DE2749023C2

DE2749023C2 - Verfahren zur schnellen Vermehrung von SV3T3 Zellen in vitro

Info

Publication number: DE2749023C2
Application number: DE2749023A
Authority: DE
Inventors: William Robert Manchester Mo. Tolbert
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1976-11-03
Filing date: 1977-11-02
Publication date: 1986-09-25
Also published as: FR2370094B1; JPS6219840B2; BE860412A; DE2749023A1; US4059486A; GB1537960A; FR2370094A1; SE443370B; CA1093995A; JPS5396394A; IL53280A0; SE7712375L; IT1088863B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen Vermehrung von SV3T3 Zellen in vitro zur Erzeugung der physiologischen Substanzen MIF (Migrationshemmfaktor) und TAF (Tumorgefäßbildungsfaktor).

Die virale Transformation von Zellstämmen in vitro durch Virusinfektion eines permanenten Zellstammes ist bekannt. So wird von Black und Rowe, Proc. Soc. Exptl. Biol. & Med., 114, 721-27 (1963), berichtet, daß der vacuolenbildende Affenvirus (SV-40) die Transformation verschiedener Zellstämme induziert. Die Entwicklung des permanenten Zellstammes 3T3 wurde zuerst von Todaro und Green, J. Cell. Biol., 17, 299-313 (1963) beschrieben, und über die Transformation dieses Zellstammes durch SV-40, wodurch dessen Eigenschaften permanent verändert wurden, wurde von Todaro et al. in Proc. Nat. Acad. Sei., 51,66—73 (1964), berichtet.

Die Kultur von SV3T3 Zellen ist für die Gewinnung bestimmter physiologisch wirksamer Produkte des Zellmetabolismus wichtig. So ist bekannt, daß diese transformierten Fibroblasten ein makromolekulares Produkt entwickeln, das die Macrophagenwanderung hemmt; es ist als Migrationshemmfaktor (MIF) bekannt. Der von sensitivierten Lymphocyten hergestellte MIF ist ausführlich von David, Proc. Natl. Acad, Sei. US., 56,72-77 (1966) und Fed. Proceedings, 30, 1930-35 (1971), beschrieben. Die Herstellung von MIF aus SV3T3 Zellen wird von Hammond et al, Science, 185, 955—57 (1974) und Poste, Exptl. Cell. Res., 92, 233-90 (1975) dargestellt.

Ein weiterer Stoff, der durch Kultur von SV3T3 Zellen gewonnen wird, ist der Tumorgefäßbildungsfaktor (TAF), von dem man weiß, daß er die Proliferation neuer Kapillaren anregt. Die biologischen Eigenschaften und Bestimmungsverfahren des TAF sind von Folkman, Cancer Res., 34, 2109-2113 (1974) und Folkman und Klagsbrun in Kapitel 31 von »Fundamental Aspects of Neoplasia«, S. 401—412, Hrsg. Gottlieb et al. Springer Verlag, New York, 1975 zusammengefaßt.

Die Herstellung der beiden Substanzen MIF und TAF ist wegen ihrer Verwendung bei verschiedenen Forschungsaufgaben in der Tumorbiologie und für diagnostische und andere medizinische Zwecke von Interesse. MIF und TAF können zwar aus in vivo gezüchtetem Gewebe isoliert werden, die Herstellung in vitro würde Gewebe isoliert werden, die Herstellung in vitro würde jedoch eine angemessenere und gleichmäßigere Gewinnung dieser Stoffe ermöglichen.

Die SV3T3 Zelle ist im allgemeinen als haftende, von einer Verankerung abhängige Zelle bekannt (Gail und Boone, Exptl. Cell Res, 70,33—40 (1972). Eine verankerungsabhängige Zelle muß sich, wenn sie in vitro kultiviert wird, normalerweise z. B. an einer Glas- oder Plastikfläche verankern, bevor sie sich teilen kann. Diese Zellen werden deshalb gewöhnlich als Monolayer in Behältern wie Kolben und Petrischalen gezüchtet. Diese Monolayerzucht ist oft erwünscht, eine bewegte flüssige Suspensionskultur von SV3T3 Zellen hätte für Wachstum und Gewinnung jedoch wesentliche Vorteile, vorausgesetzt, die gewünschten MIF- und TAF-Produkte werden in diesen Kulturen fortlaufend gebildet.

Die Zucht von SV3T3 Zellen in Suspensionskulturen von 1,2% Methocel (8000 cPoise) wurde bisher von Otsuka und Moskowitz, J. Cell. Physiol, 85,665—74 und 87, 213—40(1975) beschrieben. Es sind dies jedoch viskose, unbewegte (statische) Suspensionen ohne die Vorteile der Zellkultur in bewegten flüssigen Suspenoionskulturen wie sie hier beschrieben werden. Art und Eigenschaften solcher statischer Suspensionskulturen werden auch von Stoker et al, J. Cancer, 3, 683—93 (1968) beschrieben.

Aufgabe der Erfindung ist es somit, ein Verfahren zur schnellen Vermehrung von SV3T3 Zellen in vitro zur Erzeugung von MIF und TAF zur Verfugung zu stellen. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß SV3T3 Zellen auf einer Oberfläche gezüchtet werden, von diesen wachsenden Zellen anschließend ein Inokulat in eine flüssige Suspension von Nährmedium übertragen wird, dieses Medium bei 3O⁰C bis 38° C inkubiert und währenddessen praktisch ständig in Bewegung gehalten wird, die in Kontakt mit anderen Zellen in Aggregation von zwei bis mehreren hundert Zellen wachsenden Zellen in regelmäßigen Abständen in frisches Nährmedium übertragen werden und die bewegte Inkubation fortgeführt wird.

Es wird ein normalerweise verankerungsbeständiger SV3T3 Zellenstamm in vitro in einem bewegten flüssigen Nährmedium gezüchtet, wobei die Zellen in Kontakt mit anderen Zellen in Aggregaten von 2 bis mehreren hundert Zellen in Suspension in dem flüssigen Medium vermehrt werden. Die Anpassung des Zellstamms an das Wachstum in Suspensionskultur wird innerhalb von etwa 2 Wochen schnell erreicht. Dies ist unerwartet, da die Anpassung anderer Zellstämme an die Suspensionskultur oft mehrere Monate in Anspruch nimmt.

Das Inokulat für die Suspensionskultur erhält man durch Lösen von SV3T3 Zellen aus einer üblichen Oberflächenkultur, die dann in einem bewegten flüssigen Nährmedium suspendiert und bei 3O⁰C bis 38° C, vorzugsweise 35° C bis 37° C, inkubiert werden. Während der zweiwöchigen Wachstumsperiode werden die proliferierenden Zellen periodisch in frisches Medium übertragen, vorzugsweise in Zuchtbehälter mit zunehmender Größe, um das Produktvolumen zu vergrößern. Während der 2wöchigen Wachstumsperiode sind min-

destens zwei solcher Übertragungen in bestimmten Abständen erwünscht.

Die Erfindung wird durch die beigefügten Zeichnungen illustriert, in denen die Abbildung 1 und 2 Mikro-

photographien der aggregierten Zellen nach 312 Stunden in der bewegten flüssigen Suspensionskultur sind.

Das schnelle Wachstum von SV3T3 Zellen in Aggregaten, wie es die Erfindung vorsieht, hat einen eindeutigen Vorteil gegenüber der üblichen Suspensionskultur von Zellen, bei der das Zellwachstum sich im wesentlichen auf Zellen beschränkt, die an der Oberfläche des Zuchtbehälters haften, sowie auf einzelne Zellen, die sich von der Oberfläche ablösen und im Medium schwimmer;, oder auf Zellen, die auf der Oberfläche von weichem Agar oder anderen Gelen wachsen. Auch ist die Gewinnung von in Aggregaten gezüchteten Zellen einfacher, da die Zellen nicht mehr wie bisher von der Behälteroberfläche abgelöst werden müssen und auch die üblichen Schwierigkeiten beim Zentrifugieren einzelner suspendierter Zellen verringert werden.

Da die Zellen in der erfindungsgemäßen bewegten flüssigen Suspension in Aggregaten wachsen, können sie durch kürzeres Zentrifugieren und mit geringeren Kraftgradienten gewonnen werden, als Suspensionskulturen einzeln wachsender Zellen. Während dieses Verfahrensschrittes werden die Zellen daher weniger beschädigt und man erhält infolgedessen eine höhere prozentuale Ausbeute lebender Zellen. Im Vergleich zur Gewinnung einer äquivalenten Zellanzahl aus Monolayer-Kulturen oder Suspensionskulturen mit einzeln wachsenden Zellen ergeben sich beträchtliche Einsparungen an Zeit und Laborkosten.

Pas Zellprodukt aus dem erfindungsgemäßen bewegten flüssigen Suspensionskultur-Medium entwickelt die gewünschten Produkte MIF und TAF in wesentlichen Mengen.

In einer Ausführungsform der Erfindung können SV3T3 Zellen anfänglich in einer Subkultur auf einer Oberfläche in Monolayern bis zur Konfluenz gezüchtet werden. Dies geschieht z. B. durch Impfen eines Nährmediums mit einer Ausgangskultur von SV3T3 und Wachstum in üblichen 75 cm² Gewebekultur-Kolben. Die Ausgangskultur von SV3T3 Zellen kann z. B. aus mit SV-40 transformierten Schweizer 3T3 Zellen bestehen, die ursprünglich aus zufällig gezüchteten Schweizer Mäuseembryos entwickelt wurden (siehe Todaro und Green, wie oben) oder aus mit SV-40 transformierten BALB/c 3T3 Zellen, die eine ähnliche Morphologie haben und auch sonst praktisch identisch sind mit den mit SV-40 transformierten Schweizer 3T3 Zellen, jedoch in Zuchtkultur aus BALB/c Mäuseembryokulturen entwickelt wurden, wie dies von Aaronson und Todaro, J. Cell. Physiol., 72,141 -48 (1968) beschrieben wird.

Das Nährmedium zur Vermehrung von SV3T3 Zellen in bewegter flüssiger Suspension enthält assimilierbare Quellen von Stickstoff, Kohlenstoff und anorganischen Salzen, und kann eines der bekannten Gewebekulturmedien sein, so z. B. Basal Medium Eagle's (BME), Eagle's Minimum Essential Medium (MEM), Dulbecco's Modified Eagle Medium, Medium 199, oder ausgeglichene Salzlösungen wie die von Earle und Hanks, verstärkt mit verschiedenen Nährstoffen. Es sind dies handelsübliche Gewebekulturmedien, die im einzelnen von H. J. Morton, In Vitro, 6, 89-108 (1970) beschrieben sind. Die Verwendung von Dulbecco's Modified Eagle Medium (MEM) wird bevorzugt. Diese üblichen Kulturmedien enthalten bekannte essentielle Aminosäuren, Mineralsalze, Vitamine und Kohlehydrate. Sie werden auch häufig mit Säugetierseren, wie fötalem Kälberserum, verstärkt.

Nach dem Wachstum bis zur Konfluenz wird die SV3T3 Zellsubkultur in ein bewegtes flüssiges Kulturmedium mit praktisch derselben Zusammensetzung wie oben übertragen. Diese Übertragung geschieht durch Ablösen das Zell-Monolayers von dem Zuchtbehälter und Ausstoßen der Zellen in ein schnell gerührtes Drehgefäß, das das frische Kulturmedium enthält Man löst die Zellen ab, indem man vorzugsweise zunächst das verbrauchte Medium abzieht oder abgießt, die Zellschicht mit phosphatgepufferter Salzlösung, pH etwa 7 bis 7,4, oder anderen geeigneten Pufferstoffen mit dem

ίο angegebenen pH wäscht, und dann die Zellen trypsinisiert, um sie von der Oberfläche abzulösen.

Nachfolgende Übertragungen der wachsenden Zellen in frisches Medium können in vorherbestimmten oder periodischen Abständen erfolgen. Diese Übertragungen können in größere, frisches Medium enthaltende Zuchtgefäße vorgenommen werden, um die schnelle Proliferation der Zellen in großem Volumen zu erleichtern.
Die Suspensionskultur kann in Glas-, Plastik- oder Metallgefäßen stattfinden. So ist z. B. im allgemeinen ein Fermenter mit rostfreiem Stahl geeignet, ebenso Glas-Drehflaschen. Beispiele für solche Fermenter sind die in den US-PS 34 45 341 und 34 45 342 beschriebenen Vorrichtungen. Drehflaschen mit Rührwerk sind in den US-PS 29 58 517 und 36 22 129 beschrieben. Eine weitere Vorrichtung für bewegte flüssige Suspensionskultur in großen Mengen ist in der US-PS 30 39 932 beschrieben. Die Rührgeschwindigkeit in diesen Behältern Hegt vorzugsweise zwischen etwa 200 und 300 U/min.

Weitere Informationen über bewegte flüssige Suspensionskultur von Zellen sind in Cherry und Hull, J. Biochem. Microbiol. Tech. Eng., II (3), 267-285 (1960) und Moore und Ulrich, J. Surg. Res., 5 (6), 270-82 (1965) enthalten.

Nach geeignetem Wachstum der Zellen, z. B. nach einer 2wöchigen Zellkulturperiode bei 35⁰C bis 37° C, werden die Zellen aus der Suspension durch Zentrifugieren bei 200 bis 1000 g gewonnen. Die zusammengeklumpten Zellen werden dann in Salzlösung, Laktat-Ringerlösung, phosphatgepufferter Salzlösung oder anderen wäßrigen Lösungen mit einem pH von etwa 7 bis 7,4 gründlich gewaschen.

Die gewaschenen Zellen können dann in geeigneter Weise behandelt werden, so daß man daraus die Extrakte erhält, die die gewünschten MIF und TAF Aktivitäten besitzen. Diese Extrakte erhält man durch Inkubieren der Zellen in Salzlösung, Laktat-Ringerlösung oder phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7 bis 7,4, Zentrifugieren und Sammeln des Extrakts. Bei dieser Extraktion suspendiert man vorzugsweise die gewaschenen Zellen zunächst unter Rühren etwa 1 bis 12 Stunden bei etwa 4°C bis 37°C in dem wäßrigen Puffer oder der Salzlösung. Die Zellen werden dann zentrifugiert und der Überstand wird als erster Extrakt zurückbehalten. Die zurückgebliebenen zusammengeklumpten Zellen werden dann erneut unter Rühren 10 bis 30 Minuten bei etwa 35°C bis 37°C in einem wäßrigen Medium suspendiert. Die Zellen werden nochmals zentrifugiert und der Überstand wird als zweiter Extrakt oder Lysat zurückbehalten. Die beiden Extrakte werden jeweils etwa 20 bis 30 Minuten bei etwa 9000 bis lOO'OO zentrifugiert, um eventuelle restliche Partikel zu entfernen, dann werden sie zur Entfernung von Salzen und anderen Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht gegen destilliertes Wasser diaiysiert, lyophilisiert und bis zur Verwendung bei etwa -3O⁰C gelagert.

Der Bioassay der TAF Aktivität im lyopliilisierten Material kann in der Chorioallantois-Membran (CAM)

des 10 bis 11 Tage alten Hühnerembryos ausgeführt werden, wie von Folkman, Cancer Res., 34, 2109—13 (1974) und 36, 110-14 (1976) beschrieben. Bei diesem Verfahren werden die auf TAF Aktivität zu testenden lyophilisierten Proben zunächst in wäßriger phosphatgepufferter Salzlösung gelöst, und dann in der CAM implantiert. Die Intensität der auf das Implantat konvergierenden neuen Gefäßproliferation wird alle 24 Stunden festgestellt und nach 5 Tagen auf einer Skala von 1 + bis 5+ eingetragen.

Der Bioassay der MIF Aktivität in dem lyophilisierten Material kann mit dem von David, Pathology, 56,72—-77 (1966) und Hammond, Science, 185, 955-57 (1974) beschriebenen normalen Kapillarrohr-Migrationshemmtest ausgeführt werden. Bei diesem Verfahren werden die auf MIF Aktivität zu testenden lyophilisierten Proben mit 5% frischem Meerschweinchenserum vermischt Dieses Material wird dann gegen peritoneale Exsudatzellen von Meerschweinchen in Kapillarrohren getestet und das entstandene Wanderungsgebiet wird mittels Planimetrie gemessen und mit Kontrollen verglichen.

In den nachfolgenden ausführlichen und repräsentativen Beispiel dieser Erfindung wurden aus 601 Zellsuspension nach einer 2wöchigen Vermehrungszeit nach anfänglicher Impfung mit SV3T3 Zellen, die aus drei 75 cm² Monolayer-Kolben gewonnen worden waren, 120 ml zusammengeklumpter Zellen gewonnen. Die zusammengeklumpten Zellen wurden extrahiert und die Analyse ergab, daß sie die gewünschten Komponenten MIF und TAF entwickelten.

In diesem Beispiel wurde BALB/c SV3T3 Zellen zur Konfluenz in Monolayern durch Inkubation bei 37⁰C in Kolben gezüchtet, die Dulbecco's Modified Minimum Essential Medium (MEM) enthielten, das Glukose 4 mg/ml enthielt und mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt war.

a) Die Zellen wurden aus drei konfluierenden 75 cm² T-Kolben mit dem folgenden Subkulturverfahren abgelöst:

1) Das verbrauchte Medium wurde abgegossen.

2) Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), pH 7 bis 7,4, mit 0,02% EDTA (Dinatriumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure) wurde zum Spülen der haftenden Zellen verwendet und dann abgegossen.

3) Die Zellen wurden 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 5 ml 0,2% Trypsin in PBS mit 0,02% EDTA überschichtet. Die Kolben wurden dann kräftig geschüttelt, so daß sich die Zellen von der Oberfläche lösten.

b) Die Zellsuspension in TrypsinJösung wurde 3- bis 5mal in eine 10 ml Pipette aspiriert und dann in eine schnell gerührte 500 ml Drehflasche ausgestoßen, die Dulbecco's Modified Minimum Essential Medium (4 mg/ml), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, enthielt. Diese Drehflasche wurde dann 72 Stunden in einen Raum mit einer konstanten Temperatur von 37° C gestellt, die schnelle Bewegung wurde fortgeführt In der Suspensionskultur dieses Beispiels wurden während der 2wöchigen Zeilvermehrungszeit keinerlei Antibiotika verwendet

c) die Zellsuspension wurde dann aus der 500 ml Drehflasche in eine 3 1 Drehflasche gegeben, die so modifiziert worden war, daß 5% CO₂ in Luft kontinuierlich über die Oberfläche der Flüssigkeit streichen konnte. Die Zellen wurden mit dem MikroskoD beobachtet und schienen in Klumpen zu wachsen. Die meisten Zellen waren für den Vitalfarbstoff, Trypanblau, nicht durchlässig, was ihre Lebensfähigkeit anzeigte. Die Zellen hatten eine Granulierung des Cytoplasma. Mehrere der größeren Klumpen hatten in ihrer Mitte für den Vitalfarbstoff durchlässige Zellen. Frisches Medium wurde zugegeben, um das Volumen auf 3 1 aufzufüllen, und die Drehflasche wurde 48 Stunden bei 37°C schnell gerührt.

d) die Zellen wurden erneut mit dem Mikroskop untersucht (120 Stunden nach der Inokulation in der Drehflaschenkultur); sie schienen in kleineren Klumpen als zuvor zu wachsen und weniger Zellen waren farbdurchlässig. Die Zellen erscheinen immer noch granuliert Ein weiterer Liter frisches Medium wurde zugegeben, und die Drehfiasche weitere 48 Stunden in den Raum 37°C konstanter Temperatur zurückgestellt.

e) Nach insgesamt 168 Stunden wuTde die Zellsuspension in eine 12 1 Drehflasche übertragen und frisches Medium wurde zugegeben, um das Volumen auf 12 1 aufzufüllen. Auch diese Flasche wurde so eingerichtet, daß 5% CO₂ in Luft kontinuierlich über die Oberfläche der Flüssigkeit streichen konnten. 500 ml der Suspension wurden in einer 3 1 Drehflasche zurückbehalten und 3500 ml frisches Medium zugegeben. Die Gesamtmenge von 16 1 Suspension wurde 96 Stunden in den Raum mit 37° C zurückgestellt.

f) Nach insgesamt 264 Stunden in der Suspensionskultur wurden die SV3T3 Zellen wieder mit dem Mikroskop untersucht. Es gab nur sehr wenige (weniger als 5%) farbdurchlässige Zellen und das Zellcytoplasma hatte sein granuliertes Aussehen verloren. Die Zellen wuchsen in Klumpen mit bis zu 0,02 mm Durchmesser, auch kleinere Aggregate mit 2, 3, 4 oder mehr Zellen waren sichtbar. Die Zellsuspension aus der 3 1 Drehflasche wurde unter Zusatz von frischem Medium in eine 121 Drehflasche gegeben. Die Zellsuspension aus der 12 1 Drehflasche wurde unter Zusatz von frischem Medium auf 4 neue 12 1 Drehflaschen aufgeteilt. Sie alle wurden mit 5% CO₂ in Luft versehen. Ferner wurden zur Erhaltung der Kultur eine nichtbegaste 1 1 Drehflasche und eine begaste 3 1 Drehflasche verwendet. Alle Flaschen wurden 72 Stunden in den Raum mit 37°C zurückgestellt.

g) Aus einer der 12! Drehflaschen wurden alle 24 Stunden Proben für DNA-Bestimmungen (siehe Tabelle) entnommen, ferner wurde 1 1 der Suspension entnommen und die Zellen in flüssigem N₂ gefroren. Die Abbildungen 1 und 2 zeigen Mikrophotographien der Zellsuspensionskultur 312 Stunden nach Beginn der Suspensionskultur mit 30facher Vergrößerung. Abbildung 1 zeigt insbesondere einen relativ großen Zellklumpen, während Abbildung 2 mehrere kleinere Zellklumpen in einer Blutkörperchen-Zählkammer zeigt.

h) Nach 336 Stunden in der Suspensionskultur wurden aus 601 Suspension 120 ml zusammengeklumpter Zellen (8,1 ± 0,22 χ 10¹⁰ Zellen gemäß DNA Bestimmung) gewonnen, aus denen biologisch wirksame Komponenten extrahiert wurden. Suspensionskulturen, 31 begast und 1 1 nichtbegast, wurden unter Entnahme von Zellen und regelmäßigem Zusatz von frischem Medium über Zeiträume von mehr als 2 Monaten gehalten.

i) Die Zellen des vorhergehenden Beispiels wurden durch Zentrifugieren mit 200 bis 1000 g gewonnen und die zusammengeklumpten Zellen wurden dann dreimal nacheinander in PBS, pH 7 bis 7,4, gewaschen.

Wachstum von SV3T3 Zellen in Suspension gemäß V:

DNA Bestimmung ";;

Zeit in μg DNA pro Zellanzahl pro ΐ

h*) ml ml χ 10-"**) ₅ ;*.

2 3,56 ± 0,14 0,37 ± 0,015 |

24 7,48 ± 0,45 0,778 ± 0,047 &

48 11,04 ±0,39 1,15 ± 0,041 ;|

72 15,2 ± 1,65 1,58 ± 0,17 IO |

*) Zeit nach Inokulation der Zellen in die 12 1 Drehflasche, |

aus der 25 ml Proben entnommen wurden. Diese Flasche fl

wurde 264 Stunden nach Beginn der SV3T3 Zellen-Sus- il

pension geimpft. ^

**) Zellanzahl geschätzt aus 9,61 μg DNA pro 10⁶ SV3T3 '5 ψ

Zellen, ausgedrückt mit ± Standardabweichung. ψ

Um die erfolgreiche Proliferation der SV3T3 Zellen in *

der bewegten flüssigen Suspensionskultur weiter zu er- :

härten, wurde ein Teil der Zellen in stationäre Gewebe- 20 J

kulturkolben zur Zucht in Monolayern zurückgegeben. yi

Nach Erreichen der Konfluenz wurden die Zeilen wie :;'

zuvor in eine bewegte flüssige Suspensionskultur gege- ^:

ben; sie vermehrten sich wiederum schnell in Aggrega- .^

ten. 25 ;|

Eine weitere Bestätigung der vorliegenden Zeil- gi

Wachstumsergebnisse erhielt man mit dem Fluoreszenz- $

Antikörper-Verfahren nach Coons. Bei diesem Verfah- >

ren wurden bekannte, mit Fluoreszenz gekennzeichnete ^y"

Antikörper gegen SV3T3 Zellen verwendet, um das 30 ;;:'■

Vorhandensein von Antigen in den in den obigen Sys- i$

pensionskulturen gezüchteten SV3T3 Zellen zu zeigen. ' I,

Die MIF und TAF Aktivitäten in dem Zellprodukt, H

das aus der obigen bewegten flüssigen Suspensionskul- ;■

tür gewonnen wurde, werden wie folgt nachgewiesen: 35 ;:■;

Die gewaschenen Zellen werden in PBS, pH 7 bis 7,4, |;

mit einer Konzentration von etwa 5 χ 10⁶ bis 5 χ 10⁸ 3

Zellen pro ml erneut suspendiert. Die Zellsuspension f ί

wird dann bei 4° C 4 Stunden gerührt und wieder zentri- js;

fugiert. Der Überstand wird als erster Extrakt zurück- 40 p*

behalten. Die restlichen zusammengeklumpten Zellen r;

werden bei 37°C wieder in einer Konzentration von ?-

etwa 5 χ 10⁶ bis 2 χ 10⁷ Zellen pro ml in destilliertem t*

Wasser suspendiert und etwa 20 Minuten gerührt. Die =f;

Suspension wird nochmals zentrifugiert und der Rück- 45 · ί stand als zweiter Extrakt oder Lysat zurückbehalten.
Die zwei Extrakte werden mit 9000 g in einer Sorvall
RC2 B Zentrifuge 30 Minuten weiter zentrifugiert, 4 bis
8 Stunden bei 4° C gegen destilliertes Wasser dialysiert,

dann gefroren und lyophilisiert. Die MIF Aktivität im 50 _; lyophilisierten Extrakt wird mit dem Kapillarrohr-Mi- ΐ grationshemmtest bestimmt, die TAF Aktivität im Iy- j ophilisierten Extrakt mit dem oben beschriebenen Cho- ;?' rioallantoismembran-Test ja 55 Sj¹

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen ||

60

65

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur schnellen Vermehrung von SV3T3 Zellen in vitro zur Erzeugung von MIF und TAF, dadurch gekennzeichnet, daß SV3T3 Zellen auf einer Oberfläche gezüchtet werden, von diesen wachsenden Zellen anschließend ein Inokulat in eine flüssige Suspension von Nährmedium übertragen wird, dieses Medium bei 30⁰C bis 38° C inkubiert und währenddessen praktisch ständig in Bewegung gehalten wird, die in Kontakt mit anderen Zellen in Aggregaten von zwei bis mehreren hundert Zellen wachsenden Zellen in regelmäßigen Abständen in frisches Nährmedium übertragen werden und die bewegte Inkubation fortgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in vorherbestimmten Abständen zwei periodische Übertragungen von wachsenden Zellen in frisches Nährmedium vorgenommen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als SV3T3 Zellen BALB/c SV3T3 Zellen einsetzt.