KR100812544B1 - 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 및 이를 함유하는 허혈성괴사질환 치료용 세포치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 제대혈(탯줄혈액) 유래 혈액을 인간 혈청 또는 프라즈마를 함유하는 배지에서 배양하여 분리해 낸 성체 줄기세포인 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells) 및 이를 유효성분으로 함유하는 폐쇄성 동맥질환에 의한 허혈성 괴사질환 치료용 세포치료제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 다분화능 줄기세포는 성체 줄기세포임에도 불구하고 골형성 세포 또는 신경세포로 분화하는 능력을 가지고 있어서 대퇴부의 동맥순환 정체가 말초순환장애를 일으킴으로서 미세 혈관계의 조직을 붕괴시켜 허혈성 괴사를 야기하는 질병뿐만 아니라 뇌경색, 심근경색, 당뇨의 후유증으로 오는 사지 말단의 괴사 등 허혈성 질병의 치료에 유용하다.

Description

제대혈 유래 다분화능 줄기세포 및 이를 함유하는 허혈성 괴사질환 치료용 세포치료제{Multipotent Stem Cells Isolated from Umbilical Cord Blood and the Cellular Therapeutic Agent Comprising the Same for Treating Ischemic Disease}

본 발명은 제대혈(탯줄혈액) 유래 혈액을 인간 혈청 또는 프라즈마를 함유하는 배지에서 배양하여 분리해 낸 성체 줄기세포인 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells) 및 이를 유효성분으로 함유하는 폐쇄성 동맥질환에 의한 허혈성 괴사질환 치료용 세포치료제에 관한 것이다.

사회의 고령화와 함께 폐쇄성 동맥질환에 의한 혈행장애를 초래하는 사례가 증가되고 있다. 이러한 혈행장애의 대표적인 질환으로는 심근경색, 뇌경색, 손이나 발, 주로 무릎 아래의 적은 동맥이나 정맥에 염증이나 혈관벽의 변화에 의해 혈관이 수축하거나 좁아져 혈전에 의해 혈관이 완전히 막히는 폐쇄성 전층성 혈관염 질환인 버거씨병 및 당뇨 합병증으로 미세혈관과 대혈관의 장애로 일어나는 폐쇄성 동맥질환 등이 있다.

심근경색은 심장에 산소와 영양을 공급해주는 관상동맥의 일부가 막혀, 혈류가 중단됨으로써 그 부분의 심장의 벽, 즉 심근이 썩는 병이다. 뇌경색에는 죽상 동맥경화로 혈관이 좁아지거나 막혀서 흘러갈 피가 모자라고 이어서 산소가 모자라 서 뇌조직이 죽는 혈전성 뇌경색과 뇌경색 죽상 동맥경화가 있는 동맥의 혈전에서 떨어져 나온 조각(색전)이 뇌혈관을 따라 흘러가다 걸려서 동맥을 막기 때문에 그 아래의 뇌조직이 죽는 색전성 뇌경색이 있다.

버거씨병은 직접적인 원인이 규명되지 않았으나 여러 가지 요소들이 복합적으로 작용한 것으로 추측되고 있다. 나이나 성별, 종족 유전적요인, 자가면역성, 직업, 흡연 등이 이차적인 원인적 요소라고 여겨지고 있다. 또한 이들 환자들에게는 혈중 피브리노겐수치가 다소 높아서 혈액의 과응고 상태나 혈소판의 과응집 상태 또는 교감신경의 과민 상태로 오는 말초 혈관 수축 등도 원인적 요소로 추정된다.

그리고 당뇨병 합병증에서 가장 무서운 증상 중의 하나인 사지괴저는 당뇨병이 중증일 때 생기며, 손이나 발끝이 시커멓게 썩어 들어가는 위험한 증상이다. 정확한 원인은 알 수 없으나 외상, 화상, 화농 등의 증상에서 기인하는 것으로 추측하고 있고, 괴저는 50세 이후의 환자에게서 많이 나타나며 염증, 수포, 궤양 등을 일으키며 열이 나고 심한 경우에는 손, 발의 절단에서부터 생명을 잃게까지 하는 증상이다.

이러한 폐쇄성 동맥질환은 한국에서는 아직까지 확실한 통계가 미흡하나 백인들보다 빈도가 높아 전체 말초 동맥질환의 약 15％ 정도로 추정된다(Laohapensang, K. et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg., 28(4):418, 2004). 폐쇄성 동맥질환은 원위상지와 하지에 작거나 중간크기의 동맥과 정맥을 침범하며 대부분 사지 말단부의 동맥순환정체가 말초순환장애를 일으킴으로써, 미세혈관계의 조직을 붕괴시켜 허혈성 괴사를 야기한다. 이 허혈성 괴사시에는 동맥혈류압 감소와 모세혈관혈류의 정체로 인해, 백혈구와 혈소판이 활성화되고 혈관 내피에 손상을 입히고 결국 국소적인 저산소증과 대사변화를 초래한다.

폐쇄성 동맥질환의 치료는 막힌 동맥 상하부위 사이에 동맥의 피가 잘 흐를수 있도록 인조혈관 등을 이용하여 새로운 혈관을 만들어 주는 동맥 우회수술이 있으며, 이외에도 혈관 확장제를 투여하는 약물요법과 다리에 있는 작은 혈관을 확장시켜 주기 위해 요추부위의 교감신경을 마비시키는 치료법 등이 있다. 최근에는 혈관내피세포 성장인자(VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor 165)를 이용한 치료법의 개발(Kim, H.J. et al., Exp. Mol. Med., 36(4):336, 2004)과 자가 조혈모 세포이식을 통한 치료법 개발(Miyamoto, M. et al., Cell Transplant., 13(4):429, 2004) 등에 대한 연구가 진행되고 있다.

이러한 폐쇄성 동맥질환은 허혈성 괴사를 야기한다. 이러한 증상은 그 원인이 아직 정확하게 밝혀져 있지 않으며 또한 질환이 계속 진행되는 특성이 있기 때문에 아직 확실한 근치적 치료법이 정립되어 있지 않은 단계이다. 버거씨병 등 폐쇄성 동맥질환에 의한 허혈성괴사를 치료하는 최종적인 목적은 동맥혈류를 원활히 만드는 것이다.

한편, 줄기세포(stem cells)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cells), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multipotents stem cells)로 분류할 수 있다.

만능 줄기세포(totipotent stem cells)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다.

전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기 세포라 하며 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다.

다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포로서, 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있으며 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라고 한다.

지금까지 알려진 제대혈 유래 성체 줄기세포로는 골세포나 골격근으로 분화 가능한 중간엽 줄기세포 (Lee, O.K. et al., Blood, 103:1669, 2004; Gang, E.J. et al., BBRC, 321:102, 2004; Gang, E.J. et al., Stem Cell, 22:617, 2004), 심장세포로 분화가능한 심장줄기세포(US 2004/0126879) 및 내피전구세포(Yamamoto, K. et al., Arterio. Thromb. Vasc. Biol., 24:192, 2004) 등이 있다.

그러나, 상기 줄기세포들은 중간엽 줄기세포에 의한 골세포나 골격근으로의 분화, 심장 줄기세포에 의한 심장세포로의 분화, 내피전구세포에 의한 혈관 내피세포로의 분화 등의 제한된 조직으로의 분화능만을 나타내어 진정한 다분화능 줄기세포라고 하기에는 곤란하다. 또한, 상기 인용된 선행문헌에서는 줄기세포를 분리하는 과정에서 FBS 함유 배지를 사용하였는 바, 수득할 수 있는 세포의 수나 종류가 제한될 수밖에 없었다.

이에 본 발명자들은 제대혈 유래 혈액을 인간 혈청 또는 플라즈마를 배지로 이용하여 배양한 결과, 수득된 성체 줄기세포가 플라스틱에 부착능이 우수할 뿐만 아니라, 골형성 세포, 신경세포 등 다양한 조직으로 분화한다는 것을 규명함과 아울러, 폐쇄성 동맥질환에 의한 허혈성 괴사질환의 세포치료제로서 유용하다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

발명의 요약

본 발명의 주된 목적은 제대혈 유래 성체 줄기세포인 다분화능 줄기세포 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 성체 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 폐쇄성 동맥질환에 의한 허혈성 괴사 질환 치료용 세포치료제를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제대혈 유래 혈액을 5∼20％의 인간 혈청 또는 플라즈마를 함유하는 배지에서 배양하여 수득되고, 다음과 같은 특성을 나타내는 성체 줄기세포를 제공한다:

(a) CD24, CD29, CD31, CD33, CD45 및 CD49B에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD34, CD51/61, CD62L, CD62P, CD73, CD90, CD133 및 CD135에 대 하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄;

(b) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 둥근형태(round-shape) 또는 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타냄; 및

(c) 중배엽, 내배엽 및 외배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.

본 발명은 또한, 제대혈 유래 혈액을 5∼20％의 인간 혈청 또는 플라즈마를 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 상기 (a) 내지 (c)의 특성을 나타내는 성체 줄기세포의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 SH-2 및/또는 SH-3에 대하여 양성의 면역학적 특성을 추가로 나타내는 것을 특징으로 할 수 있고, CD44, CD105 및 CD117에 대해서는 양성 또는 음성의 면역학적 특성을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 중배엽 세포는 골형성 세포, 신경세포 또는 혈관내피세포(endothelial cells)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 성체 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 폐쇄성 동맥 또는 정맥 질환에 의한 허혈성 괴사질환 또는 심혈관 질환 치료용 세포치료제를 제공한다. 상기 허혈성 괴사 질환에는 심근경색, 뇌경색, 버거씨 병 또는 당뇨 합병증에 의한 사지괴저병 등이 있다.

본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.

본 발명은 제대혈에서 분리된 다분화능 줄기세포에 관한 것이다.

본 발명에서 제대혈은 인간을 포함한 포유동물에서 태반과 태아를 연결하는 제대정맥으로부터 채취된 혈액으로 정의되며, 본 발명의 다분화능 줄기세포는 인간의 제대혈을 사용하는 것이 바람직하다.

제대혈로부터 다분화능 줄기세포를 분리 및 정제하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 다음의 방법을 사용할 수 있다. 즉, 제대혈에서 채취한 혈액을 PBS와 일정 비율로 희석, 교반시키고 이를 10∼15:20∼30, 바람직하게는 15:25의 비율로 피콜 상 분리를 실시한다. 10∼20㎖, 바람직하게는 15㎖의 피콜용액에 상기에서 PBS와 혼합, 교반시킨 혈액샘플을 부드럽게 흘려 층이 분리되도록 한 다음 원심분리를 실시한다. 그 후 세 개의 서로 다른 층이 형성되면, 그 중에서 가운데 층의 버피코트를 마이크로 파이펫으로 취하고, HBSS로 2∼5회 세척한 다음, 원심분리하여 제대혈 유래 다분화능 줄기 세포액을 수득한다.

원심분리하여 최종 수득된 펠렛을 1∼5㎖의 배지(5∼15％의 인간 자가 혈청 또는 플라즈마(autologous human serum or plasma), 혹은 인간 타가 혈청 또는 플라즈마(allologous human serum or plasma)와 알칼리성 섬유아세포 증식 인자(bFGF) 10ng/ml을 포함하는 MSCBM+MSCGM(Cambrex, USA) 세포 배양액)에 희석하여 플라스크에 깔아서 배양을 한다. 75-flask에 seeding하는 경우 10⁶∼10⁸ 정도의 세포를 넣어 주고 5∼15％의 인간 자가 및 타가 혈청(autologous or allologous human serum)과 알칼리성 섬유아세포 증식 인자(bFGF) 10ng/ml을 첨가해준다. 5％ CO₂, 37℃ 배양기에서 배양한다. flask에 처음 seeding된 cell은 약 1∼2일후 transfer 해준다. 배지는 약 3∼7일에 1회 교체해준다.

본 발명에서는 제대혈 유래 다분화능 줄기 세포액을 기존의 FBS 대신에 인간 혈청 또는 플라즈마를 함유하는 배지에서 배양하였다. 그 결과, FIG. 1에 나타난 바와 같이, 5％ FBS 및 10％ FBS 함유 배지에서 배양한 경우와 비교하여, 5％ 및 10％의 인간 플라즈마를 함유한 배지에서 배양한 경우, 배양접시 부착하여 성장하는 세포의 수가 훨씬 많다는 것을 확인할 수 있었다.

상기에서 수득한 제대혈 유래 줄기세포액으로부터 목적의 표면항원을 발현하고 있는 다분화능 줄기세포를 수득하는 방법으로서는 소팅 기능을 가진 플로우 사이토미터를 사용한 FACS 법(Int. Immunol., 10(3):275, 1998), 자기 비즈를 사용하는 방법, 다분화능 줄기세포를 특이적으로 인식하는 항체를 사용한 패닝법(J. Immunol., 141(8):2797, 1998) 등이 있다. 또한, 대량의 배양액 등으로부터 다분화능 줄기세포를 수득하는 방법으로서는, 세포의 표면에 발현되어 분자(이하, 표면 항원이라 칭함)를 특이적으로 인식하는 항체를 단독 또는 조합하여 이를 칼럼으로서 사용하는 방법이 있다.

플로우 사이토미터 소팅 방식으로서는, 수적하전 방식, 셀캡쳐 방식 등을 들 수 있다 어떠한 방법도 세포의 표면항원을 특이적으로 인식하는 항체를 형광으로 표지하고, 표지된 항체와 항원의 결합체에 대한 형광을 측정하여 형광 강도를 전기 신호로 변환함으로서 세포의 항원 발현량을 정량할 수 있다. 또한, 사용하는 형광물질의 종류를 조합함으로서, 복수의 표면 항원을 발현하고 있는 세포를 분리하는 것도 가능하다. 여기에 사용가능한 형광물질로는, FITC(fluorescein isothiocyanate), PE(phycoerythrin), APC(allo-phycocyanin), TR(TexasRed), Cy3, CyChrome, Red613, Red670, TRI-Color, QuantumRed 등이 있다.

플로우 사이토미터를 사용한 FACS 법으로서는, 상기에서 수득한 줄기세포용액을 수집하고, 원심분리 등의 방법으로 세포를 분리한 후, 직접 항체로 염색하는 방법과 한번 적당한 배지 중에서 배양, 증식을 실시한 후에 항체를 염색하는 방법을 이용할 수 있다. 세포의 염색은 우선, 표면 항원을 인식하는 일차항체와 목적 세포샘플을 혼합하고, 얼음위에서 30분 내지 1시간 인큐베이션한다. 일차 항체가 형광으로 표지되어 있는 경우에는 세정 후 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다 일차 항체가 형광 표지되어 있지 않는 경우에는 세정 후 일차 항체에 대해서 결합 활성을 갖는 형광 표지된 이차 항체와 일차 항체가 반응한 세포를 혼합하고, 다시 얼음물에서 30분 내지 1시간 인큐베이션한다. 세정 후, 일차 항체와 이차 항체에서 염색된 세포를 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다.

자기 비즈를 사용하는 방법으로는, 목적 표면 항원을 발현하고 있는 세포를 대량으로 분리할 수 있다 분리 순도는 전술한 플로우 사이토미터를 사용하는 방법에는 미치지 않지만, 정제를 반복함으로서 충분히 높은 세포 순도를 확보할 수 있다.

각종 표면 항원으로서는 조혈관련항원, 중간업계 세포의 표면 항원 또는 신경계 뉴런의 특이항원 등을 들 수 있다. 상기 조혈관련 항원으로는 CD34, CD45 등이 있고, 중간업계 세포의 표면 항원으로는 SH-2, SH-3 등을 들 수 있으며, 신경계 뉴런의 특이항원으로는 NSE, GFAP 등을 들 수 있다. 전술한 각종 표면 항원을 인식하는 항체를 단독 혹은 조합하여 사용함으로서, 목적으로 하는 세포를 취득할 수 있다.

본 발명은 상기에서 수득된 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 허혈성 괴사모델을 이용한 마우스 모델에 이식시킨 결과, 본 발명의 다분화능 줄기세포를 투여한 경우에는 그 괴사증상유발이 저해되고, 결절된 대퇴동맥을 대신하는 신생혈관이 생성된다는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 다분화능 줄기세포는 폐쇄성 동맥 질환에 의한 허혈성 괴사 질환에 대한 세포 치료제로서 사용할 수 있다. 허혈성 괴사 질환에 대한 세포치료제로서는 본 발명에 따른 다분화능 줄기세포 중에서도 혈관세포로의 분화능을 갖는 세포를 고순도로 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다분화능 줄기세포는 허혈성 괴사의 크기 및 부위에 따라 시험관내(in vitro)에서 분화, 증식시킴으로서, 원하는 혈관으로의 분화능을 갖는 세포를 취득하고, 이것을 허혈성 괴사 부위로 이식함으로서 허혈성 괴사질환의 치료에 사용할 수 있다. 또한, 허혈성 괴사 부위로 본 발명의 다분화능 줄기세포를 직접 이식시킬 수도 있다.

본 발명의 다분화능 줄기세포는 monocyte-macrophage 항원인 CD45에 대하여 양성을 나타내고, hematopoietic lineage의 항원인 CD34에 대하여 음성을 나타내고 있어, hematopoietic 세포에서 monocyte로 분화가 진행중인 줄기세포로 여겨진다.

FIG. 1은 제대혈 유래 세포의 FBS 또는 인간 플라즈마 함유 배지에서 배양한 경우, 세포 접착력을 비교한 것으로, 왼쪽 사진은 200배 배율로 촬영한 것이고, 오른쪽 사진은 400배 배율로 촬영한 것이다.

FIG. 2는 제대혈 유래 다분화능 줄기세포가 골형성 세포로 분화된 것을 나타낸 것(A 및 B)이고, C와 D는 Von-Kossa 염색법으로 염색한 것을 나타낸 것이다.

FIG. 3은 제대혈 유래 다분화능 줄기세포와 특이항원의 결합을 나타낸 것이다. A 및 B는 각각 신경계 뉴런의 특이 항원인 NSE(neuron-specific enolse)와 신경계 성상세포의 특이항원인 GFAP(glial fibrillary acidic protein)에 양성반응을 보인다는 것을 나타낸 것이고, C와 D는 그 대조군을 나타낸 것이다.

FIG. 4는 유세포 분석기를 이용한 제대혈 유래 다분화능 줄기세포의 면역학적 특성을 나타낸 것이다(A 및 E:대조군; B:CD34; C:CD45; D:SH-2; F:SH-3).

FIG. 5는 본 발명에 따른 성체 줄기세포에서 항원의 발현여부를 조사하기 위한 PAS 염색결과를 나타낸 것이다.

FIG. 6은 허혈성 괴사 모델의 마우스에서 혈관결절 30일 후 본 발명의 줄기세포를 투여하지 않은 대조군으로서, 적색원은 절단현상이 일어난 부위를 나타낸 것이다.

FIG. 7은 허혈성 괴사 모델의 마우스에서 혈관결절 30일 후 즉시 본 발명의 줄기세포를 투여한 군으로서, 적색원은 절단현상이 일어난 부위를 나타낸 것이다.

FIG. 8은 허혈성 괴사 모델의 마우스에서 혈관결절 31일 후 본 발명의 줄기세포를 투여한 군으로서, 적색원은 절단현상이 일어난 부위를 나타낸 것이다.

FIG. 9는 허혈성 괴사모델의 마우스에서 그 증상일자 및 절단일자를 도표화한 것이다.

FIG. 10은 허혈성 괴사모델의 마우스에서 군별 절단율을 도표화한 것이다.

FIG. 11은 허혈성 괴사 모델의 마우스에서 혈관결절 30일 후, 각 군별 혈관 조영술을 이용하여 X-ray 촬영한 것이다.

FIG. 12는 허혈성 괴사 모델의 마우스의 부검 후 대퇴부 근육 부위를 조직절편화 하여 in situ hybridization 기법을 통해 human 특이 probe로 human 세포를 추적하는 것을 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예 1. 제대혈에서 다분화능 줄기세포의 분리

제대혈(umbilical cord blood)은 임상시험윤리위원회지침서(institutional Review Board guidelines)에 따라 서울대학교 대학병원과 삼성제일병원에서 정상(full-term)분만과 조산(preterm) 분만에서 수집하였다.

상기 수집된 제대혈로부터 얻은 혈액샘플 70∼100ml을 PBS와 1:1 비율로 희석한 다음, 교반하였다. 그 후 15:25의 비율로 피콜 상 분리를 실시하였다. 15㎖의 피콜 용액에 PBS와 1:1의 비율로 희석된 혈액 샘플을 부드럽게 흘려 층이 분리되도록 한 다음, 원심분리(2500rpm, 20분) 하였다. 원심분리 후 아래로부터 세 개의 서 로 다른 층이 형성되는데, 이 중에서 중간층의 버피코트를 마이크로 피펫으로 취하고, HBSS로 세 번 세척한 다음, 원심분리하여(1500rpm, 15분) 최종적인 펠렛(제대혈 유래 다분화능 줄기세포액)을 수득하였다.

실시예 2. 제대혈 유래 다분화능 줄기세포의 골형성 세포로의 분화

상기 실시예 1에서 수득한 제대혈 유래 다분화능 줄기세포액을 1㎖ 골형성 유도배지(0.1μmol/L dexamethasone[Sigma, USA], 0.05mmol/L ascorbic acid-2-phosphate [Sigma, USA] and 10mmol/L beta-glycophosphate [Sigma], 5∼20％ 인간 혈청 또는 플라즈마)에 희석하여 세포 수를 센 다음, 플라스크에서 배양(5％ CO₂, 37℃에서, 배지는 3∼4일에 한번씩 교체)하여 다분화능 줄기세포의 골형성 세포로 분화를 유도하였다. 배양 시작한 14일째 Von-Kassa 염색법을 이용하여 제대혈 유래 다분화능 줄기세포가 골형성 세포로 분화되었음을 확인하였다 (FIG. 2 참조).

실시예 3. 제대혈 유래 다분화능 줄기세포의 신경세포로의 분화

상기 실시예 1에서 수득한 제대혈 유래 다분화능 줄기세포액을 1㎖ 신경인성배지(5∼20％ 인간 혈청 또는 플라즈마에 10ng/ml basic fibroblast growth[Roche, Switzerland], 10ng/ml human epidermal growth factor[Roche, Switzerland] 10ng/ml human neural growth factor[Invitrogen, USA]를 첨가)에 희석하여 세포 수를 센 다음, 플라스크에 깔고 5％ CO_2, 37℃에서 배양하여 다분화능 줄기세포로부터 신경세포로의 분화를 유도하였다. 배양 시작한 14일 째 신경계 뉴런의 특이항원인 NSE(neuron-specific enolase)와 신경계의 성상세포 특이항원인 GFAP(glial fibrillary acidic protein)에 대하여 양성반응을 나타냄을 확인함으로서 제대혈 유래 다분화능 줄기세포가 신경세포로 분화되었음을 확인하였다 (FIG. 3 참조).

실시예 4. 제대혈 유래 다분화능 줄기세포의 면역학적 특성

상기 실시예 1에서 수득한 제대혈 유래 다분화능 줄기세포의 면역학적 특성을 알아보기 위하여 세포표면항원의 발현 양상을 조사하였다. 즉, 상기 실시예 1에서 배양한 세포를 2×10⁶∼10⁷개가 되도록 준비하여 PBS 용액으로 세척하고, 각 항원에 해당하는 항체와 실온에서 반응시켰다. 항원의 발현여부는 유세포분석기(flow cytometer)를 이용하여 확인하였다. 또한, PAS(periodic acid stain) 염색을 하였다.

그 결과, FIG. 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 제대혈 유래 다분화능 줄기세포는 CD45에 대해서는 63.38％, SH-2에 대해서는 96.54％, SH-3에 대해서는 63.99％의 양성반응을 나타냈으며, CD34에 대해서는 90％ 이상 음성을 나타냈다. 또한, 다른 항원에 대한 면역표현형을 확인한 결과, CD51/61 음성, CD62L 음성, CD62P 음성, CD133 음성, CD135음성, CD90 음성, CD29 양성, CD44 양성 또는 음성, CD49B 양성, CD105(SH-2) 양성 또는 음성, 및 CD90 음성의 면역학적 특성을 나타냈다.

한편, FIG. 5에 나타난 바와 같이, PAS 염색에서도 양성반응을 나타냈다.

실시예 5. 허혈성 괴사모델에 대한 다분화능 줄기세포의 치료효과

(1) 실험동물의 준비

BALB/cANCrjBgi-nu 종 6주령의 암컷 20마리를 (주)오리엔트에서 구입하여 1주일간 순화시킨 다음, 18마리를 선별하여 하기 실험예에 사용하였다. 온도 32 ± 3℃, 상대습도 60±10％, 환기회수 10∼12회/시간, 조명시간 12시간, 조도 250∼200lux로 하여 HEPA 필터가 장착된 MI rack에서 고압 증기멸균된 실험동물용 고형사료((주) 퓨리나)와 고압증기멸균된 음용수를 자유 섭취시키면서 사육하였다. 순화기간 및 실험기간 중에 폴리카보네이트 MI 케이지(polycarbonate MI cage, 26×42×18cm, 명진기계 제작)에서 사육상자당 7마리를 사육하였다.

상기 사육시킨 마우스에 대하여 시험 전에 체중을 측정하여 군간 체중 차이가 없게 무작위법으로 3개의 군(대조군: 7마리; 다분화능 줄기세포 즉시 투여군: 8마리; 다분화능 줄기세포 하루 후 투여: 3마리)으로 분리하였다(Table 1 참조).

상기 사육시킨 마우스에 대하여 시험 전에 체중을 측정하여 군간 체중 차이가 없게 무작위법으로 3개의 군(대조군: 7마리; 다분화능 줄기세포 즉시 투여군: 8마리; 다분화능 줄기세포 하루 후 투여: 3마리)으로 분리하였다 (표 1 참조).

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상기 3개군에 선행논문(Nicholson, C.D. et al., Int. J. Sports Med., 13(1):60, 1992)을 응용하여, 케타민 1.2mg을 복강 내 주사하여 마취시킨 다음, 각 개체의 왼쪽 대퇴부를 절개한 후에 대퇴동맥을 결절하고 봉합실로 봉합하여 버거씨 병 마우스 모델을 확립하였다.
상기 실시예 1에서 배양된 다분화능 줄기세포를 PBS로 2회 세척한 다음, 0.25％ 트립신으로 처리하여 세포를 수거하고, 원심분리를 통해 상층액을 제거하였다. 이후 PBS로 세척하여 트립신을 불활성화 시킨 후 2차 원심분리를 실시하여 1.3×10⁶∼10⁷개의 세포를 수거하였다. 이를 멸균생리식염수 100㎕에 부유시켜 다분화능 줄기세포 즉시 투여군 8마리의 각 대퇴부 근육에 투여하였다. 또한 상기 허혈성 괴사유발후 24시간후에 같은 방법으로 1.3×10⁶∼10⁷개의 다분화능 줄기세포를 멸균생리식염수 100㎕에 부유시켜, 다분화능 줄기세포 하루 후 투여군 3마리의 각 왼쪽 대퇴부 근육에 투여하였다.

상기 실시예 1에서 배양된 다분화능 줄기세포를 PBS로 2회 세척한 다음, 0.25% 트립신으로 처리하여 세포를 수거하고, 원심분리를 통해 상층액을 제거하였다. 이후 PBS로 세척하여 트립신을 불활성화 시킨 후 2차 원심분리를 실시하여 1.3×10⁶~10⁷개의 세포를 수거하였다. 이를 멸균생리식염수 100㎕에 부유시켜 다분화능 줄기세포 즉시 투여군 8마리의 각 대퇴부 근육에 투여하였다. 또한 상기 허혈성 괴사유발후 24시간후에 같은 방법으로 1.3×106∼107개의 다분화능 줄기
세포를 멸균생리식염수 100㎕에 부유시켜, 다분화능 줄기세포 하루 후 투여군 3마리의 각 왼쪽 대퇴부 근육에 투여하였
다.

상기와 같이 허혈성 괴사를 유도한 마우스에 본 발명의 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 투여한 후 30일 동안 실험동물의 대퇴부를 관찰하였다.

증상이 나타난 일자와 절단이 나타난 일자를 구분하여 기록하였고, 시험 시작 전과 종료시점에서 시험동물의 체중을 측정하고 시험이 종료된 후 부검하였다. 시험 중 측정된 시험동물의 체중 등에 관한 자료의 통계학적 분석을 위하여 one-way ANOVA를 실시하여 군간 유의성을 검정하였고, 유의성이 인정되면 Dunnett's t-test를 실행하여 대조군과 시험군간의 통계학적 유의성을 검정하였다(p〈0.05).

그 결과, FIG. 6∼8에 나타난 바와 같이, 혈관결절 30일 후 본 발명의 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 투여하지 않은 대조군 모두에서는 적색원으로 관찰되는 절단현상이 나타났다 (FIG. 6 참조), 반면, 다분화능 줄기세포 즉시 투여군의 경우, 총 8마리 가운데 5마리에서만 절단현상이 나타났으며, 6, 8번 개체의 경우 버거씨병을 유발시켰음에도 불구하고 거의 정상적인 행동양상을 보였고, 4번 개체 의 경우 버거씨병에 의한 절단이 예방되었다(FIG. 7 참조). 한편, 다분화능 줄기세포 하루 후 투여군의 경우, 총 3마리의 실험동물 모두에서 절단현상이 발생하였으며, 이는 다분화능 줄기세포 즉시 투여군에 비해 혈관신생 등의 치료적 효과가 거의 없다는 것을 의미한다(FIG. 8 참조).

또한, 허혈성 괴사모델 확립 일을 기준으로 각 개체별로 증상(혈관결절 부위에 냉감이 느껴지고 레이노현상을 보임)을 보인 일자와 왼쪽 다리나 발가락이 절단현상을 보인 일자를 조사하였다 (Table 2).

Table 2

	실험 개체수	실험전 체중(g)±SD	실험후 체중(g)±SD	절단 개체수 (절단율)	증상일자 ± 표준편차	절단일자 ± 표준편차
대조군	7	20.0 ±0.89	20.2 ±1.07	7 (100%)	1.86 ±0.38	6.57 ±2.64
다분화능 줄기세포 즉시 투여군	8	20.0 ±0.74	20.4 ±0.55	5 (62.5%)	4.00 ±1.77	7.80 ±3.56
다분화능 줄기세포 하루 후 투여군	3	20.1 ±1.27	20.4 ±1.78	3 (100%)	1.00 ±0	3.33 ±0.58

그 결과, Table 2에 나타난 바와 같이, 증상일자 및 절단일자의 경우, 다분화능 줄기세포 즉시 투여군에서 0.05 미만의 유의성을 보였으며, 나머지는 유의성이 나타나지 않았다. 각 개체별 체중을 측정하여 각 군별 평균과 표준편차를 구한 결과, 실험 전/후에 측정된 체중에 대한 유의적인 변화는 관찰할 수 없었다.

한편, 대조군과 본 발명의 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 투여군의 증상일자 및 절단일자를 비교하였다 (도 10). 그 결과, 증상일자의 경우, 대조군에 비하여, 다분화능 줄기세포 즉시 투여군에서 통계상 0.05 미만의 유의적인 변화를 확인할 수 있었다. 절단일자의 경우, 유의적인 변화는 없었으나, 대조군과 배지 대조(media control)군에 비하여, 다분화능 줄기세포 즉시 투여군에서 상대적으로 길게 나타나 혈관결절에 의한 절단현상이 느리게 일어나는 것으로 나타났다.

또한, 허혈성 괴사 모델의 군별 절단율을 조사한 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 대조군과 다분화능 줄기세포 하루 후 투여군 100%의 절단율을 나타낸 반면, 다분화능 줄기세포 즉시 투여군은 62.5%의 절단율을 나타냈다. 이 결과로부터 다분화능 줄기세포를 혈관결절 후 바로 투여하게 되면 절단현상을 경감시킬 수 있고 절단선을 낮추는데에도 유리하게 작용한다는 것을 확인할 수 있었다.

(3) 혈관 조영술

혈관조영술은 방사선(X-ray)을 이용한 혈관 검사로서, 마우스의 심장 혈관으로 조영제(아이오다인-131)를 주사하여 X-ray 상에서 혈관을 볼 수 있다. 이때 X-ray 상에서 혈관의 이상여부를 판단하여 병명이나 병소의 위치, 병의 진행정도를 확인할 수 있게 된다.

상기 대조군, 다분화능 줄기세포 즉시 투여군, 다분화능 줄기세포 하루 후 투여군의 부검 전에 각 개체를 케타민(100㎎/㎏)의 복강주사를 통해 마취시킨 다음, 혈관조영제를 투여하고, 2분 경과후에 X선을 이용하여 각 군의 대퇴동맥과 신생혈관을 확인하였다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 대조군과 다분화능 줄기세포 하루 후 투여군에서는 신생혈관을 확인할 수 없었으나, 혈관결절 후에도 왼쪽 하지의 절단현상이 일어나지 않았던 다분화능 줄기세포 즉시 투여군에서는 신생혈관을 확인할 수 있었다.

(4) In situ hybridization

부검시 심장체혈을 통해 각 군의 모든 개체들로부터 근육의 혈액을 제거하였다. 4％ paraformaldehyde phosphate 용액에 1.5％ sucrose 용액을 섞은 고정액으로 각 개체들의 왼쪽 대퇴부와 오른쪽 대퇴부의 근육조직들을 고정하였다. 30％ sucrose Phosphate 용액에 대퇴부 근육조직들이 가라앉을 때까지 4℃에서 방치한 다음, 각 조직들을 파라핀으로 포매하고 조직절편기를 이용해 5μum 두께로 근육 절편을 세절한 다음, 미리 준비한 prehybridization 용액 (50％ formamide, 4XSSC, 50mM DDT, 4XDenhart's soln, 'X TED, 100μg/ml denatured salmon sperm DNA, 250μg/ml yeast RNA)으로 42℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 여기에 DIG labelled DNA(100ng/ml)를 첨가하고, prehybridization 용액을 24시간 동안 반응시켜 DIG labelled human 특이 DNA probe가 mRNA에 결합하도록 하였다. 대퇴부조직을 2X, 1X, 0.5X SSC 용액으로 각각 10분간 2번씩 세척 후 slide glass에 고정시킨 다음, 실온에서 2시간 동안 건조시켰다.

그 결과, FIG. 12에 나타난 바와 같이, 대조군은 human probe에 의해 표지되지 않았으나, 다분화능 줄기세포 투여군의 개체에서는 혈관 내피세포에서 표지된 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통 상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 제대혈(탯줄혈액)에서 인간 혈청이나 플라즈마를 이용하여 분리된 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 줄기세포는 성체 줄기세포임에도 불구하고 골형성 세포, 신경세포 등으로 분화할 수 있는 능력을 갖고 있어, 폐쇄성 또는 허혈성 동맥질환에 의한 허혈성 괴사질환 치료용 세포치료제로서 유용하다.

Claims (8)

1. 제대혈 유래 혈액을 5~20%의 인간 혈청 또는 플라즈마를 함유하는 배지에서 배양하여 수득되고, 다음과 같은 특성을 나타내는 성체 줄기세포:

   (a) CD45, SH-2 및 SH-3에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타내고,　CD34 에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나타냄;

   (b) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 둥근형태(round-shape) 또는 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타냄; 및

   (c) 중배엽, 내배엽 또는 외배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.
2. 삭제
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4. 제1항에 있어서, 상기 중배엽 유래 세포는 골형성 세포이고, 외배엽 유래 세포는 신경세포이며, 내배엽 유래 세포는 혈관내피세포(endothelial cell)인 것을 특징으로 하는 성체 줄기세포.
5. 제대혈 유래 혈액을 5∼20％의 인간 혈청 또는 플라즈마를 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 다음과 같은 특성을 나타내는 성체 줄기세포의 제조방법:

   (a) CD45, SH-2 및 SH-3에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타내고,　CD34 에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나타냄;

   (b) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 둥근형태(round-shape) 또는 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타냄; 및

   (c) 중배엽, 내배엽 또는 외배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐
6. 제5항에 있어서, 인간 혈청 또는 플라즈마는 자가(autologous) 또는 타가(allologous)인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항 또는 제4항의 성체 줄기세포를 유효성분으로 함유하고, 혈관 결절 직후에 바로 투여하여 폐쇄성 동맥 또는 정맥 질환에 의한 허혈성 괴사질환 또는 심혈관 질환 치료 효과를 가지는 세포치료제.
8. 제7항에 있어서, 상기 폐쇄성 동맥 질환에 의한 허혈성 괴사 질환은 심근경색, 뇌경색, 고관절의 무혈성 골괴저(avascular necrosis of hip joint), 버거씨 병, 및 당뇨 합병증에 의한 사지괴저병으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포치료제.

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