CN107828724A - 一种用于培养脂肪干细胞的培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物培养技术领域，尤其涉及一种用于培养脂肪干细胞的培养基及其制备方法，所述用于培养脂肪干细胞的培养基，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂包括以下物质：蛋白胨，氯化钠，葡萄糖，乳糖、磷源，猪胆盐、甘露醇，丙酮酸钠，氨基酸，维生素，抗生素，金属盐，植物多糖，蒸馏水。本发明的培养基中含有植物多糖，不仅能够抑制除脂肪干细胞以外的其它细胞的生长，还能够促进脂肪干细胞的繁殖，有助于提高培养基中脂肪干细胞的浓度，缩短培养时间；通过各成分间协同作用，能提供细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，能够促进细胞的生长，还能够促进白蛋白的合成，长时间维持细胞活力。

Description

一种用于培养脂肪干细胞的培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物培养技术领域，尤其涉及一种用于培养脂肪干细胞的培养基及其制备方法。

背景技术

脂肪干细胞（Adipose-derivedstemcells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，具有可迅速扩增、不易衰老等一般干细胞的特点。人脂肪干细胞即人体脂肪间充质干细胞是目前广泛应用于组织工程及再生医学领域的一种成体干细胞与骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能。ADSCs呈成纤维细胞样生长，胞浆和核仁丰富，呈平行或漩涡样排列。细胞周期分析显示G0/G1期的细胞占69%，S期占24%，G2/M期占8%。在胎牛血清的存在条件下传代培养2-3天细胞增殖1倍。多次传代(10-20代)后，细胞增殖速度无明显减慢，在传代6次后细胞群体中出现衰老细胞，第15代细胞群体中衰老细胞约占15%。

目前常用的脂肪干细胞培养方法获得脂肪干细胞数有限，脂肪干细胞增殖生长缓慢，经过传代培养3代需要30天以上，得到的脂肪干细胞数量低于10⁸。而且脂肪干细胞传代扩增不能超过5代，否则脂肪干细胞易出现分化和凋亡，细胞增殖和修复的功能明显也下降，具有干细胞特征的细胞显著减少，不能保证脂肪干细胞的活性。所以为保证实验的连续性，必须随时提供大量的实验或组织工程用的种子细胞。因此，对于细胞培养基的需求非常强烈。

在现有技术中，脂肪干细胞在体外连续培养后，容易老化，核型发生改变、表面抗原发生变化、且多向分化能力仅局限于向成骨或成骨和成脂肪细胞方向分化，且培养方法复杂，提取的干细胞数量少，纯度不高，继代增殖缓慢，更要紧的是使用饲养层细胞和动物血清容易导致干细胞污染，特别是动物血清内潜在动物源性内毒素或病毒将对人体健康构成极大地风险，这样培养出的干细胞不适于直接应用于临床，限制了其在脂肪组织工程及其他组织工程中研究和应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的主要目的是提供一种用于培养脂肪干细胞的培养基及其制备方法，克服使用血清制备细胞培养基的缺点和风险，具有培养效率高的特点。

为解决上述问题，本发明提供了一种用于培养脂肪干细胞的培养基，包括基础培养基和添加剂，以质量份数计，所述添加剂包括以下物质：蛋白胨2~16份，氯化钠1~9份，葡萄糖0.1~5份，乳糖0.2~6份、磷源0.8~3.8份，猪胆盐0.02~0.12份、甘露醇0.2~2.6份，丙酮酸钠0.5~2.6份，氨基酸0.2~2.8份，维生素0.2~3.6份，抗生素0.1~2份，金属盐0.02~0.58份，植物多糖0.01~0.5份，蒸馏水1000份。

优选的，所述用于培养脂肪干细胞的培养基，以质量份数计，所述添加剂包括以下物质：蛋白胨5~12份，氯化钠2~6份，葡萄糖1~3份，乳糖0.8~5.6份、磷源1.2~2.8份，猪胆盐0.05~0.1份、甘露醇0.3~2.1份，丙酮酸钠0.8~2.0份，氨基酸0.5~2.1份，维生素0.5~2.3份，抗生素0.5~1.2份，金属盐0.12~0.36份，植物多糖0.23~0.44份，蒸馏水1000份。

优选的，所述用于培养脂肪干细胞的培养基，以质量份数计，以质量份数计，所述添加剂包括以下物质：蛋白胨7份，氯化钠3份，葡萄糖2份，乳糖2.6份、磷源1.8份，猪胆盐0.08份、甘露醇1.6份，丙酮酸钠1.8份，氨基酸2.3份，维生素1.9份，抗生素1.2份，金属盐0.43份，植物多糖0.27份，蒸馏水1000份。

本发明对基础培养基的种类没有特殊的要求，可以为本领域技术人员所常知，例如，所述培养基选自MEM培养基、DMEM培养基、DMEM-F12培养基（1:1）、HB培养基、BEM培养基中的一种，优选为DMEM-F12培养基。

本发明中，蛋白胨为细菌的生长提供氮源和碳源，是维持细胞生长的重要因素，本发明中，所述蛋白胨可以为植物蛋白胨或动物蛋白胨，优选的，所述蛋白胨为大豆蛋白胨、血液蛋白胨、胰蛋白胨、肉蛋白胨中的至少一种。

多糖是由10个以上的单糖分子组成的糖称为多糖，植物多糖是从植物中提取的多糖，为天然多糖，具有优秀的生物活性，是优质且无任何毒副作用的免疫调节剂，是维持干细胞正常生长的必要因素，多糖不仅能够促进脂肪干细胞正常生长，而且可以活化干细胞，修复和增殖干细胞的作用，此外植物多糖还能够抑制非脂肪干细胞的其他干细胞的生长和繁殖，从而提高脂肪干细胞的对营养物质的吸收效率，提高脂肪干细胞的密度和缩短其培养时间。优选的，所述植物多糖为枸杞多糖、巴戟天多糖、黄芪多糖、柴胡多糖、艾叶多糖、当归多糖、茯苓多糖、香菇多糖、车前子多糖、红枣多糖、银耳多糖中的至少一种。本发明中植物多糖的提取方法为所述领域技术人员所知，本发明在此不再赘述。

氨基酸是生长因子的一种，微生物生长所需要的生长因子量很小，而且微生物本身不能合成或合成量不足，不能满足机体生长所需要，微生物的生长或酶的合成需要氨基酸，但是微生物本身缺乏合成氨基酸的能力，必须在培养基中添加氨基酸或含有氨基酸的多肽，才能维持细菌的正常生长。优选的，所述氨基酸为甘氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-组氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-天冬氨酸和L-天冬酰胺中的至少一种。

抗生素能够抑制其它菌种的繁殖，防止其它菌种对培养基造成的污染，优选的，所述抗生素为β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、多肽类抗生素中的至少一种，更优选的，所述β-内酰胺类抗生素为青霉素G、青霉素V、苄星青霉素、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、氟氯西林、氯唑西林、双氯西林中的至少一种；所述氨基糖苷类抗生素为霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小诺霉素、阿斯霉素中的至少一种；所述多肽类抗生素为万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁中的至少一种。

磷酸盐既可以为微生物提供足够的磷元素，也可以缓冲培养基中pH值，优选的，所述磷源为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾中的至少一种。

金属盐也是维持细胞生长的另一个重要因素，优选的，所述金属盐为铁盐、铜盐、锌盐、钴盐、锰盐、铬盐、硒盐、镍盐、钼盐、钒盐、锡盐、锶盐中的至少一种。

一种用于培养脂肪干细胞的培养基的制备方法，包括以下步骤：

（1）将DMEM:F12的干粉溶解在水中得到基础培养基；

（2）将蛋白胨，氯化钠，葡萄糖，乳糖、磷源，猪胆，甘露醇，丙酮酸钠，氨基酸，维生，抗生素，金属盐，植物多糖加入到基础培养基中，搅拌至完全溶解；

（3）调节pH值至7.2～7.4，用0.22μm的透析袋过滤除菌，即得用于培养脂肪干细胞的培养基。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

本发明的培养基中不含有血清，提高了培养基的安全性；

本发明的培养基中含有植物多糖，不仅能够抑制除脂肪干细胞以外的其它细胞的生长，还能够促进脂肪干细胞的繁殖，有助于提高培养基中脂肪干细胞的浓度，缩短培养时间；

本发明中干细胞生长良好，细胞形态、密度与含有血清的培养基相当，且细胞功能和活力明显优于含血清培养基，克服了传统含血清培养基的缺陷；各成分间协同作用，能提供细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，能够促进细胞的生长，还能够促进白蛋白的合成，长时间维持细胞活力。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本实施例提供了一种用于培养脂肪干细胞的培养基，包括基础培养基和添加剂，以质量份数计，所述添加剂包括以下物质：

大豆蛋白胨7份，氯化钠3份，葡萄糖2份，乳糖2.6份、磷源1.8份，猪胆盐0.08份、甘露醇1.6份，丙酮酸钠1.8份，甘氨酸2.3份，维生素1.9份，β-内酰胺类抗生素1.2份，铁盐0.43份，枸杞多糖0.27份，蒸馏水1000份；

本实施例还提供了该用于培养脂肪干细胞的培养基的制备方法，包括以下步骤：

（1）将DMEM:F12的干粉溶解在水中得到基础培养基；

（2）将大豆蛋白胨，氯化钠，葡萄糖，乳糖、磷源，猪胆，甘露醇，丙酮酸钠，甘氨酸，维生素，β-内酰胺类抗生素，铁盐，枸杞多糖加入到基础培养基中，搅拌至完全溶解；

（3）调节pH值至7.2，用0.22μm的透析袋过滤除菌，即得用于培养脂肪干细胞的培养基。

实施例2

本实施例提供了一种用于培养脂肪干细胞的培养基，包括基础培养基和添加剂，以质量份数计，所述添加剂包括以下物质：

血液蛋白胨5份，氯化钠2份，葡萄糖1份，乳糖0.8份、磷源1.2份，猪胆盐0.05份、甘露醇0.3份，丙酮酸钠0.8份，L-谷氨酰胺0.5份，维生素0.5份，氨基糖苷类抗生素0.5份，铜盐0.12份，黄芪多糖0.23份，蒸馏水1000份；

本实施例还提供了该用于培养脂肪干细胞的培养基的制备方法，包括以下步骤：

（1）将DMEM:F12的干粉溶解在水中得到基础培养基；

（2）将血液蛋白胨，氯化钠，葡萄糖，乳糖、磷源，猪胆，甘露醇，丙酮酸钠，L-谷氨酰胺，维生素，氨基糖苷类抗生素，铜盐，黄芪多糖加入到基础培养基中，搅拌至完全溶解；

（3）调节pH值至7.2，用0.22μm的透析袋过滤除菌，即得用于培养脂肪干细胞的培养基。

实施例3

本实施例提供了一种用于培养脂肪干细胞的培养基，包括基础培养基和添加剂，以质量份数计，所述添加剂包括以下物质：

胰蛋白胨12份，氯化钠6份，葡萄糖3份，乳糖5.6份、磷源2.8份，猪胆盐0.1份、甘露醇2.1份，丙酮酸钠2.0份，L-精氨酸2.1份，维生素2.3份，多肽类抗生素1.2份，金属盐0.36份，巴戟天多糖0.44份，蒸馏水1000份；

本实施例还提供了该用于培养脂肪干细胞的培养基的制备方法，包括以下步骤：

（1）将DMEM:F12的干粉溶解在水中得到基础培养基；

（2）将胰蛋白胨，氯化钠，葡萄糖，乳糖、磷源，猪胆，甘露醇，丙酮酸钠，L-精氨酸，维生素，多肽类抗生素，金属盐，巴戟天多糖加入到基础培养基中，搅拌至完全溶解；

（3）调节pH值至7.3，用0.22μm的透析袋过滤除菌，即得用于培养脂肪干细胞的培养基。

实施例4

本实施例提供了一种用于培养脂肪干细胞的培养基，包括基础培养基和添加剂，以质量份数计，所述添加剂包括以下物质：

大豆蛋白胨2份，氯化钠1份，葡萄糖0.1份，乳糖0.2份、磷源0.8份，猪胆盐0.02份、甘露醇0.2份，丙酮酸钠0.5份，L-精氨酸0.2份，维生素0.2份，氨基糖苷类抗生素0.1份，铜盐0.02份，艾叶多糖0.01份，蒸馏水1000份；

本实施例还提供了该用于培养脂肪干细胞的培养基的制备方法，包括以下步骤：

（1）将DMEM:F12的干粉溶解在水中得到基础培养基；

（2）将大豆蛋白胨，氯化钠，葡萄糖，乳糖、磷源，猪胆，甘露醇，丙酮酸钠，L-精氨酸，维生素，氨基糖苷类抗生素，铜盐，艾叶多糖加入到基础培养基中，搅拌至完全溶解；

（3）调节pH值至7.3，用0.22μm的透析袋过滤除菌，即得用于培养脂肪干细胞的培养基。

实施例5

本实施例提供了一种用于培养脂肪干细胞的培养基，包括基础培养基和添加剂，以质量份数计，所述添加剂包括以下物质：

肉蛋白胨16份，氯化钠9份，葡萄糖5份，乳糖6份、磷源3.8份，猪胆盐0.12份、甘露醇2.6份，丙酮酸钠2.6份，L-蛋氨酸2.8份，维生素3.6份，氨基糖苷类抗生素2份，硒盐0.58份，艾叶多糖0.5份，蒸馏水1000份；

本实施例还提供了该用于培养脂肪干细胞的培养基的制备方法，包括以下步骤：

（1）将DMEM:F12的干粉溶解在水中得到基础培养基；

（2）将肉蛋白胨，氯化钠，葡萄糖，乳糖、磷源，猪胆，甘露醇，丙酮酸钠，L-蛋氨酸，维生素，氨基糖苷类抗生素，硒盐，艾叶多糖加入到基础培养基中，搅拌至完全溶解；

（3）调节pH值至7.4，用0.22μm的透析袋过滤除菌，即得用于培养脂肪干细胞的培养基。

上述描述仅是对本发明部分实施例的描述，并非对本发明范围的任何限定，本行业的普通技术人员可根据本发明对上述实施例做出改进或修改，但均属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种用于培养脂肪干细胞的培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加剂，以质量份数计，所述添加剂包括以下物质：蛋白胨2~16份，氯化钠1~9份，葡萄糖0.1~5份，乳糖0.2~6份、磷源0.8~3.8份，猪胆盐0.02~0.12份、甘露醇0.2~2.6份，丙酮酸钠0.5~2.6份，氨基酸0.2~2.8份，维生素0.2~3.6份，抗生素0.1~2份，金属盐0.02~0.58份，植物多糖0.01~0.5份，蒸馏水1000份。

2.根据权利要求1所述的用于培养脂肪干细胞的培养基，其特征在于，以质量份数计，所述添加剂包括以下物质：蛋白胨5~12份，氯化钠2~6份，葡萄糖1~3份，乳糖0.8~5.6份、磷源1.2~2.8份，猪胆盐0.05~0.1份、甘露醇0.3~2.1份，丙酮酸钠0.8~2.0份，氨基酸0.5~2.1份，维生素0.5~2.3份，抗生素0.5~1.2份，金属盐0.12~0.36份，植物多糖0.23~0.44份，蒸馏水1000份。

3.根据权利要求2所述的用于培养脂肪干细胞的培养基，其特征在于，以质量份数计，所述添加剂包括以下物质：蛋白胨7份，氯化钠3份，葡萄糖2份，乳糖2.6份、磷源1.8份，猪胆盐0.08份、甘露醇1.6份，丙酮酸钠1.8份，氨基酸2.3份，维生素1.9份，抗生素1.2份，金属盐0.43份，植物多糖0.27份，蒸馏水1000份。

4.根据权利要求1~3任意一项所述的用于培养脂肪干细胞的培养基，其特征在于，所述蛋白胨为大豆蛋白胨、血液蛋白胨、胰蛋白胨、肉蛋白胨中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的用于培养脂肪干细胞的培养基，其特征在于，所述植物多糖为枸杞多糖、巴戟天多糖、黄芪多糖、柴胡多糖、艾叶多糖、当归多糖、茯苓多糖、香菇多糖、车前子多糖、红枣多糖、银耳多糖中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的用于培养脂肪干细胞的培养基，其特征在于，所述氨基酸为甘氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-组氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-天冬氨酸和L-天冬酰胺中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的用于培养脂肪干细胞的培养基，其特征在于，所述抗生素为β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、多肽类抗生素中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的用于培养脂肪干细胞的培养基，其特征在于，所述金属盐为铁盐、铜盐、锌盐、钴盐、锰盐、铬盐、硒盐、镍盐、钼盐、钒盐、锡盐、锶盐中的至少一种。

9.一种根据权利要求1~8任意一项所述的用于培养脂肪干细胞的培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将DMEM:F12的干粉溶解在水中得到基础培养基；

（2）将蛋白胨，氯化钠，葡萄糖，乳糖、磷源，猪胆，甘露醇，丙酮酸钠，氨基酸，维生，抗生素，金属盐，植物多糖加入到基础培养基中，搅拌至完全溶解；

（3）调节pH值至7.2～7.4，用0.22μm的透析袋过滤除菌，即得用于培养脂肪干细胞的培养基。