CN104531613B - Wip1敲除在促进小鼠骨髓间充质干细胞迁移中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Wip1敲除在促进小鼠骨髓间充质干细胞迁移中的应用。本发明提供了敲除动物Wip1的物质在制备具有如下(1)‑(4)中至少一种功能的产品中的应用：(1)促进动物BMMSCs迁移；(2)抑制动物BMMSCs增殖；(3)使动物BMMSCs出现G2细胞阻滞；(4)使动物BMMSCs生长停滞和/或早衰。本发明实验证明，小鼠敲除Wip1后可以促进BMMSCs的迁移能力。

Description

Wip1敲除在促进小鼠骨髓间充质干细胞迁移中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及Wip1(wild-type p53-inducedphosphatase)敲除在促进小鼠骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal StemCells，BMMSCs)迁移中的应用。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞，它们可以不断地自我更新，并在特定条件下转变成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。干细胞是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的始祖细胞。间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是干细胞的一个研究分支，其具有自我更新，多向分化，免疫调节及寻靶等一系列优势，为将来细胞治疗呈现出希望。BMMSCs来源于骨髓，可在体外培养扩增，并能在体外特定条件下能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、神经元细胞等；同时具有迁移能力和免疫调节功能，能有效的用于多功能的治疗。

目前，关于MSCs用于治疗十余种难治性疾病的研究已开始进行，其除了用来促进恢复造血，与造血干细胞共移植提高白血病和难治性贫血等以外，还用于心脑血管疾病，肝硬化、骨和肌肉衰退性疾病、脑和脊髓神经损伤、老年痴呆及红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病的治疗研究，已经取得的部分临床试验结果令人鼓舞。

然而自体MSCs的应用过程中逐渐暴露了不便之处：例如个体间MSCs扩增能力差异很大；潜在的肿瘤细胞污染风险；培养需要一定的时间，不能及时适应病情的需要，其中MSCs和其他原代细胞一样在体外培养过程中具有生长停滞，过早衰老等相似的情况。这些制约了自体MSCs的使用。涉及到MSCs迁移到靶位置和生长停滞的一些调控因子及机制研究的不够深入，报道的较少。因此，深入解析MSCs增殖和迁移信号转导途径网络，探讨如何增强MSCs向受损组织趋化和迁移的能力，可以为提高MSCs移植效率和应用提供新思路和理论依据。

细胞在增殖和迁移过程中都涉及到蛋白的磷酸化过程，Wip1是丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，由PPM1D基因编码。其主要表达于细胞核内，参与多条通路关键元件磷酸化/去磷酸化的过程。目前研究报道中，未见其参与MSCs迁移的报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供敲除动物Wip1基因的物质的应用。

本发明提供的敲除动物Wip1基因在制备具有如下(1)-(4)中至少一种功能的产品中的应用：

(1)促进动物BMMSCs迁移；

(2)抑制动物BMMSCs增殖；

(3)使动物BMMSCs出现G2细胞阻滞；

(4)使动物BMMSCs生长停滞和/或早衰；

Wip1基因的核苷酸序列为序列表中序列1。

上述应用中，所述促进动物BMMSCs迁移体现在提高动物BMMSCs的Rac1活性、促进PI3K/AKT表达和/或促进动物BMMSCs丝状伪足的形成；

所述使动物BMMSCs出现G2细胞阻滞体现在抑制动物BMMSCs中cyclinB1表达。

上述应用中，所述动物为小鼠。

上述应用中，所述产品为药物。

本发明另一个目的是提供敲除动物Wip1基因的物质的另一种应用。

本发明提供的提供敲除动物Wip1基因的物质在制备具有如下A-D中至少一种功能的产品中的应用：

A、提高动物BMMSCs中Rac1活性；

B、促进PI3K/AKT表达；

C、促进动物BMMSCs丝状伪足的形成；

D、抑制动物BMMSCs中cyclinB1表达。

上述应用中，所述动物为小鼠。

上述应用中，所述产品为药物。

本发明实验证明，利用原代Wip1^-/-小鼠提取出来的原代BMMSCs经过细胞形态学观察，分化能力鉴定，细胞表面特异标记识别鉴定，证明Wip1敲除可以促进小鼠BMMSCs迁移。传统研究方法利用以构建好的MSCs细胞系，在其基础上过表达或者干扰某基因来研究MSCs增殖停滞和迁移的分子机制。而本发明是利用敲除某基因的原代MSCs进行分子机制研究，相对传统而言，能做到既能完全排除细胞系本身所具备无限增长的影响，又能排除未彻底清除某基因所保留部分生物学功能对机理研究的影响。

本发明所涉及的研究手段包括：增殖检测，细胞周期检测，相关蛋白表达水平检测(westernblot，免疫荧光)，细胞核染，形态学观察，细胞划痕实验，transwell检测，相关蛋白活性检测，涉及信号通路研究(抑制剂，westernblot)，F-actin染色，激光共聚焦检测。这些方法具有更加科学，严谨，可信度高的特点。

附图说明

图1为PCR鉴定Wip1^-/-鼠的凝胶电泳分析。

图2为培养BMMSCs免疫表型和分化潜能的鉴定。

图3为敲除Wip1使原代BMMSCs停滞于G2期。

图4为敲除Wip1基因后降低cyclinB1蛋白表达。

图5为Wip1-/-BMMSCs表现出生长停滞和早衰。

图6为Wip1敲除后促进MSCs迁移愈合划痕。

图7为Wip1敲除后促进MSCs通过transwell膜。

图8为敲除Wip1后促进MSCs表达Rac1活性。

图9为敲除Wip1后促进MSCs表达AKT及促进AKT的磷酸化，从而增加MSCs迁移能力。

图10为Wip1敲除后促进MSCs肌动蛋白丝的重排及丝状伪足的形成。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

Wip1^+/-小鼠(遗传背景：C57BL/6，与该遗传背景相比，仅Wip1基因为杂合型，一条染色体有Wip1，另一条染色体上敲除Wip1；其余基因与C57BL/6一致，为全身性敲除小鼠)：中国医学科学院医学实验动物研究所，Wip1基因的核苷酸序列为序列表中序列1。

DNA组织样提取试剂盒：百泰克。

Rac1-GTP Elisa试剂盒：Cytoskeleton,Inc.

FITC-CD34,FITC-CD45,APC-CD44,APC-CD29and PE-CD90及同型对照：

e-Bioscience和MACS公司。

抗体Wip1(D4F7),AKT,p-AKT(Ser473),p-AKT(Thr308),cyclinB1(4138p),and

GAPDH(14C10)：Cell Signaling Technology公司。

5um transwell膜和60-mm培养皿：Costar公司

油红、茜素红、DAPI染液：Sigma公司。

罗丹明-鬼笔环肽：Life Technologies公司。

Cell Counting Kit-8试剂盒：Dojingdo公司。

基础培养基、血清、成骨、成脂分化试剂盒：Gibco公司

NSC23766、LY294002：R&D公司。

CycleTEST PLUS DNA试剂盒：BD Biosciences公司。

实施例1、Wip1^-/-小鼠的鉴定及原代小鼠BMMSCs提取、鉴定

一、Wip1^-/-及Wip1-WT小鼠鉴定

将Wip1^+/-小鼠杂交，所产后代10周后剪尾、编号，提取DNA，经PCR鉴定扩增的带型，所用引物如下：

鉴定引物如下：

Wip1WT Primer1:5’-GAC AGT CCT GTG CCA AA ATG CT-3’；

Wip1WT Primer2:5’-GGT GAC TTG ATT GGT GGT GTA GA-3’；

Wip1KO primer A:5’-GCA GGG CTG TTT GTG GTG CT-3’；

Wip1KO primer B:5’-GCA TGC TCC AGA CTG CCT T-3’.

结果如图1所示，条带大小仅为236bp的为Wip1-WT小鼠(WT)，条带大小仅为176bp的为Wip1^-/-小鼠(KO)，两条条带均检测到的为杂合型小鼠(HET)。

鉴定完后的小鼠用于后续试验及扩繁。Wip1蛋白鉴定于后期细胞实验进行。

二、原代小鼠BMMSCs提取、鉴定

1、原代小鼠BMMSCs提取

取10-12周龄Wip1^-/-小鼠，按照动物福利要求将其处死后，用1mm注射器将股骨骨髓冲出，并用1mL移液枪吹散成细胞悬液，离心后去除上层血细胞，均匀接种于60mm培养皿中，于培养箱中两天后更换培养基并去除悬浮细胞。待细胞增殖至占培养皿90％后，按1:2传代，至第三代备用。

全培养基(10％FBS)：89％(体积分数)DMEM/F12培养基(Gibco)，10％(体积分数)胎牛血清(Gibco)，1％(体积分数)双抗(Gibco)。

2、利用流式细胞分析仪对BMMSCs特异表面抗原识别鉴定

将上述1获得的第三代的BMMSCs，取10⁵于4℃下分别与10％流抗及同型对照共孵育30分钟，使用在FACSCalibur(BD Biosciences公司)配备的Diva软件(BD Biosciences公司)进行分析。

结果如图2所示，A为同型对照流式图，B为表面特异抗原流式鉴定：CD29为99.5％，CD34为2.1％，CD44为90.5％，CD45为3.3％，CD90为97.4％。该鉴定结果符合MSCs特征，满足后续试验所需。

3、BMMSCs形态学观察及成骨成脂分化能力的检测

观察第三代BMMSCs细胞形态图2C，并在不同培养皿里分别加入成骨分化液和成脂分化液，三天后分别用茜素红染液和油红O染液对分化处理的MSCs进行染色拍照。

结果如图2D和2E所示，D为MSCs加入成骨分化液后，利用茜素红对其进行成骨分化潜能鉴定，E为MSCs加入成脂分化液后，利用油红O对其进行成脂分化潜能鉴定；比例为100微米；说明提取并培养的BMMSCs具备成骨、成脂分化的能力。

结合上述流式分析结果，证明所提取的细胞为小鼠BMMSCs，获得了Wip1敲除小鼠的BMMSCs。

采用同样的方法检测验证野生型小鼠Wip1-WT的BMMSCs。

实施例2、Wip1敲除对小鼠BMMSCs增殖能力和细胞周期影响检测

一、两种基因型小鼠Wip1^-/-和Wip1-WT的BMMSCs增殖能力测定

为了探讨wip1对MSCs体外增殖的影响，通过CCK8实验对细胞体外增殖进行分析，具体如下：

分别取5×10³个/孔Wip1^-/-的BMMSCs和Wip1-WT的BMMSCs细胞于96孔板培养6，24，36，48，或72小时。然后采用CCK8增殖测定试剂盒测定细胞的数目。每个孔中加10ul的CCK-8溶液，并在37℃下温育2小时，用酶标仪在450nm处测定OD值。OD值大小对应细胞数量的多少。所有上述实验是在5次重复进行。

结果如图3A和3B，A为Wip1-WT小鼠BMMSCs生长标准曲线(检测该试剂在该种细胞增殖检测的可应用性)，共有5个细胞接种的数量测试点，接种数量分别为2.2×10⁴，1.1×10⁴，5.5×10³，2.1×10³和1.0×10³；B为通过利用CCK8测定法测得，Wip1野生型和敲除型BMMSCs的增殖差异曲线图，两种基因型细胞具有相同的初始细胞接种量，孵育测定时间点为6，24，36，48，72小时，通过CCK8测定进行分析。在450nm处的OD值进行了测定。每个数据点表示平均值±标准差(N＝6)**P<0.01。

可以看出，与野生型Wip1小鼠相比，敲除Wip1后BMMSCs体外扩增能力受到了抑制。

二、两种基因型小鼠BMMSCs细胞周期

1、小鼠BMMSCs细胞周期测定

取第三代Wip1^-/-的BMMSCs和Wip1-WT的BMMSCs进行细胞周期检测，使用CycleTEST PLUS DNA试剂盒染色后通过流式检测。

结果如图3C、D和表1所示，3C为Wip1-WT的BMMSCs细胞周期测定图，3D为Wip1^-/-的BMMSCs细胞周期测定图。

表1 为Wip1双敲和野生型BMMSCs周期检测结果

可以看出，敲除Wip1后BMMSCs出现G2细胞阻滞。

2、Wip1敲除后引起BMMSCs出现G2阻滞的机理分析

CyclinB1是调控细胞通过G2期的关键性蛋白，cyclinB1表达量的多少直接影响细胞在G2期所停留的时间。由于敲除Wip1后BMMSCs出现G2阻滞，检测cyclinB1表达量是否和该基因敲除有关。

培养第三代Wip1^-/-的BMMSCs和Wip1-WT的BMMSCs，待细胞贴壁培养12小时，提取这些细胞的总蛋白，进行Western blot分析和免疫荧光实验。

结果如图4A、B，A为Wip1敲除的BMMSCs表达的cyclinB1蛋白的表达低于野生型细胞；B为两种细胞cyclinB1免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜观察图；比例尺为100微米；由图可以看出，敲除Wip1后cyclinB1表达量明显减少。

三、Wip1敲除后引起BMMSCs生长停滞及早衰的检测

通过连续传代的方法计算两种基因型BMMSCs每代生长所需时间，如图5C，为细胞传代培养所需时间柱状图，从第四代起Wip1^-/-BMMSCs繁殖较野生型Wip1-WTBMMSCs放缓，到第六代时几乎处于生长停滞。实验进行5次独立实验，**P<0.01。

观察第六代的两种基因型BMMSCs发现Wip1^-/-的BMMSCs整个细胞扩展表现为“摊鸡蛋”形态，如图5A；

DAPI染核，细胞核大小测定为随机选取40个细胞核进行大小测量，发现Wip1敲除的细胞，细胞核变大的数量多于野生型，而这种形态常出现在细胞发育晚期，如图5B。

这些都说明Wip1^-/-的BMMSCs更容易出现细胞生长停滞和早衰。

四、Wip1敲除影响BMMSCs迁移能力的检测

1、通过划痕实验检测迁移能力

将第三代铺满于60mm培养皿Wip1^-/-的BMMSCs和Wip1-WT的BMMSCs上用10ul枪头间隔相同距离划5道划痕，在无血清培养基条件下置于培养箱，于0、6、12、24小时观察划痕愈合情况。

如图6A，为划痕实验细胞在四个时间点的形态，分别取0、6、12、24小时为时间点，培养条件为无血清培养；清晰的观察到于12小时候后两种基因型BMMSCs划痕愈合情况出现明显差异，至24小时，Wip1敲除MSCs划痕愈合将近60％而野生型才20％。

各时间点愈合情况统计如图6B，为两种基因型细胞各时间点划痕所剩空白区域所占百分比。*:p<0.05,**:p<0.01，比例尺为100微米。

上述结果说明敲除Wip1后促进了BMMSCs的迁移能力。

2、通过transwell实验检测迁移能力

将三代Wip1^-/-的BMMSCs和Wip1-WT的BMMSCs按照相同数量接种于上室，12小时后将膜上细胞固定，并经DAPI染色去除膜上室内壁细胞后观察统计过膜的细胞数量。

结果如图7，A为transwell实验后DAPI染色图，Wip1敲除BMMSCs和野生型BMMSCs按照相同数量接种于膜上室，上室为无血清，培养箱培养12小时后细胞固定染色。该实验进行5次独立实验，**:p<0.01，比例尺为100微米；B为两种基因型BMMSCs通过transwell膜细胞数量比。

通过transwell实验可以看出，敲除Wip1的BMMSCs过膜数量超过野生型两倍多。

综上两种实验证明敲除Wip1后transwell的迁移能力能到了显著提高。

3、Wip1敲除后引起骨髓MSCs迁移能力变化的信号通路检测

(1)检测Wip1敲除后Rac1活性的变化

Rho家族蛋白在细胞迁移中所扮演着重要的作用，其中Rac1活性是非常重要的。

将三代Wip1^-/-的BMMSCs和Wip1-WT的BMMSCs进行Rac1活性鉴定：

①细胞裂解液浓度测定：

1)将无血清培养3h的BMMSCs培养板置于冰上，用预冷的1mL的PBS反复冲洗2遍后静置1min，吸取剩余的PBS。

2)每孔加入蛋白裂解液100μL(含1mM蛋白酶抑制剂)反复吹吸后将裂解液收集置于1.5ml的EP管中冰上裂解10min，每5min漩涡震荡10s以使细胞充分裂解。

3)最后4℃，12000rpm离心10min，收集分装上清。

4)按照检测试剂盒使用说明，吸取10μl细胞裂解液于96孔板中，加入试剂盒中蛋白分析试剂290μl。静置1min后于600nm检测吸光OD值，除去空白值后换算成浓度值。

②活性检测步骤：

1)分装120μL裂解液/对照组培养基于PCR管中，置于冰上，作为空白对照

2)将24μL阳性蛋白液与96μL裂解液混合置于PCR管中置于冰上，作为阳性对照。

3)按需要将Elisa检测板条从封口袋中取出，固定于检测架上，置于冰上。其余板条放回原封口袋4℃保存。

4)向板条中各孔加入100μL冰预冷的ddH₂O。

5)将-80℃保存的蛋白裂解液。

6)彻底去除板条中的水分(将板条倒扣滤纸上，用手轻轻拍打5-7次)。

7)将板架置于冰上，向各板孔中迅速滴加50μL检测液，对照与实验组重复孔需2-3个。

8)将整个检测板置于4℃环境，蛋白裂解液为300rpm振荡30min；细胞培养上清液为室温孵育2h。

9)配置检测因子一抗稀释液。

10)振荡完毕后，吸取板孔中的检测液，加入400μL漂洗液漂洗三次，漂洗完毕后同步骤⑥。

11)向板条中加入200μL抗原呈递缓冲液，室温孵育2min。

12)孵育完毕后，吸出缓冲液，加入400μL漂洗液漂洗三次，漂洗完毕后同步骤⑥。

13)向各板孔中加入50μL检测因子一抗稀释液，室温下300rpm振荡45min。

14)按照检测需求稀释二抗。

15)吸出一抗稀释液，加入400μL漂洗液漂洗三次，漂洗完毕后同步骤⑥。

16)向板条各孔加入50μL二抗稀释液，室温下300rpm振荡45min。

17)配置HRP检测试剂，将A液和B液按照1：1比例混合，避光保存。

18)吸出二抗稀释液，加入400μL漂洗液漂洗三次，漂洗完毕后同步骤⑥。

19)向板条各孔中加入50μL配置好的HRP检测试剂，避光室温孵育20min。

20)向板条各孔中加入50μL HRP终止反应液，避光静置1min。

21)降检测板置于酶标仪上，用490nm检测溶液吸光OD值，检测温度为37℃。

结果如图8A所示，两种基因型BMMSCs无血清培养6小时候后，通过ELISA实验测得Rac1活性比，该实验进行三次独立实验，敲除Wip1后BMMSCs的Rac1活性升高(**:p<0.01)。

(2)检测PI3K/AKT通路与Rac1活性的关系

两种基因型BMMSCs无血清培养基中加入PI3K/AKT通路抑制剂LY294002(100μM)培养6h后，同上述步骤检测Rac1活性，该实验进行三次独立实验，结果如图8B所示，加入抑制LY294002后两种基因型BMMSCs的Rac1活性均降低(**:p<0.01)。

(3)检测Wip1是否通过PI3K/AKT/Rac1通路调控MSCs迁移

为了鉴定Rac1活性与迁移的情况，结合transwell实验，在上室分别加入PI3K/AKT通路抑制剂LY294002(100μM)与Rac1抑制剂(NSC23766，100μM)6小时后经DAPI染色观察细胞穿膜情况，结果进行5次独立实验，比例尺为100微米，**:P<0.01。

结果如图9A、B，结果显示，加入PI3K/AKT通路抑制剂和Rac1抑制剂后两种基因型BMMSCs迁移能力都受到了抑制。说明Rac1活性和BMMSCs迁移能力是正相关的。

(4)检测Wip1调控AKT与pAKT表达情况

在细胞迁移的研究中PI3K/AKT信号通路扮演着主要的作用，研究该通路是研究细胞迁移的通路之一。

为此提取第三代Wip1^-/-的BMMSCs和Wip1-WT的BMMSCs的总蛋白，通过westernblot检测总的AKT及磷酸化AKT的表达情况。

结果如图9C，结果表明无论是总的AKT还是磷酸化AKT/AKT，敲除Wip1后这两者表达量都较野生型高，灰度分析数据如柱状图9D。C为两种基因型BMMSCs通过westernblot分析AKT及AKT两种磷酸化蛋白的表达量。D为两种基因型BMMSCs所表达的磷酸化AKT与AKT总蛋白比值柱状图。该实验进行三次独立实验，*:P<0.05，**:P<0.01。

综上四个实施方案，得出结论Wip1通过PI3K/AKT/Rac1通路来调控BMMSCs的迁移能力，即当敲除Wip1后BMMSCs促进了pAKT/AKT表达及Rac1活性，从而提高了BMMSCs的迁移能力。

4、检测Wip1敲除后BMMSCs肌动蛋白丝的排列及丝状伪足的形成

Rac1活性的变化会引起细胞伪足的形成，细胞伪足的形成直接反映细胞迁移能力的大小，因此观察细胞骨架的重排及丝状伪足的形成对细胞迁移具有更直观的反映。

将第三代Wip1^-/-的BMMSCs和Wip1-WT的BMMSCs饥饿6小时后固定，用罗丹明-鬼笔环肽对肌动蛋白进行染色，如图10A、B，A、B为通过罗丹明鬼笔环肽染色后经激光共聚焦显微镜观察的两种基因型细胞形态。比例尺为100微米。

放大相同的倍数后观察丝状伪足的形成情况，Wip1敲除的BMMSCs形成了丰富的丝状伪足，野生型几乎没有形成。如图10C、D，C、D为相同放大倍数下观察两种基因型BMMSCs丝状伪足的形态。

放大相同的倍数观察细胞骨架激动蛋白重排的情况，结果如图10E和F所示，E、F为相同放大倍数下观察两种基因型BMMSCs肌动蛋白丝的重排，发现敲除Wip1的BMMSCs肌动蛋白出现“极化”样的重排，肌动蛋白丝集中清晰，而野生型肌动蛋白丝“极化”不明显，未有清晰集中的蛋白丝。

综上实施实验，说明Wip1敲除后促进BMMSCs迁移在细胞形态上直接反应是引起了肌动蛋白的重排，促进丝状伪足的形成。

Claims (4)

1.敲除动物Wip1基因的物质在制备具有促进动物BMMSCs迁移功能的产品中的应用；

Wip1基因的核苷酸序列为序列表中序列1。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述促进动物BMMSCs迁移体现在提高动物BMMSCsRac1活性、促进PI3K/AKT表达和/或促进动物BMMSCs丝状伪足的形成。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述动物为小鼠。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述产品为药物。