CN105727295B - Wip1抑制剂的医学用途 - Google Patents

Abstract

本申请提供了野生型p53诱导的磷酸酶1(Wip1)抑制剂在制备用于治疗个体中与Th9细胞分化和发育相关的疾病的药物中的用途。

Description

Wip1抑制剂的医学用途

发明领域

本申请大体涉及生物医学领域。具体而言，本申请涉及以蛋白磷酸酶为靶点的生物医学研究和应用。

发明背景

野生型p53诱导的磷酸酶1(Wip1，也称为PP2Cδ或PPM1D)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，属于2Cδ型蛋白磷酸酶。目前有研究表明，Wip1是一种致癌基因，并可能成为癌症的治疗靶点。此外，Wip1在造血系统中的作用也逐渐得到关注。除了上述之外，Wip1是否参与其他疾病的发生和发展还少有报道。

发明概述

第一方面，本申请提供了野生型p53诱导的磷酸酶1(本文中简称为“Wip1”)抑制剂在制备用于治疗个体中与Th9细胞分化和发育相关的疾病的药物中的用途。

在一些实施方案中，Wip1抑制剂为Wip1的特异性抑制剂。

在一些实施方案中，Wip1抑制剂为Wip1表达抑制剂、Wip1活性抑制剂、或同时能抑制Wip1的表达和活性的抑制剂。

在一些实施方案中，Wip1抑制剂为能作用于Wip1的转录和/或翻译水平从而降低生成的功能性Wip1的量的抑制剂。

在一些实施方案中，Wip1抑制剂包括，但不限于，dsRNA、microRNA、siRNA、shRNA、反义RNA或核酶。

在一些实施方案中，Wip1抑制剂为能抑制Wip1的酶活性的抑制剂。

在一些实施方案中，Wip1抑制剂包括，但不限于，Wip1抗体或其抗原结合片段、与Wip1天然底物竞争性结合Wip1的类似物、小分子化合物。

在一些实施方案中，Wip1抑制剂为CCT007093(Sigma-Aldrich)。

在一些实施方案中，所要治疗的疾病的特征为在疾病进程中Th9细胞发生分化和发育。

在一些实施方案中，所要治疗的疾病为过敏性疾病。

在一些实施方案中，所要治疗的疾病包括，但不限于，过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎和食物过敏。

第二方面，本申请提供了治疗个体中与Th9细胞分化和发育相关的疾病的方法，包括向有需要的个体给予野生型p53诱导的磷酸酶1(Wip1)抑制剂。

第三方面，本申请提供了包含野生型p53诱导的磷酸酶1(Wip1)抑制剂的药物组合物，其用于治疗个体中与Th9细胞分化和发育相关的疾病。

第二或第三方面的具体技术特征和实施方案可参考上述关于第一方面的描述。

序列简要说明

SEQ ID NO:1-4为鉴定Wip1敲除小鼠的引物序列。

SEQ ID NO:5-6为荧光定量PCR中扩增IL-9所用的正向和反向引物。

SEQ ID NO:7-8为荧光定量PCR中扩增IFN-γ所用的正向和反向引物。

SEQ ID NO:9-10为荧光定量PCR中扩增IL-4所用的正向和反向引物。

SEQ ID NO:11-12为荧光定量PCR中扩增IL-17A所用的正向和反向引物。

SEQ ID NO:13-14为荧光定量PCR中扩增FoxP3所用的正向和反向引物。

SEQ ID NO:15-16为荧光定量PCR中扩增T-box21所用的正向和反向引物。

SEQ ID NO:17-18为荧光定量PCR中扩增GATA3所用的正向和反向引物。

SEQ ID NO:19-20为荧光定量PCR中扩增RORC所用的正向和反向引物。

SEQ ID NO:21-22为荧光定量PCR中扩增IL-5所用的正向和反向引物。

SEQ ID NO:23-24为荧光定量PCR中扩增IL-13所用的正向和反向引物。

SEQ ID NO:25-26为荧光定量PCR中扩增IL-2所用的正向和反向引物。

SEQ ID NO:27-28为荧光定量PCR中扩增IL-21所用的正向和反向引物。

SEQ ID NO:29-30为荧光定量PCR中扩增IRF4所用的正向和反向引物。

SEQ ID NO:31-32为荧光定量PCR中扩增BCL6所用的正向和反向引物。

SEQ ID NO:33-34为荧光定量PCR中扩增BATF所用的正向和反向引物。

SEQ ID NO:35-36为荧光定量PCR中扩增Muc5ac所用的正向和反向引物。

SEQ ID NO:37-38为荧光定量PCR中扩增Mcpt1所用的正向和反向引物。

SEQ ID NO:39-40为荧光定量PCR中扩增HPRT所用的正向和反向引物。

附图简要说明

图1显示了野生型(WT)和Wip1敲除(Wip1KO)的初始CD4⁺T细胞的Th细胞亚群的活化和分化。

(A)用细胞培养板提前包被结合的抗CD3(2μg/ml)和可溶性的抗CD28(2μg/ml)抗体刺激72h的经过CFSE标记的WT和Wip1KO CD4⁺T细胞中的CFSE稀释，总结了两种细胞的增殖能力(无显著差异)(右)。用细胞培养板提前包被结合的抗CD3(2μg/ml)和可溶性的抗CD28(2μg/ml)刺激72h的WT和Wip1KO的初始CD4⁺T细胞的激活相关标志物CD25(B)和CD69(C)的表面表达，并总结了CD4⁺CD25⁺和CD4⁺CD69⁺细胞的百分比(右)。(D)在Th1细胞诱导(Th1-skewing)条件下被刺激72h的WT和Wip1KO小鼠的受诱导的Th1细胞中的IFN-γmRNA的表达。(E)Th1诱导条件下刺激5d的初始CD4⁺T细胞中的CD4⁺IFN-γ⁺T细胞的百分比。(F)Th2诱导条件下刺激72h的WT和Wip1KO小鼠的受诱导的Th2细胞中的IL-4mRNA的表达。(G)在Th2诱导条件下培养5d的初始CD4⁺T细胞中的CD4⁺IL-4⁺T细胞的百分比。(H)在Th17诱导条件下72h的WT和Wip1KO小鼠的Th17细胞中的IL-17mRNA的表达。(I)在Th17诱导条件下培养5d的初始CD4⁺T细胞中的CD4⁺IL-17⁺T细胞的百分比。(J)在iTreg偏移条件下48h的WT和Wip1KO小鼠的iTreg细胞中的Foxp3mRNA的表达。(K)在iTreg诱导条件下刺激3d后的初始CD4⁺T细胞的iTreg特异性转录因子Foxp3的表达。数据显示为平均值±标准差(n＝3)，代表了三个独立实验中的一个实验。与WT细胞相比，*P<0.05。

图2显示了证明Wip1对于体外Th9细胞分化是必要的实验结果。

(A)在Th9诱导条件下，使用不同剂量的IL-4的培养48h后的WT和Wip1KO小鼠的初始CD4⁺T细胞中的IL-9、IL-4、IL-5、IL-13mRNA的表达。(B)如A图，在相同的Th9诱导条件下培养的WT和Wip1KO小鼠的初始CD4⁺T细胞的培养基中的IL-9的水平。(C)用抗-CD3和抗-CD28仅加培养基或TGF-β加不同浓度的IL-4分化的CD4⁺T细胞72h的IL-9的细胞内染色，总结了CD4⁺IL-9⁺细胞的百分比(右)。(D)在Th9诱导条件下培养不同时间(0-3d)的初始WT和Wip1KO CD4⁺T细胞的IL-9mRNA的表达。(E)在Th9诱导条件下培养72h的CD4⁺T细胞中的IL-9和Foxp3的细胞内染色。(F)使用不同浓度的Wip1抑制剂，在Th9诱导条件下培养48h的初始WT CD4⁺T细胞的IL-9mRNA的表达。(G)使用Wip1抑制剂(5μM)，在Th9诱导条件下分化72h的CD4⁺T细胞中的IL-9的细胞内染色，示出了总结的IL-9⁺T细胞的百分比(右)。数据表示为平均值±标准差(n＝3)，代表了三次独立实验中的一次实验。与WT细胞或对照相比，**P<0.01和***P<0.001。

图3显示了证明Wip1通过抑制JNK-c-Jun/c-Fos通路，在Th9细胞分化中调节IL-9mRNA和蛋白表达的实验结果。

(A)在Th9诱导条件下不同时间点(0-120分钟)的来自WT和Wip1KO小鼠的初始CD4⁺CD44^-CD62L⁺细胞中的p-STAT6、STAT6、p-Smad3、Smad3、p-p38、p38、p-STAT5、STAT5、p-STAT1、STAT1、p-JNK、JNK、p-c-Jun、c-Jun和β-肌动蛋白的免疫印迹分析。(B)在Th0或Th9条件下不刺激或刺激24h的初始WT和Wip1KO CD4⁺T细胞的核蛋白中的Rel-B、p65和H3的免疫印迹分析。(C)在Th9诱导条件下用(+)或不用(-)JNK特异性抑制剂(SP600125，Sigma-Aldrich)处理指定时间(0-15分钟)的初始WT和Wip1KO CD4⁺细胞中的p-c-Jun、p-JNK、JNK和β-肌动蛋白的免疫印迹分析。(D)在Th9诱导条件下用(+)或不用(-)JNK特异性抑制剂(SP600125，Sigma-Aldrich)处理48h的初始WT和Wip1KO CD4⁺细胞的IL-9mRNA表达。(E)流式细胞术检测细胞内的IL-9蛋白表达(左)并总结了IL-9⁺CD4⁺细胞的百分比(右)。(F)通过ELISA检测细胞培养上清液中的IL-9表达水平。(G)在Th9诱导条件下刺激初始CD4⁺T细胞24h，然后使用如本方法所述的抗-c-Jun单克隆抗体进行ChIP分析。(H)用有活性的c-Jun和c-Fos过表达质粒与含有IL-9启动子区的荧光素酶报告基因质粒和海肾荧光素酶载体一起转染HEK 293T细胞。24h后裂解细胞并进行双荧光素酶的活性检测。数据显示为平均值±标准差(n＝3)，代表至少两个独立实验中的一个实验。与对照或在指定组之间相比，***P<0.001。

图4显示了证明Wip1缺陷型小鼠能抵抗过敏性哮喘的实验结果。

(A)在对照和OVA诱导的过敏性哮喘模型(每组n＝4-6)中，WT和Wip1KO小鼠的血清中的IgE水平。(B)在最后一次雾化吸入OVA后48h，取WT和Wip1KO小鼠的肺组织上进行过碘酸希夫试剂(PAS)染色。原始放大倍数，×100。WT和Wip1KO小鼠的肺泡灌洗液(BALF)中的细胞的(C)Muc5ac和(D)Mcpt1mRNA表达。(E)示出了WT和Wip1KO小鼠的肺组织的H&E染色和肺泡灌洗液中的WT和Wip1KO小鼠的细胞数。原始放大倍数，×100。(F)通过流式细胞术检测WT和Wip1KO的肺泡灌洗液中的嗜酸性粒细胞的百分比(左)，并总结了嗜酸性粒细胞的百分比(右)。(G)过敏性哮喘模型中来自WT和Wip1KO小鼠(每组n＝4-6)的肺泡灌洗液各种免疫细胞的数目。(H)WT和Wip1KO小鼠的肺泡灌洗液中的细胞中的IL-9mRNA表达。用OVA刺激3d的WT和Wip1KO小鼠(每组n＝4-6)的脾细胞中的(I)IL-9mRNA表达和(J)细胞内的IL-9染色。数据代表两个或三个独立实验。与WT小鼠相比，***P<0.001。

图5显示了证明Wip1抑制剂显著减轻了体内过敏性哮喘的病理学进程的实验结果。

(A)在如本方法所述的过敏性哮喘模型中，用PBS缓冲液(含与Wip1抑制剂等量的DMSO溶剂)和Wip1抑制剂(DMSO溶解)处理的WT小鼠的肺组织的H&E染色。原始放大倍数，×50(顶行)或×100(底行)。(B)在过敏性哮喘模型(每组n＝4-6)中，对照组或Wip1抑制剂处理组的小鼠的肺泡灌洗液中的总细胞数。(C)通过流式细胞术检测用PBS缓冲液和Wip1抑制剂处理的小鼠的肺泡灌洗液中的嗜酸性粒细胞的百分比，并采用柱状图示出了嗜酸性粒细胞的百分比和细胞数(右)。(D)在过敏性哮喘模型(每组n＝4-6)中，用PBS缓冲液和Wip1抑制剂处理的小鼠血清中的IgE表达。(E)在过敏性哮喘模型中，用Wip1抑制剂处理的小鼠肺组织的PAS染色。原始放大倍数，×50(顶行)或×100(底行)。用PBS缓冲液和Wip1抑制剂处理的过敏性哮喘小鼠的肺泡灌洗液中的Mucin5ac(F)、Mcpt1(G)和IL-9(H)的mRNA表达。(I)用ELISA检测过敏性哮喘模型中用PBS缓冲液和Wip1抑制剂处理的小鼠肺组织匀浆中的IL-9水平。(J)用PBS缓冲液和Wip1抑制剂(每组n＝4-6)处理的过敏性哮喘小鼠的引流淋巴结中的CD4⁺T细胞的IL-9表达。用OVA刺激T细胞3d，然后通过流式细胞术检测细胞内的IL-9。数据(平均值±标准差)代表了两个或三个独立实验中的一个实验。与对照小鼠相比，*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。

发明的详细描述

本申请的各项发明至少部分是基于下述发现：Wip1参与Th9细胞的分化和发育，Wip1缺陷或抑制能延缓或阻止Th9细胞介导的一些病理学进程，例如过敏性疾病的发展和症状。

因此，在第一方面，本申请提供了野生型p53诱导的磷酸酶1(Wip1)抑制剂在制备用于治疗个体中与Th9细胞分化和发育相关的疾病的药物中的用途。

本文使用的术语“野生型p53诱导的磷酸酶1(Wild type p53-inducedphosphatase 1，Wip1，也称为PP2Cδ或PPM1D)”是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，属于2Cδ型蛋白磷酸酶。目前，已经鉴定出了来源于不同物种的Wip1，例如：人Wip1基因的基因登录号为NG_023265.1，NCBI链接为：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/8493；小鼠Wip1基因的基因登录号为：NC_000077.6，NCBI链接为：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/53892。

本文使用的术语“抑制”指Wip1的生物学作用产生负性影响的任何作用。通常，抑制为与对照相比时，Wip1的生物学作用减弱至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。本领域技术人员能够理解，由于Wip1属于一种蛋白磷酸酶，因此对Wip1的生物学作用的抑制可以包括使其在生物体内的表达量降低(包括转录水平或翻译水平)，也可以包括在Wip1参与的酶学反应中降低其酶学活性。

本文所用的术语“抑制剂”指能对Wip1的生物学作用产生负性影响的任何分子，例如，可通过干扰Wip1与另一分子(例如，其底物)的相互作用，或降低Wip1的蛋白水平，例如通过降低编码Wip1的基因的表达。抑制剂可为“直接的抑制剂”，其与Wip1或其结合伴侣或编码Wip1的核酸相互作用，或者“间接的抑制剂”，其不与Wip1或其结合伴侣或编码Wip1的核酸相互作用，但与调控通路中Wip1的上游或下游相互作用。

在一些实施方案中，Wip1抑制剂为Wip1的特异性抑制剂。本领域技术人员能够理解，虽然利用Wip1的特异性抑制剂是比较理想的，但是根据具体情况(例如，在某些环境下，对其他可能的蛋白磷酸酶产生抑制并不会明显影响生物体时)，使用多功能或通用型蛋白磷酸酶抑制剂也是可选的。

如上文所讨论的，Wip1抑制剂可以为Wip1表达抑制剂、Wip1活性抑制剂、或同时能抑制Wip1的表达和活性的抑制剂。

在一些实施方案中，Wip1抑制剂为能作用于Wip1的转录和/或翻译水平从而降低生成的功能性Wip1的量的抑制剂。在一些相关实施方案中，Wip1抑制剂包括，但不限于，dsRNA、microRNA、siRNA、shRNA、反义RNA或核酶。利用RNA干扰/沉默技术、反义核酸技术或核酶技术降低目标蛋白的表达水平是本领域技术人员所公知的，并且根据目标蛋白(例如，Wip1)的序列结构设计出合适的dsRNA、microRNA、siRNA、shRNA、反义RNA或核酶分子以及相应的制备和测试检验也是本领域技术人员容易实现的。

在一些实施方案中，Wip1抑制剂为能抑制Wip1的酶活性的抑制剂。在一些相关实施方案中，Wip1抑制剂包括，但不限于，Wip1抗体或其抗原结合片段、与Wip1天然底物竞争性结合Wip1的类似物、小分子化合物。

可用于本申请的抗体可包括多克隆抗体或单克隆抗体。此外，抗体可为来源于天然来源或来自重组来源的整个免疫球蛋白。抗体可以各种形式存在，包括例如作为整个抗体，或作为抗体片段，或它们的其他免疫活性片段如互补决定区。类似地，抗体可作为具有功能性抗原结合结构域，即重链和轻链可变域的抗体片段存在。同样，抗体片段可以选自但不限于如下的形式存在：Fv、Fab、F(ab)2、scFv(单链Fv)、dAb(单结构域抗体)、双特异性抗体、双链抗体和三链抗体。

一类比较常见的酶抑制剂是酶的底物类似物，其能够与酶的天然底物竞争性地结合酶的活性位点，从而降低酶学反应的效率。

小分子化合物也是酶抑制剂的常见种类，其抑制酶活的机制有多种。例如，小分子化合物可以渗透入酶的活性中心或活性结构域，干扰酶的正常作用。磷酸酶抑制剂的小分子化合物的非限制性实例包括钒酸钠、焦磷酸钠、β磷酸甘油等。

作为Wip1特异性抑制剂的一个实例，可以使用CCT007093(Sigma-Aldrich)，其结构如下所示：

本文所用的术语“Th9细胞”指能够产生白介素-9的CD4⁺辅助性T细胞(Interleukin 9(IL-9)-producing CD4⁺helper T cells)，是辅助性T细胞中的一个亚类。有研究表明，Th9的分化和发育促进某些炎症介质的释放，并且Th9参与的信号通路调控与某些疾病的发展有关，例如过敏性疾病(参见，例如，“Th9and allergic disease”,PejmanSoroosh et al.,Immunology,127,450–458,2009和“The development and in vivofunction of T helper 9cells”,Mark H.Kaplan et al.,Nature Reviews Immunology,2015)，通过引用的方式将以上两篇文献全文并入本文。

在一些实施方案中，所要治疗的疾病的特征为在疾病进程中Th9细胞发生分化和发育，由此使用Wip1抑制剂影响Th9细胞的分化和发育。

如上文所提及(例如，Pejman Soroosh et al.,同上)，Th9细胞参与过敏性疾病的发展，因此，在一些实施方案中，所要治疗的疾病为过敏性疾病，包括，但不限于，过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎和食物过敏。

本文所用的术语“个体”包括哺乳动物，例如人或非人哺乳动物。示例性的个体包括但不限于：灵长类、牲畜(例如，绵羊、母牛、马、猴、猪)、实验室测试动物(例如，兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、宠物(例如，猫、狗)等。

第二方面，本申请提供了治疗个体中与Th9细胞分化和发育相关的疾病的方法，包括向有需要的个体给予野生型p53诱导的磷酸酶1(Wip1)抑制剂。

第三方面，本申请提供了包含野生型p53诱导的磷酸酶1(Wip1)抑制剂的药物组合物，其用于治疗个体中与Th9细胞分化和发育相关的疾病。

第二或第三方面的具体技术特征和实施方案可参考上述关于第一方面的描述。

应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。

实施例

以下实施例仅以说明性而非限制性的方式提供。本领域技术人员将容易地认识到能被改变或修改多个非关键性的参数以产生基本相同或相似结果。

材料和方法

Wip1敲除(KO)小鼠

Wip1敲除(KO)小鼠由卫生部人类疾病比较医学重点实验室(北京，中国)提供。本申请的发明人将Wip1KO小鼠回交至C57BL/6背景。将所有小鼠饲养于中国科学院动物研究所的无特定病原体的动物设施中。主要使用8-12周的性别匹配的同窝小鼠进行实验。Wip1敲除小鼠的鉴定引物序列见下表：

体外诱导CD4⁺的初始T细胞分化为CD4⁺T细胞亚群

通过MoFlo XDP(Beckman Coulter)流式细胞分选仪或CD4⁺初始T细胞磁珠分选试剂盒(STEM CELL)，分选WT或Wip1KO小鼠脾脏中的的CD4⁺的初始T细胞(CD4⁺CD44^-CD62L⁺)。用提前与细胞培养板结合的抗-CD3抗体(2μg/ml；145-2C11；R&D Systems)和可溶性的抗-CD28抗体(2μg/ml；37.51；BD Biosciences)刺激活化CD4⁺的初始T细胞(在96孔板中1×10⁶个细胞/ml)并培养于Th9诱导条件(IL-4：20ng/ml，R&D Systems；TGF-β：2ng/ml，R&DSystems；和IFN-γ中和抗体：10mg/ml，XMG1.2，eBioscience)；Th2诱导条件(IL-4：20ng/ml，R&D Systems；和IFN-γ中和抗体：10mg/ml，XMG1.2，eBioscience)；Th1诱导条件(IL-12：10ng/ml；PeproTech；IL-2：100U/ml，PeproTech；和IL-4中和抗体：10mg/ml，11B11，eBioscience)；Th17诱导条件(TGF-β：1ng/ml，R&D Systems；IL-6：50ng/ml，R&D Systems；IFN-γ中和抗体：10mg/ml，XMG1.2，eBioscience；IL-4中和抗体：10mg/ml，11B11，eBioscience；和IL-2中和抗体：10mg/ml，JES6-1A12，eBioscience)；和Treg诱导条件(TGF-β：1ng/ml，R&D Systems；IL-2：100U/ml，PeproTech)下。3天或在分化的指定时间点后，通过细胞内染色和实时定量PCR评估细胞极化。

流式细胞术

细胞培养3-5天后，用PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯；50ng/ml)、离子霉素(500ng/ml；Sigma-Aldrich)于37℃刺激细胞5小时并在刺激最后的3h时将莫能霉素(Golgi-stop)(BD Pharmingen)加入到细胞中。根据制造商提供的方法(BD Bioscience)用细胞固定/透化缓冲溶液进行细胞内细胞因子染色。使用荧光标记的抗-小鼠IL-9(RM9A4；Biolegend)、抗-小鼠IL-4(11B11；eBioscience)、抗-小鼠IL-17A(TC11；Biolegend)、抗-小鼠IFN-γ(XMG1.2；Biolegend)和抗-小鼠Foxp3(NRRF-30；eBioscience)进行染色。根据制造商提供的方法(eBioscience)用细胞固定/透化缓冲溶液进行细胞核内Foxp3的染色。在FACS Calibur(BD Bioscience)或Epics XL(Beckman Coulter)流式细胞仪上进行检测并使用FCS Express 3软件对检测结果进行分析。

实时定量PCR

使用细胞总RNA提取试剂盒(Promega)从培养的细胞中提取总RNA，并用cDNA逆转录试剂盒(Takara)合成cDNA。使用Power

PCR Master Mix(Applied Biosystems)在CFX96实时系统(Bio-Rad)中进行实时定量PCR检测。每个基因检测设置三个复孔，同时每个96孔板包括两个阴性对照(NTC)。表1中总结了本研究中使用的引物。检测结果使用比较Ct法进行分析并以持家基因HPRT进行标准化。荧光定量PCR中所使用的引物序列见下表：

ELISA

根据ELISA试剂盒(eBioscience)制造商提供的方法测定肺组织的细胞培养物上清液和匀浆中的IL-9的蛋白含量。

诱导小鼠过敏性哮喘模型

在第0天和第14天给予8-10周的小鼠腹腔注射1mg的氢氧化铝(Sigma-Aldrich)和10μg的卵清蛋白(OVA，Sigma-Aldrich)的混合液体(PBS溶解)进行免疫致敏。自第21天，将小鼠暴露于雾化的OVA(1％w/v)中，每天30分钟，连续5-6天。最后一次雾化吸入OVA后48h，将小鼠处死。为了评估Wip1抑制剂(CCT007093，Sigma-Aldrich)对小鼠过敏性哮喘模型中的作用，从第20天至第24天的5天中，向小鼠腹腔注射Wip1抑制剂(2.5mg/ml，每只小鼠25μl)，对照组注射含有相同剂量的二甲基亚砜(DMSO)的PBS溶液。

将导管插入气管并用3ml的PBS灌洗肺。用细胞计数板计算肺泡灌洗液中的细胞数。用小鼠的抗CD11b(M1/70，eBioscience)、抗Siglec F(E50-2440，BD Pharmingen)、抗Ly6G(1-A8，BD Biosciences)、抗CD3e(145-2C11，eBioscience)、抗B220(RA3-6B2，Biolegend)和抗F4/80(BM8，eBioscience)的抗体对肺泡灌洗液中的细胞进行染色并通过流式细胞仪分析肺泡灌洗液中的细胞。对肺泡灌洗液中细胞提取的RNA进行实时定量PCR分析。用OVA(100μg/ml)刺激脾细胞72h后检测IL-9的mRNA的表达。取过敏性哮喘模型中的小鼠的肺脏组织，在固定液中固定后，采用石蜡包埋并切片，然后用苏木精和伊红染色(H&E)和过碘酸-雪夫试剂(PAS)染色以评估肺脏组织中炎性细胞的浸润以及肺脏支气管中粘蛋白的产生。

免疫印迹

在含10％的FBS的1640培养基中培养CD4⁺的初始T细胞。刺激后，用冷的PBS洗涤细胞一次并用RIPA细胞裂解液(50mM Tris-HCl pH 7.4，1％NP-40，0.25％Na-脱氧胆酸盐，150mM NaCl，1mM EDTA pH7.4，含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂)在冰上裂解10分钟。用BCA分析确定蛋白质浓度。将裂解物与5×SDS-PAGE上样缓冲液混合并在100℃下煮沸5分钟。用10％的SDS-PAGE电泳并转移至PVDF膜上(Millipore，CA)。封闭1h后，然后于4℃用一抗孵育过夜。然后加入合适的HRP标记的二抗，并通过化学发光(Millipore)进行检测。使用β-actin蛋白作为内参对照。磷酸化的STAT6(Tyr641)、STAT6、磷酸化的Smad3(Ser423/425)、Smad3、磷酸化的p38MAPK(Thr180/Tyr182)、P38、磷酸化的STAT5(Tyr694)、STAT5、磷酸化的STAT1(Ser727)、STAT1、磷酸化的SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)、SAPK/JNK、磷酸化的c-Jun(Ser73)、c-Jun、Rel-B、NF-κB p65、β-actin和组蛋白H3均购自CST公司。

荧光素酶分析

用正向引物(5'-TCGacgcgtGATGACCTGTGACCTGAC-3')和反向引物(5'-TCCcccgggCAGAGGCAAGGATGTATGT-3')通过PCR从小鼠基因组DNA中扩增小鼠的IL-9启动子区(-2162至+28)。引物中的小写字母是引入的Mlu I和Sma I位点，将其连接到pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体中。使用脂质体2000(Invitrogen)将报告载体与含有编码小鼠c-Jun和c-Fos的cDNA的表达质粒以及作为内参对照的pRL-TK载体(Promega)一同转染HEK293T细胞。24h后，通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega)来检测IL-9的启动子的活性。

ChIP分析

通过磁珠分选试剂盒(Stem Cell)分选小鼠脾脏中的CD4⁺CD44^-CD62L⁺的初始T细胞并以每孔1×10⁶个细胞的密度进行培养。在Th9诱导(Th9-skwing)条件刺激24h后，收集细胞，然后于室温用1％的甲醛(Sigma-Aldrich)交联10分钟并于裂解液中裂解。将裂解物进行超声处理，随后用抗-c-Jun(Abcam)、对照IgG(Abcam)进行沉淀。之后进行解交联，用苯酚和氯仿提取与抗体结合的DNA，然后采用正向引物(5'-AGAACCCGACTATTTGAAGAGCATC-3')和反向引物(5'-CTCAGTCTACCAGCATCTTCCA-3')通过实时定量PCR进行分析与抗c-Jun抗体结合的DNA的量。

统计分析

所有数据均显示为平均值±标准差。使用非配对双尾学生t检验分析只含有两组均值的数据。使用SAS 9.2版的单向方差分析(ANOVA)检测含有多组均值的数据。当P值小于等于0.05时，认为组间具有统计学显著性差异。

实施例1.Wip1缺陷对Th1、Th2和Th17细胞的分化的影响

为了研究Wip1在辅助性T(Th)细胞亚型发育中的参与度，发明人采用Wip1KO(knock out，敲除)小鼠，并首先分析Wip1是否参与初始T细胞的活化和增殖。如材料和方法中所述，体外使用抗-CD3/抗-CD28mAb刺激Wip1缺陷型和WT小鼠脾脏中分选的CD4⁺的初始T细胞。如图1所示，通过CFSE标记分析(P>0.05，图1A)确定T细胞活化后，初始Wip1缺陷型CD4⁺T细胞的增殖与WT细胞类似。与细胞增殖一致，在使用抗-CD3/抗-CD28mAb刺激后，Wip1KO和WT初始CD4⁺T细胞显示出类似比例的细胞活化标记物如CD25和CD69分子(P>0.05，图1B、C)。因此，这些数据表明，在细胞增殖和活化标记物表达方面，Wip1小鼠脾脏中的CD4⁺的初始T细胞与WT小鼠没有差异。

其次，发明人使用如材料和方法中所述的标准的体外诱导不同辅助性T(Th)细胞亚型的条件来探索Wip1在CD4⁺T细胞发育分化中的作用。通过实时定量PCR和流式细胞仪检测分析细胞因子细胞内染色，Wip1缺陷型小鼠的初始CD4⁺T细胞分化成Th1、Th2和Th17细胞的能力分别与初始WT CD4⁺T细胞的分化能力没有差异(P＞0.05，图1D-I)。然而，实时定量PCR分析表明，与WT小鼠的初始CD4⁺T细胞相比，Wip1缺陷型小鼠的初始CD4⁺T细胞iTreg分化体系下，能够检测到更高的Foxp3mRNA表达(P<0.05，图1J)。这一观察结果进一步得到如下结果的支持：体外使用抗-CD3/CD28mAb和TGF-β培养Wip1缺陷型小鼠和WT小鼠的初始CD4⁺T细胞后，与WT CD4⁺T细胞相比，Wip1缺陷型小鼠CD4⁺T细胞中的Foxp3⁺T细胞的百分比增加了(P<0.05，图1K)。因此，除了轻微影响CD4⁺Foxp3⁺iTreg细胞，Wip1不会本质上影响体外Th1、Th2和Th17细胞的分化。

实施例2.Wip1控制Th9细胞的分化和发育

在本实施例中，发明人研究了Wip1对Th9细胞发育分化的影响。用抗-CD3/抗-CD28mAb活化Wip1缺陷型小鼠和WT小鼠的初始CD4⁺T细胞，并在TGF-β和不同浓度的IL-4条件下诱导Th9细胞时，WT小鼠的初始CD4⁺T细胞表达了高水平的IL-9和低水平的IL-4、IL-5和IL-13(Th9条件下基本不表达IL-4，IL-5，IL-13)。然而，与WT小鼠的CD4⁺T细胞相比，经诱导分化的Wip1缺陷型小鼠的初始CD4⁺T细胞表达了显著更少水平的IL-9和甚至更低的IL-4、IL-5和IL-13(基本不表达)(p<0.001，图2A)。经诱导的Wip1缺陷型小鼠的CD4⁺T细胞中IL-9表达的减少进一步由ELISA所指示的培养基中IL-9的浓度的降低所验证。同样，利用流式细胞仪器分析，发明人还观察到，与WT小鼠的细胞相比，Wip1缺陷型小鼠的CD4⁺T细胞中的IL-9⁺T细胞的百分比降低了(p<0.001，图2B、C)。此外，在培养的不同时间点都可以在Wip1缺陷型小鼠的CD4⁺T细胞中检测到IL-9mRNA的较低的表达(P<0.001，图2D)。另一方面，在Th9诱导体系下培养WT和Wip1KO小鼠的初始CD4⁺T细胞后，检测到类似的低水平的Foxp3⁺T细胞(图2E)。Th9诱导体系下，Wip1KO小鼠CD4⁺T细胞中低水平的IL-4、IL-5、IL-13和Foxp3分子表明，Wip1KO小鼠初始CD4⁺T细胞分化为Th9细胞的能力减弱并非由于其偏移分化成IL-4诱导的Th2细胞或TGF-β诱导的Foxp3⁺T细胞而造成的。此外，发明人研究了Wip1-特异性抑制剂CCT007093(Sigma-Aldrich)对体外Th9细胞分化的影响。CCT007093以剂量依赖的模式显著抑制IL-9mRNA表达(图2F)。CCT007093对IL-9表达的抑制效果进一步被通过流式细胞术测定的CD4⁺IL-9⁺T细胞的百分比降低所验证(P<0.01，图2G)。以上实验结果表明：Wip1以细胞自主的方式对Th9细胞的发育进行调控。

实施例3.Wip1通过JNK-c-Jun/c-Fos途径调控Th9细胞的发育

为了理解Wip1调节Th9细胞分化的分子机制，发明人分选WT小鼠和Wip1KO小鼠的初始CD4⁺的T细胞，在Th9细胞诱导条件下通过蛋白质印迹和实时定量PCR筛选了Wip1下游分子和与Th9细胞诱导相关的潜在细胞内分子。如相关蛋白分子及其磷酸化形式在细胞中的表达和相关蛋白分子在细胞核中的表达，在Th9诱导条件下WT小鼠的初始CD4⁺T细胞中Stat6、Stat5、Stat1、Smad3、p38MAPK、JNK、c-Jun、RelB和p65分子的活化增加了，说明这些蛋白分子可能参与到Th9细胞的发育分化过程中(图3A、B)。然而，在Th9诱导条件下，Wip1KO小鼠的CD4⁺T细胞比WT小鼠的细胞显示出更高的p38MAPK、Stat1、JNK和c-Jun的活化，而WT和Wip1KO小鼠的CD4⁺T细胞显示出类似的Stat6、Stat5、Smad3蛋白和NF-κB途径的活化(图3A、B)，这表明p38MAPK、Stat1、JNK和c-Jun途径可能参与到了Wip1KO小鼠初始CD4⁺的T细胞在Th9诱导条件下分化为Th9细胞的能力减弱。分别通过相应的抑制剂SB203580和甲硫腺苷(MTA)特异性抑制p38MAPK和Stat1，不能够增强Wip1KO小鼠初始CD4⁺的T细胞在Th9诱导条件下分化为Th9细胞的能力，即不能够回复Wip1KO Th9细胞的弱分化。因此，Wip1KO T细胞中增加的p38MAPK和Stat1活性可能不是引起Wip1KO Th9的细胞分化能力的减弱。此外，发明人发现在Th9诱导期间，WT和Wip1KO T细胞中JNK抑制剂SP600125降低了JNK的活化以及c-Jun的活化(图3C)。并通过实时定量PCR、细胞内染色和ELISA分析所测，JNK抑制剂SP600125显著回复了Wip1KO Th9的分化能力不足(P<0.001，图3D-F)。这些结果揭示了，Wip1通过其对JNK分子通路的抑制来调节Th9细胞的发育分化。JNK分子下游的靶分子为由c-Jun和c-Fos的AP-1分子，同时生物信息学预测IL-9的启动子区可能含有潜在的AP-1的结合位点。因此，发明人研究了AP-1是否能够直接结合至IL-9基因启动子且具有调节IL-9表达的能力。CHIP分析表明，在Th9诱导条件下，更多c-Jun结合至IL-9启动子(P<0.001，图3G)。利用双萤光素酶报告系统检测，在HEK 293T细胞中过表达不同量的c-Jun和c-Fos，均可以显著降低含有IL-9启动子区的的荧光素酶活性(P<0.001，图3G)。另一方面，在Th9诱导条件下，与WT小鼠的CD4⁺T细胞一样，Wip1KO小鼠的CD4⁺T细胞表达了相同水平的IRF-4、BATF和Bcl6(其对于Th9诱导是重要的)。上述现象提示，Wip1通过直接抑制-c-Jun/c-Fos(其在T细胞中受JNK激活)对IL-9基因的转录来调节Th9的细胞的发育分化。

实施例4.在哮喘模型中Wip1KO小鼠具有弱的过敏反应

如材料和方法所述，在OVA诱导的过敏性哮喘小鼠模型中，发明人观察了在Wip1！KO和WT同窝小鼠的哮喘的患病程度。在如通过ELISA分析测定，在WT同窝小鼠的血清中检测到显著较高的IgE水平(P<0.001，图4A)。然而在同样的条件下，Wip1KO小鼠几乎不能上调IgE水平(P<0.001，图4A)。肺组织的支气管中的粘蛋白的产生能反映过敏性哮喘的患病程度，并可以通过过碘酸-雪夫试剂(PAS)染色进行评估。在OVA诱导过敏性哮喘小鼠模型中，与WT小鼠相比，Wip1KO小鼠在肺组织中产生较少的粘液，其由箭头指示(图4B)。同时，哮喘诱导的Wip1KO小鼠的支气管肺泡的灌洗液(BAL)的细胞中的Muc5ac和Mcpt1(其分别与粘蛋白的产生以及肥大细胞蛋白酶相关)的mRNA表达显著低于哮喘诱导的WT对照小鼠(P<0.01，图4C、D)。苏木精和伊红(H&E)染色示出了，如降低的病理学改变所示，Wip1KO小鼠在肺组织中的炎性细胞的浸润比WT小鼠明显减少(图4E)。Wip1KO小鼠对OVA诱导的哮喘的耐受也受下述结果的支持，即在OVA诱导的过敏性哮喘模型中，与WT小鼠相比，Wip1KO小鼠的肺泡灌洗液中有显著更少的白细胞和嗜酸性粒细胞的浸润(P<0.01，图4F、G)。此外，如实时定量PCR所检测，Wip1KO哮喘小鼠的BAL液中的细胞和体外采用OVA刺激的脾细胞中表达显著更少的IL-9(P<0.01，图4H、I)。同时，体外采用OVA刺激WT小鼠和WipKO小鼠的脾脏细胞，与WT小鼠的CD4⁺T细胞相比，Wip1KO小鼠的脾脏中的CD4⁺T细胞表达更少得IL-9分子(P<0.001，图4J)。因此，Wip1的缺陷减弱了体内Th9的分化，并降低了Th9介导的过敏性疾病。

实施例5.Wip1抑制剂降低小鼠过敏性哮喘的严重程度

鉴于Wip1KO小鼠表现出对过敏性哮喘的耐受特征，发明人进一步探索用Wip1抑制剂CCT007093抑制Wip1是否能阻断OVA诱导的过敏性哮喘小鼠模型中的哮喘发病机制。在诱导阶段施用Wip1抑制剂6天可以显著降低WT小鼠哮喘的严重程度(其由降低的病理学改变证明)(图5A)。这进一步得到以下结果证实：在小鼠肺泡灌洗液中存在更少的白细胞和嗜酸性粒细胞的浸润(P<0.001，图5B、C)以及在Wip1抑制剂处理的小鼠的血清中显著更低的IgE水平(P<0.01，图5D)。此外，PAS染色证实，用Wip1抑制剂CCT007093处理的小鼠在肺组织支气管中产生的粘液较少(图5E)。在Wip1抑制剂CCT007093处理后，哮喘诱导的小鼠的肺泡灌洗液的细胞中，Muc5ac、Mcpt1和IL-9的mRNA表达显著降低了(P<0.01，图5F-H)。同时，通过ELISA试剂盒所测，Wip1抑制剂处理的哮喘小鼠的肺组织匀浆中表达了显著更少的IL-9(P<0.01，图5I)。如通过流式细胞术所测，来自CCT007093处理的哮喘小鼠淋巴结(dLN)的CD4⁺T细胞在CD4⁺T细胞中表达更少的IL-9分子(P<0.01，图5J)。以上结果表明，使用Wip1抑制剂显著改善了小鼠过敏性哮喘的发病机制。

Claims (7)

1.野生型p53诱导的磷酸酶1(Wip1)抑制剂在制备用于治疗个体过敏性哮喘的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述Wip1抑制剂为Wip1表达抑制剂和/或Wip1活性抑制剂。

3.如权利要求2所述的用途，其中所述Wip1抑制剂为能作用于Wip1的转录和/或翻译水平从而降低生成的功能性Wip1的量的抑制剂。

4.如权利要求3所述的用途，其中所述Wip1抑制剂选自dsRNA、microRNA、siRNA、shRNA、反义RNA或核酶。

5.如权利要求2所述的用途，其中所述Wip1抑制剂为能抑制Wip1的酶活性的抑制剂。

6.如权利要求5所述的用途，其中所述Wip1抑制剂选自Wip1抗体或其抗原结合片段、与Wip1天然底物竞争性结合Wip1的类似物、小分子化合物。

7.如权利要求1所述的用途，其中所述Wip1抑制剂为CCT007093，其结构为

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