CN115369081B - 一种干细胞生长促进剂及其制备的细胞培养基和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种干细胞生长促进剂及其制备的细胞培养基和应用，细胞培养技术领域。本发明提供了一种干细胞生长促进剂，包括质量百分含量15％～25％肉苁蓉肽、质量百分含量10％～35％低聚木糖和质量百分含量40％～60％的以下至少一种组分：菊芋提取物、雪莲果提取物、茶多酚和谷胱甘肽。本发明提供的干细胞生长促进剂成分来源广泛，生物安全性高，有很好地促进干细胞生长及增殖的作用。为节约干细胞培养及生产成本提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种干细胞生长促进剂及其制备的细胞培养基和应用。
背景技术
细胞培养是细胞的大规模克隆过程，是临床医学和药学研究不可或缺的内容。目前，干细胞研究在医学和药学方面受到广泛的关注。干细胞(ESC)，尤其是间充质干细胞，因具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控等特点而在临床上受到广泛应用，如造血干细胞的移植、组织损伤修复、自身免疫性疾病和基因治疗的载体等。
动物细胞培养是大规模获得实验材料的重要环节。无胎牛血清的基础培养基虽然成本较低，但细胞传代及扩增能力不足，无法满足生产需要。胎牛血清具有高含量的刺激生长因子，含有胎牛血清的完全培养基虽然能够支持间充质干细胞的多次传代增殖，但由于其成分复杂、容易携带病毒或或病原体，且因性质不稳定引起的批次之间差异大，使得细胞生产过程的标准化较难实现。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种干细胞生长促进剂及其制备的细胞培养基，通过将草木植物来源的组分进行复配，达到促进细胞生长的目的。
本发明提供了一种干细胞生长促进剂，包括质量百分含量15％～25％肉苁蓉肽、质量百分含量10％～35％低聚木糖和质量百分含量40％～60％的以下至少一种组分：菊芋提取物、雪莲果提取物、茶多酚和谷胱甘肽。
优选的，包括质量百分含量15％～25％肉苁蓉肽、质量百分含量25％～35％低聚木糖和质量百分含量40％～60％菊芋提取物。
优选的，包括质量百分含量15％～25％肉苁蓉肽、质量百分含量25％～35％低聚木糖、质量百分含量25％～35％雪莲果提取物和18％～22％茶多酚。
优选的，包括质量百分含量15％～25％肉苁蓉肽、质量百分含量10％～12％低聚木糖、质量百分含量18％～22％菊芋提取物、18％～22％雪莲果提取物、18％～22％茶多酚和9％～11％谷胱甘肽。
本发明提供了一种促进细胞生长的细胞培养基，以无血清培养基为基础，添加不低于100mg/mL所述干细胞生长促进剂。
优选的，所述干细胞生长促进剂的浓度为120～400mg/mL。
优选的，所述干细胞生长促进剂的浓度为150～200mg/mL。
本发明提供了所述干细胞生长促进剂或所述细胞培养基在细胞培养中的应用。
优选的，所述细胞包括干细胞。
优选的，所述干细胞包括间充质干细胞。
本发明提供了一种干细胞生长促进剂，包括质量百分含量15％～25％肉苁蓉肽、质量百分含量10％～35％低聚木糖和质量百分含量40％～60％的以下至少一种组分：菊芋提取物、雪莲果提取物、茶多酚和谷胱甘肽。本发明所述干细胞生长促进剂与空白对照相比，具有显著促进细胞生长和扩增的作用，具有良好的增殖效果，可作为细胞促进剂添加到无血清培养基中用于细胞培养。同时所述干细胞生长促进剂的组分来源于草本精华，毒副作用小，生物安全性高，并且生产成本低，较低的浓度即可实现细胞的生长和扩增，具有较高的应用价值。
附图说明
图1为含不同浓度的干细胞生长促进剂1的细胞培养基对细胞活力的影响结果；
图2为含不同浓度的干细胞生长促进剂2的细胞培养基对细胞活力的影响结果；
图3为含不同浓度的干细胞生长促进剂3的细胞培养基对细胞活力的影响结果；
图4为150mg/ml浓度的干细胞生长促进剂2的细胞培养基培养间充质干细胞的形态图；
图5为150mg/ml浓度的干细胞生长促进剂2的细胞培养基培养间充质干细胞的PPARγ基因表达结果；
图6为200mg/ml浓度的干细胞生长促进剂2和对照促进剂培养间充质干细胞后细胞活力的影响结果。
具体实施方式
本发明提供了一种干细胞生长促进剂，包括质量百分含量15％～25％肉苁蓉肽、质量百分含量10％～35％低聚木糖和质量百分含量40％～60％的以下至少一种组分：菊芋提取物、雪莲果提取物、茶多酚和谷胱甘肽。
在本发明中，所述干细胞生长促进剂的方案中，所述肉苁蓉肽增强免疫力、延缓衰老；所述低聚木糖发挥促进机体生成烟酸、叶酸等多种营养物质的作用。所述菊芋提取物发挥可溶性膳食纤维，提高免疫力的作用。所述雪莲果提取物具有抗老化作用。所述茶多酚发挥抑制氧化酶作用。所述谷胱甘肽发挥抗衰老的作用。将上述组分的3种或4种或5种组分组成，形成不同配方的干细胞生长促进剂。
在本发明中，所述干细胞生长促进剂由3种组分组成时，记为干细胞生长促进剂1，优选包括质量百分含量15％～25％肉苁蓉肽、质量百分含量25％～35％低聚木糖和质量百分含量40％～60％菊芋提取物，更优选为包括质量百分含量18％～22％肉苁蓉肽、质量百分含量28％～32％低聚木糖和质量百分含量48％～52％菊芋提取物，最优选为包括质量百分含量20％肉苁蓉肽、质量百分含量30％低聚木糖和质量百分含量50％菊芋提取物。
在本发明中，所述干细胞生长促进剂由4种组分组成时，记为干细胞生长促进剂2，包括质量百分含量15％～25％肉苁蓉肽、质量百分含量25％～35％低聚木糖、质量百分含量25％～35％雪莲果提取物和18％～22％茶多酚，更优选为包括质量百分含量18％～22％肉苁蓉肽、质量百分含量28％～32％低聚木糖、质量百分含量28％～32％雪莲果提取物和19％～21％茶多酚，最优选为包括质量百分含量20％肉苁蓉肽、质量百分含量30％低聚木糖、质量百分含量30％雪莲果提取物和20％茶多酚。
在本发明中，所述干细胞生长促进剂由5种组分组成时，记为干细胞生长促进剂3，包括质量百分含量15～25％肉苁蓉肽、质量百分含量10％～12％低聚木糖、质量百分含量18～22％菊芋提取物、18％～22％雪莲果提取物、18％～22％茶多酚和9％～11％谷胱甘肽，更优选为18％～22％肉苁蓉肽、质量百分含量10％～11％低聚木糖、质量百分含量19％～21％菊芋提取物、19％～21％雪莲果提取物、19％～21％茶多酚和9.5％～10.5％谷胱甘肽，最优选为20％肉苁蓉肽、质量百分含量10％低聚木糖、质量百分含量20％菊芋提取物、20％雪莲果提取物、20％茶多酚和10％谷胱甘肽。
在本发明中，上述3种干细胞生长促进剂对细胞生长和增殖促进作用，虽然促进强度不及胎牛血清，但与空白对照组相比，能够显著促进细胞的生长和提高细胞存活情况。不同配方的干细胞生长促进剂促生长功能强弱存在差异，具体为干细胞生长促进剂2优于干细胞生长促进剂3，干细胞生长促进剂3优于干细胞生长促进剂1。
在本发明中，所述干细胞生长促进剂的制备方法，优选为将各组分混合即可。
本发明提供了一种促进细胞生长的细胞培养基，以无血清培养基为基础，添加不低于100mg/mL所述干细胞生长促进剂。
在本发明中，所述细胞培养基含有干细胞生长促进剂1时，干细胞生长促进剂1的浓度不低于150mg/mL，细胞活力为130～150％。所述细胞培养基含有干细胞生长促进剂2时，干细胞生长促进剂2的浓度不低于100mg/mL，优选为120～400mg/mL，更优选为150～200mg/mL，细胞活力为120～300％。所述细胞培养基含有干细胞生长促进剂3时，干细胞生长促进剂3的浓度不低于100mg/mL，细胞活力为150～190％。
在本发明中，所述细胞培养基的制备方法，优选为将干细胞生长促进剂溶解于无血清培养基中即可，经无菌处理得到。
本发明提供了所述干细胞生长促进剂或所述细胞培养基在细胞培养中的应用。
在本发明中，所述细胞优选包括干细胞。所述干细胞优选包括间充质干细胞。
在本发明中，所述细胞培养的方法优选为将单细胞接种至细胞培养基中于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养72h。
下面结合实施例对本发明提供的一种干细胞生长促进剂及其制备的细胞培养基和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
原料来源见表1。
表1本发明原料获取途径
| 组分名称 | 来源 |
| 肉苁蓉肽(98％) | 西安绿肽生物科技有限公司 |
| 茶多酚(99％) | 山东福亿药业有限公司 |
| 菊芋提取物(95％) | 西安恩肽元生物科技有限公司 |
| 雪莲果提取物(99％) | 西安优硕生物科技有限公司 |
| 低聚木糖(95％) | 山东百龙创园生物科技有限公司 |
| 谷胱甘肽(99％) | 陕西艾特生物科技有限公司 |
| 无血清培养基 | Gibco公司 |
| 胎牛血清 | Gibco公司 |
| 完全培养基 | Gibco公司 |
| 胰蛋白酶 | 北京索莱宝科技有限公司 |
实施例1
干细胞生长促进剂1的细胞培养基的制备方法
按照以下配比准确称量各组分，并混合：肉苁蓉肽20％、低聚木糖30％、菊芋提取物50％。称取5g配方1粉末于离心管中，加入10mL无血清培养基并充分振荡混匀，0.2μM滤膜过滤至新的无菌离心管中，得到浓度为500mg/mL的母液，4℃保存。
实施例2
干细胞生长促进剂2的细胞培养基的制备方法
按照以下配比准确称量各组分，并混合：肉苁蓉肽20％、茶多酚20％、雪莲果提取物30％、低聚木糖30％。称取5g配方2粉末于离心管中，加入10mL无血清培养基并充分振荡混匀，0.2μM滤膜过滤至新的无菌离心管中，得到浓度为500mg/mL的母液，4℃保存。
实施例3
干细胞生长促进剂3的细胞培养基的制备方法
按照以下配比准确称量各组分，并混合：肉苁蓉肽20％、茶多酚20％、菊芋提取物20％、雪莲果提取物20％、低聚木糖10％、谷胱甘肽10％。称取5g配方3粉末于离心管中，加入10mL无血清培养基并充分振荡混匀，0.2μM滤膜过滤至新的无菌离心管中，得到浓度为500mg/mL的母液，4℃保存。
实施例4
冻存细胞的复苏、细胞传代培养促间充质干细胞生长实验
从液氮中取出冻存的间充质干细胞，迅速置于37℃水浴中，待细胞融化后将其加入含有9mLPBS的无菌离心管中，1500rpm条件下离心3min，弃上清，用1mL完全培养基重悬细胞，加入预先添加了9mL完全培养基的10cm细胞培养皿中，于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。
待细胞汇合度达到80％～90％后，在超净工作台中进行操作。吸除培养基，加入3mLPBS清洗两次以除去残留培养基及死亡细胞，加入1mL含0.53mM EDTA的0.25％胰蛋白酶，轻轻晃动培养皿使胰蛋白酶消化液充分覆盖细胞表面，37℃条件下消化3min，消化完成后，立即加入3mL完全培养基终止消化，移液器轻柔吹打并收集1mL细胞，加入预先添加了9mL完全培养基的培养皿中，于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。
传3代至细胞稳定后，待细胞细胞汇合度达到80％～90％，在超净工作台中进行操作。吸除培养基，加入3mLPBS清洗两次以除去残留培养基及死亡细胞，加入1mL含0.53mMEDTA的0.25％胰蛋白酶，轻轻晃动培养皿使胰蛋白酶消化液充分覆盖细胞表面，37℃条件下消化3min，消化完成后，立即加入3mL完全培养基终止消化，移液器轻柔吹打并收集细胞于无菌离心管中，1500rpm条件下离心3min，弃上清，加入适量完全培养基并轻轻吹打细胞，计数，最终按照10000个/孔的细胞密度接种于96孔板中，于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养12～16h。
吸除96孔板中的完全培养基，PBS清洗1次后，以无血清培养基作为阴性对照，以含有胎牛血清的完全培养基作为阳性对照，设置50、100、150、200、250、300、350、400mg/mL的浓度梯度作为实验组处理细胞，于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养72h。
吸除培养基，PBS清洗1次，每孔加入200μL无血清培养基及20μLMTT溶液，细胞培养箱中孵育4h后，弃培养基，每孔加入200μL DMSO，于492nm处检测吸光度并进行后续数据分析,每组设置6个孔。
统计学处理分析
按照公式I计算细胞活力。
细胞活力(％)＝(OD实验组/OD阴性对照组)×100％ 公式I。
利用Excel中TTEST进行显著性分析，**表示与阴性对照组相比，p<0.05；***表示与阴性对照组相比，p<0.01。
结果见图1～图3。由图1可知，所述细胞培养基含有干细胞生长促进剂1时，与空白对照组相比，干细胞生长促进剂1的浓度不低于150mg/mL时，能显著提高细胞活力，细胞活力为130％～150％。由图2可知，细胞培养基含有干细胞生长促进剂2时，与空白对照组相比，干细胞生长促进剂1的浓度不低于100mg/mL时，能显著提高细胞活力，并且随着浓度的升高细胞活力有先升高后降低的趋势，在150～200mg/mL时，细胞活力为200％～300％，150mg/mL时最佳。由图3可知，所述细胞培养基含有干细胞生长促进剂3时，与空白对照组相比，干细胞生长促进剂3的浓度不低于100mg/mL时，能显著提高细胞活力，细胞活力为150％～190％。由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此也常常用来检测细胞的增殖情况。总体来看，干细胞生长促进剂2优于干细胞生长促进剂3，干细胞生长促进剂3优于干细胞生长促进剂1。
实施例5
用浓度150mg/mL的干细胞生长促进剂2培养间充质干细胞，培养方法同实施例4记载，培养2天后观察细胞形态，同时设置阴性对照和阳性对照，其中阴性对照组培养基为无血清培养基(不添加血清)，阳性对照组采用完全培养基进行培养。
结果见图4。从图4可以看出，150mg/mL的干细胞生长促进剂2组的细胞和阳性对照组细胞形态呈细长形，并且细胞生长数量相似，而阴性对照组间充质干细胞的细胞呈细长形，但细胞数量较少。
实施例6
培养后间充质干细胞的成脂分化能力评估
采用实施例5的培养方法培养间充质干细胞，同时设置阴性对照组和阳性对照组。培养2天后，更换为成脂诱导分化培养基培养3天，之后再更换为成脂诱导分化培养基维持液培养1天，收集间充质干细胞。Takara试剂盒提取间充质干细胞RNA并进行反转录，采用q-PCR测定培养后间充质干细胞的PPARγ基因的表达情况来评估培养后间充质干细胞的成脂分化能力。具体方法如下：
(1)提取RNA
①倒出培养液，使用1×PBS清洗一次。
②向培养细胞中加入适当量的裂解BufferRL(使用前加入50×DTT Solution)，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落。
③将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀，室温静置2分钟。
④将gDNAEraser Spin Column安放到2ml的CollectionTube上。
⑤将裂解液转移入到gDNAEraser Spin Column中。12,000rpm，离心1分钟。
⑥弃gDNAEraser Spin Column。保留2ml Tube中的滤液。
⑦加入与滤液等体积的70％乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀。立即将混合液全部转入到RNASpin Column中。
⑧12,000rpm，离心1分钟，弃滤液。将RNA Spin Column放回到2mlCollectionTube中。
⑨将500μl的BufferRWA加入至RNA Spin Column中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。
⑩将600μl的BufferRWB加入至RNA Spin Column中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。
重复操作步骤10。
将RNA Spin Column重新安置于2ml CollectionTube上，12,000rpm离心2分钟。
将RNASpin Column安置于1.5ml的RNase Free CollectionTube上，在RNA SpinColumn膜中央处加入50～200μl的RNase Free dH2O室温静置5分钟。
12,000rpm离心2分钟洗脱RNA。
将第一次的洗脱液重新加回至RNA Spin Column中，室温静置5分钟，12,000rpm离心2分钟洗脱RNA。
使用nano测定RNA浓度。将每个样本的浓度和体积调整至相同水平。
(2)去除基因组DNA反应：采用<TB Green qPCR>法，于冰上配制反应液(10μL体系)，配方如下(Total RNA为1ng)；室温静置5min，然后置于4℃保存。
表2去除基因组DNA反应液配方
(3)反转录反应采用<TB Green qPCR>法，于冰上配制反应液，配方如表3所示。
表3反转录反应液配方
将反应液置于PCR扩增仪中，设置程序37℃45min，85℃5s，4℃终止并保存。
(4)Real Time PCR反应，于冰上配制反应液，配方如表4所示。
表4qPCR反应液配方
其中，检测基因PPARγ的正向引物:TTGAATGTCGTGTCTGTGGAG(SEQ ID NO:1)；
检测PPARγ基因的反向引物:CGAATGGTGATTTGTCTGTTG(SEQ ID NO:2)；
内参基因为GAPDH的正向引物:CTTTGTCAAGCTCATTTCCTGG(SEQ ID NO:3)；
GAPDH的反向引物:TCTTCCTCTTGTGCTCTTGC(SEQ ID NO:4)。
将反应液放入qPCR仪器，设置程序：95℃预变性10min；95℃变性10s；60℃退火20s；72℃延伸15s，进行40个循环。
(5)数据处理：利用比较循环阈值法(2-ΔΔCT)计算基因的相对表达量。
结果见图5。结果表明利用干细胞生长促进剂2培养干细胞不影响其成脂分化能力。
实施例7
用150mg/mL的干细胞生长促进剂2培养间充质干细胞(记为150)，同时以相同浓度的熊果苷替代干细胞生长促进剂2中雪莲果提取物制备得到的150mg/mL的干细胞生长促进剂4(记为150')，同时按照实施例4的方法设置阴性对照组和阳性对照组。按照实施例4的方法检测细胞活力。
结果见图6。替换后的干细胞生长促进剂2虽能显著促进干细胞增殖，但与原配方之间也存在极显著差异，表明原干细胞生长促进剂2组分具有更好的促增殖效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种干细胞生长促进剂，其特征在于，由质量百分含量15％～25％肉苁蓉肽、质量百分含量25％～35％低聚木糖和质量百分含量40％～60％菊芋提取物组成。
2.一种干细胞生长促进剂，其特征在于，由质量百分含量15％～25％肉苁蓉肽、质量百分含量25％～35％低聚木糖、质量百分含量25％～35％雪莲果提取物和18％～22％茶多酚组成。
3.一种干细胞生长促进剂，其特征在于，由质量百分含量15％～25％肉苁蓉肽、质量百分含量10％～12％低聚木糖、质量百分含量18％～22％菊芋提取物、18％～22％雪莲果提取物、18％～22％茶多酚和9％～11％谷胱甘肽组成。
4.一种促进细胞生长的细胞培养基，其特征在于，以无血清培养基为基础，添加不低于100mg/mL权利要求1～3任意一项所述干细胞生长促进剂。
5.根据权利要求4所述细胞培养基，其特征在于，所述干细胞生长促进剂的浓度为120～400mg/mL。
6.根据权利要求4或5所述细胞培养基，其特征在于，所述干细胞生长促进剂的浓度为150～200mg/mL。
7.权利要求1～3任意一项所述干细胞生长促进剂或权利要求4～6任意一项所述细胞培养基在干细胞培养中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述干细胞为间充质干细胞。
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