CN111118046B - 一种能够调控MSCs成脂肪分化能力的基因及其衍生产品 - Google Patents

一种能够调控MSCs成脂肪分化能力的基因及其衍生产品 Download PDF

Info

Publication number
CN111118046B
CN111118046B CN202010046860.4A CN202010046860A CN111118046B CN 111118046 B CN111118046 B CN 111118046B CN 202010046860 A CN202010046860 A CN 202010046860A CN 111118046 B CN111118046 B CN 111118046B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mscs
wip1
gene
expression
differentiation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010046860.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111118046A (zh
Inventor
张毅
樊月
刘伟江
白海涛
刘元林
李雪
王洋
于丰实
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Original Assignee
Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA filed Critical Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority to CN202010046860.4A priority Critical patent/CN111118046B/zh
Publication of CN111118046A publication Critical patent/CN111118046A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111118046B publication Critical patent/CN111118046B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0664—Dental pulp stem cells, Dental follicle stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种能够调控MSCs成脂肪分化能力的基因，所述基因为Wip1基因，所述Wip1基因正向调控MSCs成脂肪分化能力。本发明人通过实验发现，Wip1基因通过PP2A‑PPAR‑γ信号通路调节MSCs成脂分化的能力，为MSCs生物学特性的研究及临床应用提供了理论与实验依据，也为临床研究应用MSCs治疗疾病提供新靶标。

Description

一种能够调控MSCs成脂肪分化能力的基因及其衍生产品
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种能够调控MSCs成脂肪分化能力的基因及其衍生产品。
背景技术
间充质干细胞(MSCs)是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，由于骨髓是其主要来源，因此统称为骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞具有以下特性：一、具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。二、具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能。三、具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。四、面目模糊，表面抗原不明显，异体移植排异较轻，配型要求不严格。正是由于间充质干细胞所具备的这些免疫学特性，使其在血液病治疗方面具有广阔的临床应用前景。通过自体移植可以重建组织器官的结构和功能，并且可避免免疫排斥反应。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)来源于不同组织，是具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，体内和体外培养均可使其向成脂肪、成骨和成软骨分化。但其具体的分化机制研究甚少。
磷酸酶Wip1(野生型p53诱导的磷酸酶1)是由PPM1D基因编码的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，是一种p53依赖的基因，属于PP2C(蛋白磷酸酶2C)家族，该家族成员主要参与细胞代谢过程，包括增殖、凋亡、分化等等。Wip1在原核生物和真核生物中均有表达，主要存在细胞核中。在细胞稳态调控、DNA损伤修复、抗衰老、肿瘤发生及免疫调控等方面具有重要作用，并作为原癌基因受到越来越多的关注。
PP2A是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2，在人类其由PPP2CA基因编码，由A和B两个亚单位组成。对磷酸酶的调节起到重要作用，对细胞内多种信号通路产生影响。研究已经发现PP2A影响成骨细胞和脂肪细胞的分化，通过调节相关转录因子的表达来确定成骨细胞或脂肪细胞的表型。
过氧化物酶体增殖体激活受体-γ(peroxisome proliferator activatedreceptorγ，PPAR-γ)，是重要的细胞分化转录因子，在哺乳动物的脂肪组织、血管平滑肌组织、心肌组织中均有表达。PPAR-γ是由配体激活的核转录因子，活化后可以调控多种核内靶基因的表达。研究发现，PPAR-γ具有调节脂肪代谢、炎症、免疫以及细胞分化等作用，参与诸多慢性免疫性疾病的发生及发展。PPAR-γ是MSCs成脂早期过程中的转录因子，PPAR-γ高表达，说明细胞成脂分化能力强。
发明内容
我们通过研究发现，Wip1基因敲除后MSCs成脂分化能力显著下降，进一步研究发现，具体机制是Wip1基因通过调控PP2A-PPAR-γ信号通路促进MSCs的成脂分化。
本发明目的之一是Wip1基因调控MSCs成脂肪分化能力的分子机制研究提供新的线索，为临床研究应用MSCs治疗疾病提供新靶标。
具体方案：本发明人利用成熟的小鼠骨组织来源的MSCs分离培养和体外诱导培养体系，经实验研究发现Wip1基因通过调节PP2A-PPAR-γ信号通路调控MSCs的成脂分化；具体实施过程，体外分离培养Wip1+/+MSCs和Wip1-/-MSCs，进一步诱导，成脂分化后检测成脂相关转录因子PPAR-γ，C/EBPα变化。结果表明，Wip1-/-MSCs成脂诱导后，脂滴数量显著减少，成脂相关转录因子表达显著降低。采用基因芯片结合生物信息学分析，发现Wip1-/-MSCs中PP2A表达降低。收集MSCs成脂诱导第0天，第2天，第4天和第5天的样本，q-PCR检测发现成脂相关转录因子PPAR-γ与PP2A变化一致。利用PP2A siRNA敲低MSCs中PP2A，q-PCR和Westernblot检测结果显示，敲低PP2A基因后，成脂分化关键转录因子PPAR-γ表达显著下调，说明成脂分化能力降低，从而证实Wip1具有促进MSCs成脂分化能力。
首先，本发明提供了一种能够调控MSCs成脂肪分化能力的基因，所述基因为Wip1基因。
优选的，所述Wip1基因正向调控MSCs成脂肪分化能力。
优选的，所述Wip1基因通过调节PP2A-PPAR-γ信号通路调控MSCs的成脂分化。
优选的，所述间充质干细胞包括牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。
在本发明上述应用的一些实施方案中，所述间充质干细胞(MSCs)为小鼠骨组织来源的间充质干细胞。
进一步地，本发明提供了一种基因修饰间充质干细胞的生物制剂，所述基因为Wip1基因，所述制剂中含有促进Wip1基因表达的试剂和促进Wip1基因表达产物的试剂。如MSCs成脂分化的促进剂。
优选的，所述促进Wip1基因表达的试剂包括促进基因转录的试剂，促进基因翻译的试剂，促进Wip1蛋白含量提高的试剂；所述促进Wip1基因表达产物的试剂包括促进Wip1基因表达稳定性的试剂，促进Wip1基因表达产物活性的试剂，促进Wip1基因表达产物功能的试剂。
进一步地，本发明提供了一种基因修饰间充质干细胞的生物制剂，所述基因为Wip1基因，所述制剂中含有降低Wip1基因表达的试剂和降低Wip1基因表达产物的试剂。
优选的，所述降低Wip1基因表达的试剂是通过siRNA敲低PP2A基因使得成脂关键转录因子PPAR-γ表达显著下调，从而抑制MSC成脂分化能力。
优选的，PP2A siRNA具有SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列。
更进一步地，本发明提供了一种细胞治疗药物，所述药物通过Wip1基因修饰间充质干细胞起作用。
优选地，所述细胞治疗药物包括外用细胞治疗药物或注射细胞治疗药物。
再进一步地，本发明还提供了一种基因改造MSCs的方法，所述方法是通过调控Wip1基因的表达进而调节PP2A-PPAR-γ信号通路来改造MSCs。
具体为：
1)从1周龄C57bl/6小鼠骨组织中分离获取间充质干细胞，然后进行原代培养和传代培养；
2)利用siRNA瞬时转染技术将PP2A siRNA导入P3代间充质干细胞，然后培养。
siRNA瞬时转染的转染体系为：jet PRIME reagent buffer 200ul/2ml、siRNA3ul/2ml、jet PRIME reagent 4ul/2ml，转染时间为48h。
最后，本发明还提供了一种基因改造MSCs的方法在制备利用MSCs治疗疾病药物中的应用，所述利用MSCs治疗疾病药物包括肿瘤药物等。
有益效果
本发明人通过实验发现，Wip1基因通过PP2A-PPAR-γ信号通路调节MSCs成脂分化的能力，为MSCs生物学特性的研究及临床应用提供了理论与实验依据，也为临床研究应用MSCs治疗疾病提供新靶标。因此，可将Wip1用于制备调控MSCs成脂分化的产品，如MSCs成脂分化的促进剂。本发明采用成熟的小鼠骨组织来源的MSCs分离培养技术，结合特定的成脂诱导分化体系及特定的接种细胞数，稳定的基因转染敲低技术，可操作性强，方便实用。
附图说明
图1所示为鼠尾基因型鉴定结果；
图2为Wip1+/+MSCs和Wip1-/-MSCs成脂诱导后油红O染色结果；
图3为Wip1+/+MSCs和Wip1-/-MSCs成脂诱导后油红O染色，显微镜下脂滴计数结果和成脂相关转录因子PPAR-γ和C/EBPα变化；
图4为293T细胞过表达Wip1后PP2A表达升高；
图5为MSCs成脂诱导后相关因子变化；
图6为敲低MSCs中PP2A，PPAR-γ表达降低。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明所用常规基础方法示例如下：
Wip1：Gene ID:53892
PPAR-γ：Gene ID:19016
PP2A：Gene ID:19052
C/EBPα：Gene ID:12606
基因型鉴定方法如下：
首先提取鼠尾DNA，然后PCR扩增，最后水平电泳检测基因型。
鼠尾DNA提取如下：收集需要检测的小鼠尾尖0.5～1cm，至于1.5mL Ep管中，并做好标记(或-20℃冰箱暂存)；加入200μL裂解液，用眼科剪把组织剪成小块；55℃孵育2h，间断混匀裂解液使组织消化充分；在通风橱内，加入200μL酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)至裂解液中，剧烈震荡，充分混匀变性蛋白质，至于离心机中最高转速离心10min；取出离心管，小心的收取上层水相的上清约180μL(<200μL，切勿吸入中间层沉淀)，加入10％体积的醋酸钠和60％体积的异丙醇，混合均匀，至于离心机中最高转速离心10min；去除上清，加入70％的乙醇溶液洗涤沉淀两次，离心机中最高转速离心后去除上清；晾干，加入50μL TE溶液或ddH2O溶解DNA，得到的基因组即可用于PCR。
原代MSCs培养方法：
1)断颈处死1周龄小鼠，75％酒精浸泡5分钟；
2)无菌条件下剪取胫骨、股骨骨干，置于含10％血清的完全培养基的青瓶中；
3)眼科剪剪碎，1％Ⅱ型胶原酶消化45min；
4)将骨片移至装有10％血清的完全培养基的25cm2培养瓶中，用电动移液枪吹散，放置孵箱培养；
5)72h后换液，弃去悬浮细胞，每2～3d换一次液；
6)待细胞长至80～90％融合后，胰蛋白酶消化，传代，重复上述步骤，直至细胞培养至P3待用。
继代培养方法：
胰酶消化细胞，血清终止，拍打培养瓶瓶壁，使所有细胞脱落，移入离心管，1000rpm/min，离心10min，弃去上清，完全培养基重悬细胞，接种于培养瓶。
293T细胞过表达方法：
首先复苏实验室保存的293T细胞，接种于T75培养瓶培养，传代后接种于六孔板，1×105/孔，长到80％融合换液，加入转染试剂(jet PRIME reagent buffer 200ul/孔、质粒1ug/孔、jet PRIME reagent 4ul/孔)，转染时间为48h，收取细胞用于继续实验。
芯片方法：
委托康普森公司，按照程序化流程操作。
实施例1：小鼠基因组总DNA提取及基因型鉴定
通过Wip1+/-小鼠的交配，获得1周龄小鼠，剪取鼠尾进行基因型鉴定。图1为基因型鉴定结果，2号和5号是Wip1+/+小鼠，1号，6号和4号是杂合小鼠，3号为Wip1-/-小鼠。
实施例2：Wip1+/+MSCs和Wip1-/-MSCs体外分离培养和成脂诱导分化
将上述例一中鉴定出的Wip1+/+小鼠和Wip1-/-小鼠消毒后超净工作台内提取骨片，行原代MSCs培养。将体外分离培养的P2代Wip1+/+MSCs和Wip1-/-MSCs，接种于六孔板进行成脂诱导。用油红O染色，检测Wip1+/+MSCs和Wip1-/-MSCs成脂分化结果计数形成的脂滴数。如图2为油红O染色结果，可以发现两种MSCs均可向成脂细胞分化，a、b：Wip1+/+MSCs；c、d：Wip1-/-MSCs；a、c：自分化组；b、d:诱导组。如图3A为高倍视野下脂滴计数结果，发现Wip1+/+MSCs脂滴更多。图3B和图3C为q-PCR检测成脂相关转录因子结果。显示与Wip1-/-MSCs成脂关键转录因子PPAR-γ和C/EBPα表达显著降低。q-PCR检测所用引物如表1所示。
以上结果表明Wip1缺失可使MSCs成脂分化能力显著降低。
表1：引物与基因序列
Figure BDA0002369736120000071
实施例3：Wip1+/+MSCs和Wip1-/-MSCs中PP2A表达差异
Wip1+/+MSCs和Wip1-/-MSCs芯片显示PP2A在两种细胞中的表达存在明显差异，为此，提取P3代Wip1+/+MSCs和Wip1-/-MSCs蛋白，Western blot进行验证。结果如图4A所示Wip1-/-MSCs中PP2A表达下降，差异显著。
为探讨Wip1与PP2A是否存在相互作用，我们将293T细胞过表达Wip1-GFP。如图4B所示，流式细胞术检测结果显示转染效率为57.5％，说明Wip1基因成功转入293T细胞。如图4C所示，荧光显微镜下可见大量荧光细胞。图4D所示结果为Western blot检测发现Wip1过表达，同时PP2A表达亦显著升高。
实施例4：成脂诱导过程中PP2A与成脂相关转录因子变化一致
MSCs成脂诱导分化后，收集第0天，第2天，第4天和第5天的样本，q-PCR检测成脂诱导分化过程中成脂相关关键转录因子PPAR-γ、C/EBPα和PP2A表达。如图5所示，成脂过程中PPAR-γ和C/EBPα均先升高后降低，PP2A与其变化趋势一致。
实施例5：干扰PP2A表达后PPAR-γ表达亦降低
体外分离培养MSCs，传至P3代接种于6孔板，转染PP2A siRNA。合成3对siRNAPP2A，(序列为SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:14)，转染48h后，收集细胞，q-PCR验证，挑选一组敲低效果最好的用于后续实验。如图6A所示，siRNA-615敲低效果最好。选择siRNA-615，再次转染MSCs，如图6B所示PP2A敲低。进一步检测，PP2A敲低后成脂肪相关转录因子变化。如图6C所示，q-PCR检测发现PPAR-γ表达亦显著降低。图6D所示，Western blot检测发现PP2A表达降低同时PPAR-γ表达也降低。
上述实验结果表明，Wip1基因敲低的MSCs成脂分化能力亦显著降低，Wip1通过调节PP2A-PPAR-γ信号通路影响MSCs的成脂分化。
以上结果表明，Wip1基因具有促进MSCs成脂分化作用。可用于制备MSCs促分化产品，或者在治疗肥胖时，敲除Wip1基因可更好的治疗肥胖，为成脂分化机制提供了新的信号通路机制。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种能够调控MSCs成脂肪分化能力的基因及其衍生产品
<130> P200123
<141> 2020-01-16
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
tcaagatcat cagcaatgcc 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
cgataccaaa gttgtcatgg a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
gaccactccc actcctttga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
attcaattgc catgagggag 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
acgagacgtc tatagacatc ag 22
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
aggaactcgt cgttgaagg 19
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
ttatgggaga ctatgtggac ag 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
ctcggtaacg aaccttaaga g 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
cuaaagaaau ccugacaaat t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
uuugucagga uuucuuuagt t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
cgacgagugu uuaaggaaat t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
uuuccuuaaa cacucgucgt t 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
ggaaauacgg aaaugcaaat t 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
uuugcauuuc cguauuucct t 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
acgugacacg uucggagaat t 21

Claims (3)

1.一种降低PP2A表达的试剂，其特征在于，包括PP2A siRNA-615，序列为SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:12。
2.权利要求1所述试剂在制备降低成脂关键转录因子PPAR-γ表达的制剂中的应用。
3.权利要求1所述试剂在制备抑制MSCs成脂分化能力的制剂中的应用。
CN202010046860.4A 2020-01-16 2020-01-16 一种能够调控MSCs成脂肪分化能力的基因及其衍生产品 Active CN111118046B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010046860.4A CN111118046B (zh) 2020-01-16 2020-01-16 一种能够调控MSCs成脂肪分化能力的基因及其衍生产品

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010046860.4A CN111118046B (zh) 2020-01-16 2020-01-16 一种能够调控MSCs成脂肪分化能力的基因及其衍生产品

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111118046A CN111118046A (zh) 2020-05-08
CN111118046B true CN111118046B (zh) 2022-02-22

Family

ID=70489490

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010046860.4A Active CN111118046B (zh) 2020-01-16 2020-01-16 一种能够调控MSCs成脂肪分化能力的基因及其衍生产品

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111118046B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111549033B (zh) * 2020-06-11 2021-02-12 南京市江宁医院 慢病毒感染人表皮角质细胞株及其构建方法和应用
CN113648416A (zh) * 2021-02-05 2021-11-16 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 调控间充质干细胞免疫抑制作用的标志物及其应用
CN114748628B (zh) * 2022-05-18 2023-11-24 上海舶望制药有限公司 一种基因表达抑制剂在治疗肥胖症中的应用
CN116426469B (zh) * 2023-06-07 2023-09-08 北京大学口腔医学院 LAP2α在间充质干细胞成脂向分化中的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104531613B (zh) * 2014-11-17 2017-12-19 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 Wip1敲除在促进小鼠骨髓间充质干细胞迁移中的应用
EP3355930A4 (en) * 2015-10-01 2019-03-06 Warp Drive Bio, Inc. METHOD AND REAGENTS FOR THE ANALYSIS OF PROTEIN-PROTEIN INTERFACES

Also Published As

Publication number Publication date
CN111118046A (zh) 2020-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111118046B (zh) 一种能够调控MSCs成脂肪分化能力的基因及其衍生产品
CN112111448B (zh) 改良的间充质干细胞培养基、骨髓间充质干细胞及其培养方法和应用
CN106636210B (zh) 转录因子组合诱导成纤维细胞转分化为类睾丸间质细胞的方法
CN110777120B (zh) Tgfbi作为调控间充质干细胞成脂分化的标志物的应用
CN110106150B (zh) 一种滑膜肉瘤细胞系hSS-005R的制备方法及应用
CN111269942A (zh) Tgfbi作为调控间充质干细胞成骨分化的标志物的应用
CN107320726A (zh) LncRNA‑TUG1在制备调控牙周膜干细胞的干性维持能力的药物中的应用
CN104805122A (zh) Runx2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞表达成骨基因的方法
CN108753703B (zh) 一种牙鲆胚胎肌卫星细胞系建立方法
CN111592585A (zh) Ul16蛋白在制备促进细胞线粒体功能相关药物中的应用
CN112941106B (zh) 一种通过foxp1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法
CN109456995A (zh) 基因敲除质粒、细胞系及制备方法和应用
CN1654667A (zh) 减毒hsv－1基因治疗载体
EP4219719A1 (en) Nucleic acid molecule targeting mutation site of cyp4v2 gene and use thereof
CN114958851A (zh) 一种降低乳腺癌转移的抑制剂
CN1781551A (zh) 蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂抗肿瘤侵袭与转移作用及应用
CN113855794A (zh) 一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗
CN115896112B (zh) 靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA，构建该基因缺失细胞株的方法及应用
CN111849981B (zh) 基于PLIN1基因的sgRNA、质粒载体及其构建方法和应用
CN101979520A (zh) 特异促成软骨分化的核心结合因子al基因重组病毒及其制备方法和应用
CN114958767B (zh) 基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的制备方法
CN115369081B (zh) 一种干细胞生长促进剂及其制备的细胞培养基和应用
CN108424914B (zh) 抑制人恶性脑胶质瘤的靶向auf1基因抑制剂及其应用
CN117448379A (zh) iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法及其应用
CN113425742A (zh) 过表达CTLA-4Ig/PD-L1的宫内膜干细胞在制备治疗肺纤维化的药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant