DE60314602T2

DE60314602T2 - Verfahren zur isolierung und kulturexpansion mesenchymaler stamm-/vorläuferzellen aus nabelschnurblut sowie verfahren zur differenzierung von aus nabelschnurblut stammenden mesenchymalen stamm-/vorläuferzellen in unterschiedliche mesenchymgewebe

Info

Publication number: DE60314602T2
Application number: DE60314602T
Authority: DE
Inventors: Chul-Won Ha; Yoon-Sun Yang; Sung-Eun 204-1104 Seongnam-si YANG
Original assignee: Medipost Co Ltd
Current assignee: Medipost Co Ltd
Priority date: 2002-02-19
Filing date: 2003-02-19
Publication date: 2008-02-28
Anticipated expiration: 2023-02-20
Also published as: EP1483371A4; ES2287447T3; KR100489248B1; KR20030069115A; WO2003070922A1; ATE365793T1; US20050118714A1; CN1630717A; DK1483371T3; JP2005517441A; EP1483371A1; CN1281739C; DE60314602D1; EP1483371B1; US20100184218A1; AU2003207399A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung mesenchymaler Stamm-/Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut und ein Verfahren zur Differenzierung der aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen in verschiedene mesenchymale Gewebe.
Stand der Technik
Als Behandlungsmethoden für verletzte Gewebe und Organe durch chronische Krankheit und Krebs gibt es im Wesentlichen zwei therapeutische Optionen wie Behandlung mit Medikamenten und Operation. Diese Techniken sind jedoch insofern problematisch, da es sich hauptsächlich um rein symptomatische Behandlungen handelt, die nur die Symptome lindern, oft chirurgische Komplikationen verursachen und eine erhebliche ökonomische Belastung bei Langzeitbehandlung darstellen.
Als Mittel zur Behandlung von verletztem Gewebe und Organen, das die bisherigen Probleme überwindet und einen besseren Behandlungserfolg erzielen kann, wird seit einiger Zeit einer Methode erneut Aufmerksamkeit geschenkt, die von Zellen mit Selbsterneuerungs- und Differenzierungsfähigkeit als Quelle für Transplantationen für die verletzten Gewebe und Organe Gebrauch macht.
Typische Beispiele für solche Zellen beinhalten mesenchymale Stammzellen, Vorläuferzellen und hämopoietische Stammzellen. Die hämopoietischen Stammzellen differenzieren sich in intravaskuläre Blutzellen, einschließlich Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten, während die mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen multipotente Stammzellen sind, die sich in unterschiedliche Zellen ausdifferenzieren können.
Die mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen können sich in unterschiedliche Zellen und Gewebe ausdifferenzieren, aus denen der menschliche Körper aufgebaut ist, einschließlich Knochenmarkstromazellen, Chondrozyten, Osteoblasten, Adipozyten, Myozyten, Tenozyten, Ligamentzellen und Nervenzellen. Deshalb werden sie, was den praktischen Nutzen in der regenerativen Medizin betrifft, als wichtigste Zellen hervorgehoben.
Bis jetzt ist Knochenmark die Hauptquelle der mesenchymalen Stamm-Vorläuferzellen.
Knochenmark ist reich an mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen, aber die Gewinnung von Knochenmark ist eine invasive Methode, die ein mehrmaliges Stechen mit einer Biopsienadel einschließt und somit in der praktischen Anwendung schwierig ist. Darüber hinaus erfordert die Gewinnung von Knochenmark eine Operation unter Vollnarkose, so dass für die Patienten erhebliche psychische und physische Belastungen, und durch eine Operation auch erhebliche Schmerzen entstehen. Aufgrund der Schwierigkeiten bei der Gewinnung, ist die Errichtung einer Infrastruktur, einschließlich einer Knochenmarkbank nicht praktikabel.
Auf der anderen Seite kann die Gewinnung von Nabelschnurblut nach der Geburt einfach durchgeführt werden, und verletzt die Mutter und das Baby nicht, und hat somit eine hohe Wahrscheinlichkeit praktisch angewendet zu werden. Darüber hinaus wird die Lagerung von Nabelschnurblut und die Errichtung einer Bank als so ein allgemeiner und aktiver Fortschritt bei der Bevölkerung bekannt werden, dass es einfach sein wird, seinen Spender zu finden.
Nabelschnurblut ist eine gute Quelle für hämopoietische Stammzellen und die Transplantation von hämopoietischen Stammzellen aus Nabelschnurblut wird klinisch eingeführt. Da es jedoch noch nicht geklärt ist, ob Nabelschnurblut eine gute Quelle für mesenchymale Stamm-/Vorläuferzellen darstellen kann, ist es das Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Methode zur Isolierung und Kultivierung der mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut bereitzustellen und die Eigenschaften von aus Nabelschnurblut gewonnenen Zellen als mesenchymale Stamm-/Vorläuferzellen darzustellen.
Die Verfahren zur Gewinnung der mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut müssen als fähig betrachtet werden, ausschließlich mesenchymale Stamm-/Vorläuferzellen isolieren und kultivieren zu können, während die hohe Reinheit und die exzellente Lebensfähigkeit der Zellen erhalten bleiben, da verschiedene Zellen, einschließlich hämopoietischer Blutzellen unter den Nabelschnurblutzellen vorhanden sind, und die mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen nur einen sehr kleinen Teil davon ausmachen.
Als Verfahren zur Isolierung und Kultivierung der mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen, wird hauptsächlich die Ficoll-Hypaque-Zentrifugation angewendet. Dieses Verfahren ist jedoch insofern problematisch, als unter verschiedenen Nabelschnurblutzellen nur die Leukozyten entfernt werden können, so dass die tatsächlich zur Verfügung stehenden mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen unter den isolierten Zellen nur in sehr kleiner Anzahl vorhanden sind und außerdem durch andere Zellen während der Subkultivierung beeinflusst werden und dadurch ihre Lebensfähigkeit verringert ist.
Aufgrund dieser Reduzierung von Zellanzahl und -qualität gelingt die Herbeiführung der Differenzierung dieser Zellen in mesenchymale Gewebe nicht immer gut, und die Bedingungen für die Differenzierung dieser Zellen in bestimmte Gewebe sind nicht bekannt.
Dementsprechend besteht Bedarf an einem Verfahren zur effizienten Isolierung und Kultivierung der mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut und einem Verfahren zur Differenzierung dieser Zellen in mesenchymale Gewebe.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur effizienten Isolierung und Kultivierung der mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut durch Antigen-Antikörperreaktion mithilfe mesenchymaler stamm-/vorläuferzellenspezifischer Antikörper bereitzustellen und außerdem ein Verfahren zur Differenzierung dieser Zellen in mesenchymale Gewebe bereitzustellen.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung mesenchymaler Stamm-/Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut bereit.
Das Verfahren zur Zellisolierung und -kultivierung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Schritte: Auftragen von Nabelschnurblut auf Ficoll-Hypaque Lösung; Zentrifugation des Nabelschnurbluts auf der Ficoll-Hypaque Lösung, um mononukleäre Zellen zu erhalten; zur Reaktion bringen von Zellen, die durch Monolayerkultur der mononukleären Zellen erhalten wurden, mit Antikörpern gegen mesenchymale stamm-/vorläuferzellenspezifische Antigene für eine vorbestimmte Inkubationszeitspanne; Isolierung nur der Zellen, die an ihre entsprechenden Antikörper gebunden sind, unter Verwendung eines Zellsorters und Kultivierung der isolierten Zellen.
In dem Verfahren zur Isolierung und Kultivierung der mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen gemäß der vorliegenden Erfindung, ist das Nabelschnurblut definiert als Blut, das aus der Umbilikalvene, die bei Säugetieren die Plazenta mit dem Fötus verbindet, gewonnen wird. In dem Verfahren zur Zellisolierung und Kultivierung gemäß der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise menschliches Nabelschnurblut verwendet.
Die Ficoll-Hypaque-Lösung, die in dem Verfahren zur Zellisolierung und Kultivierung erfindungsgemäß verwendet wird, hat eine Dichte von vorzugsweise 1,077 g/ml.
Von den Antikörpern gegen die mesenchymalen stamm-/vorläuferzellenspezifischen Antigene, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Zellisolation und Kultivierung Verwendung finden, werden einer oder mehrere aus den Antikörpern gegen Zelloberflächenantigene, die aus den mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen exprimiert werden, ausgewählt. Insbesondere werden einer oder mehrere aus den Antikörpern zu CD105, stro-1, SH3 und SH4 ausgewählt und diese Antikörper werden vorzugsweise zusammen verwendet, um die Reinheit zu maximieren.
Die Antikörper gegen die mesenchymalen stamm-/vorläuferzellenspezifischen Antigene, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Zellisolation und Kultivierung Verwendung finden, sind mit einem geeigneten Marker versehen, der je nach Eigenschaft des Zellsorters variiert. Insbesondere wenn ein magnetischer Zellsortierer verwendet wird, werden Antikörper, an die magnetische Mikroperlen angehängt sind, verwendet. Bei Verwendung eines FAC-Sortierers werden Antikörper, an die ein Fluorochrom wie zum Beispiel Fluoreszinisothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), PeCP o.ä. angehängt ist, verwendet.
In den Zellen, die wie oben beschrieben isoliert wurden, sind ausschließlich die Zellen vorhanden, die die Antigene exprimieren, d.h. die mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen vorhanden.
In der vorliegenden Erfindung wird die Immunantwort zwischen Antigenen und Antikörpern durch die Verwendung von Antikörpern gegen die mesenchymalen stammzellen-/vorläuferzellenspezifischen Antigene wie oben beschrieben verwendet, so dass ausschließlich die im Nabelschnurblut vorhandenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen unter den verschiedenen Zellen isoliert und kultiviert werden. Somit wird die Anzahl der tatsächlich verfügbaren Stammzellen erhöht.
Die vorliegende Erfindung stellt mesenchymale Stamm-/Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut bereit, die durch das oben beschriebene Verfahren zur Zellisolierung und Kultivierung gewonnen werden.
In der vorliegenden Erfindung sind die Vorläuferzellen definiert als alle Vorläuferzellen, die während der Differenzierung der aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen in Chondrozyten und Osteoblasten gewonnen werden.
Die aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen besitzen immunphänotypische Eigenschaften insofern als sie positiv reagieren auf Antikörper gegen CD29, CD49e, CD44, CD54, CD 13, CD90, SH2, SH3 und SH4 Antigens, und negativ reagieren auf Antikörper gegen CD45, CD34, CD 14, HLA-DR, CD31, CD51/61, CD49d, CD106 und CD64 Antigene.
Nachstehend werden die immunphänotypischen Eigenschaften der aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen gemäß der vorliegenden Erfindung im Detail beschrieben.
Die aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung reagieren negativ auf CD45, CD34 und CD14 als hämatopoietische Antigene und HLA-DR als Histokompatibilitätsantigen, so dass sie Abstoßungsreaktionen minimieren können, die bei Gewebs- oder Organtransplantationen das größte Problem darstellen. Daher sind die aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung nützlich als Quelle von Zellen für allogene Transplantationen sowie als universelle Spenderzellen.
Die aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung reagieren negativ auf CD31 als ein endothelzellenassoziiertes Antigen und auf CD51/61 als ein osteoklastenassoziiertes Antigen.
Daher werden, wenn die aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung bei Gewebstransplantationen verwendet werden, die Nebenwirkungen minimiert, die durch die Produktion von unerwünschten Blutgefäßen oder die Differenzierung der Zellen in Osteoklasten während der Produktion von Chondrozyten und Osteoblasten verursacht werden können.
Die aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm/-Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung reagieren positiv auf CD29 und CD49e als integrinrezeptorassoziierte Antigene und negativ auf CD49d.
Die aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung reagieren positiv auf CD44 und CD54 als matrixrezeptorassoziierte Antigene und negativ auf CD 106.
Die aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm/-Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung reagieren positiv auf Antikörper gegen andere Antigene, und zwar CD13 und CD90 und negativ auf Antikörper gegen CD64 Antigen.
Die aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm/-Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung reagieren positiv auf Antikörper gegen SH2, SH3 und SH4 als mesenchymale stamm-/vorläuferzellenassoziierte Antigene, und diese immunphänotypische Eigenschaft bleibt stabil erhalten selbst nach verschiedenen Durchläufen.
Die immunphänotypischen Eigenschaften der Zellen der Erfindung wie oben beschrieben sind identisch mit den immunphänotypischen Eigenschaften typischer mesenchymaler Stamm-/Vorläuferzellen.
Die aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung haben die Fähigkeit zur Selbsterneuerung unter geeigneten Bedingungen, so dass sie sich weiterhin ausbreiten können ohne sich in bestimmte Zellen oder Gewebe auszudifferenzieren.
Die aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm/-Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung sind Zellen, die aus einer jüngeren Population stammen als die Zellen aus den mesenchymalen Stammzellen, die aus allgemeinen mesenchymalen Geweben, einschließlich Mark, Muskel und Hautgeweben isoliert wurden, so dass sie eine bessere Differenzierungsfähigkeit aufweisen.
Aufgrund dieser Multipotenz können die Zellen der vorliegenden Erfindung unter geeigneten Bedingungen in mesenchymale Gewebe ausdifferenziert werden, wie z. B. Osteoblasten, Chondrozyten, Adipozyten, Myozyten, Tenozyten etc..
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Differenzierung der aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen in Mesenchymzellen bereit.
Das Verfahren zur Zelldifferenzierung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Kultivieren der mesenchymalen Stamm/-Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut in einem Zelldifferenzierungsmedium für vorbestimmte Zeitspannen unter geeigneten Bedingungen, die in Abhängigkeit von der Art der mesenchymalen Gewebezellen, die ausdifferenziert werden sollen, variieren.

Bei dem Verfahren zur Zelldifferenzierung gemäß der vorliegenden Erfindung kann es sich bei den Mesenchymzellen speziell um Chondrozyten oder Osteoblasten handeln. Zusammensetzungen von chondrogenem Differenzierungsmedium und osteogenem Differenzierungsmedium, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind jeweils in den untenstehenden Tabellen 1 und 2 angegeben. TABELLE 1: Zusammensetzung von chondrogenem Differenzierungsmedium gemäß der vorliegenden Erfindung

Bestandteile		Konzentration
TGF-β III		10 ng/ml
ITS-Plus	Rinderinsulin Transferrin Selensäure Linolsäure Rinderserum-Albumin (BSA)	6,25 μg/ml 6,25 μg/ml 5,35 μg/ml 1,25 μg/ml 100 μg/ml
Natriumpyruvat		100 nM
Dexamethason		100 nM
Ascorbinsäure-2-Phosphat		50 μg/ml
Prolin		40 μg/ml

TABELLE 2 Zusammensetzungen von osteogenem Differenzierungsmedium gemäß der vorliegenden Erfindung

Bestandteile	Konzentration
Dexamethason	0,1 μM
β-Glycerinphosphat	10 mM
Ascorbinsäure-2-Phosphat	50 μM

Die in Tabelle 1 und 2 aufgeführten Bestandteile werden, nach Zugabe zu einem aus DMEM, α-MEN, McCoys 5A Medium, Eagle's Basalmedium, CMRL-Medium, Glasgow Minimales Essentielles Medium, Ham's F-12 Medium, Iscove's modifiziertes Dulbecco- Medium, Liebovitz L-15 Medium, RPMI 1640 Medium etc. ausgewählten konventionellen Zellkulturmedium verwendet. Im Fall des chondrogenen Differenzierungsmediums wird vorzugsweise DMEM verwendet und im Fall des osteogenen Differenzierungsmediums wird vorzugsweise α-MEM verwendet.
Des Weiteren kann das Zelldifferenzierungsmedium, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, zusätzlich zu den oben beschriebenen Bestandteilen ein oder mehrere Hilfsmittel enthalten. Solche Hilfsstoffe umfassen einen Wachstumsfaktor und Pferde- oder Humanserum und ebenso Antibiotika und fungizide Mittel, einschließlich Penicillin G, Streptomycinsulfat, Amphotericin B, Gentamycin und Nyastin, das zugefügt werden kann, um Kontaminierung mit Mikroorganismen zu verhindern.
Wie aus den entenstehenden Beispielen ersichtlich können die mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen mit hoher Reinheit und hervorragender Überlebensfähigkeit gemäß des Verfahrens zur Zellisolierung und Kultivierung der vorliegenden Erfindung aus Nabelschnurblut gewonnen werden.
Die Mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung können in verschiedene mesenchymale Gewebe ausdifferenziert werden, so dass sie unter geeignetem chondrogenem Medium und Bedingungen Typ II-Collagen, Typ X-Collagen und Aggrecan-Gene als typische Marker für Chondrozyten exprimieren.
Die aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm/-Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung können unter einem geeigneten osteogenen Medium und Bedingungen Osteocalcin, Osteopontin und alkalische Phosphatase-Gene als typische Marker für Osteoblasten exprimieren, und erlauben extrazelluläre Akkumulation von Calcium in der gleichen Weise wie die Osteoblasten.
Daher kann das Verfahren zur Zellisolierung und Kultivierung der vorliegenden Erfindung zur Massenproduktion der mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen, bei denen es sich um so genannte Multipotente Zellen handelt, verwendet werden. Dies wird außerdem entsprechend der Ausweitung eines Nabelschnurblut-Lagerungssystems, das zurzeit aktiv durch eine Nabelschnurblutbank geleitet wird, seinen Nutzen zeigen.
Des Weiteren können die aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen, die durch das Verfahren zur Zellisolierung und Kultivierung der vorliegenden Erfindung gewonnen wurden, wenn nötig, in verschiedene Gewebe differenziert werden. Daher können sie eine wichtige Entwicklung bei der Behandlung von verletzten mesenchymalen Geweben, dessen Wiederherstellung schwierig war, hervorbringen.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1 ist eine Abbildung, die einen Sammelbeutel zeigt, der Nabelschnurblut, das aus der Nabelschnurvene gewonnen wurde, enthält.
2 ist eine Abbildung, die die morphologischen Eigenschaften der aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung zeigt.
3 ist eine Abbildung, die das Ergebnis eines Tests zur Prüfung, ob aus Nabelschnurblut gewonnene mesenchymale Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung hämatopoietische Antigene und Histokompatibilitätsantigene exprimieren, darstellt.
4 ist eine Abbildung, die das Ergebnis eines Tests zur Prüfung, ob aus Nabelschnurblut gewonnene mesenchymale Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung Endothelzellen-assoziierte Antigene und Osteoklasten-assoziierte Antigene exprimieren, darstellt.
5 ist eine Abbildung, die das Ergebnis eines Tests zur Prüfung, ob aus Nabelschnurblut gewonnene mesenchymale Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung Integrinrezeptor-assoziierte Antigene exprimieren, darstellt.
6 ist eine Abbildung, die das Ergebnis eines Tests zur Prüfung, ob aus Nabelschnurblut gewonnene mesenchymale Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung matrixrezeptorassoziierte Antigene exprimieren, darstellt.
7 ist eine Abbildung, die das Ergebnis eines Tests zur Prüfung, ob aus Nabelschnurblut gewonnene mesenchymale Stamm/-Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung andere Antigene exprimieren, darstellt.
8 ist eine Abbildung, die das Ergebnis eines Tests zur Prüfung, ob Oberflächenantigene von Stamm/-Vorläuferzellen in aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung exprimiert werden, darstellt.
9 ist eine Abbildung, die das Ergebnis einer Immunfärbung für knorpelassoziierte Proteine zeigt, nachdem aus Nabelschnurblut gewonnene mesenchymale Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung zu Chondrozyten ausdifferenziert wurden.
10 ist eine Abbildung, die das Ergebnis einer RT-PCR für knorpelassoziierte Gene zeigt, nachdem aus Nabelschnurblut gewonnene mesenchymale Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung zu Chondrozyten ausdifferenziert wurden.
11 ist eine Abbildung, die das Ergebnis einer histochemischen Färbung für knochenassoziierte Proteine und anorganische Substanzen zeigt, nachdem aus Nabelschnurblut gewonnene mesenchymale Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung zu Osteoblasten ausdifferenziert wurden, und
12 ist eine Abbildung, die das Ergebnis einer RT-PCR für knochenassoziierte Gene zeigt, nachdem aus Nabelschnurblut gewonnene mesenchymale Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung zu Osteoblasten ausdifferenziert wurden.
Beste Ausführungsweise der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden an Beispielen im weiteren Detail beschrieben. Es ist zu beachten, dass die vorliegende Erfindung nicht auf oder durch die Beispiele beschränkt ist.
Beispiel 1: Isolierung und Kultivieren mesenchymaler Stamm-/Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut gemäß der vorliegenden Erfindung
1) Isolierung und ex vivo Kultivierung mesenchymaler Stamm-/Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut
Nabelschnurblut wurde aus der Nabelschnurvene nach der Geburt entnommen. Zur Entnahme des Nabelschnurbluts wurde nach ausreichender Sterilisation der Nabelschnur mit Alkohol und Betadin mit einer 16G-Nadel, die an einen Sammelbeutel angeschlossen war, der 23 ml eines CDPA-1 Gerinnungshemmers enthielt, so in die Nabelschnurvene eingestochen, dass das Nabelschnurblut durch die Schwerkraft in den Beutel lief (siehe 1).
Nachdem 15 ml Ficoll-Hypaque Lösung (Dichte 1,077 g/ml) in ein 50 ml konisches Röhrchen eingefüllt worden war, wurden 25 ml Nabelschnurblut, welches wie oben beschrieben gewonnen wurde, langsam auf die Ficoll-Hypaque Lösung aufgetragen und mit 400 × g 40 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, um eine mononukleäre Zellschicht zu ergeben. Nach Entfernen des Überstands wurde die mononukleäre Zellschicht in ein sauberes Röhrchen übertragen. Zu den mononukleären Zellen wurde 30 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), die 2% fötales Rinderserum enthielt, hinzugefügt, mit 200 × g für 10 Minuten zentrifugiert und gewaschen.
Nachdem das Waschen zweimal wiederholt wurde, wurde die mononukleäre Zellschicht mit 30 ml NH₄Cl-Tris-Lösung versetzt, die 15 Minuten lang stehen gelassen und mit 200 × g 10 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert wurde. Nach Entfernen des Überstands wurde die mononukleäre Zellschicht mit 30 ml 2-prozentiger FBS-PBS, die 10 Minuten lang mit 200 × g bei Raumtemperatur zentrifugiert wurde, versetzt und gewaschen.
Nachdem dieses Verfahren erneut wiederholt wurde, wurde die mononukleäre Zellschicht, die durch das Entfernen des Überstands gewonnen wurde mit 10 ml Basalmedium (α-MEM oder DMEM-Medium) enthaltend 10 % FBS versetzt und gut durchmischt.
Die mononukleären Zellen, die wie oben beschrieben isoliert wurden, wurden auf ihre Lebensfähigkeit und ihre Anzahl hin gemessen, in ein Zellkulturgefäß mit Basalmedium zusammen in geeigneter Anzahl (5 × 10⁵ bis 1 × 10⁶ Zellen/cm²) eingebracht und dann mit 5 % CO₂ im CO₂-Inkubator inkubiert. Dann wurden die Zellen in einem Monolager bei 37 °C kultiviert.
Das Erscheinungsbild einer Kolonie wurde jeden Tag mit einem Mikroskop beobachtet, um zu untersuchen, ob die Kolonie gut angewachsen ist und in einem Monolager am Boden des Kulturgefäßes wächst.
Nachdem die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreicht hatten, wurde das Medium mittels einer Saugpumpe und einer Pipette entfernt und die Zellen dann mit PBS, aus der Kalzium und Magnesium entfernt worden waren, gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden mit 0,25 Trypsin/EDTA-Lösung versetzt und 10 Minuten bei 37 °C in einem CO₂-Inkubator mit 5% CO₂ stehengelassen Aus dem Zellkulturgefäß herausgelöste Zellen wurden wieder in einem Röhrchen gesammelt, mit 200 × g 10 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert und gewaschen.
Die gewaschenen Zellen wurden für eine vorgegebene Inkubationszeit mit Antikörpern gegen mesenchymale stamm-/vorläuferzellenspezifische Antigene zur Reaktion gebracht. Bei den Antikörpern gegen mesenchymale stamm-/vorläuferzellenspezifische Antigene handelte es sich um die Antikörper gegen CD 105, stro-1, SH3 and SH4, bei denen jedem der Antikörper eine magnetische Perle Order ein Fluorochrom angelagert ist, wie zum Beispiel Fluorescinisothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE) oder PerCP etc..
Nach Reaktion mit den Antikörpern wurden die an ihre entsprechenden Antikörper gebundenen Stamm-/Vorläuferzellen unter Verwendung von Zelltrennungsvorrichtungen wie einem magnetischen Zellsorter oder FAC-Sorter isoliert.
Die wie oben beschrieben isolierten Zellen wurden mit 10 ml Basalmedium enthaltend 10 %FBS versetzt, sorgfältig durchmischt und auf ihre Lebensfähigkeit und Zellzahl hin gemessen. Das Basalmedium und die mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen in geeigneter Anzahl (4 to 5 × 10⁴ Zellen/cm²) wurden auf dem Boden eines Zellkulturgefäßes aufgetragen und bei 37 °C mit 5 % CO₂- im CO₂-Inkubator inkubiert.
Danach, sobald die Zellen eine Konfluenz von 100 % erreichten, wurde eine wiederholte Subkultivierung durchgeführt, so dass sich die aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen sich ex vivo ausbreiteten.
2 zeigt die morphologischen Merkmale von Zellen, die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert wurden. In 2a wuchsen die Zellen, die mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung isoliert wurden, in Spindelform als eine typische Form mesenchymaler Stamm-/Vorläuferzellen und in einer Fibroblastenkolonie-ähnlichen homogenen Form. Wie in 2b dargestellt, wurden die Zellen der vorliegenden Erfindung mit Trypanblau gefärbt und auf ihre Lebensfähigkeit hin gemessen, und die Ergebnisse zeigten eine besonders hervorragende Lebensfähigkeit von 98-99 %.
Im Ergebnis dessen erlaubt die vorliegende Erfindung die effiziente Isolierung und Kultivierung mesenchymaler Stamm-/Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut.
2) Analyse der Merkmale von aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen, die durch die vorliegende Erfindung erhalten werden
Um zu untersuchen, ob die aus Nabelschnurblut gewonnenen Zellen, die durch die vorliegende Erfindung erhalten werden, die Merkmale der mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen aufweisen, wurde das Expressionsmuster der Zelloberflächenantigene der Zellen, die unter 1) im Beispiel 1 gewonnen wurden, wie folgt analysiert.
Antigene deren Immunphänotypen in diesem Beispiel untersucht wurden, waren CD45, CD34 und CD14 als hämatopoietische Antigene, HLA-DR als Histokompatibilitätsantigen, CD31 als endothelzellenassoziiertes Antigen, CD51/61 als osteoklastenassoziiertes Antigen, CD29, CD49d und CD49e als integrinrezeptorassoziierte Antigene, CD44, CD54 und CD 106 als matrixrezeptorassoziierte Antigene, SH2, SH3 und SH4 als mesenchymale stamm-/vorläuferspezifischen Antigens, und CD 13, CD64 und CD90 als andere Antigene.
2 × 10⁶ Zellen, die im oben genannten Punkt 1) kultiviert wurden, wurden mit PBS-Lösung, enthaltend 2 % FBS gewaschen und mit Antikörpern entsprechend der jeweiligen Antigene bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Die Expression der Antigene wurde mithilfe eines Flowcytometers untersucht, und die daraus resultierenden Ergebnisse sind in den 3-7 dargestellt. Und zwar stellt 3 die Ergebnisse für die hämatopoietischen Antigene und die Histokompatibilitätsantigene dar, 4 stellt die Ergebnisse für die endothelzellenassoziierten Antigene und osteoklastenassoziierten Antigene dar, 5 zeigt die Ergebnisse für die integrinrezeptorassoziierten Antigene dar, 6 zeigt die Ergebnisse für Matrixrezeptorassoziierte Antigene und 7 zeigt die Ergebnisse für die anderen Antigene.
Wie in 3 dargestellt, zeigten die erfindungsgemäßen aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen eine negative Reaktion auf die Antikörper zu CD45, CD34 und CD 14 als hämatopoietische Antigene und HLA-DR als Histokompatibilitätsantigen.
Daher weisen die die erfindungsgemäßen aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen nur eine geringe Menge an hämatopoietischen Antigenen und Histokompatibilitätsantigen auf, so dass sie die Abstoßung minimieren können, die ein Problem bei der Gewebetransplantation darstellt.
Wie in 4 dargestellt, zeigten die erfindungsgemäßen aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen eine negative Reaktion auf die Antikörper gegen CD31 als ein endothelzellenassoziiertes Antigen und auf CD51/61 als ein osteoklastenassoziiertes Antigen.
Daher kann festgestellt werden, dass, wenn die erfindungsgemäßen aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen bei Gewebstransplantationen verwendet werden, keine Nebenwirkungen auftreten, die durch die Produktion von unerwünschten Blutgefäßen und die Differenzierung der Zellen zu Osteoklasten während der Produktion von Chondrozyten und Osteoblasten verursacht werden können.
Wie in 5 dargestellt, zeigten die erfindungsgemäßen aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen eine positive Reaktion auf Antikörper gegen CD29 und CD49e als integrinrezeptorassoziierte Antigene, während sie eine negative Reaktion auf einen Antikörper gegen das CD49d Antigen zeigten.
Wie in 6 dargestellt, zeigten die erfindungsgemäßen aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen eine positive Reaktion auf Antikörper gegen CD44 und CD54 als matrixrezeptorassoziierte Antigene, während sie eine negative Reaktion auf einen Antikörper gegen das CD 106 Antigen zeigten.
Wie in 7 dargestellt, zeigten die erfindungsgemäßen aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm/-Vorläuferzellen eine positive Reaktion auf Antikörper gegen andere Antigene, d.h. CD13 und CD90, während sie eine negative Reaktion auf einen Antikörper gegen das CD64 Antigen zeigten.
Es wurde außerdem ein Test zur Untersuchung durchgeführt, ob jede der Kulturen der aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung des ersten, fünften, zehnten und fünfzehnten Durchgangs SH2, SH3 und SH4 als typische Oberflächenantigene der mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen exprimiert. Daher kann, wie in 8 dargestellt, festgestellt werden, dass die Zellen der vorliegenden Erfindung eine positive Reaktion auf diese Antigene zeigten, wie die Kultur der aus Knochenmark gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen des ersten Durchgangs, selbst nach mehreren Subkultivierungen, und dieser Immunphänotyp blieb selbst nach mehreren Durchgängen stabil erhalten.
Die in den 3-8 gezeigten Immunphänotypen der mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung sind mit denen der vorhergehenden mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen identisch. Dies deutet an, dass die Zellen, die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung aus Nabelschnurblut isoliert wurden, hervorragende Merkmale für mesenchymale Stamm-/Vorläuferzellen besitzen.
BEISPIEL 2 Differenzierung von aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung in Chondrozyten.
1) Differenzierung von aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung in Chondrozyten.
Um zu untersuchen, ob die aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung die Eigenschaft der Differenzierung in mesenchymale Gewebe aufweisen, wurde die Differenzierung dieser Zellen in Chondrozyten eingeleitet.
Die Zusammensetzung des zur Differenzierung in Chondrozyten verwendeten Mediums wurde in der oben stehenden Tabelle 1) aufgeführt und die Zellen wurden in Pelletkulturen differenziert. Das Medium wurde alle drei Tage ausgetauscht und es wurden in wöchentlichen Intervallen nach Einleitung der Differenzierung Zellproben genommen und einer Immunmarkerexpressionsanalyse und einer molekularbiologischen Analyse unterzogen.
2) Immunchemische Analyse der chondrogen differenzierten Gewebe
Nach der Differenzierung in Chondrozyten, wurden die Zellen der vorliegenden Erfindung wie folgt einer Immunfärbung unterzogen, um zu prüfen, dass sie Typ II Collagen als chondrozytenspezifisches Antigen exprimieren.
Zellpelletproben, die in wöchentlichen Intervallen nach Einleitung der Differenzierung in Chondrozyten genommen wurden, wurden in Paraffin eingelegt oder eingefroren und abgeteilt, um die Antigenität der Epitope zu erhalten Dann wurden die Pelletgewebe auf Objektträgern immobilisiert auf eine Dicke von 3-5 μm und einer Immunfärbung unterzogen.
Die jeweiligen Objektträger wurden 5 Minuten lang mit Wasserstoffperoxid behandelt um in den Zellen vorhandene Peroxidase zu entfernen und dann für 5 Minuten mit einem Proteinblocker behandelt.
Danach wurden sie 10 Minuten lang mit monoklonalen Rattenantikörpern inkubiert. Nach dem Waschen wurden sie 10 Minuten lang mit Streptavidin-Peroxidase behandelt. Anschließend wurden sie mit Chromogenen behandelt um eine Farbreaktion hervorzurufen und mit Hämatoxylin gegengefärbt.
Daraufhin wurden eine Woche nach Einleitung der Differenzierung der aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung in Chondrozyten, positive Ergebnisse in einem Teil der Pellets beobachtet.
Ebenfalls wurden wie in 9 dargestellt drei Wochen nach Einleitung der Differenzierung positive Ergebnisse bei allen Pellets beobachtet.
Angesichts der Tatsache, dass die differenzierten Zellen Typ II-Collagen als wichtigen Bestandteil der extrazellulären Matrix (ECM) wie oben beschrieben sezernieren, wird davon ausgegangen, dass die Zellen der vorliegenden Erfindung die Funktion der Chondrozyten in ausreichendem Maße ausüben können.
3) Molekularbiologische Analyse der chondrogen differenzierten Gewebe
Nach Einleitung der Differenzierung der Zellen der Erfindung in Chondrozyten, wurde die Reverse Transcription-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) wie folgt ausgeführt, um zu untersuchen, ob die Zellen der Erfindung chondrozytenspezifische Gene exprimieren.
Zellpelletproben, die in wöchentlichen Intervallen nach Einleitung der Differenzierung in Chondrozyten genommen wurden, wurden 5 Minuten lang mit Trizol R behandelt und mit Chloroform behandelt und anschließend mit 15000 rpm 15 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde entnommen und mit Isopropanol versetzt, um RNA auszufällen.
Bei der RT-Reaktion wurden die RNA, die wie oben beschrieben gewonnen wurde, 1 μl oligo-d(T) Primer, 1 μl dNTP Mischlösung und RNase-freies Wasser gemischt und für 5 Minuten bei 65 °C zur Reaktion gebracht. Zu dieser Mischung wurden 4μl RT Reaktionspuffer, 2μl DTT und 1 μl RNase-Hemmer hinzugefügt und 2 Minuten lang bei 42 °C zur Reaktion gebracht. Danach wurde Reverse Transkriptase zu der Mischung hinzugefügt und bei 42 °C 50 Minuten lang zur Reaktion gebracht. Die cDNA, die wie oben beschrieben gewonnen wurde, wurde bei 70 °C 15 Minuten lang inaktiviert und als PCR-Matrize verwendet.
In der PCR-Reaktion wurden Typ I-Collagen, Typ II-Collagen, Typ X-Collagen und Aggrecan-Gene als Primer verwendet. Als positive Kontrolle wurde ein humaner artikulärer Chondrozyt ausgewählt und als negative Kontrolle ein GAPDH-Gen, das ständig in Zellen auf einem konstanten Level exprimiert wird, ausgewählt.

Zu jedem der Reagenzgläser wurden, 5μl cDNA, Primer, dNTP Mischlösung, Magnesiumchlorid, 10-facher PCR Reaktionspuffer, and Taq-Polymerase hinzugefügt, zu diesen wurden sterilisiertes, dreifach destilliertes Wasser hinzugefügt, um das endgültige Reaktionsvolumen von 50μl einzustellen. Anschließend wurde die PCR-Reaktion in dem Endvolumen der Reaktion von 50μl ausgeführt. Die Rasensequenz eines Primers für jedes dieser Gene und die Reaktionsbedingungen werden in der untenstehenden Tabelle 3 dargestellt.

TABELLE 3:
Gene	Rasensequenz der Primer	PCR-Zusammensetzung	PCR-Bedingungen
GAPDH	5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' (forward, SEQ ID NO:1)		Initiale Denaturierung bei 94°C für 2min; 35 Zyklen bei 94°C für 30 sek., 60°C für 30 sek., und 72°C für 30 sek.; und finale Extension bei 72°C für 7Min.
	5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (reverse, SEQ ID NO: 2)
Typ I-Collagen	5'-CCCCCTCCCCAGCCACAAAGA-3' (forward, SEQ ID NO:3)	cDNA	Initiale Denaturierung bei 94°C für 2min; 35 Zyklen bei 94°C für 30 sek., 60°C für 30 sek., und 72°C für 30 sek.; and finale Extension bei 72°C für 7Min.
	5'-TCTTGGTCGGTGGTGGACTCT-3' (reverse SEQ ID NO: 4)
Typ II-Collagen	5'-TTTCCCAGGTCAAGATGGTC-3' (forward, SEQ ID NO:5)	Matrize: 5μl	Initiale Denaturierung bei 94°C für 2min; 35 Zyklen bei 94°C für 30 sek., 55°C für 30 sek., und 72°C für 30 sek.; and finale Extension bei 72°C für 7Min.
	5'-CTTCACCACCTGTCTCACCA-3' (reverse, SEQ ID NO: 6)	Primer: 2.5μl, bzw. PCR Mischung

Typ X-Collagen	5'-CCCTTTTTGCTGCTAGTATCC-3' (forward, SEQ ID NO: 7)	Lösung: 7.7μl	Initiale Denaturierung bei 94°C für 2min; 35 Zyklen bei 94°C für 30 sek., 57°C für 30 sek., und 72°C für 30 sek.; and finale Extension bei 72°C für 7Min.
	5'-CTGTTGTCCAGGTTTTCCTGGCAC-3' (reverse, SEQ ID NO: 8)
Aggrecan	5'-TGAGGAGGGCTGGAACAAGTACC-3' (forward, SEQ ID NO: 9)		Initiale Denaturierung bei 94°C für 2min; 35 Zyklen bei 94°C für 30 sek., 60°C für 30 sek., und 72°C für 30 sek.; and finale Extension bei 72°C für 7Min.
	5'-GGAGGTGGTAATTGCAGGGAACA-3' (reverse, SEQ ID NO: 10)

Die jeweiligen PCR-Produkte wurden der Elektrophorese unterzogen und deren Ergebnisse sind in 10 dargestellt.
Wie in 10 dargestellt, exprimierten die aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung ab einer Woche nach Einleitung ihrer Differenzierung in Chondrozyten alle Typ II-Collagen, Typ X-Collagen und Aggrecan-Gene.
Insbesondere wurde der Expressionslevel jedes Gene mit längerer Differenzierungszeit weiter erhöht. Vier Wochen nach Einleitung der Differenzierung war der Expressionslevel jedes der Gene ebenso hoch wie beim humanen artikulären Chondrozyten (bezeichnet als „chon"), der die positive Kontrolle darstellt.
Auf der anderen Seite war der Expressionslevel des GAPDH-Gens als negative Kontrolle konstant, unabhängig von der Zeit der Differenzierungseinleitung.
Dementsprechend können die aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm/-Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung unter geeigneten Bedingungen in Chondrozyten ausdifferenziert werden.
BEISPIEL 3 Differenzierung von aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm/-Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung in Osteoblasten.
1) Differenzierung von aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung in Osteoblasten.
Um zu untersuchen, ob die aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm/-Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung die Eigenschaften der Differenzierung in Osteoblasten aufweisen, wurde die Differenzierung dieser Zellen in Osteoblasten eingeleitet.
Die Zusammensetzung des zur Differenzierung in Osteoblasten verwendeten Mediums wurde in der oben stehenden Tabelle 2 aufgeführt, und die Zellen wurden in einer Monolayerkulture differenziert. Das Medium wurde alle drei Tage ausgetauscht und es wurden in wöchentlichen Intervallen nach Einleitung der Differenzierung Zellproben genommen und einer Immunmarkerexpressionsanalyse und einer molekularbiologischen Analyse unterzogen.
2) Histochemische Analyse der ostengen differenzierten Gewebe
Nach der Differenzierung in Osteoblasten wurden die Zellen der vorliegenden Erfindung wie folgt einer histochemischen Färbung unterzogen, um zu untersuchen, ob sie alkalische Phosphatase exprimieren, welche ein osteoblastenspezifisches Antigen ist.
Zellen, die in wöchentlichen Intervallen nach Einleitung der Differenzierung in Osteoblasten durch Monolayerkultur entnommen wurden, wurden mit Methanol immobilisiert und auf alkalische Phosphatase als osteoblastenspezifisches Antigen histochemisch eingefärbt. Außerdem wurden die Zellen durch von-Kossa-Färbung untersucht, um zu bestimmen, ob Kalzium als extrazelluläre Komponente angereichert wird. Die Ergebnisse sind in 11 dargestellt.
Wie in 11 dargestellt, wurden ab eine Woche nach Einleitung der Differenzierung der aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung in Osteoblasten, positive Ergebnisse in einem Teil der Gewebe beobachtet. Drei bis vier Wochen nach Einleitung der Differenzierung, wurden in allen Geweben positive Ergebnisse beobachtet.
Die Ergebnisse der von-Kossa-Färbung zeigten, dass die extrazelluläre Kalziumanreicherung allmählich anstieg.
Angesichts der Tatsache, dass die differenzierten Zellen alkalische Phosphatase als wichtigen Bestandteil der Osteoblasten exprimieren und extrazelluläre Kalziumanreicherung wie oben beschrieben erlauben, wird davon ausgegangen, dass die Zellen der vorliegenden Erfindung Funktionen der Osteoblasten in ausreichendem Maße ausüben können.
3) Molekularbiologische Analyse der ostengen differenzierten Gewebe
Nach der Differenzierung in Osteoblasten wurde die RT-PCR wie folgt ausgeführt, um zu untersuchen, ob die Zellen der vorliegenden Erfindung osteoblastenspezifische Gene exprimieren.
Gewebeproben, die in wöchentlichen Intervallen nach Einleitung der Differenzierung in Osteoblasten genommen wurden, wurden 5 Minuten lang mit Trizol R behandelt und dann mit Chloroform behandelt und anschließend mit 15000 rpm 15 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde entnommen und mit Isopropanol versetzt, um RNA auszufällen.
Bei der RT-Reaktion wurden die RNA, die wie oben beschrieben gewonnen wurde, 1 μl oligo-d(T) Primer, 1 μl dNTP Mischlösung und RNase-freies Wasser gemischt und für 5 Minuten bei 65 °C zur Reaktion gebracht. Zu dieser Mischung wurden 4μl RT Reaktionspuffer, 2μl DTT und 1 μl RNase-Hemmer hinzugefügt und 2 Minuten lang bei 42 °C zur Reaktion gebracht. Danach wurde Reverse Transkriptase zu der Mischung hinzugefügt und bei 42 °C 50 Minuten lang zur Reaktion gebracht. Die cDNA, die auf diese Weise gewonnen wurde, wurde bei 70 °C 15 Minuten lang inaktiviert und als PCR-Matrize verwendet.
Bei der PCR-Reaktion wurden Osteocalcin, Osteopontin und alkalische Phosphatase, welche osteoblastenspezifische Gene sind, als Primer verwendet. Als negative Kontrolle wurde ein GADPH-Gen, das ständig auf einem konstanten Level in Zellen exprimiert wird ausgewählt.

Zu jedem der Reagenzgläser wurden, 5μl cDNA, Primer, dNTP Mischlösung, Magnesiumchlorid, 10-facher PCR Reaktionspuffer, and Taq-Polymerase hinzugefügt, zu diesen wurden sterilisiertes, dreifach destilliertes Wasser hinzugefügt, um das endgültige Reaktionsvolumen von 50μl einzustellen. Anschließend wurde die PCR-Reaktion in dem Endvolumen der Reaktion von 50μl ausgeführt. Die Rasensequenz eines Primers für jedes dieser Gene und die Reaktionsbedingungen werden in der untenstehenden Tabelle 4 dargestellt.

TABELLE 4:
Gene	Basensequenzen der Primer	PCR-Zusammensetzung	PCR-Bedingungen
GAPDH	5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' (forward, SEQ ID NO: 1) 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (reverse, SEQ ID NO: 2)		Initiale Denaturierung bei 94°C für 2min; 35 Zyklen bei 94°C für 30 sek., 55°C für 30 sek., und 72°C für 30 sek.; and finale Extension bei 72°C für 7Min.
Osteocalcin	5'-CATGACAGCCCTCACA-3' (forward, SEQ ID NO: 11)	cDNA Matrize: 5μl
Osteocalcin	5'-AGAGCGACACCCTAGAC-3'(reverse, SEQ ID NO: 12)	Primer: 2.5μl,
Osteopontin	5'-CCAAGTAAGTCCAACGAAAG-3' (forward, SEQ ID NO: 13)	beziehungsweise
Osteopontin	5'-GGTGATGTCCTCGTCTGTA-3' (reverse, SEQ ID NO: 14)	PCR-Mischlösung: 7.7μl
Alkalische Phosphatase	5'-TGGAGCTTCAGAGACTCAACACCA-3' (forward, SEQ ID NO: 15)

5'-ATCTCGTTGTCTGAGTACCAGTCC-3' (reverse, SEQ ID NO: 16)

Die jeweiligen PCR-Produkte wurden der Elektrophorese unterzogen und die Ergebnisse davon sind in 12 dargestellt.
Wie in 12 dargestellt, exprimierten die aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung ab einer Woche nach Einleitung ihrer Differenzierung in Osteocyten alle Osteocalcin, Osteopontin und alkalische Phosphatase. Der Expressionslevel jeden Gens wurde mit längerer Differenzierungszeit weiter erhöht.
Auf der anderen Seite war der Expressionslevel des GAPDH-Gens als negative Kontrolle konstant, unabhängig vom Durchgang der Differenzierungseinleitungszeit.
Dementsprechend können die aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung unter geeigneten Bedingungen in Osteoblasten ausdifferenziert werden.
Anwendbarkeit in der Industrie
Wie oben beschrieben, hat das Verfahren der Zellisolierung und Kultivierung gemäß der vorliegenden Erfindung den Effekt, die mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen aus dem Nabelschnurblut zu isolieren, während die hohe Reinheit und Lebensfähigkeit der Zellen erhalten bleiben.
Die mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung aus Nabelschnurblut isoliert und kultiviert wurden, können unter geeigneten Bedingungen in verschiedene mesenchymale Gewebe, einschließlich Chondrozyten und Osteoblasten ausdifferenziert werden.
Dementsprechend sind das Verfahren der Zellisolierung und Kultivierung gemäß der vorliegenden Erfindung und die aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen, die durch dieses isoliert und kultiviert wurden nützlich bei der Erneuerung und bei der Behandlung von verletztem mesenchymalen Gewebe.
Sequenzliste

Claims

Verfahren zur Isolierung, Kultivierung und Chondrogenese von mesenchymalen Stamm/-Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut, das die Schritte umfasst: Auftragen von Nabelschnurblut auf Ficoll-Hypaque Lösung; Zentrifugation des Nabelschnurbluts auf der Ficoll-Hypaque Lösung, um mononukleäre Zellen zu erhalten; zur Reaktion bringen von Zellen, die durch Monolayerkultur der mononukleären Zellen erhalten wurden, mit Antikörpern gegen mesenchymale stamm-/vorläuferzellenspezifische Antigene für eine vorbestimmte Inkubationszeitspanne; Isolierung nur der Zellen, die an ihre entsprechenden Antikörper gebunden sind, unter Verwendung eines Zellsorter; Kultivierung der isolierten Zellen; und Kultivierung der mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen in Zelldifferenzierungsmedium, für eine vorbestimmte Inkubationszeitspanne, zur Ausdifferenzierung in Chondrozyten.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen von den mononuklearen Zellen unter Ausnutzung von spezifischer Antikörperbindung an einen oder mehrere Antikörper, der/die ausgesucht ist/sind aus Antikörpern gegen CD 105, SH3 und SH4 Antigene.
Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei die mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet sind, die Abstoßungsreaktion im Fall von Gewebe- oder Organtransplantation zu minimieren.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die aus Nabelschnurblut erhaltenen mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen eine positive Reaktion auf Antikörper für CD29, CD49e, CD44, CD54, CD13, CD90, SH2, SH3 und SH4 Antigene zeigen, und eine negative Reaktion auf Antikörper für CD45, CD34, CD14, HLA-DR, CD31, CD51/61, CD49d, CD106 und CD64 Antigene zeigen.
Das Verfahren nach Anspruch 4, wobei die mesenchymalen Stamm-/Vorläuferzellen durch ihre Fähigkeit charakterisiert sind, die Nebenwirkung zu minimieren, die durch die Produktion von unerwünschten Blutgefäßen oder die Ausdifferenzierung in Osteoklasten während der Chondrogenese im Fall von Gewebe- oder Organtransplantation verursacht werden.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zelldifferenzierungsmedium aus 10 ng/ml TGF-βIII, 6,25 μg/ml Rinderinsulin, 6,25 μg/ml Transferrin, 5,35 μg/ml Seleniger Säure, 1,25 μg/ml Linolsäure, 100 μg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 100 mM Natriumpyruvat, 100 nM Dexamethason, 50 μg/ml Ascorbinsäure-2-Phosphat und 40 μg/ml Prolin und einem herkömmlichen Zellkulturmedium besteht.
Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei das herkömmliche Zellkulturmedium ausgewählt ist aus DMEM, α-MEN, McCoys 5A Medium, Eagles Basal Medium, CMRL Medium, Glasgow Minimalmedium, Hams F-12 Medium, Iscove's modified Dulbecco's Medium, Liebovitz L-15 Medium, RPMI 1640 Medium.
Das Verfahren nach Ansprüchen 6 oder 7, wobei das Zelldifferenzierungsmedium weiter ein oder mehrere Hilfsstoffe enthält, ausgewählt aus einem Wachstumsfaktor, Pferde- oder Humanserum, Antibiotika und antimykotischen Wirkstoffen, einschließlich Penicillin G, Streptomycinsulfat, Amphotericin B, Gentamycin und Nystatin.