CN109601526A - T细胞冻存液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞生物学领域，更具体涉及生物冻存技术领域，尤其涉及活性免疫细胞的冻存液及其制备方法。本发明的冻存液含有二甲基亚砜(DMSO)、右旋糖苷40、人血清白蛋白(HSA)、氯化钙、氯化钾、乳酸钠。本发明的冻存液对细胞毒性小，不影响细胞原本的功能，能为细胞的冷冻、储存和解冻过程提供安全的保护。

Description

T细胞冻存液及其制备方法
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，更具体涉及生物冻存技术领域，尤其涉及活性免疫细胞的冻存液及制备方法。
背景技术
肿瘤免疫治疗是指直接或间接利用人体免疫系统对肿瘤患者进行有效治疗的方法，主要包括肿瘤疫苗、免疫检查点抑制剂、细胞免疫治疗以及细胞因子类等。备受关注的细胞免疫治疗已从早期的LAK(淋巴因子激活的杀伤细胞)、TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)、 CIK(多种细胞因子诱导的杀伤细胞)及CTL(细胞毒性T淋巴细胞)等传统或非特异性细胞疗法，发展到特异性的CAR-T(嵌合抗原受体修饰的T细胞)和TCR-T(T细胞受体嵌合型T细胞)等细胞疗法。随着细胞治疗在临床上的广泛应用，细胞制品保存和低温运输面临巨大的挑战。
在常温或37℃环境中，细胞内生化反应活跃，代谢旺盛，这些生理过程产生大量的氧自由基和脂质过氧化物会引起环境pH值和渗透压变化，造成细胞溶胀和死亡。在细胞运输中，这一问题更为突出。在冷冻状态下，细胞几乎停止生命活动和新陈代谢，因此通常将细胞冷冻后用液氮或干冰进行转运。细胞冷冻和解冻时，容易受到溶液损伤和冰晶损伤，引发细胞死亡。
细胞冻存技术是细胞制品保存的重要手段。大量的临床试验表明人体免疫细胞功能受到肿瘤等众多疾病、衰老、环境污染、应激压力等因素的影响，直接决定了临床治疗的效果。在迫不得已情况下使用配型的异体细胞，免疫排斥风险也很大。细胞制剂区别于小分子化学药物、蛋白质药物，具有制备流程长、生产成本高、不同批次间质量控制困难等特点，成为细胞治疗大踏步前进道路上不得不攻克的瓶颈之一。为确保细胞制剂的质量控制和临床治疗，细胞制剂从细胞来源到扩增培养的终产品都离不开深低温细胞冻存技术。
1972年，Mazur等首先根据中国仓鼠组织培养细胞的低温保存实验数据分析，提出关于冷冻损伤的两因素假说，即冰晶损伤和溶液损伤假说。
这个假说认为随着温度的下降，细胞内外的水分结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而致的细胞损伤即就是冰晶损伤(Intracellular ice damage)。冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。同时随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，细胞膜上的脂质会因长时问暴露在高溶质的溶液中而受到损坏，细胞发生渗漏，导致在复温时大量水分渗入细胞内造成细胞死亡。这种因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶液损伤(Solution damage)。溶液损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重。
现阶段冷冻保护剂总体上分为两种——渗透性和非渗透性，可以理解成细胞膜内冷冻保护剂和细胞外冷冻保护剂。两者对组织或细胞冷冻保护的共同之处在于均可以相对提高冻存液电解质浓度，相对降低电解质浓度的剧变，并减少由此带来的细胞损伤。渗透性冷冻保护剂主要为DMSO、丙三醇(G)、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、乙酰胺、甲醇等小分子类物质；非渗透性冷冻保护剂则是聚乙烯吡咯烷酮—PVP、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉等大分子类物质。以二甲基亚砜为例在同一过程中解释冷冻保护剂的保护作用：同是从室温开始往-80℃降温，不同的是此时的细胞已经浸泡在 10％DMSO的培养液中，零度以上没有问题，在零度往下的时候，水分子趋于迅速形成氢键，但是DMSO是强力氢键破坏剂，水分子只能缓缓结晶且由于DMSO的干扰锋锐不再。同时电解质浓度开始相对升高，但是考虑到电解质浓度本身就已经很高(10％的 DMSO)，因而前后环境的变化尚在细胞的承受范围之内——细胞成功保存。
现有的CAR-T冻存液配方如美国诺华公司CAR-T冻存液配方之一，其含有以下组分：Plasma-Lyte A(血浆溶菌素A)：31.25％，55％葡萄糖/45％氯化钠：31.25％，右旋糖酐40(LMD)/5％葡萄糖：10％，25％人血白蛋白(HSA)：20％，二甲基亚砜(DMSO)：7.5％；或诺华的配方之二，其含有以下组分：20％HSA(人血清白蛋白)： 50％，HBSS(Hank's平衡盐溶液)：40％，DMSO：10％；或诺华的配方之三，其含有以下：20％HSA：50％，Plasma-Lyte A(血浆溶菌素A)：40％，DMSO：10％。这三种配方因其含有HBSS或Plasma-Lyte A，这两种成分中均含有多种离子，配方更为复杂，制备步骤多，成本高。
又如STEMCELL Technologies公司冻存液产品，其含有CS10。目前该冻存液的成分尚未被公开，其成分存在一定的风险性。
目前来说，现有的细胞冻存液可能或多或少会存在一些问题，研究新的细胞冻存液，以便更好的支持肿瘤免疫疗法是目前很多研究者孜孜不倦的追求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的细胞保存用的冻存液。
本发明的进一步目的在于提供一种成分简单的细胞冻存液。
本发明的进一步目的在于提供一种成本低的细胞冻存液。
本发明的进一步目的在于提供一种尤其适用于T细胞保存用的冻存液。
本发明的进一步目的在于提供一种细胞毒性更小的细胞冻存液。
本发明的进一步目的在于提供一种副作用更小的细胞冻存液。现有的细胞冻存液，基本上含有二甲基亚砜(DMSO)。DMSO是目前最好的细胞冻存保护剂，可以说是冻存液的必要组分。DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。同时，DMSO也是一种细胞毒性和基因毒性很大的化学试剂。一方面，冻存液中DMSO在复苏时，对冻存的细胞有直接严重的损伤(低温时二甲基亚砜的细胞毒性受到抑制)：研究结果表明，培养液中DMSO浓度为10％时，细胞生长抑制率近100％；1％浓度时抑制率为35％，即使是0.04％的浓度，DMSO对细胞的生长也有不利的影响。|另一方面，冻存液中存在的 DMSO存在的能引起超敏反应，直接回输人体可引起患者恶心呕吐、暂时性高血压，房室传导阻滞等副作用。
为此，本发明的主要目的之一在于制备一款对冻存细胞影响的冻存液。
为实现上述目的，本发明采用了以下的技术手段：
一方面，本发明提供了一种细胞冻存液，其含有以下体积分数的组分：
(1)右旋糖酐40：4.5-6.5％；
(2)氯化钙：0.01-0.03％；
(3)氯化钾：0.02-0.04％；
(4)乳酸钠：0.2-0.4％；
(5)HSA：8-10％；
(6)DMSO：5-8％；
(7)溶剂为生理盐水(质量分数0.9％的氯化钠)。
作为优选的实施方式，其含有以下组分：
(1)右旋糖酐40：4.5-6.5％；
(2)氯化钙：0.015-0.025％；
(3)氯化钾：0.025-0.035％；
(4)乳酸钠：0.3-0.35％；
(5)HSA：9-10％；
(6)DMSO：5-6％；
(7)溶剂为生理盐水。
作为更优选的实施方式，其含有以下组分：：
(1)右旋糖酐40：5％；
(2)氯化钙：0.02％；
(3)氯化钾：0.03％；
(4)乳酸钠：0.31％；
(5)HSA：10％；
(6)DMSO：5％；
(7)溶剂为生理盐水。
上述的细胞冻存液的制备方法，仅需将各组分按质量分数充分混匀。
本发明中，上述的细胞冻存液可以为多种细胞或组织的冷冻、储存和解冻过程提供安全的保护环境。尤其是为免疫细胞的冷冻、储存和解冻过程提供安全的保护环境。作为优选的实施方式，所述的免疫细胞选自T细胞或者基于T细胞的产品。其中，基于T细胞的产品选自以下群组：LAK(淋巴因子激活的杀伤细胞)、TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)、 CIK(多种细胞因子诱导的杀伤细胞)、CTL(细胞毒性T淋巴细胞)、CAR-T(嵌合抗原受体修饰的T细胞)和TCR-T(T细胞受体嵌合型T细胞)等。进一步地，所述的细胞为动物细胞；更优选为人细胞。作为优选的实施方式，所述的细胞冻存液用于CAR-T 的冻存。
本发明中，所述的细胞冻存液对于冻存曲线无特别要求，现有技术中常规的细胞的冻存曲线均可以，其可以适于多种条件下的冻存保护，作为示范性的例子，可以选择以下的冻存曲线：
曲线1
(1)以每分钟1℃的速度降温，直至样本温度达到-4℃。
(2)以每分钟25℃的速度降温，直到箱体温度达到-40℃。
(3)以每分钟5℃的速度升温，直到箱体温度达到-14℃。
(4)以每分钟1℃的速度降温，直到样本温度达到-40℃。
(5)以每分钟10℃的速度降温，直到样本温度达到-90℃。
曲线2
(1)以每分钟1℃的速度降温，直至样本温度达到-5℃。
(2)以每分钟21℃的速度降温，直到箱体温度达到-54℃。
(3)以每分钟17℃的速度升温，直到箱体温度达到-21℃。
(4)以每分钟2℃的速度降温，直到样本温度达到-40℃。
(5)以每分钟10℃的速度降温，直到样本温度达到-80℃。
曲线3
(1)以每分钟1℃的速度降温，直至样本温度达到-4℃。
(2)以每分钟25℃的速度降温，直到箱体温度达到-40℃。
(3)以每分钟10℃的速度升温，直到箱体温度达到-12℃。
(4)以每分钟1℃的速度降温，直到样本温度达到-40℃。
(5)以每分钟10℃的速度降温，直到样本温度达到-90℃。
曲线4
(1)以每分钟5℃的速度降温，直至样本温度达到4℃。
(2)以每分钟1℃的速度降温，直到箱体温度达到-45℃。
(3)以每分钟5℃的速度升温，直到箱体温度达到-100℃。
曲线5
(1)以每分钟1℃的速度降温，直至样本温度达到-5℃。
(2)以每分钟20℃的速度降温，直到箱体温度达到-40℃。
(3)以每分钟10℃的速度升温，直到箱体温度达到-10℃。
(4)以每分钟1℃的速度降温，直到样本温度达到-35℃。
(5)以每分钟10℃的速度降温，直到样本温度达到-90℃。
作为优选的实施方式，选择冻存曲线为曲线1。在该冻存曲线下，无论是细胞复苏后的活细胞数、平均活力，以及复苏率，还是CAR-T对靶细胞的杀伤力，均维持在最好的状态。
本发明的有益效果：
(1)细胞毒性小：在多种冻存曲线下保存后再复苏，本发明冻存液保护的细胞基本上可以达到95％以上的平均活力和平均复苏率。虽然本发明的冻存液含有DMSO，但复苏后的洗涤前后活细胞数均能达到1.8×10E7，细胞活力达到90％以上，对冻存的细胞毒性小。此外，经本发明的冻存液保护后复苏的细胞，对细胞功能影响小，经冻存后的CAR- T对靶细胞依然维持高杀伤力。本发明的冻存液中含有更高浓度的HSA，一方面可以为细胞提供营养，另一方面可以在细胞冻存过程中提供非渗透性保护物质，从而更好地保护细胞，以实现更高的存活率及活力。此外，本发明的冻存液含有一定剂量的氯化钙、氯化钾、乳酸钠，可以调节体液、电解质、酸碱平衡用药，主要用于预防酸中毒、缺水症及电解质紊乱。
(2)成分简单：本发明的冻存液仅含有几种常见组分，不含未知组分，减少了对细胞活性的干扰；冻存液中不存在抗体、补体等成分，对培养细胞影响小；杂蛋白少，生产的产品后期处理容易。
(3)成本低：因成分简单，制备方法简单，其所含组分为常规组分，本发明冻存液的成本仅为市面上冻存液成本的1/5到1/3。
(4)适用范围广：本发明的冻存液适用于多种细胞或者组织。此外，针对不同的冻存曲线，本发明的冻存液均能满足保护需求。
附图说明
图1显示了不同处方和冻存曲线的细胞平均活力及复苏率。
图2显示了DMSO被洗涤前后，CAR-T的活细胞数和细胞活力，其中图A为不同冻存液及冻存曲线处理后24H，CAR-的T活细胞数和细胞活力变化；图B为不同冻存液及冻存曲线处理后25H，CAR-T活细胞数和细胞活力变化。
图3显示了不同冻存液及冻存曲线对CAR-T细胞杀伤功能的影响，其中图A为不同冻存液及冻存曲线处理后24H CAR-T和靶细胞后，IFN-gama的释放量；图B为不同冻存液及冻存曲线处理后25H CAR-T和靶细胞后，IFN-gama的释放量。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
作为一种可实施的方式，配方1中，二甲基亚砜购买自购买于美国的origen公司，为医用级别；Plasma-Lyte A购买自Baxter Healthcare公司；葡萄糖氯化钠注射液(55％葡萄糖/45％氯化钠)购买自华仁药业(日照)有限公司；右旋糖酐40葡萄糖注射液(右旋糖酐40(LMD)/5％葡萄糖)购买自上海长征富民金山制药有限公司；25％人血白蛋白 (HSA)购买自奥克特珐玛公司的注射液。
作为一种可实施的方式，配方2中，20％HSA购买自杰特贝林公司的注射液；HBSS(Hank's平衡盐溶液)购买自Thermo Fisher Scientific公司。
作为一种可实施的方式，配方3中，20％HSA购买自杰特贝林公司的注射液；二甲基亚砜购买自Mylan Institutional；Plasma-Lyte A购买自Baxter Healthcare公司。
作为一种可实施的方式，配方4购买自STEMCELL Technologies公司。
作为一种可实施的方式，配方5中，Plasma-Lyte A购买自Baxter Healthcare公司；CS10购买自STEMCELL Technologies公司。
作为一种可实施的方式，配方6中，20％HSA购买自杰特贝林公司的注射液；CS10购买自STEMCELL Technologies公司。
作为一种可实施的方式，配方7中，右旋糖酐40：5％；氯化钙：0.02％；氯化钾：0.03％；乳酸钠：0.31％；HSA：10％；DMSO：5％；溶剂是生理盐水。右旋糖酐40(注射级)购买于罗辅医药科技(上海)有限公司；二甲基亚砜购买于美国的origen公司，为医用级别；药用级氯化钙、氯化钾和乳酸钠购买于西安天正药用辅料有限公司；所述生理盐水是以0.9％氯化钠注射液的形式加入。本发明对所述生理盐水的来源没有特殊的限制。
作为一种可实施的方式，配方8中，20％HSA购买自杰特贝林公司的注射液；20％的羟乙基淀粉糊购买自华润双鹤药业股份有限公司；DMSO购买于美国的origen公司，为医用级别。
一、复苏验证方法
实施例1CAR-T细胞的制备
具体步骤参照《CN104829733A抗原结合单元稳定的嵌合抗原受体及制备方法与应用》。抽取两个健康成人(编号：24H及25H)血液，分离外周血单个核细胞 (PBMC)，磁珠分选T细胞后转染慢病毒制备成CAR-T细胞，培养7天后冻存。
实施例2冻存液
T细胞冻存液配方(8个)：
冻存配方1(B1)：Plasma-Lyte A：31.25％，55％葡萄糖/45％氯化钠：31.25％，右旋糖酐40(LMD)/5％葡萄糖：10％，25％人血白蛋白(HSA)：20％，二甲基亚砜(DMSO)：7.5％。(美国诺华公司CAR-T冻存液配方)。
冻存配方2(B2)：20％HSA(人血清白蛋白)：50％，HBSS(Hank's平衡盐溶液)：40％，DMSO：10％。(美国诺华公司CAR-T冻存液配方)
冻存配方3(B3)：20％HSA：50％，Plasma-Lyte A(血浆溶菌素A)：40％， DMSO：10％。(美国诺华公司CAR-T冻存液配方)
冻存配方4(B4)：CS10(STEMCELL Technologies公司冻存液产品)。
冻存配方5(B5)：Plasma-Lyte A(血浆溶菌素A)：50％，CS10：50％
冻存配方6(B6)：20％HSA：50％，CS10(STEMCELL Technologies公司冻存液产品)：50％。
冻存配方7(B7)：右旋糖酐40：5％；氯化钙：0.02％；氯化钾：0.03％；乳酸钠：0.31％；HSA：10％；DMSO：5％；溶剂是生理盐水。所述生理盐水是以0.9％氯化钠注射液的形式加入。
冻存配方8(B8)：20％HSA(Human Serum Albumin，人血清白蛋白)：20％，Hydroxyethyl starch paste(羟乙基淀粉糊)：70％，DMSO：10％。
配方4为市面上购买，配方5-8为自己配置，根据以上配方，预先配置好所有冻存液。加入DMSO后必须进行避光储存。配置的冻存液放置不能超过4周。冻存前，所有冻存管和冻存液均放于4℃环境中备用。
需要说明的是，上述的配方中，某些冻存液配方由多种制剂复合配置而成，如美国诺华公司CAR-T制品KYMRIAH的冻存液配方，为所述冻存配方1(B1)：Plasma-Lyte A：31.25％，55％葡萄糖/45％氯化钠：31.25％，右旋糖酐40(LMD)/5％葡萄糖： 10％，25％人血白蛋白(HSA)：20％，，二甲基亚砜(DMSO)：7.5％。冒号前面的百分号表示质量分数，冒号后面的百分号表示体积分数。实际工业过程中，可不采用多种制剂复合配置而成，而直接用单一的组分配置得到各配方，如配方7中，可直接采用以下质量分数的单一组分混合均匀制备：如冻存配方7(B7)：右旋糖酐40：5％；氯化钙：0.02％；氯化钾：0.03％；乳酸钠：0.31％；HSA：10％；DMSO：5％；溶剂是生理盐水。所述生理盐水是以0.9％氯化钠注射液的形式加入。
实施例3CAR-T细胞的冻存曲线
T细胞冻存曲线(5个)：
曲线1(A1)
(1)以每分钟1℃的速度降温，直至样本温度达到-4℃。
(2)以每分钟25℃的速度降温，直到箱体温度达到-40℃。
(3)以每分钟5℃的速度升温，直到箱体温度达到-14℃。
(4)以每分钟1℃的速度降温，直到样本温度达到-40℃。
(5)以每分钟10℃的速度降温，直到样本温度达到-90℃。
(6)此时程序结束，单击“退出程序”按钮，将程序结束。
曲线2(A2)
(1)以每分钟1℃的速度降温，直至样本温度达到-5℃。
(2)以每分钟21℃的速度降温，直到箱体温度达到-54℃。
(3)以每分钟17℃的速度升温，直到箱体温度达到-21℃。
(4)以每分钟2℃的速度降温，直到样本温度达到-40℃。
(5)以每分钟10℃的速度降温，直到样本温度达到-80℃。
(6)此时程序结束，单击“退出程序”按钮，将程序结束。
曲线3(A3)
(1)以每分钟1℃的速度降温，直至样本温度达到-4℃。
(2)以每分钟25℃的速度降温，直到箱体温度达到-40℃。
(3)以每分钟10℃的速度升温，直到箱体温度达到-12℃。
(4)以每分钟1℃的速度降温，直到样本温度达到-40℃。
(5)以每分钟10℃的速度降温，直到样本温度达到-90℃。
(6)此时程序结束，单击“退出程序”按钮，将程序结束。
曲线4(A4)
(1)以每分钟5℃的速度降温，直至样本温度达到4℃。
(2)以每分钟1℃的速度降温，直到箱体温度达到-45℃。
(3)以每分钟5℃的速度升温，直到箱体温度达到-100℃。
(4)此时程序结束，单击“退出程序”按钮，将程序结束。
曲线5(A5)
(1)以每分钟1℃的速度降温，直至样本温度达到-5℃。
(2)以每分钟20℃的速度降温，直到箱体温度达到-40℃。
(3)以每分钟10℃的速度升温，直到箱体温度达到-10℃。
(4)以每分钟1℃的速度降温，直到样本温度达到-35℃。
(5)以每分钟10℃的速度降温，直到样本温度达到-90℃。
(6)此时程序结束，单击“退出程序”按钮，将程序结束。
冻存情况：根据以上实施例2中的8种冻存液以及上述的5条冻存曲线对实施例1中的2个批次的CAR-T细胞(两个健康成人来源的CAR-T细胞)进行冻存。
加入冻存液后，4℃放置时间不宜超过30min。(两人操作，一人冻存细胞，一人进行程序降温仪器的操作)
样本按冻存曲线不同标记为A1-A5，按冻存液不同标记为B1-B8。利用冻存管进行冻存，冻存的数目为2E+07/管，每组设置3个平行管进行冻存及复苏检测。
实施例4检测冻存液对细胞活力及复苏率的影响
取出冻存细胞，37℃恒温水浴锅迅速溶解细胞，混入4ml的T细胞培养基，取样检测细胞平均活力、复苏率和活细胞数。同时因冻存液中含有DMSO，会对细胞产生损伤，细胞离心(300g×10min)去除DMSO后，用T细胞培养基重悬后，检测洗涤后的活细胞数和细胞活力的变化。利用NC200仪器测定细胞的活力以及活细胞数目。
图1显示了，对于来源于两个健康成人(编号：24H及25H)的CAR-T细胞，样本按冻存曲线不同标记为A1-A5，按冻存液不同标记为B1-B8。取出冻存细胞，37℃恒温水浴锅迅速溶解细胞，混入4ml的T细胞培养基，取样检测细胞的平均活力及复苏率。由图1可知，对于两组CAR-T，除冻存液配方B4，B5外，其余冻存液配方在五个冻存曲线下均基本上可以达到95％以上的平均活力和平均复苏率。
图2显示了，来源于两个健康成人(编号：24H及25H)的CAR-T细胞，冻存复苏之后(未洗涤)，以及离心洗涤后再检测活细胞数和细胞活力。样本按冻存曲线不同标记为A1-A5，按冻存液不同标记为B1-B8。由图2可知，对于两组CAR-T，除冻存液B1和 B5外，采用其余冻存液配方，洗涤后活细胞数达到1.8×10E7，细胞活力达到90％以上。此外，冻存曲线A2，A3不利于CAR-T细胞的冻存。
实施例5检测冻存液对CAR-T细胞杀伤功能的影响
冻存细胞于37℃迅速溶解细胞，加入4ml的培养基，对细胞进行离心， 300g×10min。计数后，与靶细胞1:1共培养，检测IFN-gama的释放，释放量越大杀伤力越强。
根据靶细胞不同，设置以下检测组：
①T-NC：只有CAR-T细胞(无靶细胞)
②CAR-T/K：靶细胞为K562细胞(CD19阴性)
③CAR-T/K19：靶细胞为K562-CD19(CD19阳性)
④CAR-T/N：靶细胞为Nalm6细胞(CD19阳性)
⑤CAR-T/R：靶细胞为Raji细胞(CD19阳性)
IFN-gama检测的具体步骤：
细胞计数，1:1比例与靶细胞共培养4h，取培养上清用Human IFN-gama(人gama干扰素)ELISA试剂盒(欣博盛生物科技有限公司；货号EHC102g.96)检测CAR-T细胞分泌IFN-gama的能力。具体操作步骤为:1)从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条；2)空白孔加标准品&标本通用稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100 μL/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90分钟；3)洗板5次；4)空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100μL/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育60分钟。5)洗板5次；6)空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100μL/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱，避光孵育30分钟；7)洗板5次；8)加入显色底物(TMB)100μL/孔，避光37℃孵箱，避光孵育15分钟；9)加入终止液100μL/孔,混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。10)绘制标准曲线：每个标准品和标本的OD值应减去空白孔的OD值，以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，手工绘制或用软件绘制标准曲线。11)通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
此前实施例4中细胞复苏活率已经排除冻存液B1和B5，所以该实施例中杀伤试验没有包括这两种冻存液。
图3A显示来源于供者24H的CAR-T产品，冻存复苏结果显示利用冻存曲线A1，A2 和A3的IFN-gama释放要明显高于A4和A5冻存曲线。图3B显示来源于供者25H的 CAR-T产品，冻存复苏结果显示利用冻存曲线A1，A2，A3和A4的IFN-gama释放要明显高于A5冻存曲线。因此，冻存曲线A1则为优选的实施方式。此外，对于不同的冻存液，则B2-B4，B6-B8则相差不大。
结合实施例4和5的分析结果，可得到下表1。其中，冻存液B1虽为诺华公司CAR- T冻存液配方，其采用该冻存液冻存的CAR-T经离心洗涤DMSO后，CAR-T的细胞活力低于预期的90％。而B2中的HBSS溶液和B3中的Plasma-Lyte A中均含有多种离子，处方较为复杂。冻存液B4和B5均为在STEMCELL Technologies公司的CS10配方上进行改进，但其在五个冻存曲线下，对CAR-T细胞的平均活力和平均复苏率基本上低于95％。冻存液B6则为STEMCELL Technologies公司的CS10配方，其成分目前还未公开，存在一定的安全风险性。冻存液B7对CAR-T细胞的平均活力和平均复苏率高于95％，且成分简单，但其中的中羟乙基淀粉类药品的安全性存在较大争议.
综上，本发明所要求保护的冻存液配方B7可以调控冻存过程的分子生物学反应，维持保存后细胞活力和对靶细胞的杀伤功能，且成分简单，制备简单，成本低，非常适用于适合CAR-T细胞冻存，应用于临床操作。
表1冻存处方及冻存曲线考察结果
缩略词：
CAR-T：嵌合抗原受体修饰的T细胞
TCR-T：T细胞受体嵌合型T细胞
Plasma-Lyte A：血浆溶菌素A
HSA：人血白蛋白
DMSO：二甲基亚砜
HBSS：Hank's平衡盐溶液
Dextran 40(右旋糖苷40)
LMD：low molecular(weight)dextran低分子量葡聚糖
Hydroxyethyl starch paste：羟乙基淀粉糊。

Claims (7)

1.一种细胞冻存液，其特征在于，包含以下质量分数的组分：
(1)右旋糖酐40：4.5-6.5％；
(2)氯化钙：0.01-0.03％；
(3)氯化钾：0.02-0.04％；
(4)乳酸钠：0.2-0.4％；
(5)HSA：8-10％；
(6)DMSO：5-8％；
(7)溶剂为生理盐水。
2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，包含以下质量分数的组分：
(1)右旋糖酐40：4.5-6.5％；
(2)氯化钙：0.015-0.025％；
(3)氯化钾：0.025-0.035％；
(4)乳酸钠：0.3-0.35％；
(5)HSA：9-10％；
(6)DMSO：5-6％；
(7)溶剂为生理盐水。
3.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，包含以下质量分数的组分：
(1)右旋糖酐40：5％；
(2)氯化钙：0.02％；
(3)氯化钾：0.03％；
(4)乳酸钠：0.31％；
(5)HSA：10％；
(6)DMSO：5％；
(7)溶剂为生理盐水。
4.根据权利要求1-3任一所述的冻存液，其制备方法为：将权利要求1-3中的各组分按质量分数配置，充分混匀。
5.权利要求1-4所述的冻存液在组织在细胞冻存中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的细胞为免疫细胞。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的免疫细胞为T细胞或基于T细胞的产品；其中，所述的基于T细胞的产品选自LAK、TIL、CIK、CTL、CAR-T和TCR-T。
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