CN108651439A - 一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法，包括以下组分：重组人白介素‑2、人血白蛋白、聚乙二醇、海藻糖，以及基础培养基或注射用氯化钠。本发明采用将重组人白介素‑2(IL‑2)添加到外周血单核细胞冻存液中，可大幅度提高复苏后培养免疫细胞的活性稳定性，使其保持原有细胞高活性，从而使免疫细胞很好地保持了细胞复苏后的生理功能和生物学特性，可有效解决细胞复苏后直接规模化扩增问题。本发明在免疫细胞冻存液中添加聚乙二醇和海藻糖，可以替代现用的二甲基亚砜(DMSO)为基础的冻存液，有效降低其对细胞毒性，维持细胞稳定性，提高复苏后直接应用的安全性，适合用于细胞冻存复苏后直接应用。
Description
技术领域
本发明涉及细胞冻存技术领域，特别是免疫细胞冻存，尤其涉及外周血单核细胞冻存，具体为一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法。
背景技术
细胞冻存技术作为一种保存细胞的有效方法在生物学领域已有深入广泛的应用。对供体的外周血单核细胞深低温保存可保持其活力和功能，无论对临床还是基础研究均具有重要意义，尤其是用于单一种免疫细胞研究时。冷冻保存外周血单核细胞不仅可以解决现有免疫细胞诱导时外周血单核细胞采集困难，需要多次采血问题，用于肿瘤治疗以及抗衰老保健治疗。正常情况下，液体冻结时会造成细胞损伤，其中，一种情况是由于不适当的降温和复温导致细胞内形成冰晶和重结晶；另一种情况是由于冷冻使得电解质和溶质浓度升高所导致的溶质损伤。通常，免疫细胞在-70℃～-80℃冻存，细胞活性会随着冷冻时间的延长迅速下降，在-196℃时细胞生物学过程几乎停止，因此要长期保存免疫细胞，液氮温度是最佳的储存温度。选择合适的冷冻保护剂可以避免细胞在冷冻时细胞内冰晶的形成，保护细胞膜和细胞器免受损伤。
细胞冻存经常采用渗透性保护剂，例如甘油和二甲基亚砜(DMSO)两种，而甘油作为冷冻保护剂冻存的免疫细胞存活率较低，但DMSO却可以迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，使水分在细胞冻结前透出细胞外形成冰晶，成为免疫细胞冻存最理想的冷冻保护剂。
目前国内冻存方法多采用的是DMSO、动物血清和细胞培养液按不同比例搭配成的冻存液，例如CN102301992A公开的用于冻存单个核细胞的冻存液，其包含血浆和二甲基亚砜，但不仅限于此，还可以包含动物血清和培养基等成分。采用该冻存液的优点是细胞保存时间长，然而该冻存液中含有的动物血清引入了外源蛋白，同时增加了动物病原污染的可能性。目前也有一些采用冻存液中不含动物血清的文献，例如，CN104026118A公开的免疫细胞冻存液，其包含二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基。采用该冷冻液的优点在于不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，然而该冷冻液冻存细胞的存活率以及细胞活性仍较低。
通常，外周血的T细胞、B细胞和NK细胞膜表面均存在白介素-2(IL-2)受体，IL-2与其受体结合后可以调节该细胞的增生，调节免疫球蛋白的生成；促进T细胞、B细胞和NK细胞的增殖、分化并能提高NK细胞的杀伤活性。然而，目前主要是将IL-2作为体外刺激培养物用于免疫细胞的扩增培养，而本发明采用将重组人白介素-2(IL-2)添加到外周血单核细胞冻存液中，可大幅度提高复苏后培养免疫细胞的活性稳定性，使其保持原有细胞高活性，从而使免疫细胞很好地保持了细胞复苏后的生理功能和生物学特性，可有效解决细胞复苏后直接规模化扩增问题。本发明在免疫细胞冻存液中添加聚乙二醇和海藻糖，可以替代现用的二甲基亚砜(DMSO)为基础的冻存液，有效降低其对细胞毒性，维持细胞稳定性，提高复苏后直接应用的安全性，适合用于细胞冻存复苏后直接应用。
因此，寻找一种如何保持细胞高活性并可实现长期存储、即时复苏的外周血单核细胞冻存液及冻存方法是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法，以解决可以保持细胞高活性并可实现长期存储、即时复苏的外周血单核细胞冻存液及冻存方法的问题。
一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法，其特征在于，包括以下组分：重组人白介素-2、人血白蛋白、聚乙二醇、海藻糖，以及基础培养基或注射用氯化钠。
优选的，所述免疫细胞冻存液包括：重组人白介素-250-200U/mL；聚乙二醇0.1-0.4g/mL；海藻糖0.05-0.3g/ml；人血白蛋白0.01-0.1g/ml基础培养基或注射用氯化钠90-99体积％，总量为100％。
优选的，所述外周血单核细胞冻存液中的重组人白介素-2的含量为50-200U/mL，例如可以是50U/mL、60U/mL、80U/mL、100U/mL、120U/mL、150U/mL、1600U/mL、180U/mL、200U/mL，所述外周血单核细胞冻存液中的聚乙二醇含量为0.1-0.4g/mL，例如可以是0.1g/mL、0.12g/mL、0.15g/mL、0.2g/mL、0.22g/mL、0.25g/mL、0.3g/mL、0.32g/mL、0.35g/mL、0.38g/mL、0.4g/mL，所述外周血单核细胞冻存液中的海藻糖含量为0.05-0.3g/mL，例如可以是0.05g/mL、0.1g/mL、0.15g/mL、0.2g/mL、0.25g/mL、0.3g/mL，所述外周血单核细胞冻存液中的基础培养基或注射用氯化钠的体积百分含量为90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％，所述外周血单核细胞冻存液中的人血白蛋白含量为0.01-0.1g/mL，例如可以是0.01g/mL、0.02g/mL、0.03g/mL、0.04g/mL、0.05g/mL、0.06g/mL、0.07g/mL、0.08g/mL、0.09g/mL、0.1g/mL，当在外周血单核细胞冻存液中还含有除重组人白介素-2、聚乙二醇、海藻糖、人血白蛋白组分以外的其它组分时，所述基础培养基或注射用氯化钠的含量会进行适当的下调，比如降低为80％-95％，例如所述基础培养的含量还可以是80％、80.5％、81％、81.5％、82％、82.5％、83％、83.5％、84％、84.5％、85％、85.5％、86％、86.5％、87％、87.5％、88％、88.5％、89％、89.5％，以满足所述免疫细胞冻存液中各组分含量之和为100％，所述外周血单核细胞冻存液中的重组人白介素-2、聚乙二醇、海藻糖、人血白蛋白，以及基础培养基或注射用氯化钠可以采用上述各组分所选择的含量进行任意配合，各组分的体积百分含量之和为100％。
优选的，所述外周血单核细胞冻存液包括：重组人白介素-2100-200U/mL；聚乙二醇0.2-0.4g/mL；海藻糖0.1-0.2g/mL；基础培养基或注射用氯化钠95-99体积％。
优选的，所述外周血单核细胞冻存液中，所述基础培养基为DMEM/F12培养基(Gibco)或淋巴细胞培养基[X-VIVOTM15(LONZA)、HIPP-T009(倍谙基)]，且所述淋巴细胞培养基为HIPP-T009(倍谙基)，其均可购自倍谙基公司。
优选的，所述免疫细胞为T细胞、自然杀伤细胞或CIK细胞中的任意一种。
优选的，本发明提供了一种外周血单核细胞的冻存方法，包括一下步骤：(1)将外周血单核细胞与本发明所述的外周血单核细胞冻存液混合；
(2)进行程序降温至-80℃，然后转移至液氮中冷冻保存。
优选的，所述外周血淋巴细胞优选的冻存方法包括以下步骤：
(1)冻存液的制备：制备本发明所述的外周血单核细胞细胞冻存液；
(2)细胞悬液的制备：将供体资源分离去除血浆，并将下层全血离心分离获得外周血单核细胞，将所述外周血单核细胞与所述外周血单核细胞冻存液混合得到细胞悬液，置于无菌的冻存管中；
(3)冻存：将所述冻存管进行程序降温至-80℃，然后转移至液氮中冷冻保存；(4)细胞复苏：取出冻存管快速置于37-40℃水浴1-3分钟，轻轻晃动直至细胞悬液完全融化，离心，以淋巴细胞无血清培养基洗涤2-3次，即可。
优选的，步骤(2)所述供体资源为外周血。
优选的，所述离心的转速为1500-3000转/分钟，例如可以是1500转/分钟、1800转/分钟、2100转/分钟、2400转/分钟、2700转/分钟、3000转/分钟例如可以是10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟，且所述细胞悬液的浓度为5-10×106个细胞/mL，例如可以是5×106个细胞/mL、6×106个细胞/mL、7×106个细胞/mL、8×106个细胞/mL、9×106个细胞/mL、10×106个细胞/mL，优选为7×106个细胞/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明的外周血单核细胞冻存液和冻存方法，使得复苏细胞存活率达到90％以上，细胞生物学特性不发生变化，保证了外周血单核细胞的生物学活性；
(2)本发明的外周血单核细胞冻存液中不含动物血清，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，不会对人体免疫治疗产生影响，而且，本发明的外周血单核细胞冻存液中不含有DMSO，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，也不会对免疫细胞后续培养有影响；
(3)本发明的外周血单核细胞冻存液和冻存方法有效解决了外周血单核细胞无法存储、长时间运输的问题，实现了外周血单核细胞的本地采集、异地扩增以及应用。
(4)采用将重组人白介素-2(IL-2)添加到外周血单核细胞冻存液中，可大幅度提高复苏后培养免疫细胞的活性稳定性，使其保持原有细胞高活性，从而使免疫细胞很好地保持了细胞复苏后的生理功能和生物学特性，可有效解决细胞复苏后直接规模化扩增问题，而且本发明在免疫细胞冻存液中添加聚乙二醇和海藻糖，可以替代现用的二甲基亚砜(DMSO)为基础的冻存液，有效降低其对细胞毒性，维持细胞稳定性，提高复苏后直接应用的安全性，适合用于细胞冻存复苏后直接应用。
(5)通过采用权利要求8中的步骤2，可以有效提高免疫细胞的纯度，从而有利于后续的复苏以及细胞存活率的提高，外周血中均富含各种矿物质离子和蛋白因子，可提供细胞代谢所述物质并维持细胞所述的渗透压，是天然的营养体系和缓冲体系，采用来自外周血的外周血单核细胞，并经特殊的提取过程，可以增加细胞的纯度，并避免了动物源病原微生物的交叉感染风险，便于冻存细胞后续的细胞扩增。
附图说明
图1是本发明的外周血单核细胞冻存液冻存3个月复苏后的再次扩增NK和CIK细胞生长曲线图；
图2是实施例1-6和对比例1-3的外周血单核细胞冻存液冻存1个月、3个月、6个月和12个月后，其复苏后的单核细胞活性(冻存密度1.0×106个细胞/ml)结果图表。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-2，本发明提供一种技术方案：一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法，包括以下组分：重组人白介素-2、人血白蛋白、聚乙二醇、海藻糖，以及基础培养基或注射用氯化钠，所述免疫细胞冻存液包括：重组人白介素-250-200U/mL；聚乙二醇0.1-0.4g/mL；海藻糖0.05-0.3g/ml；人血白蛋白0.01-0.1g/ml基础培养基或注射用氯化钠90-99体积％，总量为100％，所述外周血单核细胞冻存液中的重组人白介素-2的含量为50-200U/mL，例如可以是50U/mL、60U/mL、80U/mL、100U/mL、120U/mL、150U/mL、1600U/mL、180U/mL、200U/mL，所述外周血单核细胞冻存液中的聚乙二醇含量为0.1-0.4g/mL，例如可以是0.1g/mL、0.12g/mL、0.15g/mL、0.2g/mL、0.22g/mL、0.25g/mL、0.3g/mL、0.32g/mL、0.35g/mL、0.38g/mL、0.4g/mL，所述外周血单核细胞冻存液中的海藻糖含量为0.05-0.3g/mL，例如可以是0.05g/mL、0.1g/mL、0.15g/mL、0.2g/mL、0.25g/mL、0.3g/mL，所述外周血单核细胞冻存液中的基础培养基或注射用氯化钠的体积百分含量为90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％，所述外周血单核细胞冻存液中的人血白蛋白含量为0.01-0.1g/mL，例如可以是0.01g/mL、0.02g/mL、0.03g/mL、0.04g/mL、0.05g/mL、0.06g/mL、0.07g/mL、0.08g/mL、0.09g/mL、0.1g/mL，当在外周血单核细胞冻存液中还含有除重组人白介素-2、聚乙二醇、海藻糖、人血白蛋白组分以外的其它组分时，所述基础培养基或注射用氯化钠的含量会进行适当的下调，比如降低为80％-95％，例如所述基础培养的含量还可以是80％、80.5％、81％、81.5％、82％、82.5％、83％、83.5％、84％、84.5％、85％、85.5％、86％、86.5％、87％、87.5％、88％、88.5％、89％、89.5％，以满足所述免疫细胞冻存液中各组分含量之和为100％，所述外周血单核细胞冻存液中的重组人白介素-2、聚乙二醇、海藻糖、人血白蛋白，以及基础培养基或注射用氯化钠可以采用上述各组分所选择的含量进行任意配合，各组分的体积百分含量之和为100％，所述外周血单核细胞冻存液包括：重组人白介素-2100-200U/mL；聚乙二醇0.2-0.4g/mL；海藻糖0.1-0.2g/mL；基础培养基或注射用氯化钠95-99体积％，所述外周血单核细胞冻存液中，所述基础培养基为DMEM/F12培养基(Gibco)或淋巴细胞培养基[X-VIVOTM15(LONZA)、HIPP-T009(倍谙基)]，且所述淋巴细胞培养基为HIPP-T009(倍谙基)，其均可购自倍谙基公司，所述免疫细胞为T细胞、自然杀伤细胞或CIK细胞中的任意一种，本发明提供了一种外周血单核细胞的冻存方法，包括一下步骤：(1)将外周血单核细胞与本发明所述的外周血单核细胞冻存液混合；(2)进行程序降温至-80℃，然后转移至液氮中冷冻保存。所述外周血淋巴细胞优选的冻存方法包括以下步骤：(1)冻存液的制备：制备本发明所述的外周血单核细胞细胞冻存液；(2)细胞悬液的制备：将供体资源分离去除血浆，并将下层全血离心分离获得外周血单核细胞，将所述外周血单核细胞与所述外周血单核细胞冻存液混合得到细胞悬液，置于无菌的冻存管中；(3)冻存：将所述冻存管进行程序降温至-80℃，然后转移至液氮中冷冻保存；(4)细胞复苏：取出冻存管快速置于37-40℃水浴1-3分钟，轻轻晃动直至细胞悬液完全融化，离心，以淋巴细胞无血清培养基洗涤2-3次，即可，步骤(2)所述供体资源为外周血，所述离心的转速为1500-3000转/分钟，例如可以是1500转/分钟、1800转/分钟、2100转/分钟、2400转/分钟、2700转/分钟、3000转/分钟例如可以是10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟，且所述细胞悬液的浓度为5-10×106个细胞/mL，例如可以是5×106个细胞/mL、6×106个细胞/mL、7×106个细胞/mL、8×106个细胞/mL、9×106个细胞/mL、10×106个细胞/mL，优选为7×106个细胞/mL。该方法是按照以下步骤进行的：下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
一、实验材料及其来源：
1、实验环境：GMP实验室里的生物安全柜中操作。
2、试剂：DMEN/F12培养基(GIBCO)、重组人白介素-2、人血白蛋白(上海莱士)。
3、器材：离心机(THERMO，美国)、程控降温盒(Corning)、生物安全柜(Thermo)、1mL和5mL冻存管(Corning)、50mL离心管(Corning)。二、实施过程：
实施例1：制备外周血单核细胞冻存液(重组人白介素-2+聚乙二醇+海藻糖+DMEM/F12培养基+人血白蛋白)：按体积含量，将0.05g/ml人血白蛋白、50U/mL的重组人白介素-2、0.1g/mL的聚乙二醇、0.1g/mL的海藻糖和99％的DMEM/F12培养基混匀，制得外周血单核细胞冻存液，于4℃保存备用。
实施例2：制备外周血单核细胞冻存液(重组人白介素-2+聚乙二醇+海藻糖+DMEM/F12培养基+人血白蛋白)：按体积含量，将0.05g/ml人血白蛋白、100U/mL的重组人白介素-2、0.2g/mL的聚乙二醇、0.15g/mL的海藻糖和98％的DMEM/F12培养基混匀，制得外周血单核细胞冻存液，于4℃保存备用。
实施例3：制备外周血单核细胞冻存液(重组人白介素-2+聚乙二醇+海藻糖+DMEM/F12培养基+人血白蛋白)：按体积含量，将1.0g/ml人血白蛋白、200U/mL的重组人白介素-2、0.0.3g/mL的聚乙二醇、0.2g/mL的海藻糖和95％的DMEM/F12培养基混匀，制得外周血单核细胞冻存液，于4℃保存备用。
实施例4：制备外周血单核细胞冻存液(重组人白介素-2+聚乙二醇+海藻糖+淋巴细胞培养基HIPP-T009+人血白蛋白)：按体积含量，将50U/mL的重组人白介素-2、0.2g/mL的聚乙二醇、0.1g/mL的海藻糖和95％的淋巴细胞培养基HIPP-T009以及0.01g/mL的人血白蛋白混匀，制得外周血单核细胞冻存液，于4℃保存备用。
实施例5：制备外周血单核细胞冻存液(重组人白介素-2+聚乙二醇+海藻糖+淋巴细胞培养基HIPP-T009+人血白蛋白)：按体积含量，将100U/mL的重组人白介素-2、0.1g/mL的聚乙二醇、0.15g/mL的海藻糖和86％的淋巴细胞培养基HIPP-T009以及0.02g/mL的人血白蛋白混匀，制得免疫细胞冻存液，于4℃保存备用。
实施例6：制备外周血单核细胞冻存液(重组人白介素-2+聚乙二醇+海藻糖+注射用氯化钠+人血白蛋白)：按体积含量，将50U/mL的重组人白介素-2、0.2g/mL的聚乙二醇、0.2g/mL的海藻糖和86％的注射用氯化钠以及0.1g/mL的人血白蛋白混匀，制得外周血单核细胞冻存液，于4℃保存备用。
对比例1：制备外周血单核细胞冻存液(胎牛血清+DMSO+DMEM/F12)：按体积百分比，将10％的胎牛血清与10％的DMSO和80％的DMSO+DMEM/F12培养基混匀，制得免疫细胞冻存液，于4℃保存备用。
对比例2：制备外周血单核细胞冻存液(供体血浆+DMSO+DMEM/F12)：按体积百分比，将10％的供体血浆与10％的DMSO和80％的DMEM/F12培养基混匀，制得外周血单核细胞冻存液，于4℃保存备用。
对比例3：制备外周血单核细胞冻存液(供体血浆+DMSO+淋巴细胞培养基HIPP-T009)：按体积百分比，将10％的供体血浆与10％的DMSO和80％的淋巴细胞培养基HIPP-T009培养基混匀，制得外周血单核细胞冻存液，于4℃保存备用。
实施例7：采用实施例1-6和对比例1-3的外周血单核细胞冻存液进行细胞的冻存外周血经2000转/分钟，离心10分钟，分离去除上层血浆于4℃备用，下层全血经淋巴细胞分离液密度梯度400g离心35分钟，分离获得外周血单核细胞，单个核细胞以5×106个细胞/mL与冻存液混合放入1mL、5mL冻存管中。将冻存管放入程序降温盒放入-80℃深低温冰箱24小时，再放入液氮罐(-196℃)中存储。取出冻存管快速置于37℃水浴1-2分钟，振荡直至细胞悬液完全融化，经离心，以淋巴细胞无血清培养基洗涤2次，即可。
实施例8：采用实施例1-6和对比例1-3的外周血单核细胞冻存液进行冻存外周血经3000转/分钟，离心20分钟，分离去除上层血浆于4℃备用，下层全血经淋巴细胞分离液密度梯度400g离心25分钟，分离获得外周血单核细胞，单个核细胞以6×106个细胞/mL与冻存液混合放入1mL、5mL冻存管中。将冻存管放入程序降温盒或放入-80℃深低温冰箱12小时，再放入液氮罐(-196℃)中存储30分钟，然后转入-20℃环境下放置3小时，再放入-80℃深低温冰箱10小时，再转入液氮罐中存储。取出冻存管快速置于40℃水浴3分钟，振荡直至细胞悬液完全融化，经离心，以淋巴细胞无血清培养基洗涤2次，即可。
使用实施例1-6和对比例1-3的外周血单核细胞冻存液冻存1个月、3个月、6个月和12个月后，其复苏后的单核细胞活性(冻存密度1.0×106个细胞/ml)结果如附图2表格图所示。
三、实验结果：
由表可以看出：使用实施例1-6的免疫细胞冻存液冻存1个月、3个月、6个月和12个月后复苏的NK细胞活性均在90％以上，其中，实施例2、4、6冻存的细胞复苏后的活性高于实施例1、3、5另外，实施例1-7的免疫细胞冻存液冻存1个月、3个月、6个月和12个月后复苏的NK细胞均没有镜下可见异物、细菌、真菌、内毒素、支原体的污染。
通过将实施例1-6与对比例1-3进行比较可以得出，采用实施例1-6的外周血单核细胞冻存液可以使细胞复苏后取得更好的细胞活性，细胞生物学特性不发生变化，保证了免疫细胞的生物学活性。
通过上述实施例可以说明，采用本发明的外周血单核细胞冻存液能够使细胞复苏后的存活率达到90％以上，有效解决了外周血单核细胞无法存储、长时间运输的问题，实现了本地采集、制备、存储、应用等。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法，其特征在于，包括以下组分：重组人白介素-2、人血白蛋白、聚乙二醇、海藻糖，以及基础培养基或注射用氯化钠。
2.根据权利要求1所述的一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法，其特征在于：所述免疫细胞冻存液包括：重组人白介素-250-200U/mL；聚乙二醇0.1-0.4g/mL；海藻糖0.05-0.3g/ml；人血白蛋白0.01-0.1g/ml基础培养基或注射用氯化钠90-99体积％，总量为100％。
3.根据权利要求1所述的一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法，其特征在于：所述外周血单核细胞冻存液中的重组人白介素-2的含量为50-200U/mL，例如可以是50U/mL、60U/mL、80U/mL、100U/mL、120U/mL、150U/mL、1600U/mL、180U/mL、200U/mL，所述外周血单核细胞冻存液中的聚乙二醇含量为0.1-0.4g/mL，例如可以是0.1g/mL、0.12g/mL、0.15g/mL、0.2g/mL、0.22g/mL、0.25g/mL、0.3g/mL、0.32g/mL、0.35g/mL、0.38g/mL、0.4g/mL，所述外周血单核细胞冻存液中的海藻糖含量为0.05-0.3g/mL，例如可以是0.05g/mL、0.1g/mL、0.15g/mL、0.2g/mL、0.25g/mL、0.3g/mL，所述外周血单核细胞冻存液中的基础培养基或注射用氯化钠的体积百分含量为90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％，所述外周血单核细胞冻存液中的人血白蛋白含量为0.01-0.1g/mL，例如可以是0.01g/mL、0.02g/mL、0.03g/mL、0.04g/mL、0.05g/mL、0.06g/mL、0.07g/mL、0.08g/mL、0.09g/mL、0.1g/mL，当在外周血单核细胞冻存液中还含有除重组人白介素-2、聚乙二醇、海藻糖、人血白蛋白组分以外的其它组分时，所述基础培养基或注射用氯化钠的含量会进行适当的下调，比如降低为80％-95％，例如所述基础培养的含量还可以是80％、80.5％、81％、81.5％、82％、82.5％、83％、83.5％、84％、84.5％、85％、85.5％、86％、86.5％、87％、87.5％、88％、88.5％、89％、89.5％，以满足所述免疫细胞冻存液中各组分含量之和为100％，所述外周血单核细胞冻存液中的重组人白介素-2、聚乙二醇、海藻糖、人血白蛋白，以及基础培养基或注射用氯化钠可以采用上述各组分所选择的含量进行任意配合，各组分的体积百分含量之和为100％。
4.根据权利要求1所述的一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法，其特征在于：所述外周血单核细胞冻存液包括：重组人白介素-2100-200U/mL；聚乙二醇0.2-0.4g/mL；海藻糖0.1-0.2g/mL；基础培养基或注射用氯化钠95-99体积％。
5.根据权利要求1所述的一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法，其特征在于：所述外周血单核细胞冻存液中，所述基础培养基为DMEM/F12培养基(Gibco)或淋巴细胞培养基[X-VIVOTM15(LONZA)、HIPP-T009(倍谙基)]，且所述淋巴细胞培养基为HIPP-T009(倍谙基)，其均可购自倍谙基公司。
6.根据权利要求1所述的一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法，其特征在于：所述免疫细胞为T细胞、自然杀伤细胞或CIK细胞中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法，其特征在于：本发明提供了一种外周血单核细胞的冻存方法，包括一下步骤：
(1)将外周血单核细胞与本发明所述的外周血单核细胞冻存液混合；
(2)进行程序降温至-80℃，然后转移至液氮中冷冻保存。
8.根据权利要求1所述的一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法，其特征在于：所述外周血淋巴细胞优选的冻存方法包括以下步骤：
(1)冻存液的制备：制备本发明所述的外周血单核细胞细胞冻存液；
(2)细胞悬液的制备：将供体资源分离去除血浆，并将下层全血离心分离获得外周血单核细胞，将所述外周血单核细胞与所述外周血单核细胞冻存液混合得到细胞悬液，置于无菌的冻存管中；
(3)冻存：将所述冻存管进行程序降温至-80℃，然后转移至液氮中冷冻保存；
(4)细胞复苏：取出冻存管快速置于37-40℃水浴1-3分钟，轻轻晃动直至细胞悬液完全融化，离心，以淋巴细胞无血清培养基洗涤2-3次，即可。
9.根据权利要求8所述的一种冻存方法，其特征在于：步骤(2)所述供体资源为外周血。
10.根据权利要求8所述的一种冻存方法，其特征在于：所述离心的转速为1500-3000转/分钟，例如可以是1500转/分钟、1800转/分钟、2100转/分钟、2400转/分钟、2700转/分钟、3000转/分钟例如可以是10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟，且所述细胞悬液的浓度为5-10×106个细胞/mL，例如可以是5×106个细胞/mL、6×106个细胞/mL、7×106个细胞/mL、8×106个细胞/mL、9×106个细胞/mL、10×106个细胞/mL，优选为7×106个细胞/mL。
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