DE2749022C2

DE2749022C2 - Verfahren zur raschen Adaption von Zellstämmen an Suspensionskulturen

Info

Publication number: DE2749022C2
Application number: DE2749022A
Authority: DE
Inventors: Joseph University City Mo. Feder; William Robert Manchester Mo. Tolbert
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1976-11-03
Filing date: 1977-11-02
Publication date: 1986-10-30
Also published as: JPS629318B2; IL53281A0; FR2370095B1; BE860413A; FR2370095A1; CA1093994A; GB1535490A; DE2749022A1; SE7712376L; IT1088864B; US4059485A; JPS5359091A; SE432778B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur raschen Adaption von normalerweise verankerungsabhängigen, permanenten Zellstämmen an bewegte flüssige Suspensionskulturen.

Die Vermehrung von Säugetierzellen in einer bewegten flüssigen Suspension ist in vielen Laboratorien durchgeführt worden. Zuerst wid davon von Owens et al, Ann. N. Y. Acad. ScL, 58,1039-55 (1954) und Earle et al, J. Nat. Cancer Inst. 14,1159-71 (1954) berichtet. Seit damals sind zahlreiche Zellstämme an die Suspensionskultur adaptiert worden. Ausführliche Übersichtsartikel darüber gibt es von Cherry und Hull, J. Biochem. Microbiol. Techn. Eng. II (3), 267-85 (1960) und Moore und Ulrich, J. Surg. Res. 5 (6), 270-82 (1965).

Die Suspensionskultur von Säugetierzellen ist für die Vermehrung von Zellen in großen Mengen interessant Für dieses Zellkulturverfahren bestehen viele der zeitlichen und räumlichen Beschränkungen nicht, die mit der herkömmlichen Zucht in Monolayern verbunden sind. In dem Versuch, praktische Suspensionskulturverfahren zu entwickeln, widmete man in der Vergangenheit den Bedingungen in der Kulturvorrichtung und den Nährmedien große Aufmerksamkeit. Beispiele von Kulturbedingunges und Nährmedien werden von Earle et al, US-PS 29 90 335 bzw. McLimans et al, US-PS 30 39 932 beschrieben. In den meisten beschriebenen Verfahren wurden die Zellen normalerweise als Suspension einzelner Zellen gezüchtet. Jede vorübergehende Aggregierung von Zellen im Verlauf der Suspensionskultur wurde als störend empfunden und es wurden Bedingungen geschaffen, die eine solche Aggregierung vermeiden oder beschränken (siehe Cook et al. In Vitro, 9, (5) 318 - 30 (1974) und US- PS 38 50 748).

Es ist auch bekannt, daß Turmorzellen als Multizel-Ien-Spheroide in einer nicht bewegten Suspension von weichem Agar gezüchtet werden können (Folkman und Hochberg,). Exptl. Med., 138,745-75(1973). In anderen Fällen wurden einzelne Tumorzellen beobachtet, die über die Oberfläche von weichem Agar aggregierten oder sich von der Oberfläche von weichem Agar ablösten und im Medium schwammen (Costachel et aL Z. Krebsforsch, 72,24-31 (1969).

Im Gegensatz zu diesen früheren Verfahren zur Zellvermehrung in Suspensionskultur betrifft die Erfindung als absichtliche Verwendung von Zellaggregaten als Mittel, Zellen, die auf dem Substrat haftend wachsen, schnell an bewegte flüssige Suspensionen zu adaptieren.

ίο Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur raschen Adaption normalerweise verankerungsabhängiger permanenter Zellstämme an bewegte flüssige Suspensionskulturen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Inokulat dieses Zellstammes in einer substratverankerten Kultur über das normale Monolayerwachstum hinaus, bis Multilayer entstehen, gezüchtet wird, die Zellen von der substratverankerten Kultur in Form von Zellaggregaten mit Durchmessern von 2J>_htm bis 500 um abgelöst, die Aggregate in eine flüssige Suspension von Nähnnedium übertragen werden, dieses Medium bei 30⁰C bis 38° C inkubiert und währenddessen praktisch ständig in Bewegung gehalten wird, die wachsenden Zellen in regelmäßigen Abständen in frisches Nährmedium übetragen und die bewegte Inkubation fortgeführt wird.

Die Ansprüche 2 und 3 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

Erfindungsgemäß werden also dicht gelagerte Zellen, die auf einer Substratkultur haftend schnell wachsen, durch Behandlung mit Enzymen vorsichtig von dem Substrat abgelöst, so daß sich Aggregate mit Durchmessern von etwa 20 μΐη bis 500 μΐη bilden. Diese Aggregate werden dann in frisches Medium in einer bewegten flüssigen Suspension übertragen, wobei die Zellen weiter in Aggregaten wachsen. Es wurde gefunden, daß innerhalb dieser Aggregate Kontakte und Wechselwirkungen von Zelle zu Zelle in zufriedenstellender V/eise die Kontakte zwischen Zelle und Substrat ersetzen können, und so daß Wachstum von normalerweise verankerungsabhängigen Zellen in einer flüssigen Suspension möglich wird. Die Zellen teilen sich weiterhin mit der gleichen Verdoppelungszeit, die auch in substratverankerten Kulturen festgestellt wurde, und es wird keine oder nur eine kurze Adaptionszeit benötigt.

Das bisher im allgemeinen notwendige langwierige Adaptionsverfahren zur Umwandlung von verankerungsabhängigen Kulturen zu Einzelzellensuspensionen erfordert die Selektion von Zellen mit abweichenden Eigenschaften und birgt die Gefahr, das gewünschte

so Produkt zu verlieren. Bei der erfindungsgemäßen raschen Umwandlung zu Aggregatsuspensionen ist eine solche Selektion nicht notwendig und im allgemeinen tritt kein Verlust a;; gewünschten Zelleigenschaften ein. Die Zellen können über lange Zeiträume in Aggregatsuspensionen vermehrt werden, oder sie können öfter aus substratverankerten Kulturen hergestellt werden, wenn eine fortgesetzte Suspensionskultur eine gewünschte Eigenschaft selektiert. Ebenso können Zellen lange Zeit eingefroren gehalten, dann aufgetaut, in eine substratverankerte Kultur ausgesetzt und dann schnell in eine erfindungsgemäße Aggregatsuspension umgewandelt werden.

Der gewünschte Zellstamm wird zunächst in einer substratverankerten Kultur gezüchtet. Während dieser Wachstumsperiode sollte der Substratstamm wegen eines schnelleren Wachstums an das gleiche Medium adaptiert werden, das später in der Suspensionskultur verwendet wird.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde eine ganze Reihe normalerweise verankerungsabhängiger permanenter Säugetierzellstämme schnell an das Wachstum in bewegten flüssigen Kulturen adaptiert Die folgenden Zellstämme gelten dafür als Beispiele:

Menschliche Lunge, mit SV-40 transformierter Zellstamm,

Mäuseniere, mit SV-40 transformierter Zellstamm, Renales Adenocarcinom von Mäusen,
Mäuseembryo, mit Kirsten-Virus transformierter Zellstamm mit der Bezeichnung KNIH und
Mäuseembryo, mit SV-40 transformierter Zellstamm.

Solche Stämme wurden von Dr. Judah Folkman von der Harvad Medical School oder von der American Type Culture Collection, Rockland, Maryland, bezogen.

Den KNIIf Xellstamm erhält man aus NIH Mäuseembryofibrobiasten, die ursprünglich von jainchill et aL, J. Virology, 4,549—53 (1969) gezüchtet wurden, und die mit Kirsten-Virus, einem von Kirsten et aL, J. Nat Cancer Inst, 39, 311—35 (1967) isolierten Mäusesarkomvirus, transformiert worden sind.

Andere permanente Zellstaimr«, die für die Adaption an die erfindungsgemäßen bewegten flüssigen Suspensionskulturen geeignet sind, sind dem Fachmann bekannt. Der Begriff »permanent« bedeutet hier einen Zellstamm mit der Fähigkeit, endlos in vitro in Subkultur gehalten zu, werden. Dies stimmt mit dem von S. Federoff vorgeschlagenen Gebrauch von Begriffen der tierischen Gewebekultur überein, der von der Tissue Culture Association bei ihrerr- Jahrestreffen am 3.6.1966 in San Francisco angenommen wurde.

Für das Zellenwachsturn geeignete Kulturmedien enthalten assimilierbare Quellen von Stickstoff, Kohlenstoff und anorganischen Salzen. Es kann eines der bekannten Gewebekulturmedien verwendet werden, z. B. Basal Medium Eagle's (BME), Eagle's Minimum Essential Medium (MED), Dulbecco's Modified Eagle Medium, Medium 199 und ausgeglichene Salzlösungen (BSS) vie die von Earle und Hanks, verstärkt mit verschiedenen Nährstoffen. Diese Gewebekulturmedien sind im Handel erhältlich und sind ausführlich von H. J. Morton, In Vitro, 6, 89—108 (1970) beschrieben. Diese Kulturmedien enthalten essentielle Aminosäuren, Mineralsalze, Vitamine und Kohlenhydrate. Häufig werden sie auch mit Säugetierseren wie fötalem Kälberserum verstärkt

Vor der Kultur in Suspension sollte der permanente Zellstamm in dem gewünschten Kulturmedium in einer substratverankerten Kultur über normales Monolayerwachstum hinaus gezüchtet werden, wodurch Multilayer von Zellen entstehen und Zell-zu-Zellkontakte in drei Dimensionen gebildet werden. Dies kann durch häufiges Neuaussetzen der substratverankerten Zellen ohne Subkultivierung bewirkt werden. Die Zucht erfolgt in gewöhnlichen Kulturkolben, wie z. B. 75 cm² Falcon-Kolben.

Di? Behandlung zum Ablösen der Zellen vom Substrat ist kritisch. Es müssen dabei Zellaggregate oder Klumpen mit Durchmessern zwischen 20 μπι und 500 μπι entstehen. Innerhalb dieses Bereichs befinden sich vorzugsweise etwa 75% der Zellen in Aggregaten von jeweils etwa 6 bis 100 Zellen. Möglicherweise ist dabei ein kleiner Anteil einzelner Zellen vorhanden, die sich nicht zusammengeklumpt haben oder sich während der Verpflanzung der Zellen von den Aggregaten abgetrennt haben. Man vermeidet vorzugsweise, eine unangemessen große Anzahl solch einzelner Zellen in die bewegte flüssige Suspensionskultur zu übertragen, da sie meistens absterben. Sind die Zellaggregate zu groß, sind z. B. die Durchmesser größer als 500 μπι, dann erreichen nur ungenügende Nährstoffe die Zellen in der Mitte und toxische Stoffe werden entwickelt, die das Wachstum hemmen und die Lebensfähigkeit der Zellen

ίο zerstören.

Die gewünschte Ablösung der Zellen vom Substrat wird durch enzymatische Dissoziierung, z. B. durch Trypsinisierung und dgl. bei Raumtemperatur (im allgemeinen etwa 20—25° C) und sorgfältige mikroskopische

»5 Überwachung erleichtert Die Enzymbehandlung kann drei verschiedene Zellanordnungen zur Folge haben, nämlich einzelne Zellen, Zellaggregate oder -klumpen, und große Zellschichten. Werden die Zellen in Aggregaten der gewünschten Größe abgelöst, dann ist keine weitere Behandlung mehr nötig. Werden die Zellen jedoch hauptsächlich einzeln oder in Schichten abgelöst, dann muß weiterbehande't werdea Bei Einzclablösting läßt man die Kolben bei Raumtemperatur stehen, bis sich die gewünschten Klumpen bilden. Die mit Enzym abgelösten Zellen sind klebrig und bilden nach einer gewissen Zeit Aggregate, wenn sie nicht bewegt werden. Bilden sich große Zellschichten, dann sollten diese unterteilt und in die- gewünschte Aggregatgröße aufgebrochen werden; dies geschieht durch leichtes Schütteln

oder durch Passage durch eine kleine Öffnung, wie z. B. eine Pipettenspitze oder eine Kanüle, die den gewünschten Durchmesser haben.

Enzyme, die für das Ablösen der Zellen vom Substrat geeignet sind, sind beispielsweise Trypsin, Pronase, CoI-lagenase und Hyaluronidase. Trypsin wird bevorzugt und ist im Handel von Enzymfirmen wie Miles Laboratories Inc. und Worthington Biochemical Corp. leicht erhältlich. Für Informationen über die Verwendung dieser Enzyme für die primäre Gewebe-Dissoziierung wird auf Kruse und Patterson, Tissue Culture Methods and Application, Academic Press, 1973, Teil 1, S. 3—36, verwiesen.

Nach der Ablösung vom Substrat werden die Zellaggregate in ein schnell gerührtes Drehgefäß mit frischem Kulturmedium übertragen. Diese Behälter können z. B. aus Glas, Plastik oder Metall konstruiert sein. Im allgemeinen ist ein Fermentor mit rostfreiem Stahlmantel, wie er von der New Brunswick Scientific Co. Inc. hergestellt wird, geeignet, nachdem die Ablenkbleche entfernt

so worden sind, ebenso Glas-Drehflaschen, z. B. von Bellco Glass Inc. Beispiele für solche Fermentoren sind die in den US-PS 34 45 341 und 34 45 342 beschriebenen Vorrichtungen. Drebflaschen und Rührwerk sind in den US-PS 29 58 517 und 36 22 129 beschrieben. Eine weitere Vorrichtung für bewegte flüssige Suspensionskultur in großen Mengen ist in der US-PS 30 39 932 beschrieben. Die Rührgeschwindigkeit in diesen Behältern liegt vorzugsweise zwischen etwa 200 und 300 U/min.
Um eine zufriedenstellende Vermehrung von Zellen in der Suspensionskultur sicherzustellen, sollte die Konzentration der Zellen, die aus der Substratverankerung in das Drehgefäß übertragen werden, mindestens etwa 10⁶ Zellen pro ml Suspension betragen.
Während der Suspensionskultur sollte der pH bei etwa 6,7 bis 7,7, vorzugsweise etwa 7,0 bis 7,4 gehalten werden. Dies geschieht am besten mit einem geeigneten Puffer, z. B. phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) oder anderen bekannten Puffern mit dem angegebenen pH-

Wert

Die Kulturtemperatur solke zwischen etwa 30⁰C und 38° C, vorzugsweise etwa 35° C bis 37° C liegen.

Während der Wachstumsperiode in der Suspensionskultur können in vorherbestimmten periodischen Abständen aufeinanderfolgende Übertragungen der wachsenden Zellen in frisches Medium vorgenommen werden. Diese Übertragungen können in jeweils größere Kulturbehälter mit frischem Nährmedium vorgenommen werden, urn die rasche Proliferation der Zellen in großer Menge zu erleichtern.

Nach geeignetem Zellwachstum, z. B. nach 2-wöchiger Kultur bei 35° C bis 37° C, können die Zellen z. B. durch Sedimentieren oder Zentrifugieren bei 200 bis 1000 g aus der Suspension gewonnen werden. Die zusammengeklumpten Zellen werden dann gründlich gewaschen, z. B. in Salzlösung, Laktat-Ringerlösung, PBS und anderen wäßrigen Lösungen mit einem pH von etwa 6,7 bis 7,7, vorzugsweise etwa 7,0 bis 7,4. Die gewaschenen Zellen können für die weitere Verwendung nach Bedarf aufbewahrt oder es können gewünschte Produkte extrahiert v/erden, so z. B. Enzyme, Hormone, Antikörper und Zellstoffwechselprodukte.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1

Es wurde eine Kultur eines mit SV-40 transformierten Zellstammes der menschlichen Lunge eingesetzt Die Kultur wurde 60 Tage auf dem Substrat verankert in 75 cm² Falcon-Kolben aus Plastik gehalten. Während dieser Zeit wurden die Zellen an das in der nachfolgenden Suspensionskultur zu verwendende Medium adaptiert, nämlich Dulbecco's Modified Minimum Essential Medium mit 4,5 g/ml Glucose und ergänzt mit fötalem Kälberserum. In wöchentlichen Abständen wurden aus den Zellen Subkulturen gebildet und dem Medium wurde alle 2 Tage frisches Medium zugegeben. Während der letzten beiden Wochen wurden keine Subkulturen gebildet, dai Medium aber täglich aufgefüllt

Nach Ablauf der 60 Tage wurden sechs 75 cm² Kolben, die in Multilayern dicht mit Zellen beschichtet waren, wie folgt geleert:

Das verbrauchte Medium wurde abgegossen. Zum Spülen der haftenden Zellen wurde phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) mit pH 7,2, mit 0,0£% Dinatriumäthylendiamintetraacetat (EDTA) verwendet. Dann wurden 5 ml 0,2% Trypsin in PBS mit 0,02% EDTA zugegeben, und die Zellen darunter bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Kolben wurden auf einem umgedrehten Mikroskop sorgfältig beobachtet. Nach 3 Minuten Einwirkung erzeugte leichtes Bewegen der Kolben Zellaggregate mit den gewünschten Durchmessern von 20 bis 500 μηι. Diese Bewegung wurde erzeugt indem man den Kolben aufrecht in einer Hand hielt, wobei die an der Obefläche haftenden Zellen sich unter der Flüssigkeit befanden, und ihn vorsichtig auf die Handfläche der anderen Hand aufschlug. So wurde eine Bewegung zwischen leichten Wellen und turbulentem Waschen der Zellen in der Flüssigkeit erzeugt. Dadurch wirkte zwischen der sich bewegenden Flüssigkeit und dem relativ stationären Kolben eine Scherkraft auf die Zellen.

Die erhaltenen 5 ml Zellaggregatsuspension wurden in einen 500 ml Bellco Drehkolben mit 200 ml Medium gegeben. Die Kultur wurde in einem warmen Raum bei 37°C mit einer Rührgeschwindigkeit von etwa 250 U/ min inkubiert. Die Zellen wuchsen weiter, ohne daß eine Verminderung oder eine Pause in der Geschwindigkeit beobachtet werden konnte. In gleichmäßigen Abständen wurde Medium zugegeben und die Kultur wie folgt in größere Behälter übertragen:

Nach 48 Stunden wurde Medium zugegeben, um das Gesamtvolumen der Suspension auf 500 ml aufzufüllen. Nach insgesamt 144 Stunden wurden 400 ml Suspension verwendet um einen 3 1 Bellco Drehbehälter, der 21 Medium enthielt zu impfen. 400 ml frisches Medium

ίο wurden in die ursprüngliche 500 ml Drehflasche gegeben. Die 31 Drehflasche wurde mit 1 l/min 5% CO₂ in Luft belüftet Beide Flaschen wurden weiterhin in dem 37° C warmen Raum mit 250 U/min gerührt

Nach insgesamt 240 Stunden Aggregat-Suspensionskultur wurde das Volumen der Suspension in der 3 1 Drehflasche auf 41 erhöht (1 1 mehr als die angegebene Kapazität). Die 500 ml Drehflasche wurde geleert und die Zellen wurden zu diesem Zeitpunkt in flüssigem Stickstoff eingefroren.

Nach 335 Stunden wurden 3 1 der Suspension in einen 121 Drehbehälter gegeben und die "*,; und 12 1 Drehflaschen wurden mit frischem MediuiE auf 41 bzw. 12! aufgefüllt Beide wurden mit Belüftung mit 5% CO₂ in Luft bei 37° C und 250 U/min inkubiert

Insgesamt 480 Stunden nach Beginn der Aggregat-Suspensionskultur wurden mit Zentrifugieren aus 161 Suspension 30 ml zusammengeklumpter Zellen gewonnen. Die DNA-Bestimmung (140 ± 2,6 mg DNA) zeigte eine Ausbeute von etwa 1,4 ± 0,03 χ 10¹⁰ Zellen an.

Beispiel 2

Mit praktisch denselben Verfahren und Bedingungen wie in Beispiel 1 wurde ein anderer, normalerweise verankerungsabhängiger menschlicher Zellstamm, nämlich ein anderer als in Beispiel 1 mit SV-40 transformierter Zellstamm der menschlichen Lunge rasch an die bewegte flüssige Suspensionskultur adaptiert. Insgesamt 38 Tage nach Beginn der Aggregatsuspcnsiouskultur ergaben 161 der Suspension 1,84 ± 0,3 < χ 10^I0Zellen.

Beispiel 3

Ein dritter normalerweise verankerung3abhängiger Zellstamm, ein mit SV-40 transformierter Mäusenierenzellstamm wurde mit praktisch denselben Verfahren und Bedingungen wie in Beispiel 1 rasch an die bewegte flüssige Suspensionskultur adaptiert Insgesamt 19 Tage nach Beginn der Aggregatsuspensionskultur ergaben 161 Suspension 2,57 ± 0,05 χ 10¹⁰ Zellen.

Beispiel 4

Ein weiterer normalerweise verankerungsabhängiger Mäusezellenstamm, nämlich ein mit SV-40 transformierter MäuseemHryozellstamm wurde inii praktisch denselben Verfahren und Bedingungen wie in Beispiel 1 rasch an die bewegte flüssige Suspensionskultur adaptiert. Insgesamt 14 Tage nach Beginn der Aggregat-Suspensionskultur ergaben 601 der Suspension 8,1 ± 0,22 χ 10'°Zellen.

Beispiel 5

Ein weiterer normalerweise verankerungsabhängiger mit Kirsten-Virus transformierter Mäuseembryo-Zellstamm wurde mit praktisch denselben Verfahren und Bedingungen wie in Beispiel 1 rasch an die bewegte

ΔΙ ^y \)ΔΔ

flüssige Suspensionskultur adaptiert. Insgesamt 15 Tage nach Beginn der Aggregatsuspensionskultur ergaben 601 der Suspension eine visuell beobachtete signifikante Zellmenge; eine tatsächliche Zellzählung wie in Beispiel 1 wurde jedoch nicht durchgeführt.

Beispiel 6

Noch ein weiterer normalerweise verankerungsabhängiger Mäusezellenstamm, nämlich der eines renalen to Adenocarcinoms, wurde mit praktisch denselben Verfahren und Bedingungen wie in Beispiel 1 rasch an die bewegte flüssige Suspensionskultur adaptiert. Insgesamt 10 Tage nach Beginn der Aggregatsuspensionskultur ergaben 4 I der Suspension eine visuell beobachtete signifikante Zellmenge; eine tatsächliche Zellzählung wie in Beispiel t wurde jedoch nicht durchgeführt.

20

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur raschen Adaption normalerweise verankerungsabhängiger permanenter Zellstämme an bewegte flüssige Suspensionskulturen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Inokulat dieses Zellstammes in einer subtratverankerten Kultur über das normale Monolayerwachstum hinaus, bis Multilayer entstehen, gezüchtet wird, die Zellen von der substratverankerten Kultur in Form von Zellaggregaten mit Durchmessern von 20 um bis 500 um abgelöst, die Aggregate in eine flüssige Suspension von Nähnnedium übertragen werden, dieses Medium bei 30⁰C bis 38° C inkubiert und währenddessen praktisch ständig in Bewegung gehalten wird, die wachsenden Zellen in regelmäßigen Abständen in frisches Nährmedium übertragen und die bewegte Inkubation fortgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in vorherbestimmten Abständen zwei periodische Übertragungen von wachsenden Zeiien in frisches Nährmedium vorgenommen werden.

3. Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß der Zellstamm ein mit SV 40 transformierter Stamm ist