, and a method for culturing fibroblasts using the medium composition.
  • the GDF11 or the human-derived adult stem cell culture comprising the same can promote the proliferation of fibroblasts
  • the GDF11 or the human-derived adult stem cell culture comprising the same to culture the fibroblasts Can be used as an active ingredient of the culture medium composition for culturing, and can be used to culture the fibroblasts using the culture medium composition for culturing the fibroblasts.
  • the method of culturing the fibroblasts provided by the present invention includes the step of inoculating and culturing the fibroblasts in the fibroblast culture medium composition.
  • the present invention provides a method for producing GDF11 comprising culturing the adult human stem cells.
  • the method for producing GDF11 comprises the steps of (a) culturing human-derived adult stem cells and obtaining a culture supernatant; And (b) recovering GDF11 from the obtained culture supernatant.
  • culture refers to the overall action of growing cells in environmental conditions with appropriate artificial control.
  • the culturing is carried out for the purpose of producing GDF11 secreted into the culture supernatant by culturing the stem cells provided in the present invention, and the culturing method is not particularly limited, and a method well known in the art Can be used.
  • Culture conditions are not particularly limited, but may be appropriate pH (pH 5 to 9, preferably pH 6 to 8) using a basic compound (e.g. sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia) or an acidic compound (e.g. phosphoric acid or sulfuric acid). , Most preferably pH 6.8), can be introduced into the culture to maintain the aerobic conditions by introducing an oxygen or oxygen-containing gas mixture, the culture temperature is not particularly limited to this, for example, 30 to 40 °C, As another example may be 33 to 37 °C, another example 37 °C, the incubation time is also not particularly limited, but in one example 5 to 15 days, another example 7 to 10 days, another example 7 days This can be
  • the culture medium used may include sugars and carbohydrates (e.g. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose), fats and fats (e.g. soybean oil, sunflower seeds) as carbon sources.
  • sugars and carbohydrates e.g. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose
  • fats and fats e.g. soybean oil, sunflower seeds
  • Oils, peanut oils and coconut oils fatty acids (e.g. palmitic acid, stearic acid and linoleic acid), alcohols (e.g. glycerol and ethanol) and organic acids (e.g. acetic acid), etc.
  • Nitrogen sources include nitrogen-containing organic compounds such as peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea, or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and Ammonium nitrate) and the like can be used individually or in combination;
  • As a source of phosphorus, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, a corresponding sodium-containing salt, and the like can be used individually or in combination;
  • Other metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate, and essential growth-promoting substances such as amino acids and vitamins.
  • various growth factors such as EGF, bFGF, vEGF, TGF- ⁇ 1, etc. may be further included in the medium so as to promote smooth proliferation of stem cells.
  • the step of recovering GDF11 from the culture may be performed by a method known in the art.
  • known GDF11 recovery methods are not particularly limited, but may be centrifugation, filtration, extraction, spraying, drying, evaporation, precipitation, crystallization, electrophoresis, fractional dissolution (eg ammonium sulfate precipitation), chromatography (eg For example, ion exchange, affinity, hydrophobicity and size exclusion).
  • the present invention provides a method for skin regeneration by administering to a subject a composition comprising GDF11 or an adult-derived adult stem cell culture comprising the same.
  • the present invention provides a method for improving wrinkles by administering to a subject a composition comprising GDF11 or a human-derived adult stem cell culture comprising the same.
  • the present invention provides the use of wound treatment, skin regeneration, or wrinkle improvement of GDF11 or human-derived adult stem cell culture containing the same.
  • Example 1-1 Obtaining Human Cord Blood-derived Mesenchymal Stem Cell Cultures
  • Human umbilical cord blood stem cells (1.89 ⁇ 10 5 cells) isolated from umbilical cord blood were inoculated in endothelial growth medium (EGM-2) containing 10% FBS, incubated for 48 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 conditions, Cultured cells were obtained. The cells thus obtained were inoculated again in H1 medium and incubated for 96 hours to obtain human cord blood-derived mesenchymal stem cell culture. At this time, DMEM medium containing EGF, bFGF, vEGF and TGF- ⁇ 1 was used as the H1 medium.
  • EGF endothelial growth medium
  • Inhaled adipose tissue was washed with PBS, 1 ⁇ l / ml primocin and 1 mg / ml type 1 collagenase were added, followed by reaction at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction was completed, centrifuged (2000 rpm, 5 minutes) to obtain precipitated cells, the cells were suspended in culture (DMEM medium containing 0.2% primocin, 1% glutamax and 10% FBS), and filtered Then, again centrifuged (1000rpm, 5 minutes) to obtain the precipitated cells. The obtained cells were put in ACK lysing buffer (Gibco) and reacted for 1 minute.
  • DMEM medium containing 0.2% primocin, 1% glutamax and 10% FBS
  • the cells (1.89 ⁇ 10 5 cell numbers) were washed with PBS, and keratinocyte-SFM media containing K-NAC medium (5% FBS, 20 mM ascorbic acid 1% and 400 mM N-acetyl-L-cysteine 0.5%). ) was inoculated to and cultured at 37 °C and 5% CO 2 conditions, 48 hours, and the obtained cultured cells. The obtained cells were inoculated again in serum-free medium (H1 media, DMEM medium), incubated for 96 hours, and then a human adipose derived stem cell culture was obtained.
  • serum-free medium H1 media, DMEM medium
  • Fibroblasts were seeded in 96-well plates at a density of 1 ⁇ 10 3 cells per well and incubated for 24 hours. Then, fibroblast culture medium, human cord blood-derived mesenchymal stem cell culture obtained in Example 1-1, or human adipose derived stem cell culture obtained in Example 1-2 were added and cultured for 72 hours. At this time, the culture was added to the H1 medium as a control. After the incubation was completed, 10 ⁇ l of CCK-8 contained in the CCK-8 kit was added to the culture, reacted for 3 hours, and then absorbance was measured at 450 nm to measure and compare the proliferative capacity of each fibroblast. One).
  • CTL control
  • HDF CM fibroblast culture
  • AD-MSC CM human adipose derived stem cell culture
  • UB-MSC CM human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell culture
  • human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell culture (UCB-MSC CM) promotes the proliferation of fibroblasts than fibroblast culture medium (HDF CM) or human adipose derived stem cell culture (AD-MSC CM), It was confirmed that the total amount of protein secreted from the cells can also be increased.
  • Fibroblasts were seeded in 6-well plates at a density of 2 ⁇ 10 5 cells per well and incubated for 48 hours. The medium was then removed, scratched at the bottom of the culture vessel, and washed with PBS. Subsequently, fibroblast culture medium, human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell culture medium obtained in Example 1-1, or human adipose-derived stem cell culture medium obtained in Example 1-2 were added thereto and cultured for 72 hours. At this time, the culture was added to the H1 medium as a control. After the incubation was completed, the level of fibroblasts migrated to the scratch site was confirmed under a microscope (FIG. 2).
  • FIG. 2 shows the control (CTL), fibroblast culture medium (HDF CM), human adipose derived stem cell culture (AD-MSC CM) or human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell culture (UCB-MSC CM) on the mobility of fibroblasts It is a microscope photograph showing the result of comparing an effect.
  • human cord blood-derived mesenchymal stem cell culture (UCB-MSC CM) promotes the mobility of fibroblasts than fibroblast culture medium (HDF CM) or human adipose derived stem cell culture (AD-MSC CM). Confirmed.
  • Fibroblasts were seeded in 6-well plates at a density of 2 ⁇ 10 5 cells per well and incubated for 24 hours. Then, fibroblast culture medium, human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell culture obtained in Example 1-1, or human adipose-derived stem cell culture obtained in Example 1-2 were added thereto, followed by culturing for 24 hours, and then each cultured Fibroblasts were subjected to Western blot analysis using antibodies to collagen type I (collagen I), collagen type IV (collagen IV), fibronectin (Fibronectin) or elastin (Elastin) (FIG. 3A). At this time, GAPDH was used as the internal control group.
  • Figure 3a shows a variety of control (CTL), fibroblast culture (HDF CM), human adipose derived stem cell culture (AD-MSC CM) or human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell culture (UCB-MSC CM) is expressed in fibroblasts Western blot analysis showing the results of comparing the effect on the protein expression level of the substrate protein. As shown in Figure 3a, it was confirmed that fibronectin and elastin were expressed at the highest level in fibroblasts treated with human cord blood-derived mesenchymal stem cell culture (UCB-MSC CM).
  • CTL control
  • HDF CM fibroblast culture
  • AD-MSC CM human adipose derived stem cell culture
  • UMB-MSC CM human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell culture
  • RNA was obtained from each fibroblast cultured in Example 4-1, and each cDNA was synthesized using RT-Premix (Bioneer). PCR was performed using the following primers as a template of the synthesized cDNA, and the expression levels of type I collagen, type III collagen or fibronectin were compared at the mRNA level. (FIG. 4B). At this time, GAPDH was used as the internal control group.
  • collagen type I F 5'-tcaaggtttccaaggacctg-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • collagen type I R 5'-tcaaggtttccaaggacctg-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • collagen type III F 5'-aaaggggagctggctacttc-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • collagen type III R 5'-gcgagtaggagcagttggag-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • fibronectin F 5'-tgaagaggggcacatgctga-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • fibronectin R 5'-gtgggagttgggctgactcg-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • Figure 3b shows a variety of control (CTL), fibroblast culture (HDF CM), human adipose derived stem cell culture (AD-MSC CM) or human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cell culture (UCB-MSC CM) is expressed in fibroblasts RT-PCR analysis picture showing the result of comparing the effect on the expression level of the substrate protein. As shown in Figure 3b, it was confirmed that type 3 collagen and fibronectin were expressed at the highest level in fibroblasts treated with human cord blood-derived mesenchymal stem cell culture (UCB-MSC CM).
  • CTL control
  • HDF CM fibroblast culture
  • AD-MSC CM human adipose derived stem cell culture
  • UMB-MSC CM human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cell culture
  • a 6 mm skin epidermal wound was induced using a biopsy punch on the back of a 5-week-old nude mouse to prepare a wound animal model.
  • Example 1-1 human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell culture obtained in Example 1-1, or obtained in Example 1-2 were respectively wound on the wound site of the wound animal model.
  • Human adipose derived stem cell culture was applied and each culture was fixed to the wound site using a silicone band. The same operation was repeated after 72 hours.
  • a wound animal model coated with H1 medium was used as a control.
  • the applied wound animal model was bred for 7 days, and then the reduction level of the wound size was compared (FIG. 4A).
  • Figure 4a compares the effect of wound treatment on control (CTL), fibroblast culture (HDF CM), human adipose derived stem cell culture (AD-MSC CM) or human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cell culture (UCB-MSC CM) Graphs and photos showing the results. As shown in Figure 4a, it was confirmed that the human cord blood-derived mesenchymal stem cell culture (UCB-MSC CM) shows the most excellent wound treatment effect.
  • CTL fibroblast culture
  • AD-MSC CM human adipose derived stem cell culture
  • UMB-MSC CM human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cell culture
  • Figure 4b is a wound animal model treated with a control (CTL), fibroblast culture (HDF CM), human adipose derived stem cell culture (AD-MSC CM) or human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cell culture (UCB-MSC CM) It is a tissue photograph showing the result of comparing the area of the wound. As shown in Figure 4b, it was confirmed once again that the human cord blood-derived mesenchymal stem cell culture (UCB-MSC CM) shows the best wound treatment effect.
  • CTL control
  • HDF CM fibroblast culture
  • AD-MSC CM human adipose derived stem cell culture
  • UMB-MSC CM human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cell culture
  • RNA was obtained from fibroblasts cultured using H1 medium, human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells obtained in Example 1-1 or human adipose derived stem cells obtained in Example 1-2, from which Each cDNA was synthesized.
  • Each cDNA synthesized above was used as a template, and realtime qPCR and PCR were performed using the following primers to compare mRNA levels of GDF11 (a and b of FIG. 5). At this time, RPL13A was used as the internal control group.
  • GDF11 F 5'-gatcctggacctacacgacttc-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • GDF11 R 5'-ggccttcagtacctttgtgaac-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • RPL13A F 5'-gcacgaccttgagggcagcc-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • RPL13A R 5'-catcgtggctaaacaggtactg-3 '(SEQ ID NO: 10)
  • FIG. 5A shows GDF11 mRNA levels expressed in fibroblasts (HDF), human adipose derived stem cells (AD-MSC) or human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells (UCB-MSC) by RT-PCR and realtime qPCR. It is a graph which shows the result of a comparison, and FIG. 5B is a photograph which shows the result of performing RT-PCR. As shown in a and b of Figure 5, it was confirmed that a large amount of GDF11 expression in human cord blood-derived mesenchymal stem cells (UCB-MSC).
  • HDF fibroblasts
  • AD-MSC human adipose derived stem cells
  • UMB-MSC human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells
  • Fibroblast culture medium human cord blood-derived mesenchymal stem cell culture obtained in Example 1-1, or human fat-derived stem cell culture obtained in Example 1-2 were filtered (0.22um syringe filter), and each of these cultures Concentrated, each concentrated culture was subjected to Western blot analysis using an antibody against GDF11 (a and b in Figure 6).
  • Figure 6a is a human bone marrow-derived stem cell culture (BM-MSC CM), human fat-derived stem cell culture (AD-MSC CM) or human umbilical cord blood-derived stem cell culture (UCB-MSC CM) used as a control (CTL)
  • BM-MSC CM human bone marrow-derived stem cell culture
  • AD-MSC CM human fat-derived stem cell culture
  • UB-MSC CM human umbilical cord blood-derived stem cell culture
  • Human cord blood stem cells were seeded in 6-well plates at a density of 2 ⁇ 10 5 cells per well and incubated for 24 hours. The cultured cells were then treated with 25 nM of control siRNA or siRNA for GDF11 (siGDF11), respectively, and cultured for 72 hours. Subsequently, each cell was passaged, and then treated with siRNA and cultured under the same conditions. After the incubation was completed, the cells were obtained, which were inoculated in a 24 well plate at a density of 4 X 10 4 cells per well, followed by incubation for 2 days, according to the method of Example 2, according to the method of Example 2 (A) of FIG.
  • Figure 7a is a graph showing the effect of GDF11 on the proliferation of human cord blood-derived mesenchymal stem cells
  • Figure 7b is comparing the expression level of collagen according to the suppression of GDF11 expression in the human cord blood-derived mesenchymal stem cells It is a photograph showing the result.
  • FIG. 7A it was confirmed that when the expression of GDF11 was decreased, the proliferation rate of human cord blood-derived mesenchymal stem cells was decreased.
  • FIG. 7B when the expression of GDF11 was decreased, the human cord blood-derived mesenchymal stem was decreased. It was confirmed that the expression level of type 3 collagen in the cells is reduced.
  • Human umbilical cord blood stem cells were inoculated in a 100 mm culture vessel at a density of 5 X 10 5 cells, and when the saturation was 80 to 90%, 6-well plates were inoculated at a density of 2 X 10 5 cells per well, 24 Incubated for hours. Subsequently, it was replaced with DMEM medium containing 100X glutamax and treated with EGF, bFGF, vEGF or TGF-beta1 at a concentration of 1 or 10 ng / ml, respectively, and cultured for 1, 3 and 6 days.
  • FIG. 8 shows expression levels of GDF11 according to treatment time and concentration in human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells treated with control group (a), EGF (b), bFGF (c), TGF-beta1 (d) or vEGF (e). It is a graph showing the result of comparing changes of. As shown in FIG. 8, in each case, it was confirmed that GDF11 expression was increased, and the highest expression was confirmed at day 6. In addition, it was confirmed that expression was further increased when the four factors were treated simultaneously.
  • Figure 9 shows the proliferation level (figure 9a) of fibroblasts in the fibroblasts treated with GDF11, the expression level of collagen type 1 (figure 9b and f) in the fibroblasts, expressed in the fibroblasts Expression level of type 3 collagen (c and f of Figure 9), the expression level of elastin expressed in the fibroblasts (d and f of Figure 9) and the expression level of MMP1 expressed in the fibroblasts (Fig. 9e And f) graphs and photographs showing the results of the comparison.
  • a of FIG. 9 as the concentration of GDF11 increases, fibroblast proliferation is promoted.
  • b and f of FIG. 9 as the concentration of GDF11 increases, the expression of type 1 collagen is promoted.
  • GDF11 has an effect of promoting the regeneration and wrinkle improvement of the skin involved in the collagen and elastin.

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Abstract

본 발명은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용 약학 조성물, 주름개선용 약학 조성물, 창상 치료용 약학 조성물, 피부재생용 의약외품 조성물, 주름개선용 의약외품 조성물, 창상 치료용 의약외품 조성물, 피부재생용 화장료 조성물, 주름개선용 화장료 조성물, 창상 개선용 화장료 조성물, 섬유아세포 배양용 배지 조성물, 상기 배지 조성물을 이용하여 섬유아세포를 배양하는 방법 및 상기 줄기세포를 배양하여 GDF11을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 GDF11은 인간 유래 성체 줄기세포 배양액에 포함되어 섬유아세포의 증식을 촉진시키는 효과를 나타내므로, 보다 다양한 피부재생용, 주름개선용 또는 창상 치료용 제품의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

GDF11을 포함하는 조성물 및 그의 용도
본 발명은 GDF11을 포함하는 조성물 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용 약학 조성물, 주름개선용 약학 조성물, 창상 치료용 약학 조성물, 피부재생용 의약외품 조성물, 주름개선용 의약외품 조성물, 창상 치료용 의약외품 조성물, 피부재생용 화장료 조성물, 주름개선용 화장료 조성물, 창상 개선용 화장료 조성물, 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 피부 재생 방법, 주름 개선 방법, 창상 치료 방법, 섬유아세포 배양용 배지 조성물, 상기 배지 조성물을 이용하여 섬유아세포를 배양하는 방법 및 상기 줄기세포를 배양하여 GDF11을 제조하는 방법에 관한 것이다.
최근 현대인들은 건강한 삶에 대한 관심이 증가하고 있으며, 생활수준이 향상되고 여성의 사회진출 증가, 고령화 사회 등의 변화로 소비자들의 화장품에 대한 욕구는 단순히 아름답게 꾸미기 위한 용도에서 점차 기능적 측면이 강조된 화장품에 관심도가 높아지면서 인체에 무해한 천연 물질에서 찾으려는 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 피부노화는 복합적인 생물학적 현상으로 크게 두 가지 요인으로 구분할 수 있는데 시간이 지남에 따라 진행되는 자연노화(내인성노화)와 외부환경, 특히 자외선에 희한 광노화로 나눈 수 있다. 피부는 항상 산소와 태양관선에 노출되어 있어 이로부터 유발되는 산화적 스트레스는 피부노화를 촉진한다. 피부는 다양한 환경적 요인과 항상 접촉하고 있기 때문에 산화적 스트레스 요인의 공격에 직접적으로 노출되어 있으며, 피부가 다량의 자외선에 노출되면, 피부에서 활성산소종(ROS)이 과잉으로 생성되어, 항산화 방어계는 붕괴되며, 결국 노화를 촉진 시킨다.
인체의 중성구 과립구내에 존재하는 엘라스타제는 진피 내 피부탄력을 유지하는데 중요한 기질 단백질인 엘라스틴을 분해하는 효소이며, 다른 중요한 기질 단백질인 콜라겐을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이다. 상기 엘라스타제의 저해제는 피부 주름을 개선하는 작용을 나타내며, 우르솔산 등이 엘라스타제 저해제로 이용되고 있지만, 우르솔산은 물이나 오일 등의 용매에는 잘 녹지 않는 성질을 가지고 있기 때문에 제제화하기 어려워 일반적으로 사용하기 어려운 문제점이 있다.
콜라겐은 대부분 피부의 진피층에 존재하며, 피부 전체 건조중량의 약 70~80%를 차지하고 있으며, 세포 외 기질(extracellular matrix)의 주요 구성 성분인 collagen은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질이다. 콜라겐의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 자외선 조사에 의해 콜라겐의 분해 효소인 collagenase의 발현이 촉진되며, 이는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다.
또한, 기질 단백질의 결핍은 광노화에 있어 중요한 인자중 하나이며, 자외선에 의해 세포 사이를 채우는 성분인 교원질과 탄력질의 합성이 감소하게 되면 다양한 기질 단백질 분해 효소의 발현이 증가 하게 된다. 따라서, 피부 노화의 주된 원인인 콜라겐과 엘라스틴 분해효소인 콜라게나제와 엘라스타제에 의해 분해되며, 진피 층은 피부의 물리 화학적인 성질을 결정하여 모세혈관과 표피에 영양을 공급해주는 중요한 역할을 하므로 피부의 노화와 밀접한 관련이 있다.
종래에는 콜라겐의 주름개선 효과를 이용하기 위하여 화장품 또는 연고 등과 같은 피부외용제 조성물에 콜라겐을 배합한 제품들이 출시되었으나, 이들 제품들은 콜라겐 자체를 피부 표면에 도포하는 것으로 고분자 물질인 콜라겐의 경피 흡수가 어려워 본질적인 주름개선 효과를 나타낼 수 없었다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 콜라겐합성 촉진물질에 대한 관심이 높아졌으며, 종래 알려진 콜라겐합성 촉진물질로는 비타민C, 레티노익산, 형질전환생장인자(transforming growth factor, TGF), 동물태반 유래의 단백질(JP8-231370), 베툴린산(betulinic acid, JP8-208424), 클로렐라추출물(JP9-40523, JP10-36283, 섬유아세포 증식 촉진작용) 등이 있다.
최근에는 줄기세포에 대한 관심이 높아지면서, 분화능을 갖는 줄기세포 또는 그의 추출물이 피부노화를 억제할 수 있음이 보도되었고, 이에 따라 줄기세포를 이용하여 피부노화를 억제하는 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 한국공개특허 제2009-0116659호에는 줄기세포 배양액을 포함하는 주름개선, 미백 또는 노화방지용 화장료 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 이러한 줄기세포 배양액에는 무수하게 많은 성분이 포함되어 있기 때문에, 실질적인 주름개선 효과를 나타내는 성분이 무엇인지 아직까지는 확인되지 않았다. 만일, 이러한 주름개선 효과를 나타낼 수 있는 유효성분이 규명되면, 보다 효과적으로 주름을 개선할 수 있는 제품이 개발될 것으로 예상되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 없는 실정이다.
본 발명자들은 종래에 피부의 주름개선효과가 있다고 알려진 인간 유래 성체 줄기세포 배양액으로부터 피부주름을 개선시킬 수 있는 유효성분을 발굴하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 상기 배양액에 포함된 GDF11이 섬유아세포의 증식을 촉진할 뿐만, 아니라, 피부주름을 개선시킬 수 있는 콜라겐의 합성수준을 증가시키고, 콜라게나제의 활성을 억제하여, 피부주름 개선효과를 나타내는 유효성분임을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 주름개선용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 창상 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 주름개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 창상 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 주름개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 창상 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 섬유아세포 배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 배지 조성물을 사용하여 섬유아세포를 배양하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 유래 성체 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 GDF11의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 창상 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 재생 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 주름 개선 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액의 창상 치료 용도, 피부 재생 용도, 또는 주름 개선 용도를 제공하는 것이다.
본 발명에서 제공하는 GDF11은 인간 유래 성체 줄기세포 배양액에 포함되어 섬유아세포의 증식을 촉진시키는 효과를 나타내므로, 보다 다양한 피부재생용, 주름개선용 또는 창상 치료용 제품의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포의 증식능에 미치는 영향을 비교한 결과를 나타내는 사진(A), 흡광도 수준을 나타내는 그래프(B), 세포수 수준을 나타내는 그래프(C) 및 단백질 발현총량의 수준을 나타내는 그래프(D)이다.
도 2는 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포의 이동성에 미치는 영향을 비교한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 3a는 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포에서 발현되는 다양한 기질단백질의 단백질 발현수준에 미치는 영향을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 3b는 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포에서 발현되는 다양한 기질단백질의 발현수준에 미치는 영향을 비교한 결과를 나타내는 RT-PCR 분석사진이다.
도 4a는 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)의 창상 치료효과를 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다.
도 4b는 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 처리된 창상 동물모델의 창상부위의 면적을 비교한 결과를 나타내는 조직사진이다.
도 5의 a는 RT-PCR 및 realtime qPCR을 수행하여 섬유아세포(HDF), 인간 지방 유래 줄기세포(AD-MSC) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(UCB-MSC)에서 발현되는 GDF11 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 5의 b는 RT-PCR을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 6의 a는 대조군(CTL)으로 사용된 인간 골수 유래 줄기세포 배양액(BM-MSC CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)에 포함된 GDF11의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이고, 도 6의 b는 상기 웨스턴블럿 분석결과를 정량분석한 그래프이다.
도 7의 a는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 증식에 미치는 GDF11의 효과를 나타내는 그래프이고, 도 7b는 상기 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 GDF11의 발현억제에 따른 콜라겐의 발현수준 변화를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 8은 대조군(a), EGF(b), bFGF(c), TGF-beta1(d) 또는 vEGF(e)이 처리된 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 처리시간 및 농도에 따른 GDF11의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 GDF11이 처리된 섬유아세포에서 섬유아세포의 증식수준(도 9의 a), 상기 섬유아세포에서 발현되는 제1형 콜라겐의 발현수준(도 9의 b 및 f), 상기 섬유아세포에서 발현되는 제3형 콜라겐의 발현수준(도 9의 c 및 f), 상기 섬유아세포에서 발현되는 엘라스틴의 발현수준(도 9의 d 및 f) 및 상기 섬유아세포에서 발현되는 MMP1의 발현수준(도 9의 e 및 f)을 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다.
본 발명자들은 종래에 피부의 주름개선효과가 있다고 알려진 인간 유래 성체 줄기세포 배양액으로부터 피부주름을 개선시킬 수 있는 유효성분을 발굴하기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 치매예방 또는 치료효과가 있다고 알려진 GDF11(growth differentiation factor 11)에 주목하게 되었다. 상기 GDF11은 운동능력을 회복시키고, 퇴행된 뇌혈관을 재생시키는 단백질로 알려져 있는데, 섬유아세포의 증식을 촉진시키고, 이동성을 향상시키고, 기질단백질의 발현을 증가시키는 효과를 나타내는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액에 상기 GDF11이 검출됨을 확인하고, 이를 다른 줄기세포의 배양액과 비교한 결과, 다양한 성체줄기세포 중에서도 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 배양하여 수득한 배양액에 다량으로 포함되어 있음을 확인하였다. 이에, 상기 GDF11의 효과를 검증한 결과, GDF11의 발현이 감소되면 인간 유래 성체 줄기세포의 증식속도가 감소하고, 이로부터 발현되는 제3형 콜라겐의 발현수준이 감소함을 확인하였으며, 상기 GDF11의 발현에는 다양한 성장인자(EGF, bFGF, TGF-beta1 또는 vEGF)가 관여할 뿐만 아니라, 섬유아세포에 GDF11을 처리하면, 상기 섬유아세포의 증식을 촉진하고, 상기 섬유아세포에서 콜라겐과 엘라스틴의 발현을 증가시킴을 확인하였다. 따라서, 상기 GDF11은 섬유아세포의 증식촉진에 의하여 유발될 수 있는 창상치료효과, 피부재생효과, 주름개선효과 등을 촉진할 수 있을 것으로 분석되었다.
이처럼 GDF11이 섬유아세포의 증식 및 이로 인한 피부의 창상치료, 주름개선, 피부재생에 관여한다는 사실은 지금까지 전혀 공지되지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용, 주름개선용 또는 창상 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "GDF11(growth differentiation factor 11)"이란, "BMP-11(bone morphogenetic protein 11)"이라고도 하며, 사람의 12번 염색체에 존재하는 GDF11 유전자에 의해 발현되는 단백질을 의미한다. 상기 GDF11은 미오스타틴 유사체 단백질로 알려져 있는데, 신경조직의 성장을 억제하는 억제제로서 작용하는 것으로 알려져 있고, 최근에는 운동능력을 회복시키고, 퇴행된 뇌혈관을 재생시키는 효과를 나타내는 치매예방 또는 치료효과가 있다고 보고되었다. 본 발명의 GDF11의 서열정보는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI) 등과 같은 공지의 데이터 베이스로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 사람 유래의 GDF11 유전자(NM_005811), 사람 유래의 GDF11 단백질(NP_005802), 마우스 유래의 GDF11 유전자(NM_010272), 마우스 유래의 GDF11 단백질(NP_034402) 등이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 GDF11은 섬유아세포의 증식촉진을 통한 피부재생 촉진, 주름개선 촉진, 창상 치료촉진 등의 효과를 나타낼 수 있으므로, 이들 효과를 나나내는 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "인간 유래 성체 줄기세포 배양액"이란, 인간의 성체 줄기세포를 배양하여 수득한 배양물 또는 상기 배양물로부터 줄기세포를 제거한 배양상등액 등을 의미한다. 상기 성체 줄기세포를 배양하여 수득한 배양액에는 상기 성체 줄기세포가 배양하면서 분비한 다양한 물질(예를 들어, GDF1 등)이 포함되어 있어, 상기 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 이용하면 섬유아세포의 증식촉진을 통한 피부재생 촉진, 주름개선 촉진, 창상 치료촉진 등의 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인간 유래 성체 줄기세포 배양액은 인간의 성체 줄기세포를 배양하여 수득한 배양상등액으로 해석될 수 있는데, 이에 사용되는 성체 줄기세포는 GDF11를 배양액으로 분비할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일례로서 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반으로부터 유래된 것일 수 있으며, 본 발명에서는 인간 유래 중간엽 줄기세포 배양액으로서 인간 제대혈유래 중간엽 줄기세포의 배양액을 사용하였다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 섬유아세포의 증식능에 대한 줄기세포 배양액의 효과를 확인한 결과, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포 배양액(HDF CM) 또는 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 보다도 섬유아세포의 증식을 촉진하고, 세포로부터 분비되는 단백질 총량 또한 증가시킬 수 있음을 확인하였고(도 1), 섬유아세포의 이동성을 촉진시킴을 확인하였다(도 2). 또한, 섬유아세포에서 발현되는 다양한 기질단백질(콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴 등)의 발현수준을 상대적으로 높은 수준으로 향상시키고(도 3a 및 3b), 동물모델에서도 상대적으로 우수한 창상치료효과를 나타냄을 확인하였다(도 4a 및 4b).
이러한 효과를 나타내는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액의 유효성분으로서 GDF11(growth differentiation factor 11)을 대상으로 이의 효과를 분석한 결과, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액에서 GDF11가 대량으로 포함되어 있음을 확인하고(도 5의 a 및 b), 상기 GDF11는 인간 골수, 지방 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 보다 높은 수준으로 분비되고 있음을 확인하였다(도 6의 a 및 b). 또한, 상기 GDF11이 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에 미치는 효과를 분석한 결과, GDF11의 발현수준이 억제되면 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 증식이 억제되고, 이로부터 발현되는 제3형 콜라겐의 발현수준이 감소되며(도 7의 a 및 b), 상기 GDF11의 발현에는 EGF, bFGF, TGF-beta1 및 vEGF가 관여함(도 8)을 확인하였다.
상기 GDF11이 섬유아세포에 미치는 영향을 분석한 결과, 섬유아세포의 증식을 촉진시키고, 상기 섬유아세포에서 콜라겐과 엘라스틴의 발현을 증가시킴을 확인하였다.
따라서, 상기 GDF11은 섬유아세포의 증식촉진에 의하여 유발될 수 있는 창상치료효과, 피부재생효과, 주름개선효과 등을 촉진할 수 있을 것으로 분석되었다.
본 발명의 약학 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 피부재생용, 주름개선용 및 창상 치료용 약학 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 GDF11의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 1 X 10-9 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로로 투여하거나 공지된 피부재생용, 주름개선용 및 창상 치료용 약학 조성물과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 100 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 10 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는 창상 치료방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "개체"란 피부재생, 주름개선 또는 창상 치료가 요구되는 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "치료"란, 본 발명의 GDF11을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 피부재생, 주름개선 또는 창상 치료가 요구되는 개체에 투여하여 피부재생, 주름개선 또는 창상 치료가 수행되거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 피부재생, 주름개선 또는 창상 치료용 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 위산에 의하여 상기 GDF11이 변성 또는 분해될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용, 주름개선용 또는 창상 치료용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등이 이에 포함된다. 본 발명의 의약외품 조성물의 종류나 제형은 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 소독 청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제 비누, 핸드 워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터 충진제 등일 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용, 주름개선용 또는 창상 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 GDF11은 상술한 바와 같이, 섬유아세포의 증식을 촉진시킬 수 있으므로, 상기 섬유아세포의 증식에 의하여 유발되는 피부재생, 주름개선 또는 창상 개선효과를 나타내는 기능성 화장품의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "기능성 화장품(cosmedical, cosmeceutical)"이란 화장품에 의약품의 전문적인 치료기능이 도입되어, 일반 화장품과 달리 생리활성적인 효능, 효과가 강조된 전문적인 기능성을 갖는 제품으로서, 피부의 미백에 도움을 주는 제품, 피부 주름개선에 도움을 주는 제품, 피부를 곱게 태우거나 자외선으로부터 피부를 보호하는데 도움을 주는 제품 중에서 보건복지부령이 정하는 화장품을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 기능성 화장품은 다양한 기능성 화장품 중에서 피부재생, 주름개선, 창상개선 효과를 나타내어 피부노화 방지에 도움을 주는 제품을 의미하고, 일 례로서 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장품이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않고, 상기 기능성 화장품에 포함되는 GDF11의 함량 역시 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 기능성 화장품은 상기 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하고, 통상적으로 사용되는 화장료를 추가로 함유할 수 있는데, 예를 들면 수용성 스킨제제화를 위하여 글리세롤, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 솔비톨, 폴리에틸렌글리콜, 카르복시비닐 폴리머, 잔탄검, 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 로커스트빈검, 알란토인, 카라기난 등을 첨가할 수 있으며; 점도와 경도조절제로 밀납, 파라핀 왁스, 스테아릴알콜, 카르나우바 왁스, 칸데릴라 왁스 및 칼슘스테아레이트, 알루미늄스테아레이트, 아연스테아레이트, 위치하젤(witchhazel) 등을 사용할 수 있고; 자외선 흡수제로 부틸메톡시디벤조일메탄, 옥틸메톡시신나메이트 등을 사용할 수 있으며; 안료로는 이산화티탄, 미립자 이산화디탄, 카올린, 나이론 파우다, 탈크, 세리사이트, 마이카, 폴리메틸메타크릴레이트 등의 체질 안료와 황색산화철, 흑색산화철, 적색산화철, 울트라마린, 산화크롬, 수산화크롬 등의 착색안료를 사용할 수 있고; 보습제로 1,3-부틸렌글리콜, 농글리세린, 에틸렌글리콜 등과 키틴, 키토산, 히아론산, 하이알루로닌산, 젖산, 글리콜산 등의 천연보습 물질들을 이용할 수 있으며; 방부제로 파라옥시안식향산 에스테르류, 이미다졸리디닐우레아 등을 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 상기한 성분들을 제품특성에 따라 1종 또는 2종이상 혼용 배합할 수도 있다.
본 발명의 기능성 화장품은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 섬유아세포 배양용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용하여 섬유아세포를 배양하는 방법을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액은 섬유아세포의 증식을 촉진시킬 수 있으므로, 상기 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액은 섬유아세포를 배양하기 위한 배양용 배지 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있고, 상기 섬유아세포를 배양하기 위한 배양용 배지 조성물을 사용하여 섬유아세포를 배양할 수 있다.
한편, 본 발명에서 제공하는 섬유아세포의 배양방법은 상기 섬유아세포 배양용 배지 조성물에 섬유아세포를 접종하고 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 인간 유래 성체 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 GDF11의 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 GDF11의 제조방법은 (a) 인간 유래 성체 줄기세포를 배양하고, 배양상등액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 배양상등액으로부터 GDF11을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 용어 "배양"이란, 세포를을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 전반적인 행위를 의미한다.
본 발명의 목적상 상기 배양은 본 발명에서 제공하는 줄기세포를 배양하여 배양상등액으로 분비되는 GDF11을 제조하기 위한 목적으로 수행되며, 이러한 배양방법은 특별히 제한되지 않고, 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있으며, 배양온도는 특별히 이에 제한되지 않으나 일 예로서, 30 내지 40℃, 다른 예로서 33 내지 37℃, 또 다른 예로서 37℃가 될 수 있고, 배양시간 역시 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 5 내지 15일, 다른 예로서 7 내지 10일, 또 다른 예로서 7일이 될 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으며; 인 공급원으로서 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
또한, 줄기세포의 원활한 증식을 촉진할 수 있도록, EGF, bFGF, vEGF, TGF-β1 등의 다양한 성장인자를 상기 배지에 추가로 포함할 수 있다.
아울러, 배양물로부터 GDF11을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 공지된 GDF11 회수 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용함이 바람직하다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 피부 재생 방법을 제공한다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 주름 개선 방법을 제공한다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액의 창상 치료 용도, 피부 재생 용도, 또는 주름 개선 용도를 제공한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 줄기세포 배양액의 수득
실시예 1-1: 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액의 수득
제대혈로부터 분리된 인간 제대혈 줄기세포(1.89 X 105 세포수)를 10% FBS를 포함하는 EGM-2(endothelial growth medium)에 접종하고, 37 ℃ 및 5% CO2 조건에서 48시간 동안 배양하고, 배양된 세포를 수득하였다. 상기 수득한 세포를 다시 H1 배지에 접종하고, 96시간 동안 배양한 다음, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액을 수득하였다. 이때, H1 배지로는 EGF, bFGF, vEGF 및 TGF-β1을 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다.
실시예 1-2: 인간 지방 유래 줄기세포 배양액의 수득
흡입지방조직을 PBS로 세척하고, 1㎕/㎖의 프리모신(primocin) 및 1mg/㎖의 제1형 콜라게나아제를 가한 다음, 37℃에서 2시간동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 원심분리(2000rpm, 5분)하여 침전된 세포를 수득하고, 상기 세포를 배양액(0.2% primocin, 1% glutamax 및 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지)에 현탁시키고, 여과한 다음, 다시 원심분리(1000rpm, 5분)하여 침전된 세포를 수득하였다. 상기 수득한 세포를 용해완충액(ACK lysing buffer, Gibco)에 넣고 1분 동안 반응시켰다. 이어, 상기 세포(1.89 X 105 세포수)를 PBS로 세척하고, K-NAC 배지(5% FBS, 20mM ascorbic acid 1% 및 400mM N-acetyl-L-cysteine 0.5%를 포함하는 keratinocyte-SFM media)에 접종하여 37℃ 및 5% CO2 조건에서, 48시간 동안 배양하고, 배양된 세포를 수득하였다. 상기 수득한 세포를 다시 무혈청배지(H1 media, DMEM 배지)에 접종하고, 96시간 동안 배양한 다음, 인간 지방 유래 줄기세포 배양액을 수득하였다.
실시예 2: 섬유아세포의 증식능에 대한 세포 배양액의 효과
섬유아세포(HDFs)를 96-웰 플레이트에 각 웰당 1 X 103 세포수의 밀도로 접종하고, 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 섬유아세포 배양액, 실시예 1-1에서 수득한 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액 또는 실시예 1-2에서 수득한 인간 지방 유래 줄기세포 배양액을 가하고 72시간 동안 배양하였다. 이때, 대조군으로는 H1 배지를 가하고 배양한 것을 사용하였다. 배양이 종료된 후, 상기 배양물에 CCK-8 kit에 포함된 CCK-8 10㎕를 가하고, 3시간 동안 반응시킨 다음, 450nm에서 흡광도를 측정하여 각 섬유아세포의 증식능을 측정 및 비교하였다(도 1).
도 1은 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포의 증식능에 미치는 영향을 비교한 결과를 나타내는 사진(A), 흡광도 수준을 나타내는 그래프(B), 세포수 수준을 나타내는 그래프(C) 및 단백질 발현총량의 수준을 나타내는 그래프(D)이다. 도 1에서 보듯이, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포 배양액(HDF CM) 또는 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 보다도 섬유아세포의 증식을 촉진하고, 세포로부터 분비되는 단백질 총량 또한 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 3: 섬유아세포의 이동성 분석
섬유아세포를 6-웰 플레이트에 각 웰당 2 X 105 세포수의 밀도로 접종하고, 48시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 배지를 제거하고, 배양용기의 바닥에 스크래치를 형성시킨 다음, PBS로 세척하였다. 이어, 섬유아세포 배양액, 실시예 1-1에서 수득한 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액 또는 실시예 1-2에서 수득한 인간 지방 유래 줄기세포 배양액을 가하고 72시간 동안 배양하였다. 이때, 대조군으로는 H1 배지를 가하고 배양한 것을 사용하였다. 배양이 종료된 후, 상기 스크래치 부위로 이동된 섬유아세포의 수준을 현미경으로 확인하였다(도 2).
도 2는 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포의 이동성에 미치는 영향을 비교한 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 2에서 보듯이, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포 배양액(HDF CM) 또는 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 보다도 섬유아세포의 이동성을 촉진시킴을 확인하였다.
실시예 4: 섬유아세포의 기질단백질의 발현분석
실시예 4-1: 웨스턴블럿 분석
섬유아세포를 6-웰 플레이트에 각 웰당 2 X 105 세포수의 밀도로 접종하고, 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 섬유아세포 배양액, 실시예 1-1에서 수득한 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액 또는 실시예 1-2에서 수득한 인간 지방 유래 줄기세포 배양액을 가하고 24시간 동안 배양한 다음, 배양된 각 섬유아세포를 대상으로 제1형 콜라겐(collagen I), 제4형 콜라겐(collagen IV), 피브로넥틴(Fibronectin) 또는 엘라스틴(Elastin)에 대한 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 3a). 이때, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
도 3a는 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포에서 발현되는 다양한 기질단백질의 단백질 발현수준에 미치는 영향을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 3a에서 보듯이, 피브로넥틴과 엘라스틴은 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 처리된 섬유아세포에서 상대적으로 가장 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다.
실시예 4-2: RT-PCR 분석
상기 실시예 4-1에서 배양된 각 섬유아세포로부터 총 RNA를 수득하고, RT-Premix(Bioneer)를 이용하여 각각의 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA를 주형으로 하고 하기 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, mRNA 수준에서 제1형 콜라겐(Type I collagen), 제3형 콜라겐(Type III collagen) 또는 피브로넥틴(Fibronectin)의 발현수준을 비교하였다(도 4b). 이때, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
collagen type I F: 5'-tcaaggtttccaaggacctg-3'(서열번호 1)
collagen type I R: 5'-tcaaggtttccaaggacctg-3'(서열번호 2)
collagen type III F: 5'-aaaggggagctggctacttc-3'(서열번호 3)
collagen type III R: 5'-gcgagtaggagcagttggag-3'(서열번호 4)
fibronectin F: 5'-tgaagaggggcacatgctga-3'(서열번호 5)
fibronectin R: 5'-gtgggagttgggctgactcg-3'(서열번호 6)
도 3b는 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포에서 발현되는 다양한 기질단백질의 발현수준에 미치는 영향을 비교한 결과를 나타내는 RT-PCR 분석사진이다. 도 3b에서 보듯이, 제3형 콜라겐과 피브로넥틴은 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 처리된 섬유아세포에서 상대적으로 가장 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다.
실시예 5: 창상 동물모델의 치료효과 분석
먼저, 5주령의 누드마우스 등쪽에 바이옵시 펀치(biopsy Punch)를 이용하여 6mm 피부 전층박리상처를 유도하여, 창상 동물모델을 제작하였다.
24시간이 경과된 후, 상기 제작된 창상 동물모델의 창상부위에 각각 200㎕의 섬유아세포 배양액, 실시예 1-1에서 수득한 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액 또는 실시예 1-2에서 수득한 인간 지방 유래 줄기세포 배양액을 도포하고 실리콘 밴드를 사용하여 창상부위에 상기 각 배양액을 고정시켰다. 72시간 후에 동일한 작업을 반복수행하였다. 이때, 대조군으로는 H1 배지를 도포한 창상 동물모델을 사용하였다. 끝으로, 상기 도포된 창상 동물모델을 7일 동안 사육한 다음, 상처크기의 감소수준을 비교하였다(도 4a).
도 4a는 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)의 창상 치료효과를 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다. 도 4a에서 보듯이, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 가장 우수한 창상치료효과를 나타냄을 확인하였다.
한편, 상기 동물모델의 창상부위를 적출하고, 창상부위의 단면을 비교하였다(도 4b).
도 4b는 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 처리된 창상 동물모델의 창상부위의 면적을 비교한 결과를 나타내는 조직사진이다. 도 4b에서 보듯이, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 가장 우수한 창상치료효과를 나타냄을 다시한번 확인하였다.
실시예 6: GDF11(growth differentiation factor 11)에 대한 분석
실시예 6-1: GDF11에 대한 RT-PCR 분석
H1 배지를 사용하여 배양된 섬유아세포, 실시예 1-1에서 수득한 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 또는 실시예 1-2에서 수득한 인간 지방 유래 줄기세포로부터 각각의 총 RNA를 수득하고, 이로부터 각각의 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 각 cDNA를 주형으로 하고, 하기의 프라이머를 사용한 realtime qPCR 및 PCR을 수행하여 GDF11의 mRNA 수준을 비교하였다(도 5의 a 및 b). 이때, 내부대조군으로는 RPL13A를 사용하였다.
GDF11 F: 5'-gatcctggacctacacgacttc-3'(서열번호 7)
GDF11 R: 5'-ggccttcagtacctttgtgaac-3'(서열번호 8)
RPL13A F: 5'-gcacgaccttgagggcagcc-3'(서열번호 9)
RPL13A R: 5'-catcgtggctaaacaggtactg-3'(서열번호 10)
도 5의 a는 RT-PCR 및 realtime qPCR을 수행하여 섬유아세포(HDF), 인간 지방 유래 줄기세포(AD-MSC) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(UCB-MSC)에서 발현되는 GDF11 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 5의 b는 RT-PCR을 수행한 결과를 나타내는 사진이다. 도 5의 a 및 b에서 보듯이, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(UCB-MSC)에서 GDF11가 대량으로 발현됨을 확인하였다.
실시예 6-2: GDF11에 대한 웨스턴블럿 분석
섬유아세포 배양액, 실시예 1-1에서 수득한 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액 또는 실시예 1-2에서 수득한 인간 지방 유래 줄기세포 배양액을 여과한(0.22um syringe filter) 다음, 이들 각 배양액을 농축하고, 농축된 각 배양액을 대상으로 GDF11에 대한 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 6의 a 및 b).
도 6의 a는 대조군(CTL)으로 사용된 인간 골수 유래 줄기세포 배양액(BM-MSC CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)에 포함된 GDF11의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이고, 도 6의 b는 상기 웨스턴블럿 분석결과를 정량분석한 그래프이다. 도 6a 및 6b에서 보듯이, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)에 상대적으로 높은 수준의 GDF11가 포함되어 있음을 확인하였다.
실시예 7: 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 GDF11의 기능분석
실시예 7-1: 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 증식에 미치는 GDF11의 기능분석
인간 제대혈 줄기세포를 6-웰 플레이트에 각 웰당 2 X 105 세포수의 밀도로 접종하고, 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 배양된 세포에 각각 25nM의 대조군 siRNA 또는 GDF11에 대한 siRNA(siGDF11)를 처리하고, 72시간 동안 배양하였다. 이어, 상기 각 세포를 계대배양한 후, 동일한 조건의 siRNA를 각각 처리하고 배양하였다. 배양이 종료된 후, 상기 세포를 수득하고, 이를 24웰 플레이트에 각 웰당 4 X 104 세포수의 밀도로 접종한 다음, 2일 동안 배양하면서, 실시예 2의 방법에 따라, 이들 세포의 증식능을 비교하고(도 7의 a), 실시예 4-1 및 6-1의 방법에 따라 상기 각 세포에서 발현되는 GDF11, 제1형 콜라겐(collagen I) 및 제3형 콜라겐(collagen III)의 mRNA 수준을 비교하였다(도 7의 b). 이때, 내부대조군으로는 RPL13A를 사용하였다.
도 7의 a는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 증식에 미치는 GDF11의 효과를 나타내는 그래프이고, 도 7b는 상기 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 GDF11의 발현억제에 따른 콜라겐의 발현수준 변화를 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 7의 a에서 보듯이, GDF11의 발현이 감소되면 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 증식속도가 감소됨을 확인하였고, 도 7의 b에서 보듯이, GDF11의 발현이 감소되면 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 제3형 콜라겐의 발현수준이 감소됨을 확인하였다.
실시예 7-2: 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 GDF11의 발현기전 분석
인간 제대혈 줄기세포를 100mm 배양용기에 5 X 105 세포수의 밀도로 접종하고, 80 내지 90%의 포화도가 되면, 6-웰 플레이트에 각 웰당 2 X 105 세포수의 밀도로 접종하고, 24시간 동안 배양하였다. 이어, 100X 글루타맥스(glutamax)를 포함하는 DMEM 배지로 교체하고, EGF, bFGF, vEGF 또는 TGF-beta1을 각각 1 또는 10ng/㎖의 농도로 처리하였으며, 1, 3 및 6일 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 각 세포로부터 총 RNA를 수득하고, 이로부터 cDNA를 합성한 다음, SYBR Green PCR 장치를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다(도 8의 a 내지 e). 이때, 대조군으로는 H1 배지를 처리한 세포를 사용하였다.
도 8은 대조군(a), EGF(b), bFGF(c), TGF-beta1(d) 또는 vEGF(e)이 처리된 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 처리시간 및 농도에 따른 GDF11의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 8에서 보듯이, 각각의 경우에 모두 GDF11발현이 증가함을 확인하였고, 6일차때 가장 높은 발현을 확인하였다. 또한, 상기 4가지 인자를 동시에 처리한 경우 발현이 더욱 증가함을 확인하였다.
이러한 결과는, 상기 4가지 인자가 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 GDF11발현 조절에 관여함을 암시하는 것으로 분석되었다.
실시예 8: 섬유아세포에서 GDF11의 기능분석
섬유아세포를 배양하면서, 0, 0.01, 0.1 또는 0.2㎍/㎖의 GDF11을 처리하고, 배양이 종료된 후, 섬유아세포의 증식수준, 상기 섬유아세포에서 발현되는 제1형 콜라겐의 발현수준, 상기 섬유아세포에서 발현되는 제3형 콜라겐의 발현수준, 상기 섬유아세포에서 발현되는 엘라스틴의 발현수준 및 상기 섬유아세포에서 발현되는 MMP1의 발현수준을 비교분석하였다(도 9).
도 9는 GDF11이 처리된 섬유아세포에서 섬유아세포의 증식수준(도 9의 a), 상기 섬유아세포에서 발현되는 제1형 콜라겐의 발현수준(도 9의 b 및 f), 상기 섬유아세포에서 발현되는 제3형 콜라겐의 발현수준(도 9의 c 및 f), 상기 섬유아세포에서 발현되는 엘라스틴의 발현수준(도 9의 d 및 f) 및 상기 섬유아세포에서 발현되는 MMP1의 발현수준(도 9의 e 및 f)을 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다. 도 9의 a에서 보듯이, GDF11의 농도가 증가할 수록, 섬유아세포의 증식이 촉진되고, 도 9의 b 및 f에서 보듯이, GDF11의 농도가 증가할 수록, 제1형 콜라겐의 발현이 촉진되지만, 과도하게 증가하면 오히려 발현이 억제됨을 확인하였으며, 도 9의 c 및 f에서 보듯이, GDF11의 농도가 증가할 수록, 제3형 콜라겐의 발현이 촉진되고, 도 9의 d 및 f에서 보듯이, GDF11의 농도가 증가할 수록, 엘라스틴의 발현이 촉진되지만, 과도하게 증가하면 오히려 발현이 억제됨을 확인하였으며, 도 9의 e 및 f에서 보듯이, GDF11의 농도가 증가할 수록, MMP1의 발현이 억제되지만, 과도하게 증가하면 오히려 발현이 증가됨을 확인하였다.
상기 결과로부터, GDF11이 상기 콜라겐 및 엘라스틴이 관여하는 피부의 재생 및 주름개선을 촉진하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

Claims (19)

  1. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용 약학 조성물.
  2. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 주름개선용 약학 조성물.
  3. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 창상 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 유래 성체 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반으로부터 유래된 것인 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    섬유아세포의 증식을 촉진시키는 것인 조성물.
  7. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용 의약외품 조성물.
  8. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 주름개선용 의약외품 조성물.
  9. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 창상 치료용 의약외품 조성물.
  10. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용 화장료 조성물.
  11. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 주름개선용 화장료 조성물.
  12. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 창상 개선용 화장료 조성물.
  13. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 섬유아세포 배양용 배지 조성물.
  14. 제13항의 섬유아세포 배양용 배지 조성물에 섬유아세포를 접종하고 배양하는 단계를 포함하는, 섬유아세포의 배양방법.
  15. (a) 인간 유래 성체 줄기세포를 배양하고, 배양상등액을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 수득한 배양상등액으로부터 GDF11(growth differentiation factor 11)을 회수하는 단계를 포함하는, GDF11의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 인간 유래 성체 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반으로부터 유래된 것인 방법.
  17. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 창상 치료 방법.
  18. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 피부 재생 방법.
  19. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 주름 개선 방법.
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