CN110150267A - 一种临床级tcr-t细胞低dmso冻存剂及冻存方法 - Google Patents

一种临床级tcr-t细胞低dmso冻存剂及冻存方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种临床级TCR‑T细胞低DMSO冻存剂及冻存方法，所述临床级TCR‑T细胞低DMSO冻存剂包含以下组分：二甲基亚砜：2.2‑5.5％w/v；鱼精蛋白：0.5‑2％w/v；葡聚糖：0.1‑1％w/v；维生素C：0.001‑0.01％w/v；棉子糖：0.5‑2％w/v；用注射用水定容至100ml。所述冻存方法包括如下步骤：1)将所述临床级TCR‑T细胞低DMSO冻存剂直接加入至TCR‑T细胞中，混合均匀后得到细胞悬液；2)将细胞悬液装入冻存袋中；3)将冻存袋装入冻存夹中，按照1℃/min的速率进行程序降温至‑80℃，12‑16h后转至‑80℃冰箱长期存储。

Description

一种临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂及冻存方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂及冻存方法。
背景技术
在世界范围内，实体肿瘤是肿瘤患者死亡的主要原因，其中男性患者和女性患者的死亡率分别占94.4％和96.8％。手术、放疗和化疗这一类传统疗法近几年有很大的进展，但这种疗法对身体有极大负担，并且在发生恶性转移之后，无论采取何种传统疗法，都是很难彻底治愈的。但随着分子生物学技术的快速发展，人们发现T细胞可以通过基因编辑在细胞表面表达识别肿瘤抗原的T细胞受体(TCRs)或嵌合抗原受体(CARs)，以此提高免疫细胞的特异性及反应性。
基因改造T细胞的制备相对简便且更具普遍性。TCR-T细胞免疫疗法是继淋巴因子活化的杀伤细胞(lymphokineactivated killercells，LAK)和肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocyte，TIL)免疫疗法之后，针对性更强的一种细胞免疫治疗方法。
较之于CAR-T细胞治疗，TCR-T具有一些关键优势：
①通过使用完整的TCR复合物的全信号能力，更强、更全面地激活工程化的T细胞；
②MHC分子对肿瘤表面抗原的独立识别；
③在免疫突触中可募集与TCR自然结合的所有共刺激受体；
④具有对抗T细胞衰竭和免疫抑制性肿瘤微环境的措施。
TCR-T是从有靶向肿瘤活性的T细胞中克隆出TCR基因之后转导到正常T细胞里而得到TCR工程化的T细胞。这种经TCR工程化的T细胞能在体外培养中产生大量肿瘤抗原特异性的CTL细胞，发挥细胞毒性作用，回输到体内后，增强免疫系统介导的对肿瘤细胞的消除，特异地靶向和杀伤肿瘤细胞，用于对肿瘤患者的治疗。随着高通量测序技术的发展，单细胞克隆的TCR基因的鉴定工作也较以往更加简单。因此，这种以TCR为基础的免疫细胞疗法显示出了无可取代的优越性
TCR-T细胞冻存制剂是目前TCR-T细胞药物的最常见剂型。在临床肿瘤治疗的应用当中，TCR-T细胞制剂通过静脉回输的方式进入患者体内，因此质量控制是非常关键的一步。国家已出台多项细胞制剂质量控制的法律法规，因为质量检测的时间周期较长，冻存形式是细胞制剂完成完整质量检测的唯一方式；临床应用时，可单次采集T制备足够数量的TCR-T细胞，根据患者治疗状况进行分批多次回输治疗，因此，一种安全、高效、临床应用级别的TCR-T冻存剂及TCR-T细胞冻存方法是保证TCR-T细胞治疗效果的重要前提之一。
细胞的冷冻存储中，使用的冻存剂一般分为渗透型的保护剂和非渗透型的保护剂，渗透型的保护剂以二甲基亚砜居多，非渗透性的保护剂则包括一些大分子物质，包括右旋糖酐、羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、人血清白蛋白、聚蔗糖等。不同细胞保护剂对细胞的保存效果差别很大。
传统的TCR-T细胞冻存剂至少含有10％DMSO以及右旋糖酐等大分子的胞外保护剂，即使辅料级别的DMSO同样具有血管刺激，口腔黏膜刺激等副作用，在患者器官机能受损的情况下，DMSO与大分子胞外保护剂会增加患者肝脏、肾脏等器官的代谢负担；同时，利用传统的方法冻存TCR-T细胞效果参差不齐，T细胞改造得到的TCR-T细胞冻存后细胞活性维持较为困难，特别是针对肿瘤细胞的杀伤活性下降明显。
发明内容
本发明针对现有技术的缺点和不足，提供一种临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂及冻存方法，本发明的临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂去除了传统的增加肝肾代谢压力的常用大分子胞外保护剂，选用了临床注射级别的原辅料，在降低DMSO的使用量的情况下有效保护TCR-T细胞免受低温冷冻损伤，安全性高，TCR-T细胞的复苏成活率高，复苏成活率可以达到95％以上，同时很好的保证了复苏后的TCR-T细胞的生理功能和生物学特性，复苏后的TCR-T细胞对于肿瘤细胞的杀伤性能与新鲜TCR-T细胞基本一致；本发明提供的冻存方法，TCR-T细胞的冻存复苏效果达到最优化，同时操作简便，为临床TCR-T细胞的储存应用提供可靠保证。
一种临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂，包含以下组分：
二甲基亚砜：2.2-5.5％w/v
鱼精蛋白：0.5-2％w/v
葡聚糖：0.1-1％w/v
维生素C：0.001-0.01％w/v
棉子糖：0.5-2％w/v
用注射用水定容至100ml。
优选的，所述临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂包含以下组分：
二甲基亚砜：2.2％w/v
鱼精蛋白：0.5％w/v
葡聚糖：0.1％w/v
维生素C：0.002％w/v
棉子糖：0.5％w/v
用注射用水定容至100ml。
优选的，所述临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂包含以下组分：
二甲基亚砜：3.3％w/v
鱼精蛋白：1％w/v
葡聚糖：0.3％w/v
维生素C：0.005％w/v
棉子糖：1％w/v
用注射用水定容至100ml。
优选的，所述临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂包含以下组分：
二甲基亚砜：4.4％w/v
鱼精蛋白：1.5％w/v
葡聚糖：0.6％w/v
维生素C：0.008％w/v
棉子糖：1.5％w/v
用注射用水定容至100ml。
优选的，所述临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂包含以下组分：
二甲基亚砜：5.5％w/v
鱼精蛋白：2％w/v
葡聚糖：1％w/v
维生素C：0.1％w/v
棉子糖：2％w/v
用注射用水定容至100ml。
本发明还提供一种TCR-T细胞的冻存方法，所述冻存方法包括如下步骤：
1)将所述临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂直接加入至TCR-T细胞中，混合均匀后得到细胞悬液；
2)将细胞悬液装入冻存袋中；
3)将冻存袋装入冻存夹中，按照1℃/min的速率进行程序降温至-80℃，12-16h后转至-80℃冰箱长期存储。
所述步骤1)中所述临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂与TCR-T细胞在常温条件下混合，将得到的细胞悬液在冻存前放置在2-8℃环境下预冷30min。
有益技术效果为：
1)本发明的冻存剂配方简单，原料均为辅料级别，安全性高，同时能有效保护TCR-T细胞免受冷冻损伤，极大的提高了TCR-T细胞的冻存复苏活率，复苏后的细胞成活率可以达到95％以上，且复苏后的细胞维持了生理功能和生物学特性，能有效地杀伤肿瘤细胞；
2)本发明的TCR-T细胞冻存剂将TCR-T细胞在-80℃条件下保存3年后，细胞成活率维持在85％以上，说明TCR-T细胞在本发明冻存剂中-80℃存储稳定性较好。
3)目前市场上暂无针对TCR-T细胞保存的冻存剂，本发明的TCR-T细胞冻存剂及冻存方法可以有效解决TCR-T细胞存储、运输和临床应用的相关技术瓶颈，大大提高TCR-T细胞-80℃冻存时间，配方简单，大大降低了TCR-T细胞在液氮中存储运输的成本，为TCR-T细胞的临床应用提供可靠保证。
4)本发明的冻存剂，减少了DMSO的含量与大分子胞外保护剂，减少了对血管和口腔黏膜刺激等副作用，避免了DMSO与大分子胞外保护剂对肝脏、肾脏等器官造成的代谢负担。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1：
将二甲基亚砜2.2g、鱼精蛋白0.5g、葡聚糖0.1g、维生素C 0.002g和棉子糖0.5g，用注射用水定容至100mL。
实施例2
将二甲基亚砜3.3g、鱼精蛋白1g、葡聚糖0.3g、维生素C 0.005g和棉子糖1g，用注射用水定容至100mL。
实施例3
将二甲基亚砜4.4g、鱼精蛋白1.5g、葡聚糖0.6g、维生素C 0.008g和棉子糖1.5g，用注射用水定容至100mL。
实施例4
将二甲基亚砜5.5g、鱼精蛋白2g、葡聚糖1g、维生素C 0.1g和棉子糖2g，用注射用水定容至100mL。
将实施例1-4得到的冻存剂，分别在常温条件下直接重悬TCR-T细胞，混合均匀得到细胞悬液，将细胞悬液在冻存前在2-8℃环境下预冷30min；将预冷后的细胞悬液转移至冻存袋中，将冻存袋装入冻存夹，按照1℃/min的速率进行程序降温至-80℃，12-16h后转至-80℃冰箱长期存储。
利用台盼蓝染色法，对上述实施例1-4冻存的TCR-T细胞，测定不同时间段的TCR-T细胞存活率，具体结果见下表：
细胞存活率 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
12个月(％) 76.21 83.28 87.64 95.37
24个月(％) 73.27 81.04 84.18 93.25
36个月(％) 72.15 79.56 84.01 90.89
利用K562细胞对实施例4冻存的TCR-T细胞进行肿瘤杀伤检测试验，结果如下：
从上述测试结果可以看出，本发明的冻存剂能有效保护TCR-T细胞减少冷冻损伤，因减少DMSO的使用量极大提高冻存剂的安全性，同时提高TCR-T细胞的复苏成活率，3年冻存时间复苏后的TCR-T细胞成活率可以达到70％-90％以上，延长了TCR-T细胞的保存时间；用本发明的冻存剂冻存后的TCR-T细胞与未冻存的TCR-T细胞，肿瘤杀伤率相差不大，说明经本发明冻存剂冻存的TCR-T细胞维持了生理功能和生物学特性，冻存复苏后的细胞均没有细菌、真菌、支原体的污染，内毒素水平较低，检测指标符合临床应用的要求。
因为本发明的冻存剂中二甲基亚砜浓度较低，无需低温操作以降低二甲基亚砜的毒性，同时保证复苏后TCR-T细胞的活性。
二甲基亚砜是应用最广泛且高效的渗透性保护剂，二甲基亚砜能提高细胞膜对水的通透性，降低溶液的冰点，慢速程序降温可以将细胞内的水分充分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶形成造成的细胞损伤。
本发明的冻存剂中的成分鱼精蛋白，是一种碱性蛋白质，因为其安全性在食品防腐、生物医药等领域有着广泛的应用，在TCR-T细胞的-80℃冻存存储过程中，鱼精蛋白作为一种核酸结合蛋白可以保证细胞遗传物质的稳定性，以此保证TCR-T细胞复苏后的生物学功能不会被改变，能有效地杀伤肿瘤细胞；同时，鱼精蛋白还是一种高效的TCR-T细胞膜稳定性维持蛋白，鱼精蛋白通过与TCR-T细胞膜表面的蛋白结合形成稳定的复合物，大大减少细胞在冻存过程中因为膜结构破坏而导致的细胞凋亡或者死亡情况。
葡聚糖是一种大分子的非渗透性细胞保护剂，可使细胞脱水，减少细胞内冰晶形成，对细胞膜具有保护作用，维持细胞膜结构的稳定性，同时葡聚糖可以维持细胞内外电解质平衡，减少溶质损伤。
本发明所述的冻存剂还添加了维生素C，细胞在冷冻保存时,除物理损伤和化学损伤外，冷冻及复苏过程中产生氧自由基亦可造成TCR-T细胞的损伤，冻存剂中添加生物抗氧化剂维生素C可用于清除冷冻及复苏过程中产生的氧自由基，不仅提高TCR-T细胞复苏率，同时大大缓解了因为冻存而导致的TCR-T细胞的衰老和凋亡状况，维持了TCR-T细胞的生物杀伤活性。
本发明的冻存剂添加了棉子糖，减少细胞在接近冰点时胞内的冰晶形成，可以减少二甲基亚砜的使用，维持细胞膜的稳定性，有效的保护细胞，并有效降低细胞毒性。
如上所述，尽管参照特定的优选实施例和测试结果已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制，在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上做出各种变化。

Claims (7)

1.一种临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂，其特征在于，所述临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂包含以下组分：
二甲基亚砜：2.2-5.5％w/v
鱼精蛋白：0.5-2％w/v
葡聚糖：0.1-1％w/v
维生素C：0.001-0.01％w/v
棉子糖：0.5-2％w/v
用注射用水定容至100ml。
2.根据权利要求1所述的临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂，其特征在于，所述临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂包含以下组分：
二甲基亚砜：2.2％w/v
鱼精蛋白：0.5％w/v
葡聚糖：0.1％w/v
维生素C：0.002％w/v
棉子糖：0.5％w/v
用注射用水定容至100ml。
3.根据权利要求1所述的临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂，其特征在于，所述临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂包含以下组分：
二甲基亚砜：3.3％w/v
鱼精蛋白：1％w/v
葡聚糖：0.3％w/v
维生素C：0.005％w/v
棉子糖：1％w/v
用注射用水定容至100ml。
4.根据权利要求1所述的临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂，其特征在于，所述临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂包含以下组分：
二甲基亚砜：4.4％w/v
鱼精蛋白：1.5％w/v
葡聚糖：0.6％w/v
维生素C：0.008％w/v
棉子糖：1.5％w/v
用注射用水定容至100ml。
5.根据权力要求1所述的临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂，其特征在于，所述临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂包含以下组分：
二甲基亚砜：5.5％w/v
鱼精蛋白：2％w/v
葡聚糖：1％w/v
维生素C：0.1％w/v
棉子糖：2％w/v
用注射用水定容至100ml。
6.一种应用权力要求1-5任意一项所述临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂的TCR-T细胞冻存方法，其特征在于，所述TCR-T细胞冻存方法包括如下步骤：
1)将所述临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂直接加入至TCR-T细胞中，混合均匀后得到细胞悬液；
2)将细胞悬液装入冻存袋中；
3)将冻存袋装入冻存夹中，按照1℃/min的速率进行程序降温至-80℃，12-16h后转至-80℃冰箱长期存储。
7.根据权力要求6所述的TCR-T细胞冻存方法，其特征在于，所述步骤1)中所述临床级TCR-T细胞低DMSO冻存剂与TCR-T细胞在常温条件下混合，将得到的细胞悬液在冻存前放置在2-8℃环境下预冷30min。
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