CN115943949B - 一种细胞冻存液及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞冻存液及其制备方法和应用。所述细胞冻存液包括复方电解质、人血白蛋白、氯化钠、葡萄糖、右旋糖酐、AB血清和二甲基亚砜。本发明深入分析细胞冻存过程，重新设计细胞冻存液的组分，利用复方电解质、人血白蛋白、氯化钠、葡萄糖、右旋糖酐、AB血清和二甲基亚砜协同配合，各组分缺一不可，有效降低冻存过程中的细胞损伤，有效保持经冻存后细胞的活性，保持复苏后细胞高活率及高活性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种细胞冻存液及其制备方法和应用，尤其涉及一种γδT细胞冻存液及其制备方法和应用。
背景技术
根据TCR受体的不同，可将T细胞分为αβT细胞和γδT细胞。其中，αβT细胞占T细胞总数的95％以上，γδT细胞则至占T细胞总数的1％～5％，且主要分布于黏膜相关淋巴组织中。γδT细胞是一种能杀伤癌细胞，肿瘤干细胞的免疫细胞，其被用于γδT细胞疗法，进行癌症治疗，γδT细胞虽然所占比例低，但对来自39个恶性肿瘤的约18000个人类肿瘤表达特征的荟萃分析表明，肿瘤内γδT细胞的表达是对生存率最有利的预后指标之一。近年来γδT细胞已经被用于肿瘤免疫的细胞治疗，并在临床治疗中具有良好的效果；然而目前γδT细胞的冻存效率较低，表现为复苏后活率低和肿瘤杀伤能力弱，大大限制了临床应用。
传统的细胞冻存液通常为纯胎牛血清中添加一定比例的二甲基亚砜，二甲基亚砜，可以减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性，可以在细胞冻存过程中保护细胞，在冻存液中加入血清，可以为细胞提供营养，同时，血清中富含的蛋白等大分子物质可以对细胞有较好的保护作用，但是胎牛血清的使用在临床中可能会引入动物源性成分，增加细菌和病毒等感染风险。目前市面上可应用于临床的冻存液大多是针对T细胞、NK细胞、干细胞类的冻存液，如WO 2017/049166Al中公开的CAR-T细胞冻存液、上海慧存医疗科技有限公司自主研发的含10％DMSO，无血清药用级细胞冻存液(ClecellTM)、南京三生生物科技有限公司出售的治疗用细胞冷冻保护剂亘诺，但这类冻存液对γδT细胞的冻存效果一般，较难满足复苏后细胞具备高活率及高活性的要求。
综上所述，提供一种高效细胞冻存液，尤其针对γδT细胞的高效冻存，对于免疫细胞治疗领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种细胞冻存液及其制备方法和应用，所述细胞冻存液具有良好的细胞冻存效果，尤其针对免疫细胞，如γδT细胞，经冻存后复苏后仍具备高活率及高活性，维持良好肿瘤杀伤能力。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种细胞冻存液，所述细胞冻存液包括复方电解质、人血白蛋白、氯化钠、葡萄糖、右旋糖酐、AB血清和二甲基亚砜。
本发明中，深入分析细胞冻存过程，重新设计细胞冻存液的组分，利用复方电解质、人血白蛋白、氯化钠、葡萄糖、右旋糖酐、AB血清和二甲基亚砜协同配合，有效降低冻存过程中的细胞损伤，有效保持经冻存后细胞的活性，保持复苏后细胞高活率及高活性。
优选地，所述细胞冻存液中所述复方电解质的体积百分比为10％～35％。
优选地，所述细胞冻存液中所述人血白蛋白的质量百分比为2.5％～8.75％。
优选地，所述细胞冻存液中所述氯化钠的质量百分比为0.0956％～0.141％。
优选地，所述细胞冻存液中所述葡萄糖的质量百分比为1.0625％～1.5625％。
优选地，所述细胞冻存液中所述右旋糖酐的质量百分比为0.1％～1％。
优选地，所述细胞冻存液中所述AB血清的体积百分比为5％～10％。
优选地，所述细胞冻存液中所述二甲基亚砜的质量百分比为1％～10％。
优选地，所述细胞冻存液还包括水。
优选地，所述细胞冻存液按质量百分比计含有10％～35％复方电解质、2.5％～8.75％人血白蛋白、0.0956％～0.141％氯化钠、1.0625％～1.5625％葡萄糖、0.1％～1％右旋糖酐、5％～10％AB血清和1％～10％二甲基亚砜，余量为水。
本发明中，控制所述细胞冻存液中各组分含量，能够进一步提高冻存效果。
优选地，所述右旋糖酐包括右旋糖酐40或右旋糖酐70。
优选地，所述复方电解质来自于复方电解质注射液。
优选地，所述氯化钠来自于氯化钠注射液。
优选地，所述葡萄糖来自于葡萄糖注射液。
优选地，所述右旋糖酐来自于右旋糖酐40葡萄糖注射液。
优选地，所述人血白蛋白来自于人血白蛋白注射液。
本发明中，市售复方电解质注射液、人血白蛋白注射液、氯化钠注射液、葡萄糖注射液、右旋糖酐40葡萄糖注射液、AB血清和二甲基亚砜及本领域中通用试剂均适用于本发明，不作特殊限制。
优选地，所述细胞冻存液中所述复方电解质注射液的体积百分比为21.25％～31.25％。
优选地，所述细胞冻存液中所述人血白蛋白注射液的体积百分比为10％～35％。
优选地，所述细胞冻存液中所述氯化钠注射液的体积百分比为10.625％～15.625％。
优选地，所述细胞冻存液中所述葡萄糖注射液的体积百分比为10.625％～15.625％。
优选地，所述细胞冻存液中所述右旋糖酐40葡萄糖注射液的体积百分比为10％。
优选地，所述细胞冻存液中所述AB血清的体积百分比为5％～10％。
优选地，所述细胞冻存液中所述二甲基亚砜的体积百分比为7.5％。
优选地，所述复方电解质注射液含有氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁。
优选地，所述复方电解质注射液中各组分质量浓度为：5.26g/L氯化钠、5.02g/L葡萄糖酸钠、3.68g/L醋酸钠、0.37g/L氯化钾以及0.30g/L氯化镁。
优选地，所述人血白蛋白注射液的质量浓度为250g/L。
优选地，所述氯化钠注射液的质量浓度为9g/L。
优选地，所述葡萄糖注射液的质量浓度为100g/L。
优选地，所述右旋糖酐40葡萄糖注射液包含60g/L右旋糖酐40和50g/L的葡萄糖。
本发明的细胞冻存液成分不含动物源血清，不存在引入动物源抗原的风险，二甲基亚砜含量较低，该含量无论对人体亦或是γδT细胞的毒性均大大降低，更加安全。
第二方面，本发明提供第一方面所述的细胞冻存液的制备方法，所述制备方法包括：
将复方电解质、人血白蛋白、氯化钠、葡萄糖、右旋糖酐、AB血清和二甲基亚砜混合，得到所述细胞冻存液。
本发明中，所述制备方法还可包括：
将人血白蛋白、氯化钠、葡萄糖、右旋糖酐、AB血清充分混合配置为A液；将二甲基亚砜和复方电解质混合配置为B液，最后将A液、B液混合，得到所述细胞冻存液。该方法能够避免二甲基亚砜和其他成分同时加入而形成沉淀，继而可能影响冻存效果。
第三方面，本发明提供第一方面所述的细胞冻存液在细胞冷冻保存中的应用。
本发明中，所述细胞冻存液组分通过深入分析细胞冻存过程而设计，理论上适用于任何动物细胞，不作特殊限制，此外，本发明还进一步发现所述细胞冻存液针对γδT细胞具有良好的冻存效果，能够有效保持冻存复苏后γδT细胞的活率及活性以及肿瘤杀伤能力
本发明中，所述细胞可选自T细胞、NK细胞、单个核细胞、DC细胞、γδT细胞或CAR-T细胞中的任意一种或至少两种的组合。
第四方面，本发明提供一种冷冻保存细胞的方法，所述方法包括：
将待保存细胞与第一方面所述的细胞冻存液混合，得到混合液，将所述混合液进行降温并置于液氮保存。
优选地，所降温的程序包括：以1～2℃/min降温至-10℃～-12℃，以25～30℃/min降温至-50℃～-60℃，以10～12℃/min升温至-20℃～-30℃，以1～5℃/min降温至-80℃～-100℃。
优选地，所述降温前还包括将所述混合液置于2℃～8℃进行预冷的步骤。
优选地，所述混合液中细胞的密度为1～5×107cells/mL，包括但不限于1×107cells/mL、2×107cells/mL、3×107cells/mL、4×107cells/mL或5×107cells/mL。
本发明中，设计分段式程序降温程序，能够进一步适配所述细胞冻存液，从而进一步提高冻存效果。
本发明中，所述细胞可选自T细胞、NK细胞、单个核细胞、DC细胞、γδT细胞或CAR-T细胞中的任意一种或至少两种的组合。
第五方面，本发明提供第一方面所述的细胞冻存液在制备细胞治疗药物中的应用。
第六方面，本发明提供一种细胞制剂，所述细胞制剂包括第一方面所述的细胞冻存液和活细胞。
本发明中，所述细胞可选自T细胞、NK细胞、单个核细胞、DC细胞、γδT细胞或CAR-T细胞中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的细胞冻存液中复方电解质、人血白蛋白、氯化钠、葡萄糖、右旋糖酐、AB血清和二甲基亚砜协同配合，各组分缺一不可，有效降低冻存过程中的细胞损伤，有效保持经冻存后细胞的活性，保持复苏后细胞高活率及高活性；
(2)本发明的细胞冻存液不含动物源血清，不存在引入动物源抗原的风险，二甲基亚砜含量较低，该含量无论对人体亦或是γδT细胞的毒性均大大降低，更加安全；
(3)本发明的冷冻保存细胞的方法，设计分段式程序降温程序，能够进一步适配所述细胞冻存液，从而进一步提高冻存效果，有效保证了γδT细胞的存活率，经冻存后的γδT细胞仍保持良好的细胞活性，细胞回收率高。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
本发明具体实施例中，以γδT细胞为例验证本发明的细胞冻存液及冷冻保存存细胞的方法。
本发明实施例中采用的试剂：1.复方电解质注射液，四川科伦药业股份有限公司，500mL：氯化钠2.63g氯化钠，2.51g葡萄糖酸钠，1.84g醋酸钠，0.185g氯化钾，0.15g氯化镁；2.人血白蛋白，奥克特珐玛AB公司，50mL，12.5g；3.0.9％氯化钠注射液，安徽丰原药业股份有限公司，500mL，4.5g；4.10％葡萄糖注射液，安徽丰原药业股份有限公司，500mL，50g；5.右旋糖酐40葡萄糖注射液，四川科伦药业股份有限公司，500mL：30g右旋糖酐40和25g葡萄糖；6.AB血清，Gemini公司，100mL；7.二甲基亚砜，奥利金生物医学公司，70mL。
实施例1
本实施例提供一种细胞冻存液和冷冻保存细胞的方法，所述细胞冻存液按体积百分比计由以下成分组成(体积比)：复方电解质注射液21.25％、人血白蛋白(质量百分比为25％)30％、氯化钠(质量百分比为0.9％)注射液10.625％、葡萄糖(质量百分比为10％)注射液10.625％、右旋糖酐40葡萄糖(质量百分比为5％)注射液10％、AB血清10％和二甲基亚砜7.5％。所述细胞冻存液的制备方法包括：
(1)按比例将人血白蛋白、0.9％氯化钠注射液、10％葡萄糖注射液、右旋糖酐40葡萄糖注射液、AB血清充分混合均匀配置为A液；
(2)将复方电解质注射液和二甲基亚砜混匀配置为B液；
(3)将步骤(1)、步骤(2)得到的A液和B液均置于4℃保存。
所述冷冻保存存细胞的方法包括以下步骤：
(1)将上述得到的A液和B液混匀，加入待冻存的γδT细胞，吹打均匀，所述冻存液中γδT细胞的密度为1×107cells/mL；
(2)将步骤(1)得到的细胞悬液置于4℃条件下静置10min，然后按降温程序：以1℃/min降温至-12℃，以30℃/min降温至-60℃，以10℃/min升温至-30℃，以1℃/min降温至-80℃进行降温，降温完成后转移至液氮中保存。
实施例2
本实施例提供一种细胞冻存液和冷冻保存细胞的方法，与实施例1相比，区别仅在于所述细胞冻存液由以下成分组成：复方电解质注射液31.25％、人血白蛋白10％、0.9％氯化钠注射液15.625％、10％葡萄糖注射液15.625％、右旋糖酐40葡萄糖注射液10％、AB血清10％、二甲基亚砜7.5％。
实施例3
本实施例提供一种细胞冻存液和冷冻保存存细胞的方法，与实施例1相比，区别仅在于所述细胞冻存液由以下成分组成：复方电解质注射液21.25％、人血白蛋白35％、0.9％氯化钠注射液10.625％、10％葡萄糖注射液10.625％、右旋糖酐40葡萄糖注射液10％、AB血清5％、二甲基亚砜7.5％。
实施例4
本实施例提供一种细胞冻存液和冷冻保存细胞的方法，与实施例1相比，区别仅在于所述细胞冻存液由以下成分组成：复方电解质注射液31.25％、人血白蛋白25％、0.9％氯化钠注射液10.625％、10％葡萄糖注射液10.625％、右旋糖酐40葡萄糖注射液10％、AB血清5％、二甲基亚砜7.5％。
实施例5
本实施例提供一种细胞冻存液和冷冻保存细胞的方法，与实施例1相比，区别仅在于所述细胞冻存液由以下成分组成：复方电解质注射液31.25％、人血白蛋白15％、0.9％氯化钠注射液15.625％、10％葡萄糖注射液15.625％、右旋糖酐40葡萄糖注射液10％、AB血清5％、二甲基亚砜7.5％。
实施例6
本实施例提供一种细胞冻存液和冷冻保存细胞的方法，与实施例1相比，区别仅在于，所述降温程序为：以1℃/min降温至-80℃。
实施例7
本实施例提供一种细胞冻存液和冷冻保存细胞的方法，与实施例1相比，区别仅在于所述细胞冻存液由以下成分组成：复方电解质注射液20％、人血白蛋白38％、0.9％氯化钠注射液3％、10％葡萄糖注射液4％、右旋糖酐40葡萄糖注射液11.5％、AB血清12％、二甲基亚砜11.5％。
实施例8
本实施例提供一种细胞冻存液和冷冻保存细胞的方法，与实施例1相比，区别仅在于所述细胞冻存液由以下成分组成：复方电解质注射液40％、人血白蛋白6％、0.9％氯化钠注射液18％、10％葡萄糖注射液20％、右旋糖酐40葡萄糖注射液6％、AB血清3％、二甲基亚砜7％。
对比例1
本对比例与实施例1相比，区别仅在于所述细胞冻存液由以下成分组成：复方电解质注射液31.25％、人血白蛋白20％、葡萄糖/氯化钠注射液31.25％、右旋糖酐40葡萄糖注射液10％、二甲基亚砜7.5％(参考WO 2017/049166 Al)。
对比例2
本对比例与实施例1相比，区别仅在于所述细胞冻存液采用上海慧存医疗科技有限公司自主研发的含10％DMSO，无血清药用级细胞冻存液(ClecellTM)。
对比例3
本对比例与实施例1相比，区别仅在于所述细胞冻存液采用南京三生生物科技有限公司出售的治疗用细胞冷冻保护剂亘诺。
对比例4
本对比例与实施例1相比，区别仅在于将复方电解质按比例增加到葡萄糖、右旋糖酐40和AB血清。
对比例5
本对比例与实施例1相比，区别仅在于将葡萄糖按比例增加到复方电解质、右旋糖酐40和AB血清。
对比例6
本对比例与实施例1相比，区别仅在于将右旋糖酐40按比例增加到复方电解质、葡萄糖和AB血清。
对比例7
本对比例与实施例1相比，区别仅在于将AB血清按比例增加到复方电解质、葡萄糖和右旋糖酐40。
试验例1
本试验例进行细胞复苏检测。
将上述实施例1～8、对比例1～7中的冻存管取出，置于37℃恒温水浴锅中快速复苏，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，用含10％FBS的1640培养基重悬制成细胞悬液，取出20μL细胞悬液进行AO/PI染色，检测细胞活率和回收率，细胞活率＝活细胞数/总细胞数；细胞回收率＝复苏后活细胞数/复苏前活细胞数，结果如表1所示。
细胞复苏后培养：根据上述计数结果，将各组别细胞密度调整为3×106cells/mL，取少量细胞悬液于24孔细胞培养板中培养，分别于Day 1、Day 3、Day 4、Day 6进行细胞活率检测，结果如表2所示。
表1
表2
| 样品 | Day0活率 | Day1活率 | Day3活率 | Day5活率 |
| 实施例1 | 87.73％ | 34.2％ | 43.26％ | 73.66％ |
| 实施例2 | 87.35％ | 34.13％ | 37.73％ | 65.47％ |
| 实施例3 | 87.82％ | 35.21％ | 50.93％ | 84.79％ |
| 实施例4 | 90.79％ | 36.89％ | 43.03％ | 71.06％ |
| 实施例5 | 89.25％ | 37.18％ | 40.9％ | 69.73％ |
| 实施例6 | 87.89％ | 34.47％ | 32.28％ | 59.17％ |
| 实施例7 | 87.17％ | 20.64％ | 10.45％ | 20.04％ |
| 实施例8 | 85.07％ | 27.48％ | 17.11％ | 38.99％ |
| 对比例1 | 85.64％ | 28.79％ | 28.4％ | 56.96％ |
| 对比例2 | 83.41％ | 28.63％ | 18.14％ | 27.69％ |
| 对比例3 | 86.69％ | 26.41％ | 24.78％ | 44.02％ |
| 对比例4 | 83.92％ | 32.76％ | 39.43％ | 51.01％ |
| 对比例5 | 88.53％ | 31.01％ | 29.4％ | 47.33％ |
| 对比例6 | 87.18％ | 30.17％ | 28.17％ | 50.39％ |
| 对比例7 | 89％ | 28.25％ | 27.63％ | 50.31％ |
由表1可知，本发明冻存液具有良好的冻存效果，能够有效保持复苏细胞活率，活细胞回收率最高可达97.16％，相较于市售的几款冻存液其冻存效果有明显提升，此外，对比实施例1和实施例6结果可知，本发明控制降温程序，能够进一步适配所述细胞冻存液，从而进一步提高冻存效果；分析实施例7和8结果可知，其中未严格控制各组分含量，活细胞回收率下降，表明本发明控制所述细胞冻存液中各组分含量，能够进一步提高冻存效果。
由表2可知，本发明冻存液具有良好的冻存效果，能够有效保持复苏细胞活性，复苏培养细胞活率对比中，γδT细胞培养效果相对更好，细胞状态恢复更快，培养第五天细胞活率最低为65.47％，最高为84.79％，表明冻存的细胞活性更高，相较于市售的几款冻存液其冻存效果有明显提升；分析实施例7和8结果可知，其中未严格控制各组分含量，细胞活性下降，表明本发明控制所述细胞冻存液中各组分含量，能够进一步提高冻存效果；此外，对比实施例1和实施例6结果可知，本发明控制降温程序，能够进一步适配所述细胞冻存液，从而进一步提高冻存效果；对比实施例1和对比例4-7可知，本发明利用复方电解质注射液、人血白蛋白、氯化钠、葡萄糖、右旋糖酐、AB血清和二甲基亚砜协同配合，有效降低冻存过程中的细胞损伤，有效保持经冻存后细胞的活性，保持复苏后细胞高活率及高活性。
综上所述，本发明深入分析细胞冻存过程，重新设计细胞冻存液的组分，利用复方电解质、人血白蛋白、氯化钠、葡萄糖、右旋糖酐、AB血清和二甲基亚砜协同配合，各组分缺一不可，有效降低冻存过程中的细胞损伤，有效保持经冻存后细胞的活性，保持复苏后细胞高活率及高活性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (6)
1.一种利用γδT细胞冻存液的冻存方法，其特征在于，所述细胞冻存液包括复方电解质、人血白蛋白、氯化钠、葡萄糖、右旋糖酐、AB血清和二甲基亚砜；
所述复方电解质来自于复方电解质注射液；
所述氯化钠来自于氯化钠注射液；
所述葡萄糖来自于葡萄糖注射液；
所述右旋糖酐来自于右旋糖酐40葡萄糖注射液；
所述人血白蛋白来自于人血白蛋白注射液；
所述细胞冻存液按体积百分比计包括21.25%~31.25%复方电解质注射液、10%~35%人血白蛋白注射液、10.625%~15.625%氯化钠注射液、10.625%~15.625%葡萄糖注射液、10%右旋糖酐40葡萄糖注射液、5%~10%AB血清和7.5%二甲基亚砜；
所述细胞冻存液按质量百分比计含有10%~35%复方电解质、2.5%~8.75%人血白蛋白、0.0956%~0.141%氯化钠、1.0625%~1.5625%葡萄糖、0.1%~1%右旋糖酐、5%~10% AB血清和1%~10%二甲基亚砜，余量为水；
所述复方电解质注射液含有氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁。
2.权利要求1所述的细胞冻存液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将复方电解质、人血白蛋白、氯化钠、葡萄糖、右旋糖酐、AB血清和二甲基亚砜混合，得到所述细胞冻存液。
3.一种冷冻保存细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：
将待保存细胞与权利要求1所述的细胞冻存液混合，得到混合液，将所述混合液进行降温并置于液氮保存。
4.根据权利要求3所述的冷冻保存细胞的方法，其特征在于，所降温的程序包括：以1~2℃/min降温至-10℃~-12℃，以25~30℃/min降温至-50℃~-60℃，以10~12℃/min升温至-20℃~-30℃，以1~5℃/min降温至-80℃~-100℃。
5.权利要求1 所述的细胞冻存液在制备细胞治疗药物中的应用。
6.一种细胞制剂，其特征在于，所述细胞制剂包括权利要求1所述的细胞冻存液和活细胞。
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