RU2527182C2 - Способ индукции миграции стволовых клеток жировой ткани - Google Patents

Способ индукции миграции стволовых клеток жировой ткани Download PDF

Info

Publication number
RU2527182C2
RU2527182C2 RU2012121191/10A RU2012121191A RU2527182C2 RU 2527182 C2 RU2527182 C2 RU 2527182C2 RU 2012121191/10 A RU2012121191/10 A RU 2012121191/10A RU 2012121191 A RU2012121191 A RU 2012121191A RU 2527182 C2 RU2527182 C2 RU 2527182C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
growth factor
stem cells
cells
adipose tissue
chemokine
Prior art date
Application number
RU2012121191/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2012121191A (ru
Inventor
Чон Чан РА
Сон Кын КАН
Сон Чин БЭК
Original Assignee
Рнл Био Ко., Лтд
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43900858&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2527182(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Рнл Био Ко., Лтд filed Critical Рнл Био Ко., Лтд
Publication of RU2012121191A publication Critical patent/RU2012121191A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2527182C2 publication Critical patent/RU2527182C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/21—Chemokines, e.g. MIP-1, MIP-2, RANTES, MCP, PF-4

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биохимии и медицины. Предложена композиция для индукции миграции стволовых клеток жировой ткани взрослых, которая содержит в качестве активного ингредиента человеческие мезенхимальные стволовые клетки из жировой ткани взрослых в количестве от 1х107 до 1х1010, которые экспрессируют на клеточной поверхности рецептор хемокина или фактора роста, или секреторный продукт из этих стволовых клеток включает рецептор хемокина или фактора роста; где секретируемый продукт стволовых клеток жировой ткани взрослых представляет собой адипонектин; и где человеческие стволовые клетки жировой ткани взрослых подвергаются первичному воздействию смесью, содержащей хемокин или фактор роста. Изобретение может быть использовано в медицине в качестве клеточного терапевтического средства благодаря более эффективной миграции стволовых клеток к пораженному участку. 2 н. и 6 з. п. ф-лы, 9 ил., 8 табл., 8 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способности взрослых стволовых клеток из жировой ткани мигрировать и, в особенности, к новому применению взрослых стволовых клеток из жировой ткани и к их специфическим секреторным продуктам, которые обладают способностью мигрировать к пораженному участку, в котором экспрессируются хемокины или факторы роста, и к способу, позволяющему более эффективно усиливать функцию рецепторов хемокинов или факторов роста.
Уровень техники
Стволовыми клетками называют клетки, обладающие не только способностью к самовоспроизведению, но также способность к дифференцировке, по меньшей мере, в клетки двух типов, и их можно подразделить на тотипотентные стволовые клетки, плюрипотентные стволовые клетки и мультипотентные стволовые клетки.
Тотипотентные стволовые клетки представляют собой клетки, имеющие тотипотентные свойства, способные к развитию в один полноценный организм, и эти свойства сохраняются клетками вплоть до 8-клеточной стадии после оплодотворения ооцита сперматозоидом. Если эти клетки изолируют и пересаживают в матку, они могут развиться в один полноценный организм. Плюрипотентные стволовые клетки, представляющие собой клетки, способные к развитию в разнообразные клетки и ткани, возникающие из эктодермальных, мезодермальных и эндодермальных слоев, происходят из внутренней клеточной массы, локализованной внутри бластоцисты, образовавшейся на 4-5-й день после оплодотворения. Эти клетки называют «эмбриональными стволовыми клетками», и они могут дифференцировать в различные клетки других тканей, но не могут сформировать новые живые организмы. Мультипотентные стволовые клетки, представляющие собой стволовые клетки, способные к дифференциации только в клетки, специфические для тканей и органов, содержащие эти клетки, вовлечены не только в рост и развитие различных тканей и органов во время внутриутробного, неонатального и взрослого периодов, но также в поддержание гомеостаза в тканях у взрослых и функции индукции регенерации при повреждении тканей. Тканеспецифические мультипотентные клетки носят общее название «взрослые стволовые клетки».
Взрослые стволовые клетки получают, извлекая клетки из различных органов человека и превращая эти клетки в стволовые клетки, и для них характерна дифференциация только в специфическую ткань. Однако недавно эксперименты по дифференциации взрослых стволовых клеток в различные ткани, включая клетки печени, были настолько сенсационно удачны, что попали в центр внимания.
Были предприняты усилия в области регенеративной медицины для регенерации биологических тканей и органов и восстановления с помощью клеток их функций, потерянных из-за заболевания или несчастного случая и т.п. Способы, часто применяемые в области регенеративной медицины, включают следующие стадии: получение от пациента стволовых клеток, мононуклеарных клеток из крови или мононуклеарных клеток из костного мозга; индукцию пролиферации и/или дифференциации клеток в пробирке с культурой; и введение отобранных недифференцированных (стволовых клеток и/или клеток-предшественников) и/или дифференцированных клеток в организм пациента с помощью трансплантации. Соответственно, ожидается, что существующие классические способы лечения заболеваний с помощью лекарственных средств или хирургии будут заменены заместительной клеточной/тканевой терапией, с помощью которой поврежденную клетку, ткань или орган заменят здоровыми, и, таким образом, польза от стволовых клеток дополнительно возрастет.
Таким образом, в настоящее время происходит изучение различных функций стволовых клеток. В особенности, развиваются различные исследования по эффективному выделению стволовых клеток, по поддержанию и пролиферации стволовых клеток в недифференцированном состоянии и по дифференциации стволовых клеток в клетки ткани. Существует ряд сообщений по миграции костномозговых стволовых клеток, индуцированной обработкой хемокинами (Adriana Lopez Ponte et al., Stem Cells, 25:1737-1745, 2007; Marek Honczarenko et al., Stem Cells, 24:1031-1041, 2006; Sordi V et al., Blood, 106:419-427, 2005; Fiedler J et al., J Cell Biochem, 87:305-312, 2002; Forte G et al., Stem Cells, 24:23-33, 2006; Wright DE et al., Blood, 87:4100-4108, 1996; Son BR et al., Stem Cells, 24:1254-1264, 2006), но не было сообщений о миграции стволовых клеток жировой ткани.
Соответственно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани обладают способностью к миграции и что миграция мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани под действием специфического хемокина или фактора роста заметно стимулируется, если стволовые клетки примируют различными хемокинами или факторами роста. На основании этих данных, авторы настоящего изобретения обнаружили способ, позволяющий увеличить способность мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани экспрессировать рецепторы хемокинов или факторов роста, таким образом, завершая настоящее изобретение.
Сущность изобретения
Цель настоящего изобретения заключается в обеспечении композиции для индукции миграции стволовых клеток жировой ткани, содержащей в качестве активного ингредиента одну или несколько взрослых стволовых клеток из жировой ткани и секретируемые ими продукты.
Другая цель настоящего изобретения заключается в обеспечении способа индукции миграции взрослых стволовых клеток из жировой ткани к пораженному участку.
Настоящее изобретение направлено на применение и функцию взрослых стволовых клеток из жировой ткани, которые экспрессируют рецепторы для хемокинов или факторов роста, или на продукты, секретируемые этими стволовыми клетками. Для достижения указанных выше целей настоящее изобретение обеспечивает композицию для индукции миграции стволовых клеток жировой ткани, композицию, содержащую в качестве активного ингредиента, взрослые стволовые клетки из жировой ткани и/или секретируемый ими продукт.
Примеры секреторного продукта взрослой стволовой клетки жировой ткани в композиции настоящего изобретения включают рецепторы Rantes, МСР-1 (белок-хемоаттрактант-1 моноцитов), MIP-3β (воспалительный белок-3β моноцитов), SDF-1α (стромальных клеток фактор-1α), ВСА-1 (привлекающий В-клетки хемокин-1), CXCL16 (хемокиновый (С-Х-С-мотив) лиганд 16), EGF (эндотелиальный фактор роста), b-FGF (основной фактор роста фибробластов), HGF (фактор роста гепатоцитов), TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1), IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста 1), PDGF-AB (фактор роста тромбоцитов АВ), TNF-α (фактор некроза опухолей-α), адипонектин, лептин и проколлаген. Предпочтительно, секреторный продукт может представлять собой адипонектин и/или лептин.
Взрослые стволовые клетки из жировой ткани и/или секретируемые ими продукты могут быть применены в виде бульонной культуры из взрослых стволовых клеток жировой ткани человека, полученной путем выращивания взрослых стволовых клеток жировой ткани человека в среде, содержащей определенные компоненты, сбора культуральной среды и удаления клеточного дебриса из культуральной среды.
Кроме того, композиция может дополнительно содержать FBS. Предпочтительно композиция может содержать примерно 30% FBS.
Взрослые стволовые клетки из жировой ткани и секретируемые ими продукты экспрессируют рецепторы для одного или нескольких хемокинов или факторов роста, которые выбирают из группы, состоящей из Rantes, МСР-1 (белок-хемоаттрактант-1 моноцитов), MIP-3β (воспалительный белок-3β моноцитов), SDF-1α (стромальных клеток фактор-1α), ВСА-1 (привлекающий В-клетки хемокин-1), CXCL16 (хемокиновый (С-Х-С-мотив) лиганд 16), EGF (эндотелиальный фактор роста), b-FGF (основной фактор роста фибробластов), HGF (фактор роста гепатоцитов), TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1), IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста 1), PDGF-AB (фактор роста тромбоцитов АВ) и TNF-α (фактор некроза опухолей-α), и мигрируют в ответ на такие хемокины или факторы роста.
Кроме того, взрослые стволовые клетки из жировой ткани в композиции настоящего изобретения предпочтительно могут быть получены от млекопитающего, более предпочтительно от человека. Например, взрослые стволовые клетки из жировой ткани могут представлять собой мезенхимальные стволовые клетки из жировой ткани человека (AdMSCs).
В особенности, взрослые стволовые клетки из жировой ткани, которые применяют в настоящем изобретении, предпочтительно примируют смесью, содержащей хемокин или фактор роста.
Предпочтительно смесь может содержать один или несколько факторов, которые выбирают из группы, состоящей из Rantes, МСР-1 (белок-хемоаттрактант-1 моноцитов), MIP-3P (воспалительный белок-3β моноцитов), SDF-1α (стромальных клеток фактор-1α), ВСА-1 (привлекающий В-клетки хемокин-1), CXCL16 (хемокиновый (С-Х-С-мотив) лиганд 16), EGF (эндотелиальный фактор роста), b-FGF (основной фактор роста фибробластов), HGF (фактор роста гепатоцитов), TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1), IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста 1), PDGF-AB (фактор роста тромбоцитов АВ) и TNF-α (фактор некроза опухолей-α). В особенности, более предпочтительно смесь может содержать один или несколько факторов, которые выбирают из группы, состоящей из Rantes, SDF-1α (стромальных клеток фактор-1α), HGF (фактор роста гепатоцитов), TNF-α (фактор некроза опухолей-α), PDGF-AB (фактор роста тромбоцитов АВ) и TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1).
Взрослые стволовые клетки человек предпочтительно включают в количестве, равном примерно от 1×107 клеток до 1×10410 клеток и более предпочтительно примерно от 1×108 клеток до 1×109 клетки.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ индукции миграции взрослых стволовых клеток жировой ткани, способ, включающий следующие стадии:
(a) примирование взрослых стволовых клеток из жировой ткани смесью, содержащей хемокин или фактор роста; и
(b) введение композиции, содержащей примированные взрослые стволовые клетки из жировой ткани и секретируемые ими продукты, в участок in vivo, который не находится в прямом контакте с пораженным участком. В этом способе композицию наиболее предпочтительно вводят внутривенно.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 представляет собой график, показывающий результаты индукции миграции мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани под действием различных хемокинов или факторов роста.
Фиг.2 представляет собой набор микрофотографий мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани, сделанных после индукции миграции клеток.
Фиг.3 представляет собой график, показывающий результаты индукции миграции мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани, примированных различными хемокинами или факторами роста, под действием 10% FBS.
Фиг.4 представляет собой график, показывающий результаты индукции миграции мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани, примированных TNF-α, под действием различных хемокинов или факторов роста.
Фиг.5 представляет собой график, показывающий результаты индукции миграции мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани, примированных различными хемокинами или факторами роста, под действием тех же хемокинов или факторов роста, которые были применены для примирования клеток.
Фиг.6 представляет собой набор графиков, показывающих полученные методом FACS результаты экспериментов, проведенных для обнаружения того, экспрессируются ли рецепторы для различных хемокинов или факторов роста в мультипотентных мезенхимальных стволовых клетках жировой ткани и в А549 клетках.
Фиг.7 представляет собой набор фотографий, показывающих полученные методом RT-PCR результаты экспериментов, проведенных для обнаружения того, экспрессируются ли мРНК рецепторов для различных хемокинов или факторов роста в мультипотентных мезенхимальных стволовых клетках жировой ткани. На фиг.7А, линия 1: CCR1 (380 bp), линия 2: CCR2 (474 bp), линия 3: CCR7 (461 bp), линия 4: CXCR4 (489 bp), линия 5: CXCR5 (494 bp), линия 6: CXCR6 (517 bp), и линия 7: GAPDH (362 bp). На фиг.7 В, М: маркер, линия 1: EGFR (419 bp), линия 2: TGFBR2 (498 bp), линия 3: PDGFRA (187 bp), линия 4: PDGFRB (508 bp), линия 5: IGF1R (299 bp), линия 6: с-МЕТ (201 bp), линия 7: TNFRSF1A (218 bp), линия 8: FGFR1 (250 bp), и линия 9: GAPDH (362 bp).
На фиг.8 изображен график и набор микрофотографий, показывающие результаты индукции миграции мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани, примированных адипонектином, в концентрации 1, 10 и 100 нг/мл.
Фиг.9 представляет собой набор микрофотографий, показывающий результаты RT-PCR, проведенной для обнаружения того, экспрессируются ли мРНК рецепторов 1 и 2 адипонектина в мультипотентных мезенхимальных стволовых клетках жировой ткани. На фиг.9, линия 1: ADIPOR1 (337 bp), линия 2: ADIPOR2 (538 bp), линия 3: GAPDH (362 bp).
Раскрытие изобретения
Если не будет указано иное, то все технические и научные термины, примененные в этой заявке, имеют такое же значение, как его обычно понимает средний специалист в этой области техники, к которой это изобретение относится. В общем, терминология, примененная в этой заявке и способы экспериментов, которые будут описаны далее, хорошо известны и обычно применяются в этой области техники.
Стволовые клетки означают клетки, обладающие не только способностью к самовоспроизведению, но также способностью дифференцировать, по меньшей мере, в два типа клеток.
Взрослые стволовые клетки представляют собой стволовые клетки, которые возникают или на стадии, на которой каждый орган эмбриона сформирован в процессе развития, или на стадии взрослого организма. Известно, что взрослые стволовые клетки мультипотентны и способны к дифференциации в ткане- и органоспецифические клетки. Такие мультипотентные стволовые клетки, представляющие собой стволовые клетки, которые способны к дифференциации в клетки, специфические для тканей и органов, содержащих эти клетки, вовлечены не только в рост и развитие различных тканей и органов в зародышевом, неонатальном и взрослом периодах развития организма, но также в поддержание гомеостаза взрослой ткани и функции индукции регенерация при повреждении ткани.
В настоящем изобретении могут быть применены взрослые стволовые клетки из жировой ткани или эпителиальной ткани, такие как волосяной фолликул или амнион. Предпочтительно применяют взрослые стволовые клетки из жировой ткани человека. Могут быть применены мезенхимальные стволовые клетки (MSC). В особенности, могут быть применены мезенхимальные стволовые клетки из жировой ткани человека (AdMSCs).
Указанную жировую ткань или эпителиальную ткань предпочтительно получают от млекопитающего, более предпочтительно от человека. В одном из примеров настоящего изобретения, применяют мезенхимальные стволовые клетки из жировой ткани человека (AdMSCs).
Как применено в настоящей заявке, «взрослые стволовые клетки из жировой ткани» или «мезенхимальные стволовые клетки из жировой ткани» представляют собой недифференцированные взрослые стволовые клетки, изолированные из жировой ткани и также называемые в этой заявке «стволовые клетки жировой ткани». Эти клетки могут быть получены в соответствии с любым общепринятым способом, известным в этой области техники.
Стволовые клетки жировой ткани могут быть получены с применением любой общепринятой среды, известной в этой области техники, подходящей для культивирования стволовых клеток. Например, в настоящем изобретении применяют DMEM (модифицированную по способу Дульбекко среду Игла).
Среда для выращивания стволовых клеток жировой ткани может быть дополнена добавками, которые стимулируют пролиферацию стволовых клеток жировой ткани с недифференцированным фенотипом, ингибируя в то же время дифференциацию клеток. Также среда, в общем, может содержать нейтральный буфер (такой как фосфат и/или бикарбонат в высокой концентрации) в изотоническом растворе; питательное вещество белковой природы (например, сыворотку, такую как FBS, заместитель сыворотки, альбумин, или незаменимые и заменимые аминокислоты, такие как глутамин). Кроме того, она может содержать липиды (жирные кислоты, холестерол, экстракт HDL или LDL из сыворотки) и другие ингредиенты, обнаруженные в наиболее полной среде этого типа (такие как инсулин или трансферрин, нуклеозиды или нуклеотиды, пируват, источник сахара, такого как глюкоза, селен в любой ионизированной форме или в виде соли, глюкокортикоид, такой как гидрокортизон, и/или восстановитель, такой как Р-меркаптоэтанол).
Кроме того, с целью защиты клеток от слипания друг с другом, прилипания к стенке сосудов или формирования кластеров, которые слишком велики, может быть полезно включить в среду средство, препятствующее образованию комков, такое как те, что поставляет на рынок компания «Invitrogen» (Cat # 0010057АЕ).
В том числе, может быть успешно применена одна или несколько из следующих дополнительных добавок:
- фактор стволовых клеток (SCF, стальной фактор), другие лиганды или антитела, которые димеризуют c-kit, и другие активаторы того же сигнального пути
- лиганды для других рецепторов тирозиновых киназ, такие как рецептор фактор
роста тромбоцитов (PDGF), колониестимулирующий фактор макрофагов, лиганд Flt-3 и васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF)
- факторы, которые увеличивают уровень циклического AMP, такие как форсколин
- факторы, которые включают gp130, такие как LIF или онкостатин-М
- гемопоэтические факторы роста, такие как тромбопоэтин (ТРО)
- трансформирующий факторы роста, такие как TGFβ1
- другие факторы роста, такие как эпидермальный фактор роста (EGF)
- нейротрофины, такие как CNTF
- N-ацетил-L-цистеин (NAC)
- гидрокортизон
- аскорбиновая кислота
В особенности, среда, которую применяют для культивирования стволовых клеток жировой ткани в одном из воплощений настоящего изобретения, предпочтительно, содержит NAC, аскорбиновую кислоту, кальций, инсулин и гидрокортизон. Более предпочтительно, она содержит FBS, NAC, аскорбиновую кислоту, кальций, rEGF, инсулин и гидрокортизон.
Композиция настоящего изобретения может содержать, в качестве активного ингредиента, секреторный продукт из мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани.
Примеры этого секреторного продукта включают целый ряд цитокинов, аминокислоты, факторы роста и т.п. Специфические примеры секреторного продукта, который может содержаться в композиции настоящего изобретения, включают TGF, bFGF, IGF-1, KGF, HGF, фибронектин, VEGF, адипонектин, лептин и проколлаген, а также их рецепторы. Среди таких секретируемых из взрослых стволовых клеток жировой ткани продуктов адипонектин или лептин происходят специфически из жировой ткани, и они принимают значительное участие в индукции клеточной миграции.
Взрослые стволовые клетки человека и/или секретируемые ими продукты могут быть применены в виде бульонной культуры взрослых стволовых клеток из жировой ткани человека, полученных в виде взрослых стволовых клеток из жировой ткани человека в среде, содержащей определенные компоненты, после сбора культуральной среды и удаления клеточного дебриза из культуральной среды. Альтернативно, экстракты из культурального бульона могут быть применены по одиночке или в комбинации.
Другими словами, композиция настоящего изобретения может представлять собой или композицию, содержащую взрослые стволовые клетки из жировой ткани и секретируемые ими продукты и компоненты среды, или композицию, содержащую секретируемые клетками продукты и компоненты среды, или композицию, содержащую только секретируемые клетками продукты по одиночке или в комбинации с взрослыми стволовыми клетками, или композицию, содержащую только взрослые стволовые клетки из жировой ткани, которые продуцируют секретируемые продукты in vivo.
В одном из аспектов настоящее изобретение направлено на применение взрослых стволовых клеток из жировой ткани и/или секретируемых ими продуктов для индукции миграции стволовых клеток. Точнее, настоящее изобретение основано на обнаружении того, что взрослые стволовые клетки из жировой ткани и их специфические секреторные продукты демонстрируют функцию рецептора хемокина или фактора роста, который экспрессируется в пораженном участке.
Как применено в настоящей заявке, выражение «демонстрируют (демонстрирует) функцию рецептора хемокина или фактора роста» относится к ситуации, в которой взрослые стволовые клетки из жировой ткани экспрессируют на клеточной поверхности рецептор, который специфически связывается со специфическим хемокином или фактором роста, или на которой секреторный продукт из этих клеток представляет собой рецептор или включает рецептор. Другими словами, это означает, что стволовые клетки жировой ткани имеют способность реагировать со специфическим хемокином или фактором роста.
Факторы роста относятся к группе полипептидов, которые стимулируют деление, рост и дифференциацию различных клеток, и известно, что они вовлечены в клеточную сигнализацию. Факторы роста подразделяют на семейства в соответствии со структурным сходством и действием на клетки-мишени с помощью таких механизмов, как аутокринный, паракринный, эндокринный и т.п. Рецепторы фактора роста, в общем, обладают активностью тирозинкиназы во внутриклеточной области, и когда они связываются с лигандом рецептора, то сами рецепторы фактора роста или остатки тирозина внутриклеточных белков фосфорилируются и происходит пролиферация или дифференциация клеток.
Хемокины составляют семейство небольших цитокинов, которые продуцируются при воспалении и регулируют рекрутинг лейкоцитов. Такие хемокины способны к селективной индукции хемотаксиса форменных элементы крови (отличных от эритроцитов), включая лейкоциты, таких как нейтрофилы, моноциты, макрофаги, эозинофилы, базофилы, тучные клетки и лимфоциты, такие как Т-клетки и В-клетки. Помимо стимуляции хемотаксиса, другие изменения могут быть селективно индуцированы хемокинами в компетентных клетках, включая изменения в форме клеток, кратковременные повышения во внутриклеточной концентрации свободных ионов кальций (Са2+), экзоцитоз гранул, интеграцию повышающей регуляции, образование биоактивных липидов (например, лейкотриенов) и окислительный взрыв, связанный с активацией лейкоцитов. Таким образом, хемокины представляют собой ранних инициаторов воспалительного ответа, вызывая выход воспалительных медиаторов, хемотаксис и экстравазацию в места инфекции или воспаления.
В общем, взаимодействия хемокин/рецептор имеют тенденцию быть нерегулярными в том смысле, что один хемокин может связываться со многими рецепторами хемокинов, и, наоборот, единственный рецептор хемокина может взаимодействовать с несколькими хемокинами. Существует много аспектов передачи сигнала через рецептор хемокина и селективности к лигандам, которые не ранее не были ясны.
Основываясь на новых данных о том, что взрослые стволовые клетки из жировой ткани и секретируемые ими продукты демонстрируют функцию таких рецепторов хемокинов, настоящее изобретение ставит своей целью применить функцию взрослых стволовых клеток из жировой ткани, которые мигрируют к месту инфекции или воспаления (т.е. к пораженному участку) в ответ на специфический хемокин, который экспрессируется в пораженном участке (эту миграцию также называют «нацеленной миграцией»). В настоящем изобретении рассматривают ответы не только для хемокинов, но также для специфических факторов роста. Точнее, взрослые стволовые клетки из жировой ткани отлично отвечают на хемокины или факторы роста, выбираемых из группы, состоящей из Rantes, МСР-1 (белок-хемоаттрактант-1 моноцитов), MIP-3β (воспалительный белок-3β моноцитов), SDF-1α (стромальных клеток фактор-1α), ВСА-1 (привлекающий В-клетки хемокин-1), CXCL16 (хемокиновый (С-Х-С-мотив) лиганд 16), EGF (эндотелиальный фактор роста), b-FGF (основной фактор роста фибробластов), HGF (фактор роста гепатоцитов), TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1), IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста 1), PDGF-AB (фактор роста тромбоцитов АВ) и TNF-α (фактор некроза опухолей-α).
С целью увеличить способность клеток мигрировать путем взаимодействия хемокинов или факторов роста и их рецепторов, композиция настоящего изобретения может дополнительно содержать FBS. Предпочтительно, композиция содержит примерно 30% FBS. Следует понимать, что если даже композиция не содержит FBS, то при введении в организм она может использовать находящийся в организме FBS.
В то же время, с целью увеличить уровень экспрессии или реакцию взрослых стволовых клеток из жировой ткани и/или рецептора секреторного продукта взрослых стволовых клеток из жировой ткани, взрослые стволовые клетки из жировой ткани предпочтительно примируют смесью, содержащей хемокин или фактор роста.
В особенности, смесь предпочтительно может содержать один или несколько факторов, который выбирают из группы, состоящей из Rantes, МСР-1 (белок-хемоаттрактант-1 моноцитов), MIP-3β (воспалительный белок-3β моноцитов), SDF-1α (стромальных клеток фактор-1α), ВСА-1 (привлекающий В-клетки хемокин-1), CXCL16 (хемокиновый (С-Х-С-мотив) лиганд 16), EGF (эндотелиальный фактор роста), b-FGF (основной фактор роста фибробластов), HGF (фактор роста гепатоцитов), TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1), IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста 1), PDGF-AB (фактор роста тромбоцитов АВ) и TNF-α (фактор некроза опухолей-α). Смесь более предпочтительно может содержать один или несколько факторов, выбираемых из группы, состоящей из Rantes, SDF-1α (стромальных клеток фактор-1α), HGF (фактор роста гепатоцитов), TNF-α (фактор некроза опухолей-α), PDGF-AB (фактор роста тромбоцитов АВ) и TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1).
Как можно видеть в примере 5 настоящего изобретения, в случае взрослых стволовых клеток из жировой ткани, примированных специфическим хемокином или фактором роста, и/или в случае секреторного продукта клеток, миграция клеток в ответ на хемокин или фактор роста значительно возрастает.
Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение направлено на способ индукции миграции взрослых стволовых клеток жировой ткани, способ, включающий следующие стадии:
(a) примирование взрослых стволовых клеток жировой ткани смесью, содержащей хемокин или фактор роста; и
(b) введение композиции, содержащей примированные взрослые стволовые клетки жировой ткани и секретируемые ими продукты, в участок in vivo, который не находится в прямом контакте с пораженным участком.
В способе настоящего изобретения, стадия (а) примирования взрослых стволовых клеток смесью, содержащей хемокин или фактор роста, может быть проведена путем выращивания взрослых стволовых клеток в среде, содержащей хемокин или фактор роста. Примирование взрослых стволовых клеток проводят в течение примерно 20-60 часов, предпочтительно примерно 20-50 часов. В одном из воплощений настоящего изобретения, примирование взрослых стволовых клеток проводят в течение примерно 24-х часов. Кроме того, примирование стволовых клеток жировой ткани смесью проводят перед выращиванием, в процессе или после выращивания стволовых клеток жировой ткани. Предпочтительно его проводят после выращивания стволовых клеток жировой ткани.
Смесь предпочтительно может содержать один или несколько факторов, выбираемых из группы, состоящей из Rantes, МСР-1 (белок-хемоаттрактант-1 моноцитов), MIP-3β (воспалительный белок-3β моноцитов), SDF-1α (стромальных клеток фактор-1α), ВСА-1 (привлекающий В-клетки хемокин-1), CXCL16 (хемокиновый (С-Х-С-мотив) лиганд 16), EGF (эндотелиальный фактор роста), b-FGF (основной фактор роста фибробластов), HGF (фактор роста гепатоцитов), TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1), IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста 1), PDGF-AB (фактор роста тромбоцитов АВ) и TNF-α (фактор некроза опухолей-α). Более предпочтительно, смесь может содержать один или несколько факторов, выбираемых из группы, состоящей из Rantes, SDF-1α (стромальных клеток фактор-1α), HGF (фактор роста гепатоцитов), TNF-α (фактор некроза опухолей-α), PDGF-AB (фактор роста тромбоцитов АВ) и TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1).
Кроме того, композиция, содержащая примированные взрослые стволовые клетки жировой ткани и/или секретируемые ими продукты, которые применяют на стадии (b), может представлять собой или композицию, содержащую все примированные стволовые клетки жировой ткани, секретируемые продукты и среду, или композицию, содержащую секретируемые продукты и среда без примированных стволовых клеток жировой ткани, или композицию, содержащую примированные стволовые клетки жировой ткани без секретируемых продуктов и среды. Таким образом, примированные стволовые клетки жировой ткани, секретируемые продукты и среда могут быть применены различными путями, но особо не ограничиваются.
Кроме того, как применено в настоящей заявке, выражение «введение композиции в участок in vivo, который не находится в прямом контакте с пораженным участком» означает размещение стволовых клеток в субъекте способами или путями, индуцирующими, по меньшей мере, частичную локализацию стволовых клеток в участках, отличных от пораженного участка, исключая способ трансплантации стволовых клеток в пораженный участок. Композиция настоящего изобретения может быть введена субъекту любым подходящим способом, таким чтобы она была доставлена в желаемое место в субъекте, в котором некоторые компоненты клеток по-прежнему жизнеспособны. Как применено в настоящей заявке, термин «введение» может быть применен взаимозаменяемо с термином «введение», «доставка», «размещение» или т.п. Для клинического введения, композиция настоящего изобретения может быть введена парентерально, например, с помощью внутримышечной или внутривенной инъекции. Наиболее предпочтительно, композиция настоящего изобретения вводят путем внутривенной инъекции.
Таким образом, настоящее изобретение направлено на способ индукции миграции взрослых стволовых клеток жировой ткани, способ, включающий внутривенное введение композиции, содержащей взрослые стволовые клетки жировой ткани, примированные хемокином или фактором роста, и/или секретируемый ими продукт.
В еще одном аспекте настоящее изобретение направлено на способ индукции нацеленной миграции взрослых стволовых клеток жировой ткани, позволяющей клеткам достичь пораженного участка, воздействуя, таким образом, на пораженный участок. Таким образом, настоящее изобретение направлено на клеточное терапевтическое средство, содержащее, в качестве активных ингредиентов, взрослые стволовые клетки жировой ткани и секретируемые ими продукты, и способ применения клеточного терапевтического средства для лечения пораженного участка.
Если не указано иначе, термин «лечить», как применен в настоящей заявке, означает обращение, снижение, торможение прогресса или предупреждение нарушения или состояния, к которому применим такой термин, или одного или нескольких симптомов такого нарушения или состояния. Термин «лечение», как применено в настоящей заявке, относится к акту воздействия, такому как «лечить», определенному непосредственно выше. Таким образом, как применено в настоящей заявке, «лечить» или «лечение» заболевания у млекопитающего включает одно или несколько из следующего:
(1) торможение роста заболевания, т.е. остановка его развития;
(2) предупреждение распространения заболевания, т.е. предупреждение метастазов;
(3) ослабление заболевание, т.е. вызывает регрессию рака;
(4) предупреждение рецидива заболевания; и
(5) смягчение симптомов заболевания.
Для того чтобы лечить пораженный участок, позволяя стволовым клеткам мигрировать в пораженный участок, композицию настоящего изобретения вводят в фармацевтически эффективном количестве.
Как применено в настоящей заявке, термин «терапевтически эффективное количество» означает, такое количество соединения, которое после введения, смягчает до некоторой степени один или несколько симптомов заболевания, которое лечат. Следовательно, терапевтически эффективное количество относится к такому количеству, которое производит следующий эффект: (1) обращение скорости прогрессирования заболевания; (2) торможение прогрессирования заболевания до некоторой степени; или (3) облегчение (предпочтительно, устранение) до некоторой степени одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием.
Композиция (клеточное терапевтическое средство) настоящего изобретения в клинической практике может быть введено парентерально, например внутримышечно или внутривенно. Наиболее предпочтительно композицию настоящего изобретения вводят с помощью внутривенной инъекции.
Для инъекции композиция настоящего изобретения предпочтительно может находиться в составе фармакологически приемлемого буфера, такого как раствор Хенкса, раствор Рингера или физиологический солевой буфер. Для чресслизистого введения в композиции применяют неинвазивные средства, подходящие для преодоления барьера, через который композиция буде проходить. Такие неинвазивные средства, в общем, известны в этой области техники.
Композиции для парентерального введения включают стерилизованные водные растворы, неводные растворители, суспендирующие средства, эмульгаторы. Суспендирующие средства и эмульгаторы, которые могут быть применены в настоящем изобретении, включают растительные масла, такие как пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и оливковое масло, и сложный эфир, применяемый для инъекций, такой как этилолеат.
Для людей клеточное терапевтическое средство настоящего изобретения обычно может быть введено один или несколько раз в дозе, равной 104-1010 клеток/организм и предпочтительно 106-108 клетки/организм. В особенности, композиция настоящего изобретения предпочтительно содержит взрослые стволовые клетки в концентрации, равной от 1×108 клеток/100 мкл до 1×109 клеток/100 мкл.
Однако следует понимать, что фактическую дозу активного ингредиента композиции следует устанавливать в соответствии с различными имеющими отношение факторами, включая заболевание, которое предстоит лечить, способ введения, возраст, пол и массу тела пациента, и тяжесть заболевания. Таким образом, вышеуказанная доза не ограничивает каким-либо образом объем настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
В дальнейшем в этом документе, настоящее изобретение будет описано подробнее с отсылкой к примерам. Специалистам в этой области техники понятно, что эти примеры даны только для иллюстративных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Источники сред и реагентов, примененные в приведенных ниже примерах, показаны в представленной ниже таблице 1.
Таблица 1
Наименование Компания
Аскорбиновая кислота «Sigma» США
СаСl2 «Sigma» США
Коллагеназа типа I «Gibco» США
DMEM «Gibco» США
DPBS «Welgene» Корея
EGF «Gibco» США
FBS «Gibco» США
Гидрокортизон «Sigma» США
Инсулин «Gibco» США
K-SFM «Gibco» США
NAC «Sigma» США
Пример 1: Выделение мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека
Жировую ткань человека изолируют из абдоминального жира путем липосакции и промывают в PBS. Изолированную ткань мелко нарезают и затем переваривают в среде DMEM, дополненной коллагеназой типа 1 (1 мг/мл) при 37°С в течение 2-х часов. После промывания в PBS переваренную ткань центрифугируют при 1000 rpm в течение 5-ти минут. Супернатант отсасывают и осадки, остающиеся на дне, промывают PBS и затем центрифугируют при 1000 rpm в течение 5-ти минут. Полученные клетки фильтруют через 100-мкм сетчатый фильтр для удаления дебриса, после чего клетки промывают PBS и затем растят в течение ночи в DMEM (10% FBS, 2 мМ NAC, 0,2 мМ аскорбиновая кислота).
Затем неприкрепившиеся клетки удаляют промыванием с PBS и оставшиеся клетки пересевают, заменяя с 2-дневными интервалами среду средой Keratinocyte-SFM (содержащей 5% FBS, 2 мМ NAC, 0,2 мМ аскорбиновую кислоту, 0,09 мМ кальций, 5 нг/мл rEGF, 5 мкг/мл инсулина и 74 нг/мл гидрокортизона), изолируя, таким образом, мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани.
Пример 2: Индукция миграции стволовых клеток жировой ткани 2-1: Индукция клеточной миграции хемокинами или факторами роста, приведенными в таблице 2. Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани, изолированные по примеру 1, высевают в каждую лунку в концентрации, равной 2×104 клетки/200 мкл, и индуцируют миграцию хемокинами или факторами роста, приведенными в представленной ниже таблице 2. В качестве группы позитивного контроля применяют 30% FBS.
Таблица 2
30% FBS ВСА-1 TGF-β1
Rantes CXCL16 IGF-1
MCP-1 EGF PDGF-AB
MIP-3β b-FGF TNF-α
SDF-1α HGF  
Фиг.1 показывает результаты индукции миграции клеток. В качестве группы негативного контроля применяют клетки, миграцию которых индуцировали средой, и в качестве группы позитивного контроля применяют клетки, миграцию которых индуцировали 30% FBS. Результаты индукции миграции клеток рассчитывают как процент по отношению к группе отрицательного контроля, которую принимают за 100%, и результаты расчетов графически показаны на фиг.1. Как можно видеть на фиг.1, мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани (AdMSC) активно мигрируют в ответ на стимуляцию хемокинами или факторами роста, таким же образом, как в ответ на стимуляцию 30%-ной FBS. В особенности, клетки активно индуцируются к миграции в ответ на Rantes, SDF-1α, HGF, TGF-β1, IGF-1, PDGF-AB или TNF-α.
2-2: Получение изображения клеток, индуцируемых к миграции другими хемокинами или факторами роста
Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани, изолированные по примеру 1, примируют свободной от FBS средой (фиг.2а), TNF-a (фиг.2b и 2С) или хемотаксическим фактором (фиг.2d) в течение 24-х часов и культивируют. Затем клетки изолируют, обрабатывая смесью 0,25% трипсин/1 мМ EDTA, после чего эти клетки промывают PBS и собирают центрифугированием при 1500 rpm в течение 5-ти минут.
Затем вкладыши Трансвелл (Costar, 3422) покрывают 0,1% желатином («Sigma-Aldrich») в течение 2-х часов и помещают в содержащий среду 24-луночный планшет. Собранные стволовые клетки жировой ткани высевают в каждый вкладыш в концентрации, равной 2×104 клетки /200 мкл, и выращивают в инкубаторе с 5%-ным СО2 при 37°С в течение 2-х часов. Затем засеянный вкладыш переносят в 24-луночный планшет, содержащий каждое из следующего: среда, хемокины и факторы роста в концентрации, равной 100 нг/мл. Затем клетки выращивают в инкубаторе с 5%-ным СO2 при 37°С в течение 24-х часов. Затем немигрировавшие стволовые клетки жировой ткани, присутствующие в верхней части вкладыша, удаляют ватной палочкой, и оставшиеся клетки промывают и затем иммобилизуют 70% метанолом в течение 1-го часа.
Затем клетки окрашивают 0,5%-ным раствором кристаллического фиолетового в течение 1-го часа. Затем клетки промывают и затем получают их изображения под микроскопом при увеличении XI00.
В результате, как можно видеть на фиг.2a-2d, скорость миграции примированных стволовых клеток жировой ткани (фиг.2c и 2d) была выше, чем скорость миграции непримированных стволовых клеток жировой ткани (фиг.2a и 2b), указывая на то, примированные клетки были плотными.
Пример 3: Миграция стволовых клеток жировой ткани, примированных хемокинами или факторами роста
Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани, изолированные по примеру 1, примированные в течение 24-х часов хемокинами или факторами роста, представленными в приведенной ниже таблице 3. Примированные клетки высевают в каждую лунку в концентрации, равной 2×104 клеток/200 мкл, и миграцию клеток индуцируют 10%-ной FBS с целью установить различие с индукцией миграции клеток под действием 30%-ной FBS. Кроме того, в качестве группы негативного контроля применяют непримированные мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани (необработанные клетки).
Таблица 3
Rantes TNF-α
SDF-1α PDGF-AB
HGF TGF-β1
Фиг.3 показывает результаты индукции миграции клеток. Исходя из числа мигрировавших клеток, как показано на фиг.3, можно видеть, что среди мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани (AdMSC), примированных различными хемокинами или факторами роста, те клетки, которые были примированы PDGF-AB или TNF-α, были более активно индуцированы к миграции под действием 10%-ной FBS. В особенности, клетки, примированные TNF-α, были наиболее активно индуцированы к миграции.
Пример 4: Миграция стволовых клеток жировой ткани, примированных TNF-α
С отсылкой к результатам опыта, полученным в примере 3, мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани, изолированные по примеру 1, примируют TNF-α в течение 24-х часов. Примированные клетки высевают в каждую лунку в концентрации, равной 2×104 клеток/200 мкл, и индуцируют к миграции под действием различных хемокинов или факторов роста, показанных в приведенной ниже таблице 4.
Таблица 4
FBS (нет) ВСА-1 TGF-β1
Rantes CXCL16 IGF-1
МСР-1 EGF PDGF-AB
МГР-3β b-FGF TNF-α
SDF-1α HGF  
Фиг.4 показывает результаты индукции миграции клеток. Как можно видеть на фиг.4, Rantes, SDF-1α, EGF, β-FGF, TGF-β1, PDGF-AB и т.п. активно индуцируют к миграции мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани (AdMSC), примированные TNF-α. В особенности, если результаты, приведенные на фиг.4, сравнить с результатами, приведенными на фиг.1, относящейся к результатам по примеру 1, то можно продемонстрировать эффект примирования под действием TNF-α. Точнее говоря, можно видеть, что если клетки примируют TNF-α, то миграция клеток становится активной.
Пример 5: Примирование стволовых клеток жировой ткани различными хемокинами или факторами роста и способность хемокинов или факторов роста индуцировать миграцию клеток
Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани, изолированные по примеру 1, примируют хемокинами или факторами роста, показанными в приведенной ниже таблице 5, в течение примерно 24-х часов. Примированные клетки высевают в каждую лунку в концентрации, равной 2×104 клеток/200 мкл, и индуцируют к миграции, применяя те же хемокины или факторы роста, которые применяли при примировании.
Таблица 5
FBS 30% ВСА-1 TGF-β1
Rantes CXCL16 IGF-1
МСР-1 EGF PDGF-AB
МГР-3β b-FGF TNF-α
SDF-1α HGF  
Фиг.5 показывает результаты индукции миграции клеток. На фиг.5, белые столбики означают непримированные клетки, и черные столбики означают число клеток, которые мигрируют в результате примирования хемокинами или факторами роста. Как можно видеть на фиг.5, миграция стволовых клеток жировой ткани, примированных Rantes, МГР-3β, SDF-1α, BCA-1, CXCL16, EGF, PDGF-AB или им подобными, была улучшена по сравнению с миграцией непримированных стволовых клеток жировой ткани. В особенности, способность клеток к миграции значительно увеличилась при примировании Rantes, SDF-1α, BCA-1, CXCL16 или PDGF-AB.
Пример 6: Экспрессия рецепторов хемокинов или факторов роста в стволовых клетках жировой ткани
Экспрессируют ли мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани, полученные по примеру 1, соответствующие рецепторы хемокинов или факторов роста, исследовали с помощью антител на соответствующие рецепторы методом проточной цитометрии (FACS).
Названия рецепторов и лигандов для хемокинов или факторов роста показаны в представленной ниже таблице 6.
Таблица 6
Рецепторы Хемокины или факторы роста Лиганды
CCR1 RANTES CCL5
CCR2 МСР-1 CCL2
CCR7 Mip-3β CCL19
CXCR4 SDF-1α CXCL 12
CXCR5 BCA-1 CXCL13
CXCR6 CXCL 16 CXCL 16
EGF EGFR  
b-FGF FGFR1  
HGF c-MET  
TGF-β1 TGFBR2  
IGF-1 IGF1R  
PDGF-AB PDGFRA, PDGFRB  
TNF-α TNFRSF1A  
Стволовые клетки жировой ткани выращивают во флаконе Т75. После того как степень смыкания монослоя достигает 90%, клетки изолируют, обрабатывая их смесью 0,25% трипсин/1 мМ ЭДТА, после чего клетки промывают PBS и собирают центрифугированием при 1500 rpm в течение 5-ти минут. Собранные клетки иммобилизуют 10%-ным раствором FBS в холодильнике при 4°С в течение 1-го часа или более и затем промывают. Затем клетки инкубируют с антителами, перечисленными в приведенной ниже таблице 7, и анализируют с помощью FACS.
Таблица 7
Антитела Компания Серийный номер
анти-CCRl человека «R&D Systems» MAB145
aHTH-CCR2 человека «R&D Systems» MAB150
анти-ССК7 человека «R&D Systems» MAB197
aHTH-CXCR4 человека «R&D Systems» MAB170
aHTH-CXCR5 человека «R&D Systems» MAB190
aHTH-CXCR6 человека «R&D Systems» MAB699
анти-ЕОР-рецептор человека «BD Pharmingen» 555997
TGFp RII (D-2) «Santa Cruz Biotechnology» sc-1779949
CD140a-PDGFRA «BD Pharmingen» 556002
CD 140b-PDGFRB «BD Pharmingen» 558821
CD221-IGF1R «BD Pharmingen» 555999
анти-HGF R/c-MET человека «R&D Systems» FAB3582F
CD 120a-TNFRSF 1A «BD Pharmingen» 550514
FGFR1 антитело [M19B2] « Abeam » ab823
Фиг.6 показывает результаты анализа. На фиг.6, темные области обозначают тестируемую группу, и черные линии обозначают контрольную группу. Рецепторы для IGF-1 и HGF не были подтверждены, и, таким образом, для того чтобы подтвердить функцию антител, культивируют клеточную линию А549 рака легких, приобретенную в Банке клеточных линий, и затем анализируют с помощью проточной цитометрии (FACS).
Как можно видеть из результатов, полученных с помощью FACS, приведенных на фиг.6, примированные мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани экспрессируют рецепторы для Rantes (CCR1), МГР-3β (CCR7), SDF-1α (CXCR1), ВСА-1 (CXCR5), CXCL16, EGF, TGF, PDGF-AB, IGF-1, TNF-α и FGF.
Вышеуказанные результаты подтвердили то, что в мультипотентных мезенхимальных стволовых клетках жировой ткани экспрессируются рецепторы для специфических хемокинов или факторов роста и что эти рецепторы отвечают на соответствующие хемокины или факторы роста, а также то, что уровень экспрессии рецепторов увеличивается путем примирования соответствующими хемокинами или факторами роста. Это означает, что направленная миграция мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани к пораженному участку in vivo может быть включена путем взаимодействия между хемокинами или факторами роста и их рецепторами, осуществляя тем самым эффективное лечение заболевания, относящегося к пораженному участку.
Пример 7: Определение мРНК хемокинов или рецепторов фактора роста в стволовых клетках жировой ткани
Экспрессируют ли мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани, полученные по примеру 1, мРНК соответствующего хемокина или рецепторов фактора роста, определяют с помощью RT-PCR.
Стволовые клетки жировой ткани, выращенные во флаконе Т75, изолируют, обрабатывая их смесью 0,25% трипсин/1 мМ ЭДТА, и затем промывают PBS, после этого клетки собирают центрифугированием при 1500 rpm в течение 5-ти минут. Общую РНК экстрагируют из собранных клеток, применяя набор для экстракции общей РНК («iNtRON Biotechnology »).
2 мкг РНК синтезируют в кДНК с помощью набора «Maxime RT Pre-mix kit» («iNtRON Biotechnology»). 1 мкл кДНК денатурируют в буфере IX h-Taq, 0,2 мМ dNTP, 0,4 пМ прямой праймер, 0,4 пМ обратный праймер и 0,25 Ед./мкл h-Taq ДНК-полимеразы («Solgent») при 95°С в течение 20-ти секунд, после этого праймеры нагревают при каждой температуре отжига, показанной в таблице 8, в течение 40 секунд и PCR-продукт наращивают при 72°С в течение 1 минуты, таким образом осуществляя амплификацию кДНК. PCR-амплификацию проводят в течение 40 циклов. Температуры нагрева праймеров рецепторов, примененных в PCR-амплификацию, показаны в приведенной ниже таблице 8.
Таблица 8
Рецепторы SEQ ID№: 1-34
(F: прямой, R: обратный)		 Продукты Температура отжига
CCR1 F: 5'-CATCTTGGCTTCCATGCCAGGCT-3' R: 5'-CCTCCGTCACTTGCACAGCCAGGT-3' 380bp 62°C
CCR2 F: 5'-CCTCCTGACAATCGATAGATACCT-3' R: 5'-GTCACCTGCGTGGCTTGGTCCAGT-3' 474bp 56°C
CCR7 F: 5'-ATCTCCAAGACCAGAGATAGTG-3' R: 5'-AAATGTTGCTCTCTTAACGAAT-3' 461 bp 62°C
CXCR4 F: 5'-GAGGAGTTAGCCAAGATGTG-3' R: 5'-TTCTTCTGGTAACCCATGAC-3' 489bp 62°C
CXCR5 F: 5'-CATCCTAATCATCCAATGCT-3' R: 5'-AGCTCTTTTCTTCCCTCTGT-3' 494bp 62°C
CXCR6 F: 5'-CCTTAACCCTGTGCTCTATG-3' R: 5'-CTCACCTCTTCAACCTTCAG-3' 517bp 62°C
EGFR F: 5'-GCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCA-3' R: 5 '-GATTCCGTCATATGGCTTGGATCCA-3' 419bp 64°C
FGFR1 F: 5'-CCTGACCACAGAATTGGAGGCTACA-3' R: 5'-AGTTCATGTGTAAGGTGTACAGTG-3' 250bp 58°C
TGFBR2 F: 5'-CCACGTGTGCCAACAACATCAACCA-3' R: 5'-TGAAGAACGACCTAACCTGCTGCC-3' 498bp 58°C
CD 120а - F: 5'-GAGAGGCCATAGCTGTCTGG-3' 218bp 58°C
TNFRSF1A R: 5'-GTTCCTTTGTGGCACTTGGT-3'    
CD 140a -PDGFRA F: 5'-GAAGCTGTCAACCTGCATGA-3' R: 5'-CTTCTTTAGCACGGATCAGC-3' 187bp 58°C
CD 140b -PDGFRB F: 5'-GCGGCTGGTGGAGCCGGTGACTGA-3' R: 5'-CTCACTTAGCTCCAGCACTCGGACA-3' 508bp 68°C
CD221 -IGF1R F: 5'-GTGAACGAGGCCGCAAGCATGCGT-3' R: 5' -CTGTGGACGAACTTATTGGCGTTGA-3' 299bp 58°C
c-MET F: 5' -CAGGCAGTGCAGCATGTAGT-3' R: 5'-GATGATTCCCTCGGTCAGAA-3' 201 bp 58°C
ADIPOR1 F: 5' -GCTGACACGGTGGAACTGGCTGAACT-3' R: 5- CTGTATGAATGCGGAAGATGCTCTTGA-3' 337bp 60°C
ADIPOR2 F: 5' -GGCAACATTTGGACACATCTCTTAGGT-3' R: 5- CAGCTCCTGTGATGTAGAGGCTGGCCA-3' 538bp 60°C
GAPDH F: 5'-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3' R: 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTCT-3' 362bp 55°C
PCR продукты разделяют с помощью электрофореза с маркерами молекулярных масс ДНК из набора « Sizer DNA Marker-50» («iNtRON») в 2,0%-ном агарозном геле и IX ТАЕ-реагенте при 110 В в течение 1 часа и 30 минут и затем визуализируют с помощью программного обеспечения «Fuji molecular imaging». В качестве контрольного гена применяют GAPDH. Все PCR-продукты секвенируют с помощью компании «Solgent Co., Ltd.», и в результате было определено, что PCR-продукты имеют идентичность последовательностей, равную 99% или выше.
Как можно видеть из результатов, представленных на фиг.7, мРНК рецепторов для хемокинов или факторов роста экспрессируются в стволовых клетках жировой ткани. На фиг.7А, линия 1: CCR1 (380 bp), линия 2: CCR2 (474 bp), линия 3: CCR7 (461 bp), линия 4: CXCR4 (489 bp), линия 5: CXCR5 (494 bp), линия 6: CXCR6 (517 bp) и линия 7: GAPDH (362 bp). На фиг.7В, линия М: маркер, линия 1: EGFR (419 bp), линия 2: TGFBR2 (498 bp), линия 3: PDGFRA (187 bp), линия 4: PDGFRB (508 bp), линия 5: IGF1R (299 bp; не экспрессируется), 6: c-MET (201 bp), линия 7: TNFRSF1A (218 bp), линия 8: FGFR1 (250 bp) и линия 9: GAPDH (362 bp). В этом примере, GAPDH применяют в качестве группы позитивного контроля.
Вышеуказанные результаты подтвердили то, что мРНК рецепторов специфических хемокинов или факторов роста экспрессируются в стволовых клетках жировой ткани. Это означает, что направленная миграция стволовых клеток жировой ткани к пораженному участку in vivo может быть включена путем взаимодействия между хемокинами или факторами роста и их рецепторами, осуществляя тем самым эффективное лечение заболевания, относящегося к пораженному участку.
Пример 8: Примирование стволовых клеток жировой ткани адипонектином и исследование способности адипонектина в различных концентрациях индуцировать миграцию клеток
8-1: Исследование способности адипонектина в различных концентрациях индуцировать миграцию клеток
Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани, изолированные по примеру 1, примируют адипонектином в течение 24-х часов. Примированные клетки индуцируют к миграции, обрабатывая их адипонектином в различных концентрациях (1 нг/мл, 10 нг/мл и 100 нг/мл).
Фиг.8 показывает результаты индукции миграции клеток. Как можно видеть на фигуре 8, миграция клеток, обработанных 100 нг/мл адипонектина, была примерно в два раза выше, чем миграция клеток, обработанных 10 нг/мл адипонектина. Это означает, что способность адипонектина индуцировать миграцию клеток возрастает с ростом его концентрации.
8-2: Экспрессия рецептора адипонектина в стволовых клетках жировой ткани
Экспрессируется ли рецептор адипонектина в стволовых клетках жировой ткани, устанавливали с помощью RT-PCR, таким же способом, как описан в примере 7, применяя праймеры и температуры отжига, показанные в вышеприведенной таблице 8.
В результате, как можно видеть на фиг.9, в стволовых клетках жировой ткани экспрессируются два типа рецепторов адипонектина (1: ADIPOR1 (337 bp) и 2: ADIPOR2 (538 bp)). Таким образом, было подтверждено, что примирование клеток жировой ткани адипонектином приводит к такому увеличению уровня экспрессии рецептора адипонектина в клетках, что взаимодействие между адипонектином и рецептором адипонектина может быть применено для лечения заболевания.
Хотя настоящее изобретение было описано подробно с отсылкой к специфическим признакам, специалистам в этой области техники ясно, что это описание дано только для предпочтительного воплощения и не ограничивает объем настоящего изобретения. Таким образом, фактический объем настоящего изобретения будет определяться прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.
Промышленная применимость
Настоящее изобретение относится к способности взрослых стволовых клеток жировой ткани и секретируемых ими продуктов мигрировать. В соответствии с настоящим изобретением взрослые стволовые клетки жировой ткани, примированные специфическим хемокином или фактором роста, или секретируемые ими продукты могут быть введены с помощью простого способа, такого как внутривенное введение, и могут быть нацелены на пораженный участок, который нуждается в трансплантации стволовых клеток, и мигрируют к пораженному участку. Таким образом, взрослые стволовые клетки жировой ткани или секретируемые ими продукты в соответствии с настоящим изобретением очень полезны в качестве клеточного терапевтического средства, которое надежно мигрирует к пораженному участку без сложной хирургической операции и демонстрирует лечебный эффект в пораженном участке.

Claims (8)

1. Композиция для индукции миграции стволовых клеток жировой ткани взрослых, которая содержит в качестве активного ингредиента человеческие мезенхимальные стволовые клетки из жировой ткани взрослых в количестве от 1х107 до 1х1010, которые экспрессируют на клеточной поверхности рецептор хемокина или фактора роста, или секреторный продукт из этих стволовых клеток включает рецептор хемокина или фактора роста; где секретируемый продукт стволовых клеток жировой ткани взрослых представляет собой адипонектин; и где человеческие стволовые клетки жировой ткани взрослых подвергаются первичному воздействию смесью, содержащей хемокин или фактор роста, и фармацевтически приемлемый носитель.
2. Композиция по п.1, дополнительно содержащая FBS (эмбриональную бычью сыворотку).
3. Композиция по п.1, в которой рецептор хемокина или фактора роста выбирают из группы, состоящей из Rantes, МСР-1 (белок-хемоаттрактант-1 моноцитов), MIP-3β (воспалительный белок-3β моноцитов), SDF-1α (стромальных клеток фактор-1α), ВСА-1 (привлекающий В-клетки хемокин-1), CXCL16 (хемокиновый (С-Х-С-мотив) лиганд 16), EGF (эндотелиальный фактор роста), b-FGF (основной фактор роста фибробластов), HGF (фактор роста гепатоцитов), TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1), IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста 1), PDGF-AB (фактор роста тромбоцитов АВ) и TNF-α (фактор некроза опухолей-α).
4. Композиция по п.1, в которой смесь содержит один или несколько факторов, выбранных из группы, состоящей из Rantes, МСР-1 (белок-хемоаттрактант моноцитов-1), MIP-3β (воспалительный белок моноцитов-3β), SDF-1α (фактор стромальных клеток-1α), ВСА-1 (привлекающий В-клетки хемокин-1), CXCL16 (хемокиновый (С-Х-С-мотив) лиганд 16), EGF (фактор роста эндотелия), b-FGF (основной фактор роста фибробластов), HGF (фактор роста гепатоцитов), TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1), IGF-1 (инсулин-подобный фактор роста 1), PDGF-AB (тромбоцитарный фактор роста АВ) и TNF-α (фактор некроза опухолей-α).
5. Композиция по п.4, в которой указанная смесь содержит один или несколько факторов, выбираемых из группы, состоящей из Rantes, SDF-1α (стромальных клеток фактор-1α), HGF (фактор роста гепатоцитов), TNF-α (фактор некроза опухолей-α), PDGF-AB (фактор роста тромбоцитов АВ) и TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1).
6. Способ индукции миграции стволовых клеток жировой ткани взрослых, включающий следующие стадии:
(a) примирование стволовых клеток жировой ткани взрослых смесью, содержащей хемокин или фактор роста препаратом композиции по п. 1; и
(b) внутривенное ведение композиции по п.1 in vivo в участок, который не находится в прямом контакте с пораженным.
7. Способ по п.6, в котором стадия (а) дополнительно включает примирование стволовых клеток взрослых с помощью FBS.
8. Способ по п.6, в котором смесь содержит один или несколько факторов, выбираемых из группы, состоящей из Rantes, SDF-1α (стромальных клеток фактор-1α), HGF (фактор роста гепатоцитов), TNF-α (фактор некроза опухолей-α), PDGF-AB (фактор роста тромбоцитов АВ) и TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1).
RU2012121191/10A 2009-10-23 2010-10-25 Способ индукции миграции стволовых клеток жировой ткани RU2527182C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2009-0101117 2009-10-23
KR20090101117 2009-10-23
PCT/KR2010/007329 WO2011049414A2 (ko) 2009-10-23 2010-10-25 지방조직 유래 성체 줄기세포 이동을 유도하는 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2012121191A RU2012121191A (ru) 2013-11-27
RU2527182C2 true RU2527182C2 (ru) 2014-08-27

Family

ID=43900858

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2012121191/10A RU2527182C2 (ru) 2009-10-23 2010-10-25 Способ индукции миграции стволовых клеток жировой ткани

Country Status (8)

Country Link
US (1) US8808682B2 (ru)
EP (1) EP2511365A4 (ru)
JP (1) JP5657009B2 (ru)
KR (1) KR101223511B1 (ru)
CN (1) CN102666840A (ru)
BR (1) BR112012009540A2 (ru)
RU (1) RU2527182C2 (ru)
WO (1) WO2011049414A2 (ru)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103087982A (zh) * 2011-10-27 2013-05-08 北京清美联创干细胞科技有限公司 一种快速分离脂肪间充质干细胞的试剂盒及方法
ES2827207T3 (es) * 2011-12-01 2021-05-20 R Bio Co Ltd Composición de medio de cultivo de rejuvenecimiento de células madre
CN104520423B (zh) * 2012-04-18 2017-07-04 K-干细胞有限公司 用于生产具有适于血管内给药的尺寸的干细胞的方法
KR101583569B1 (ko) * 2013-05-15 2016-01-08 라정찬 정맥 투여용 줄기세포 조성물
CN104419659A (zh) * 2013-08-30 2015-03-18 翔宇生医科技股份有限公司 脂肪干细胞及其干细胞分泌物的培养与量产方法
ES2831298T3 (es) * 2014-11-07 2021-06-08 Exocobio Inc Composición que incluye exosomas derivados de células madre para blanquear la piel o mejorar las arrugas
CN104531613B (zh) * 2014-11-17 2017-12-19 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 Wip1敲除在促进小鼠骨髓间充质干细胞迁移中的应用
CN104560868B (zh) * 2014-11-27 2018-06-05 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种脂肪干细胞的原代分离培养方法
WO2016194760A1 (ja) * 2015-05-29 2016-12-08 ロート製薬株式会社 美容方法およびそれに用いる皮膚外用剤、並びに遊走付与剤、皮膚状態を向上させる美容方法に用いられる成分のスクリーニング方法
RU2018107704A (ru) * 2015-08-04 2019-09-05 Сисейдо Компани, Лтд. Средство, содержащее аттрактант жировых стволовых клеток, для улучшения рыхлости или старения кожи, вызываемых образованием дермальных полостей
TWI674104B (zh) * 2015-08-04 2019-10-11 日商資生堂股份有限公司 包含脂肪幹細胞引誘劑之由於真皮空洞化所導致的皮膚鬆弛或老化改善劑
KR101956442B1 (ko) 2016-02-23 2019-03-12 경희대학교 산학협력단 줄기세포의 효능 개선을 위한 조성물 및 방법
CA3046743A1 (en) * 2016-12-16 2018-06-21 Osaka Air Machine Service, Ltd. Tissue healing agent
CN106754675B (zh) * 2016-12-21 2019-11-22 广东科玮生物技术股份有限公司 一种脂肪干细胞无血清培养基及其制备方法和用途
CN106957818A (zh) * 2017-05-03 2017-07-18 泰州市数康生物科技有限公司 一种高效促使脂肪干细胞增殖的方法及其试剂盒
EP3656867A1 (en) 2017-07-18 2020-05-27 Shiseido Company, Ltd. Method for screening anti-aging substances
CN110709506A (zh) 2017-07-18 2020-01-17 株式会社资生堂 间充质干细胞导引剂
US11058729B2 (en) 2018-01-25 2021-07-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Exosomes and miRNA to treat glaucoma
KR20190110934A (ko) 2018-03-21 2019-10-01 부산대학교 산학협력단 라파마이신을 포함하는 심근 전구 세포 노화 억제용 배지 조성물
KR102297470B1 (ko) * 2019-07-11 2021-09-02 가천대학교 산학협력단 줄기세포의 암세포로의 이동성 강화 방법
WO2021040141A1 (ko) * 2019-08-27 2021-03-04 주식회사 도프 동물지방 유래 세포외기질 및 동물지방 유래 세포외기질 보존액
CN112779212A (zh) * 2021-01-12 2021-05-11 北京大学口腔医学院 一种促进间充质干细胞球运动的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060205644A1 (en) * 2005-03-14 2006-09-14 Armen Saghatelyan Methods of treating neurological diseases by regulating migration of neuroblasts in the adult nervous system with tenascin-R
RU2350340C1 (ru) * 2007-09-06 2009-03-27 Александр Викторович Печерский Способ коррекции процессов регенерации
RU2363491C2 (ru) * 2003-08-12 2009-08-10 Тижени Н. В. Применение хемокина cxcl6 в предотвращении или восстановлении хрящевых дефектов

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003080801A2 (en) * 2002-03-19 2003-10-02 Advanced Research & Technology Transfer Adipose stromal stem cells for tissue and vascular modification
JP4869603B2 (ja) * 2002-11-20 2012-02-08 キャンサー・リサーチ・テクノロジー・リミテッド 抗体、ポリペプチドおよびその使用
JP2004331590A (ja) * 2003-05-08 2004-11-25 Yuji Matsuzawa 急性創傷治療剤及び急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物
US8119397B2 (en) * 2004-03-31 2012-02-21 Two Cells Co., Ltd. Therapeutic agents and therapeutic methods for treating injured tissue
US8715733B2 (en) * 2004-07-23 2014-05-06 DePuy Synthes Products, LLC Enhanced adipose tissue
JP2009537127A (ja) * 2006-05-17 2009-10-29 バンフィ，アンドレーア 特定レベルのトランスジーンを安定に発現する形質導入前駆細胞の均一集団を単離するための方法
JP5240715B2 (ja) * 2006-08-08 2013-07-17 国立大学法人名古屋大学 脂肪組織由来多分化能幹細胞を含有する細胞製剤

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2363491C2 (ru) * 2003-08-12 2009-08-10 Тижени Н. В. Применение хемокина cxcl6 в предотвращении или восстановлении хрящевых дефектов
US20060205644A1 (en) * 2005-03-14 2006-09-14 Armen Saghatelyan Methods of treating neurological diseases by regulating migration of neuroblasts in the adult nervous system with tenascin-R
RU2350340C1 (ru) * 2007-09-06 2009-03-27 Александр Викторович Печерский Способ коррекции процессов регенерации

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KIM L KROEZE et al. Chemokine-Mediated Migration of Skin-Derived Stem Cells: Predominant Role for CCL5/RANTES. Journal of Investigative Dermatology (2009) 129, 1569-1581; doi:10.1038/jid.2008.405; published online 1 January 2009. *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2511365A4 (en) 2013-07-03
BR112012009540A2 (pt) 2019-09-24
US20120276044A1 (en) 2012-11-01
JP2013507956A (ja) 2013-03-07
RU2012121191A (ru) 2013-11-27
KR20110044722A (ko) 2011-04-29
WO2011049414A2 (ko) 2011-04-28
EP2511365A2 (en) 2012-10-17
JP5657009B2 (ja) 2015-01-21
WO2011049414A3 (ko) 2011-09-09
US8808682B2 (en) 2014-08-19
KR101223511B1 (ko) 2013-01-31
CN102666840A (zh) 2012-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2527182C2 (ru) Способ индукции миграции стволовых клеток жировой ткани
US10960025B2 (en) Mesenchymal stem cells and uses therefor
CN105112357B (zh) 来源于胎盘的贴壁细胞及其在疾病治疗中的应用
KR102087366B1 (ko) 조직 복구 및 재생을 위한 세포 증식 방법 및 약제학적 제제
JP4950661B2 (ja) 分娩後由来細胞類を使用する、神経組織の再生および修復
JP6095893B2 (ja) 傷害後の神経組織の再生および修復
JP2010018627A (ja) 血管の形成ならびに血管新生および栄養因子の生産に使用するための骨髄間質細胞に由来する物質
JP7275441B2 (ja) 周産期組織由来間葉系幹細胞：その作製方法および使用
Brouard et al. G-CSF increases mesenchymal precursor cell numbers in the bone marrow via an indirect mechanism involving osteoclast-mediated bone resorption
WO2005063967A1 (ja) 哺乳動物の骨髄細胞または臍帯血由来細胞と脂肪組織を利用した心筋細胞の誘導
US10479978B2 (en) Postnatal adherent cells and preparation method therefor
JP6583830B2 (ja) 末梢血単核球又は末梢血単核球より分泌される因子を伴う線維芽細胞を含む細胞シート
KR20160055827A (ko) 통증 및/또는 섬유증의 조절에 지방 조직-유래 세포를 사용하는 방법
TW201908478A (zh) 調節米勒神經膠質細胞之方法
Lange-Consiglio et al. Priming with inflammatory cytokines is not a prerequisite to increase immune-suppressive effects and responsiveness of equine amniotic mesenchymal stromal cells
KR101769551B1 (ko) 층분리배양법을 이용한 지방-유래 줄기세포의 분리 및 이의 이용
WO2018225703A1 (ja) 分化誘導細胞の調製方法
WO2022123958A1 (en) Pharmaceutical composition for use in prevention and treatment of liver fibrosis and/or liver cirrhosis, comprising adipose-derived regenerative cells (adrcs)
AU2017268656B2 (en) Mesenchymal stem cells and uses therefor
TW202221113A (zh) 細胞層片小片、收容細胞層片小片的注射器、細胞層片小片的製造方法及其使用方法
윤영남 Correlation between myocardial regeneration and the release of cytokines in ischemic hearth with intramyocardial implantation of cardiomyogenic mesenchymal stem cells

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20161026