CN107047541A - 一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法 - Google Patents

一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法，所述免疫细胞冻存液包括如下组分：二甲基亚砜4‑8mL、右旋糖酐2‑6mL、细胞培养基10‑30mL、人血清白蛋白1‑5mL、人自体血浆60‑100mL。本发明的免疫细胞冻存液能有效保护免疫细胞免受冷冻损伤，安全性高，对细胞的损伤小，可以提高免疫细胞的复苏成活率，复苏后的成活率可以达到96%以上，且复苏后细胞活率高、细胞增殖数量大、细胞不易老化，并保证了免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性，微生物检测指标符合要求，延长了免疫细胞的存活期，减少了免疫细胞表面抗原的丢失。

Description

一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法。
背景技术
细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的全新的抗肿瘤治疗方法，弥补了传统的手术、放疗、化疗的弊端，已经被公认为二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有发展前途的一种治疗手段,也是世界目前唯一有希望完全消灭肿瘤细胞的治疗手段。
免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色。从血液中分离出来的单个核细胞包括：T细胞、B细胞、NK细胞和DC细胞等，是免疫细胞治疗中的初始细胞来源，经各类细胞因子诱导扩增培养，得到一群具有高效杀伤活性的免疫细胞群。
常见的免疫细胞治疗种类包括NK细胞、CIK细胞、DC-CIK细胞、TIL细胞、LAK细胞、CART细胞等。所有这些经诱导和扩增培养的免疫细胞的初始细胞来源都是外周血或脐血的单个核细胞，而且是直接分离培养。随着年龄的增长，免疫细胞在体内的活性也会随之降低，所以在年轻时期冻存具有较高活性的免疫细胞，对于未来罹患肿瘤相关疾病的治疗可以起到很好的保障，因此免疫细胞冻存及冻存后的复苏培养具有非常大的意义。除此之外，随着免疫细胞治疗项目的逐步推广，免疫细胞的远程运输，长期保存问题就凸显出来，也是细胞制备区域化进程中必须解决的问题。
目前，细胞冻存主要是采取-196℃超低温条件下的保存方案，在超低温条件下，细胞的代谢功能停滞，但并未死亡。而细胞复苏则主要采用冻存细胞在37℃快速解冻的方法，以恢复细胞的活性和功能。但是现有的免疫细胞冻存方法适用于冻存干细胞和肿瘤细胞，对于免疫细胞，在冻存过程中则易形成冰晶损伤细胞，复苏后细胞活率低、细胞增殖数量不足、细胞易老化，存在效率低下，冻存质量不高、细胞复苏后活性差以及成活率不高等问题。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种免疫细胞冻存液，该免疫细胞冻存液能有效保护免疫细胞免受冷冻损伤，安全性高，对细胞的损伤小，可以提高免疫细胞的复苏成活率，复苏后的成活率可以达到96%以上，且复苏后细胞活率高、细胞增殖数量大、细胞不易老化，并保证了免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性，微生物检测指标符合要求，延长了免疫细胞的存活期，减少了免疫细胞表面抗原的丢失。
本发明的目的在于提供一种免疫细胞冻存方法，该免疫细胞冻存方法可以有效解决免疫细胞无法存储、长时间运输的问题，实现了免疫细胞的本地采集、异地制备以及即时复苏的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种免疫细胞冻存液，所述免疫细胞冻存液包括如下组分：
二甲基亚砜 4-8mL
右旋糖酐 2-6mL
细胞培养基 10-30mL
人血清白蛋白 1-5mL
人自体血浆 60-100mL。
所述二甲基亚砜为SIGMA型号为472301的二甲基亚砜。二甲基亚砜能提高细胞膜对水的通透性，降低溶液的冰点，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
右旋糖酐可以维持渗透压和pH值，提供适宜细胞存活的介质环境。
本发明采用在免疫细胞冻存液中添加人血白蛋白作为细胞冻存稳定剂使用，有利于在冷冻复苏过程中调节渗透压，对细胞保护作用好，并且冻存液成本低，可进一步提高冻存细胞的存储稳定性，避免由于细胞存储供者血质问题导致过程储存活性不稳定或细胞复苏率下降。
本发明的免疫细胞冻存液通过采用上述原料，并严格控制各原料的重量配比，制得的免疫细胞冻存液能有效保护免疫细胞免受冷冻损伤，安全性高，对细胞的损伤小，可以提高免疫细胞的复苏成活率，复苏后的成活率可以达到96%以上，且复苏后细胞活率高、细胞增殖数量大、细胞不易老化，并保证了免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性，微生物检测指标符合要求，延长了免疫细胞的存活期，减少了免疫细胞表面抗原的丢失。
优选的，所述细胞培养基为X-VIVO15培养基、AIM-V培养基、DMEM/F12培养基、RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、GT-T561培养基和Stemspan培养基中的任意一种。
所述细胞培养基的种类为本领域技术人员熟知的细胞培养基即可，并无特殊的限制，本发明中优选为X-VIVO15培养基、AIM-V培养基、DMEM/F12培养基或RPMI-1640培养基。AIM-V培养基购于美国Invitrogen公司，其中主要含有L-谷氨酰胺、硫酸链霉素和硫酸庆大霉素等，用以保持免疫细胞活性，使得免疫细胞复苏后能够维持其细胞活性，并延长免疫细胞存活期。细胞培养基具有保持细胞渗透压、酸碱平衡体系和提供营养等作用。
优选的，所述人自体血浆的制备方法为：将人体外周血置于无菌离心管中，1500-2000rpm转速下离心4-8min，取上层血浆在56-60℃温度下灭活28-32min后，转移至新的离心管中，2500-3500rpm转速下离心15-25min，吸取上清，即为冻存用人自体血浆。
人自体血浆为营养保护剂，其中包括血清蛋白、葡萄糖、无机盐离子、胰岛素、肾上腺皮质激素，类固醇激素等，不仅能够为免疫细胞提供所需的营养物质，而且血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤。
本发明的细胞冻存液添加人自体血浆，人自体血浆与血清成分相似，亦含有免疫细胞生长所需的各种细胞因子及营养物质，且属于免疫细胞分离的副产物，方便获取，不存在异源性，避免了外源血清存在的安全隐患。
本发明中所述免疫细胞冻存液中含有的重组人白介素-2和人自体血浆具有显著的协同作用，可以显著提高免疫细胞的活性和复苏后的存活率。
本发明所述免疫细胞冻存液中采用人自体血浆作为血清替代物，不含有动物血清，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，也不会对人体过继免疫治疗产生影响。
优选的，所述免疫细胞冻存液还包括糖类1-3g，所述糖类是由海藻糖、α-1 ,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:0.8-1.2：1.5-2.5：2-4组成的混合物。
本发明的免疫细胞冻存液通过采用海藻糖，可以减少二甲基亚砜的使用，保证细胞在接近冰点时胞内的水分不会结晶，能有效的保护细胞，并有效降低细胞毒性。
本发明添加α-1 ,4-葡聚糖能够有效的降低冻存、复苏中细胞的损伤，并能够保证复苏后细胞增殖的活力。
本发明的免疫细胞冻存液通过采用香菇多糖和葡萄糖，可以保证复苏后细胞增殖活力不受影响。
优选的，所述免疫细胞冻存液还包括非必须氨基酸0.2-0.6g和维生素C 0.1-0.5g。
所述非必须氨基酸为本领域技术人员熟知的非必须氨基酸即可，并无特殊的限制，本发明优选为多种非必需氨基酸组合而成，更优选为购买自GIBCO试剂的非必须氨基酸。
本发明的免疫细胞冻存液通过采用非必须氨基酸和维生素C，可以保证复苏后细胞增殖活力不受影响。
优选的，所述免疫细胞冻存液还包括丙二醇0.2-0.6mL和聚乙二醇0.4-0.8mL。
本发明在免疫细胞冻存液中添加聚乙二醇和1,2-丙二醇，可以替代现用的二甲基亚砜为基础的冻存液，减少二甲基亚砜的用量，有效降低其对细胞毒性，维持细胞稳定性，提高复苏后直接应用的安全性，适合用于细胞冻存复苏后直接应用。
优选的，所述免疫细胞冻存液还包括重组人白介素4000-8000U。所述重组人白介素可以采用注射用重组人白介素-2。
通常，外周血的T细胞、B细胞和NK细胞膜表面均存在白介素-2(IL-2)受体，IL-2与其受体结合后可以调节该细胞的增生，调节免疫球蛋白的生成；促进T细胞、B细胞和NK细胞的增殖、分化并能提高NK细胞的杀伤活性。然而，目前主要是将IL-2作为体外刺激培养物用于免疫细胞的扩增培养，而本发明采用将重组人白介素-2(IL-2)添加到免疫细胞冻存液中，可大幅度提高所述免疫细胞的活性稳定性，使其保持原有细胞高活性，从而使免疫细胞很好地保持了细胞复苏后的生理功能和生物学特性，可有效解决细胞复苏后直接应用和进一步扩展的关键问题。
本发明添加重组人白介素-2能够有效维持细胞的活性，保证细胞复苏后正常的生物学功能。
优选的，所述免疫细胞冻存液还包括白酒草皂苷R 0.3-0.7g和勃脉力A 0.8-1.2g。
本发明的免疫细胞冻存液通过采用白酒草皂苷R与二甲基亚砜结合制备免疫细胞的冻存液，可以降低二甲基亚砜的使用量，这种冻存液对冻存细胞有较好的保护作用，冻存细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高。
本发明的免疫细胞冻存液通过采用勃脉力A，可以维持电解质平衡，使细胞处于一种比较温和的更接近于体内环境的溶液中。
优选的，所述免疫细胞冻存液还包括青霉素-链霉素双抗溶液0.1-0.5mL和氯化钠0.4-0.8g。
所述青霉素和链霉素双抗溶液为GIBCO青霉素和链霉素双抗溶液GIBCO青霉素和链霉素双抗溶液每毫升包含10000单位青霉素（碱）和 10000µg链霉素（碱），利用0.85%盐液形式的青霉素G（钠盐）和硫酸链霉素，其抗菌谱包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。青霉素和链霉素双抗溶液可保证细胞储存过程中处于无菌状态，且对免疫细胞无不良影响，安全可靠。
本发明的免疫细胞冻存液通过采用氯化钠，可以维持电解质平衡，使细胞处于一种比较温和的更接近于体内环境的溶液中。
一种免疫细胞冻存方法，将免疫细胞加入到上述所述的免疫细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-78～-82℃后转至-196℃液氮罐冻存。
所述免疫细胞冻存液预先于2-8℃预冷，以降低二甲基亚砜溶于免疫细胞冻存液时升温对细胞的损伤。
所述免疫细胞的种类为本领域技术人员熟知的任意一种免疫细胞即可，并无特殊的限制。本发明中所述免疫细胞优选为 NK 细胞、CIK 细胞或 DC 细胞。还可以为T细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞或NTK细胞。
本发明的有益效果在于：本发明的免疫细胞冻存液能有效保护免疫细胞免受冷冻损伤，安全性高，对细胞的损伤小，可以提高免疫细胞的复苏成活率，复苏后的成活率可以达到96%以上，且复苏后细胞活率高、细胞增殖数量大、细胞不易老化，并保证了免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性，微生物检测指标符合要求，延长了免疫细胞的存活期，减少了免疫细胞表面抗原的丢失。
本发明所述免疫细胞冻存液中采用人自体血浆作为血清替代物，不含有动物血清，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，也不会对人体过继免疫治疗产生影响。
本发明的免疫细胞冻存复苏后经诱导培养的存活率在96%以上，细胞保持无菌状态，各项生物学指标均满足需求，与未冻存的单个核细胞诱导成免疫细胞培养增殖状态相比无明显差异，储存效果良好，可应用于临床治疗。
本发明的免疫细胞冻存方法可以有效解决免疫细胞无法存储、长时间运输的问题，实现了免疫细胞的本地采集、异地制备以及即时复苏的应用。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1
一种免疫细胞冻存液，所述免疫细胞冻存液包括如下组分：
二甲基亚砜 4mL
右旋糖酐 2mL
细胞培养基 10mL
人血清白蛋白 1mL
人自体血浆 60mL。
所述细胞培养基为X-VIVO15培养基。
所述人自体血浆的制备方法为：将人体外周血置于无菌离心管中，1500rpm转速下离心8min，取上层血浆在56℃温度下灭活32min后，转移至新的离心管中，2500rpm转速下离心15min，吸取上清，即为冻存用人自体血浆。
所述免疫细胞冻存液还包括糖类1g，所述糖类是由海藻糖、α-1 ,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:0.8：1.5：2组成的混合物。
所述免疫细胞冻存液还包括非必须氨基酸0.2g和维生素C 0.1g。
所述免疫细胞冻存液还包括丙二醇0.2mL和聚乙二醇0.4mL。
所述免疫细胞冻存液还包括重组人白介素4000U。
所述免疫细胞冻存液还包括白酒草皂苷R 0.3g和勃脉力A 0.8g。
所述免疫细胞冻存液还包括青霉素-链霉素双抗溶液0.1mL和氯化钠0.4g。
一种免疫细胞冻存方法，将免疫细胞加入到上述所述的免疫细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-78℃后转至-196℃液氮罐冻存。
实施例2
一种免疫细胞冻存液，所述免疫细胞冻存液包括如下组分：
二甲基亚砜 5mL
右旋糖酐 3mL
细胞培养基 15mL
人血清白蛋白 2mL
人自体血浆 70mL。
所述细胞培养基为AIM-V培养基。
所述人自体血浆的制备方法为：将人体外周血置于无菌离心管中，1600rpm转速下离心7min，取上层血浆在57℃温度下灭活31min后，转移至新的离心管中，2800rpm转速下离心22min，吸取上清，即为冻存用人自体血浆。
所述免疫细胞冻存液还包括糖类1.5g，所述糖类是由海藻糖、α-1 ,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:0.9：1.8：2.5组成的混合物。
所述免疫细胞冻存液还包括非必须氨基酸0.3g和维生素C 0.2g。
所述免疫细胞冻存液还包括丙二醇0.2-0.6mL和聚乙二醇0.4-0.8mL。
所述免疫细胞冻存液还包括重组人白介素5000U。
所述免疫细胞冻存液还包括白酒草皂苷R 0.4g和勃脉力A 0.9g。
所述免疫细胞冻存液还包括青霉素-链霉素双抗溶液0.2mL和氯化钠0.5g。
一种免疫细胞冻存方法，将免疫细胞加入到上述所述的免疫细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-79℃后转至-196℃液氮罐冻存。
实施例3
一种免疫细胞冻存液，所述免疫细胞冻存液包括如下组分：
二甲基亚砜 6mL
右旋糖酐 4mL
细胞培养基 20mL
人血清白蛋白 3mL
人自体血浆 80mL。
所述细胞培养基为DMEM/F12培养基。
所述人自体血浆的制备方法为：将人体外周血置于无菌离心管中，1800rpm转速下离心6min，取上层血浆在58℃温度下灭活30min后，转移至新的离心管中，3000rpm转速下离心20min，吸取上清，即为冻存用人自体血浆。
所述免疫细胞冻存液还包括糖类2g，所述糖类是由海藻糖、α-1 ,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:1：2：3组成的混合物。
所述免疫细胞冻存液还包括非必须氨基酸0.4g和维生素C 0.3g。
所述免疫细胞冻存液还包括丙二醇0.4mL和聚乙二醇0.6mL。
所述免疫细胞冻存液还包括重组人白介素6000U。
所述免疫细胞冻存液还包括白酒草皂苷R 0.5g和勃脉力A 1g。
所述免疫细胞冻存液还包括青霉素-链霉素双抗溶液0.3mL和氯化钠0.6g。
一种免疫细胞冻存方法，将免疫细胞加入到上述所述的免疫细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-80℃后转至-196℃液氮罐冻存。
实施例4
一种免疫细胞冻存液，所述免疫细胞冻存液包括如下组分：
二甲基亚砜 7mL
右旋糖酐 5mL
细胞培养基 25mL
人血清白蛋白 4mL
人自体血浆 90mL。
所述细胞培养基为RPMI-1640培养基、GT-T551培养基或GT-T561培养基。
所述人自体血浆的制备方法为：将人体外周血置于无菌离心管中，1900rpm转速下离心5min，取上层血浆在59℃温度下灭活29min后，转移至新的离心管中，3200rpm转速下离心18min，吸取上清，即为冻存用人自体血浆。
所述免疫细胞冻存液还包括糖类2.5g，所述糖类是由海藻糖、α-1 ,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:1.1：2.2：3.5组成的混合物。
所述免疫细胞冻存液还包括非必须氨基酸0.4g和维生素C 0.3g。
所述免疫细胞冻存液还包括丙二醇0.4mL和聚乙二醇0.6mL。
所述免疫细胞冻存液还包括重组人白介素6000U。
所述免疫细胞冻存液还包括白酒草皂苷R 0.3-0.7g和勃脉力A 0.8-1.2g。
所述免疫细胞冻存液还包括青霉素-链霉素双抗溶液0.3mL和氯化钠0.6g。
一种免疫细胞冻存方法，将免疫细胞加入到上述所述的免疫细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-81℃后转至-196℃液氮罐冻存。
实施例5
一种免疫细胞冻存液，所述免疫细胞冻存液包括如下组分：
二甲基亚砜 8mL
右旋糖酐 6mL
细胞培养基 30mL
人血清白蛋白 5mL
人自体血浆 100mL。
所述细胞培养基为Stemspan培养基。
所述人自体血浆的制备方法为：将人体外周血置于无菌离心管中， 2000rpm转速下离心4min，取上层血浆在60℃温度下灭活28min后，转移至新的离心管中，3500rpm转速下离心15min，吸取上清，即为冻存用人自体血浆。
所述免疫细胞冻存液还包括糖类3g，所述糖类是由海藻糖、α-1 ,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:1.2：2.5：4组成的混合物。
所述免疫细胞冻存液还包括非必须氨基酸0.6g和维生素C 0.5g。
所述免疫细胞冻存液还包括丙二醇0.6mL和聚乙二醇0.8mL。
所述免疫细胞冻存液还包括重组人白介素8000U。
所述免疫细胞冻存液还包括白酒草皂苷R 0.7g和勃脉力A 1.2g。
所述免疫细胞冻存液还包括青霉素-链霉素双抗溶液0.5mL和氯化钠0.8g。
一种免疫细胞冻存方法，将免疫细胞加入到上述所述的免疫细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-82℃后转至-196℃液氮罐冻存。
将实施例1-5的免疫细胞冻存液和免疫细胞冻存方法对免疫细胞进行冻存，经1个月、3个月、6个月、12个月冻存后依次取出复苏，检测免疫细胞存活率，实验结果如下表所示：
细胞存活率 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
1个月（%） 97.18 97.21 97.32 97.26 97.22
3个月（%） 96.85 96.92 97.05 96.94 96.88
6个月（%） 96.42 96.48 96.53 96.51 96.45
12个月（%） 96.01 96.04 96.12 96.08 96.06
从上表可以看出，本发明的免疫细胞冻存液能有效保护免疫细胞免受冷冻损伤，安全性高，对细胞的损伤小，可以提高免疫细胞的复苏成活率，复苏后的成活率可以达到96%以上，且复苏后细胞活率高、细胞增殖数量大、细胞不易老化，并保证了免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性，且复苏后的免疫细胞均没有可见异物、细菌、真菌、细菌内毒素、支原体的污染，微生物检测指标符合要求，延长了免疫细胞的存活期，减少了免疫细胞表面抗原的丢失。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种免疫细胞冻存液，其特征在于：所述免疫细胞冻存液包括如下组分：
二甲基亚砜 4-8mL
右旋糖酐 2-6mL
细胞培养基 10-30mL
人血清白蛋白 1-5mL
人自体血浆 60-100mL。
2.根据权利要求1所述的一种免疫细胞冻存液，其特征在于：所述细胞培养基为X-VIVO15培养基、AIM-V培养基、DMEM/F12培养基、RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、GT-T561培养基和Stemspan培养基中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种免疫细胞冻存液，其特征在于：所述人自体血浆的制备方法为：将人体外周血置于无菌离心管中，1500-2000rpm转速下离心4-8min，取上层血浆在56-60℃温度下灭活28-32min后，转移至新的离心管中，2500-3500rpm转速下离心15-25min，吸取上清，即为冻存用人自体血浆。
4.根据权利要求1所述的一种免疫细胞冻存液，其特征在于：所述免疫细胞冻存液还包括糖类1-3g，所述糖类是由海藻糖、α-1 ,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:0.8-1.2：1.5-2.5：2-4组成的混合物。
5.根据权利要求1所述的一种免疫细胞冻存液，其特征在于：所述免疫细胞冻存液还包括非必须氨基酸0.2-0.6g和维生素C 0.1-0.5g。
6.根据权利要求1所述的一种免疫细胞冻存液，其特征在于：所述免疫细胞冻存液还包括丙二醇0.2-0.6mL和聚乙二醇0.4-0.8mL。
7.根据权利要求1所述的一种免疫细胞冻存液，其特征在于：所述免疫细胞冻存液还包括重组人白介素4000-8000U。
8.根据权利要求1所述的一种免疫细胞冻存液，其特征在于：所述免疫细胞冻存液还包括白酒草皂苷R 0.3-0.7g和勃脉力A 0.8-1.2g。
9.根据权利要求1所述的一种免疫细胞冻存液，其特征在于：所述免疫细胞冻存液还包括青霉素-链霉素双抗溶液0.1-0.5mL和氯化钠0.4-0.8g。
10.一种免疫细胞冻存方法，其特征在于：将免疫细胞加入到权利要求1-9任一项所述的免疫细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-78～-82℃后转至-196℃液氮罐冻存。
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Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108450458A (zh) * 2018-03-27 2018-08-28 成都菱祐生物科技有限公司 一种无血清细胞冻存液
CN108651439A (zh) * 2018-04-13 2018-10-16 上海韵飞生物科技有限公司 一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法
CN109526943A (zh) * 2018-12-30 2019-03-29 深圳光彩生命工程技术有限公司 一种免疫细胞冻存方法
CN110352951A (zh) * 2018-11-15 2019-10-22 崔磊 一种无血清无dmso组织工程骨冻存液及其制备和冻存方法
CN110881459A (zh) * 2019-11-14 2020-03-17 武汉济源高科技有限公司 一种人外周血单个核细胞冻存方法
CN112120012A (zh) * 2020-09-30 2020-12-25 广东康盾生物工程技术有限公司 一种car-t细胞冻存方法
CN112753695A (zh) * 2021-01-04 2021-05-07 浙江卫未生物医药科技有限公司 一种免疫细胞冻存方法
CN113133446A (zh) * 2021-04-30 2021-07-20 海南优尼科尔生物科技有限公司 一种外周血单个核细胞冻存液、配制及使用方法
CN113615681A (zh) * 2021-08-27 2021-11-09 郑州源创吉因实业有限公司 一种免疫细胞的冻存液及冻存方法
CN114521549A (zh) * 2022-02-28 2022-05-24 四川中科博瑞生物科技有限公司 一种免疫细胞冻存液和应用及细胞冻存方法和复苏方法
CN114586769A (zh) * 2020-12-07 2022-06-07 精准生技股份有限公司 用于细胞冷冻保存的无血清细胞冷冻保存液及其冷冻保存方法
CN115005199A (zh) * 2022-07-14 2022-09-06 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种自然杀伤细胞的冻存液、冻存方法和应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003238620A1 (en) * 2002-01-31 2003-09-18 Asahi Techno Glass Corporation Liquid for frozen storage of primate embryo stem cells and frozen storage method
CN104719282A (zh) * 2015-02-13 2015-06-24 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种外周血单个核细胞无血清冻存液及冻存方法
CN105123671A (zh) * 2015-07-24 2015-12-09 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种细胞冻存液、应用及免疫细胞冻存方法
CN105638642A (zh) * 2016-01-27 2016-06-08 上海润泉生物技术有限公司 一种免疫细胞冻存液及其应用
CN105685017A (zh) * 2016-04-18 2016-06-22 东莞市保莱生物科技有限公司 一种免疫细胞的储存方法及细胞冻存液
CN105794768A (zh) * 2016-03-29 2016-07-27 深圳爱生再生医学科技有限公司 免疫细胞冻存液及冻存方法
CN106665559A (zh) * 2016-12-28 2017-05-17 广州沙艾生物科技有限公司 一种免疫细胞冻存液及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1471140A4 (en) * 2002-01-31 2005-02-16 Asahi Techno Glass Cosporation LIQUIDITY FOR DEEP-FREEZE STORAGE OF EMBRYONIC PRIMATIVE STEM CELLS AND DEEP-FREEZE STORAGE PROCESS

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003238620A1 (en) * 2002-01-31 2003-09-18 Asahi Techno Glass Corporation Liquid for frozen storage of primate embryo stem cells and frozen storage method
CN104719282A (zh) * 2015-02-13 2015-06-24 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种外周血单个核细胞无血清冻存液及冻存方法
CN105123671A (zh) * 2015-07-24 2015-12-09 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种细胞冻存液、应用及免疫细胞冻存方法
CN105638642A (zh) * 2016-01-27 2016-06-08 上海润泉生物技术有限公司 一种免疫细胞冻存液及其应用
CN105794768A (zh) * 2016-03-29 2016-07-27 深圳爱生再生医学科技有限公司 免疫细胞冻存液及冻存方法
CN105685017A (zh) * 2016-04-18 2016-06-22 东莞市保莱生物科技有限公司 一种免疫细胞的储存方法及细胞冻存液
CN106665559A (zh) * 2016-12-28 2017-05-17 广州沙艾生物科技有限公司 一种免疫细胞冻存液及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
陈鸿书 等: "《低温技术在医学中的应用》", 31 March 1991, 中国科学技术出版社 *
魏雪飞 等: ""免疫细胞的冷冻保存"", 《中国神经免疫学和神经病学杂志》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108450458A (zh) * 2018-03-27 2018-08-28 成都菱祐生物科技有限公司 一种无血清细胞冻存液
CN108651439A (zh) * 2018-04-13 2018-10-16 上海韵飞生物科技有限公司 一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法
CN110352951A (zh) * 2018-11-15 2019-10-22 崔磊 一种无血清无dmso组织工程骨冻存液及其制备和冻存方法
CN109526943A (zh) * 2018-12-30 2019-03-29 深圳光彩生命工程技术有限公司 一种免疫细胞冻存方法
CN110881459A (zh) * 2019-11-14 2020-03-17 武汉济源高科技有限公司 一种人外周血单个核细胞冻存方法
CN112120012A (zh) * 2020-09-30 2020-12-25 广东康盾生物工程技术有限公司 一种car-t细胞冻存方法
CN114586769A (zh) * 2020-12-07 2022-06-07 精准生技股份有限公司 用于细胞冷冻保存的无血清细胞冷冻保存液及其冷冻保存方法
CN112753695A (zh) * 2021-01-04 2021-05-07 浙江卫未生物医药科技有限公司 一种免疫细胞冻存方法
CN113133446A (zh) * 2021-04-30 2021-07-20 海南优尼科尔生物科技有限公司 一种外周血单个核细胞冻存液、配制及使用方法
CN113615681A (zh) * 2021-08-27 2021-11-09 郑州源创吉因实业有限公司 一种免疫细胞的冻存液及冻存方法
CN114521549A (zh) * 2022-02-28 2022-05-24 四川中科博瑞生物科技有限公司 一种免疫细胞冻存液和应用及细胞冻存方法和复苏方法
CN115005199A (zh) * 2022-07-14 2022-09-06 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种自然杀伤细胞的冻存液、冻存方法和应用
CN115005199B (zh) * 2022-07-14 2023-08-22 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种自然杀伤细胞的冻存液、冻存方法和应用

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