CN110432259A - 一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用 - Google Patents
一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110432259A CN110432259A CN201910792520.3A CN201910792520A CN110432259A CN 110432259 A CN110432259 A CN 110432259A CN 201910792520 A CN201910792520 A CN 201910792520A CN 110432259 A CN110432259 A CN 110432259A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- frozen
- proline
- storing liquid
- trehalose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 68
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title abstract description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 94
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 23
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims abstract description 21
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 17
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 3
- 241001474374 Blennius Species 0.000 claims 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 18
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 9
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 abstract description 8
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 4
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 abstract 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 abstract 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 abstract 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 abstract 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 7
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 1
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-SCSAIBSYSA-N D-Proline Chemical compound OC(=O)[C@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- GCKMFJBGXUYNAG-HLXURNFRSA-N Methyltestosterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@](C)(O)[C@@]1(C)CC2 GCKMFJBGXUYNAG-HLXURNFRSA-N 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005381 potential energy Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 229940085503 testred Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明涉及一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用。所述冷冻保护液包括:L‑脯氨酸和海藻糖,所述L‑脯氨酸和所述海藻糖摩尔比为4~10:1。本发明所提供的细胞冻存液采用生物相容性更好的L‑脯氨酸和海藻糖,在使用时可以直接将冻存管保存于液氮中,节省大量时间,同时可以保证较高的细胞复苏率,特别是红细胞,可以达到80~90%;本发明细胞冻存液冻存后的细胞形态结构和生理功能维持稳定,细胞膜上的各功能性蛋白活性保持不变。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域,尤其涉及一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用。
背景技术
细胞冻存是现有生物学领域的一项常规技术,在购买的细胞经过传代后,一般需要将其中的一部分冻存起来,以作备用,可以用来重复实验,也可以在需要时复苏细胞,一部分拿来实验,另一部分继续传代冻存,是实验室的一种资源。同时也有很多实验在构建特定的细胞株后需要冻存一部分,以便重复使用。细胞在冻存时大量水分从细胞器中渗出,在低温条件下形成冰晶,从而对细胞本身造成损害。
现有技术为了克服细胞在低温状态下易形成冰晶的缺陷,在细胞冻存液中使用甘油或二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂,提高细胞膜对水的透过性,细胞在低温条件下,部分水分渗出,形成的冰晶较少;同时,细胞在冻存时需要采用“慢冻速融”的方法,以便于细胞内的水分可以充分地渗出,避免形成较大的冰晶。但是,现有冻存方法仍存在着一定的缺陷,以此方法冻存的细胞难免在结构和功能方面出现损伤,在复苏时,往往一部分细胞仍会死亡,而存活下来的细胞有时也需培养一段时间后恢复状态和活性。
而对于某些较为脆弱的细胞,由于其本身特殊的性质,在其冻存过程中细胞冻存液和冻存方法的选择更为重要,例如红细胞,红细胞目前被广泛用于外科手术补充失血和治疗贫血等疾病中。目前各大血站通常采用ACD,CPD,CPDA-1保存液将血液保存在4℃下,虽然能够基本保证一般情况下的临床用血需求,但是这种传统的保存方法保存时间短,通常可以保存3周,运输困难且受气温影响比较大,对于紧急情况下的大量用血以及偏远地区的用血需求就难以保障。此外,目前有采用甘油低温冷冻保存方法,能够保存红细胞长达10年之久,但是由于需要高浓度的甘油来保障红细胞经历降温及升温过程后仍然存活,所以在复苏红细胞后需要一系列复杂的耗时耗力的去甘油化过程,红细胞才能被用于输注。
发明内容
本发明提供一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用,用以解决现有技术中细胞冻存步骤繁琐,冻存后细胞结构和功能难以保持的问题。
第一方面,本发明提供一种冷冻保护液,包括:L-脯氨酸和海藻糖,所述L-脯氨酸和所述海藻糖摩尔比为4~10:1。
L-脯氨酸可以渗透到细胞内,减少细胞酸性,调整细胞的氧化还原势能,稳定蛋白质及其他生物大分子,海藻糖的性质十分稳定,可以在细胞膜表面形成保护膜,有效保持蛋白质分子不变形,维持细胞的生命特征和生物过程。本发明将此两者进行搭配,并限定其浓度使得其制成的冻存液效果在很大程度上得到提升,在冻存细胞时减少形成冰晶的数量和大小,可以不用常规的“慢冻”过程,直接置于液氮中保存也可以保持较高的细胞存活率。
进一步地,所述L-脯氨酸和所述海藻糖摩尔比为4~8:1。
进一步地,所述L-脯氨酸和所述海藻糖在细胞冻存液中终浓度为:L-脯氨酸1~2mol/L,海藻糖0.2~0.3mol/L。
第二方面,本发明提供一种细胞冻存液,包括上述冷冻保护液和基础液。
进一步地,所述基础液为PBS、0.9%NaCl、1×DMEM basic和杜氏磷酸缓冲液中的一种或多种,优选为杜氏磷酸缓冲液。
基础液在冻存液中起到维持细胞的正常生理活性的作用,合适的基础液可以使得复苏后的细胞仍能保持较好的生物活性,特别是杜氏磷酸缓冲液,本发明通过电子显微镜观察发现,以其为基础液和本发明的冻存保护液所配置的细胞冻存液,冻存的细胞在复苏前后细胞形态得以更好地保持,其细胞膜上的Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的活力也得以维持。
进一步地,所述细胞冻存液为红细胞冻存液。
相较于其他细胞,红细胞在形态上更小且更加脆弱,其冻存条件更加苛刻,一般采用甘油作为细胞冻存液,具有较好的冻存效率,然而甘油生物活性差,在解冻时需要使用不同浓度的甘油进行梯度洗脱,才能尽可能地去除甘油,方便红细胞的输注,而本发明的细胞冻存液具有较好的生物相容性,在解冻时直接37℃水浴复温后即可使用,同时可以保证较高的红细胞存活率,达到90%。
第三方面,本发明提供一种细胞冻存方法,采用上述细胞冻存液冻存细胞。
进一步地,具体步骤为:将所述细胞与所述细胞冻存液混合后直接置于低于-196℃条件下保存。
进一步地,混合后所述细胞体积为总体积的15%~25%。
在本发明一个优选实施方式中,细胞冻存方法如下:
(1)将L-脯氨酸和海藻糖用基础液杜氏磷酸盐缓冲液稀释成1~2mol/L和0.2~0.3mol/L,制成细胞冻存液;
(2)室温下将红细胞移入装有细胞冻存液的冻存管中,红细胞体积占总体积的15%~25%,后直接将冻存管置于液氮中进行保存。
进一步地,细胞冻存液在制成后在4℃条件下平衡10min。
进一步地,解冻时将冻存管从液氮中取出后37℃水浴,完成解冻过程。
本发明涉及一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用,具有如下有益效果:
(1)本发明冻存速度快,将细胞和细胞冻存液混匀后即可置于液氮中保存,无需常规的慢冻过程,特别是红细胞,可以保持80%~90%的细胞存活率。
(2)冻存后的细胞可以维持良好的形态结构和功能状态,细胞膜上的各类功能性蛋白活性不发生改变。
(3)在用于红细胞时,无需传统甘油冻存法的繁琐步骤和设备,水浴即可复苏红细胞。
附图说明
图1为本发明实验例2提供的电子显微镜观察下的冻存前后红细胞形态结构对比图,其中,A图为冻存前红细胞扫描电子显微镜图,B图为冻存后红细胞扫描电子显微镜图;
图2为本发明实验例2提供的冻存前后红细胞渗透脆性变化示意图;
图3为本发明实验例2提供的冻存前后红细胞细胞膜上Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的活力测试结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种细胞冻存液,制备方法如下:
用1×杜氏磷酸缓冲液稀释L-脯氨酸和海藻糖制备细胞冻存液,其中,L-脯氨酸浓度为1.2mol/L,海藻糖浓度为0.2mol/L;制备完成后将细胞冻存液在4℃下平衡10分钟。
实施例2
本实施例提供一种细胞冻存液,制备方法同实施例1,区别在于:
其中,L-脯氨酸浓度为2mol/L,海藻糖浓度为0.2mol/L。
实施例3
本实施例提供一种细胞冻存液,制备方法同实施例1,区别在于:
其中,L-脯氨酸浓度为1.2mol/L,海藻糖浓度为0.3mol/L。
实施例4
本实施例提供一种细胞冻存液,制备方法同实施例1,区别在于:基础液选用1×PBS。
实施例5
本实施例提供一种细胞冻存液,制备方法同实施例1,区别在于:基础液选用0.9%NaCl。
对比例1
本对比例提供一种细胞冻存液,成分如下:
10%甘油、1.5%甘露醇以及0.65%NaCl。
对比例2
本对比例提供一种细胞冻存液,制备方法同实施例1,区别在于:将L-脯氨酸替换为D-脯氨酸。
对比例3
本对比例提供一种细胞冻存液,制备方法同实施例1,区别在于:将L-脯氨酸替换为HES。
对比例4
本对比例提供一种细胞冻存液,制备方法同实施例1,区别在于:将海藻糖替换为葡萄糖。
对比例5
本对比例提出一种细胞冻存液,制备方法同实施例1,区别在于:
其中,L-脯氨酸浓度为0.25mol/L,海藻糖浓度为0.9mol/L。
实验例1
本实验例对上述实施例和对比例中的细胞冻存液通过如下方法进行冻存效果测试:
将新鲜的无菌脱纤维绵羊血用缓冲液离心(以1000转/分钟离心5分钟)洗涤1~2遍,去除其中坏损的红细胞;
将洗涤后的红细胞以20%的体积比加入1mL细胞冻存液中,后移入1.2mL冻存管内;
将冻存管直接浸入液氮中进行冻存。
在冻存7天后,将冻存管中液氮中取出,浸入37℃水浴中,振荡加强对流换热,约1min完成解冻程序。
将解冻后的红细胞收集离心后,利用酶标仪测试上清液在450nm处的吸光度,比色法测试溶血率,并对其聚集程度进行检测,得到如下表结果:
表1红细胞溶血率对比结果
实验例2
本实验例对使用实施例1的冻存液冻存的红细胞在冻存前后细胞形态、渗透脆性和细胞膜上的Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活性进行测试,具体方法如下:
取实验例1中解冻后的红细胞收集离心后,在电子显微镜下观察其形态,如图1所示,红细胞维持良好的中间凹陷的盘状形态,
通过将解冻后的红细胞和未经冻存的红细胞加到一系列不同浓度低渗盐水中以测试红细胞的渗透脆性进行测试得到如图2所示结果:当复苏后的红细胞在0.60%~0.65%NaCl中的时候发生50%溶血率,和冻存前红细胞的渗透脆性相比无明显改变。
通过酶标定法对细胞膜上Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶进行活力测试得到如图3所示结果:复苏后的红细胞的细胞膜上的Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的活性分别为1.56±0.36μmol Pi-1(109RBCs)-1hour-1,1.52±0.26μmol Pi-1(109RBCs)-1hour-1,与正常红细胞的细胞膜上酶活性基本一致。
实验例3
本实验例对使用实施例1的冻存液冻存的3T3在冻存前后的细胞存活率进行测试,区别在于基础液使用1×DMEM basic,测试具体步骤如下:
取3T3细胞,将1×106个3T3细胞加入1mL细胞冻存液中,后移入1.2mL冻存管内;
将冻存管直接浸入液氮中进行冻存。
在冻存7天后,将冻存管中液氮中取出,浸入37℃水浴中,振荡加强对流换热,约1min完成解冻程序。
将解冻后的3T3细胞收集离心后,将细胞培养1天后,利用CCK8试剂及酶标仪,测试在450nm处的吸光度,获得细胞活率。
结果显示,3T3细胞的存活率达到53%。
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种冷冻保护液,其特征在于,包括:L-脯氨酸和海藻糖,所述L-脯氨酸和所述海藻糖摩尔比为4~10:1。
2.根据权利要求1所述的冷冻保护液,其特征在于,所述L-脯氨酸和所述海藻糖摩尔比为4~8:1。
3.根据权利要求1所述的冷冻保护液,其特征在于,所述L-脯氨酸和所述海藻糖在细胞冻存液中终浓度为:L-脯氨酸1~2mol/L,海藻糖0.2~0.3mol/L。
4.一种细胞冻存液,其特征在于,包括权利要求1-3任一项所述冷冻保护液和基础液。
5.根据权利要求4所述的细胞冻存液,其特征在于,所述基础液为PBS、0.9%NaCl、1×DMEM basic和杜氏磷酸缓冲液中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的细胞冻存液,其特征在于,所述基础液为杜氏磷酸缓冲液。
7.根据权利要求4-6任一项所述的细胞冻存液,其特征在于所述细胞冻存液为红细胞冻存液。
8.权利要求4-7任一项所述细胞冻存液的制备方法,其特征在于,包括:使用所述基础液稀释L-脯氨酸和海藻糖至合适浓度。
9.一种细胞冻存方法,其特征在于,采用权利要求4-7任一项所述的细胞冻存液冻存细胞。
10.根据权利要求9所述的细胞冻存方法,其特征在于,具体步骤为:将所述细胞与所述细胞冻存液混合后直接置于低于-196℃的条件下保存。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910792520.3A CN110432259B (zh) | 2019-08-26 | 2019-08-26 | 一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910792520.3A CN110432259B (zh) | 2019-08-26 | 2019-08-26 | 一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110432259A true CN110432259A (zh) | 2019-11-12 |
CN110432259B CN110432259B (zh) | 2021-07-23 |
Family
ID=68437771
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910792520.3A Active CN110432259B (zh) | 2019-08-26 | 2019-08-26 | 一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110432259B (zh) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111296412A (zh) * | 2020-04-17 | 2020-06-19 | 赛尔瑞成(北京)生命科学技术有限公司 | 一种无血清低dmso细胞冻存液及其应用 |
CN112167243A (zh) * | 2020-10-14 | 2021-01-05 | 中国科学技术大学 | 红细胞冻存液及快速冻存方法 |
CN113115766A (zh) * | 2019-12-31 | 2021-07-16 | 中国农业大学 | 一种提高精液保存品质的精液保存液及其制备方法与应用 |
CN113170778A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-07-27 | 广州瑞铂茵健康科技有限公司 | 一种细胞冻存液及其制备方法与应用 |
CN114190366A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-03-18 | 松山湖材料实验室 | 冻存液及其制备方法与在人正常肝细胞的应用 |
CN114732005A (zh) * | 2022-04-07 | 2022-07-12 | 广州市天河诺亚生物工程有限公司 | 一种可反复冻融脐带血单个核细胞冻存液及其应用 |
CN114982744A (zh) * | 2022-07-07 | 2022-09-02 | 广州沙艾生物科技有限公司 | 一种脐带干细胞储存液及其制备方法 |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5242792A (en) * | 1991-02-25 | 1993-09-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Method for the preservation of red blood cells by lyophilization using glycerol or inositol with disaccharides |
WO2014198760A1 (en) * | 2013-06-12 | 2014-12-18 | Universite De Namur | Freeze preservation of living cells |
CN105961374A (zh) * | 2016-07-04 | 2016-09-28 | 深圳市合康生物科技股份有限公司 | 细胞冻存液 |
CN107183012A (zh) * | 2017-07-12 | 2017-09-22 | 山东翰康生物科技有限公司 | 人体干细胞的冷冻液及冷冻储存方法 |
CN108184819A (zh) * | 2018-01-24 | 2018-06-22 | 北京臻溪谷医学研究中心(有限合伙) | 一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用 |
CN108207930A (zh) * | 2016-12-15 | 2018-06-29 | 中国科学院理化技术研究所 | 一种鸡尾酒式冷冻保护剂及其应用 |
CN108244102A (zh) * | 2018-04-17 | 2018-07-06 | 北京大学第三医院 | 一种生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂、试剂盒及其使用方法 |
CN108464300A (zh) * | 2018-04-17 | 2018-08-31 | 北京大学第三医院 | 一种制备玻璃化冷冻液的方法及装置系统 |
-
2019
- 2019-08-26 CN CN201910792520.3A patent/CN110432259B/zh active Active
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5242792A (en) * | 1991-02-25 | 1993-09-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Method for the preservation of red blood cells by lyophilization using glycerol or inositol with disaccharides |
WO2014198760A1 (en) * | 2013-06-12 | 2014-12-18 | Universite De Namur | Freeze preservation of living cells |
CN105961374A (zh) * | 2016-07-04 | 2016-09-28 | 深圳市合康生物科技股份有限公司 | 细胞冻存液 |
CN108207930A (zh) * | 2016-12-15 | 2018-06-29 | 中国科学院理化技术研究所 | 一种鸡尾酒式冷冻保护剂及其应用 |
CN107183012A (zh) * | 2017-07-12 | 2017-09-22 | 山东翰康生物科技有限公司 | 人体干细胞的冷冻液及冷冻储存方法 |
CN108184819A (zh) * | 2018-01-24 | 2018-06-22 | 北京臻溪谷医学研究中心(有限合伙) | 一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用 |
CN108244102A (zh) * | 2018-04-17 | 2018-07-06 | 北京大学第三医院 | 一种生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂、试剂盒及其使用方法 |
CN108464300A (zh) * | 2018-04-17 | 2018-08-31 | 北京大学第三医院 | 一种制备玻璃化冷冻液的方法及装置系统 |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113115766A (zh) * | 2019-12-31 | 2021-07-16 | 中国农业大学 | 一种提高精液保存品质的精液保存液及其制备方法与应用 |
CN111296412A (zh) * | 2020-04-17 | 2020-06-19 | 赛尔瑞成(北京)生命科学技术有限公司 | 一种无血清低dmso细胞冻存液及其应用 |
CN111296412B (zh) * | 2020-04-17 | 2022-10-04 | 赛尔瑞成(北京)生命科学技术有限公司 | 一种无血清低dmso细胞冻存液及其应用 |
CN112167243A (zh) * | 2020-10-14 | 2021-01-05 | 中国科学技术大学 | 红细胞冻存液及快速冻存方法 |
CN112167243B (zh) * | 2020-10-14 | 2023-03-10 | 中国科学技术大学 | 红细胞冻存液及快速冻存方法 |
CN113170778A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-07-27 | 广州瑞铂茵健康科技有限公司 | 一种细胞冻存液及其制备方法与应用 |
CN113170778B (zh) * | 2021-03-31 | 2022-03-22 | 广州瑞铂茵健康科技有限公司 | 一种细胞冻存液及其制备方法与应用 |
CN114190366A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-03-18 | 松山湖材料实验室 | 冻存液及其制备方法与在人正常肝细胞的应用 |
CN114732005A (zh) * | 2022-04-07 | 2022-07-12 | 广州市天河诺亚生物工程有限公司 | 一种可反复冻融脐带血单个核细胞冻存液及其应用 |
CN114982744A (zh) * | 2022-07-07 | 2022-09-02 | 广州沙艾生物科技有限公司 | 一种脐带干细胞储存液及其制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110432259B (zh) | 2021-07-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110432259A (zh) | 一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用 | |
CN110050782B (zh) | 一种干细胞冻存液及其制备方法和冻存方法 | |
US20200060260A1 (en) | Compositions and methods for organ preservation | |
RU2396748C2 (ru) | Среда для хранения клеток | |
CN101720753B (zh) | 组织工程产品的低温保存液及其使用方法 | |
CN109090100A (zh) | 一种间充质干细胞冻存液及其制备方法与使用方法 | |
CN108207930A (zh) | 一种鸡尾酒式冷冻保护剂及其应用 | |
US20190059360A1 (en) | Cryopreservation of cells in absence of vitrification inducing agents | |
CN109329271A (zh) | 一种临床用间充质干细胞冷冻保存液及其制备方法 | |
CA2719806A1 (en) | Method, system, and apparatus for hypothermic collection, storage, transport and banking of birth tissue | |
CN105941389A (zh) | 一种无动物源血清的细胞冻存液 | |
Stoll et al. | Membrane stability during biopreservation of blood cells | |
CN102763642B (zh) | 一种冷冻保护液以及冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的方法 | |
Arav et al. | Freeze drying (lyophilization) of red blood cells | |
US20210195891A1 (en) | Cryopreservation of tissues and organs | |
Yang et al. | Effect of cryoprotectants on rat kidney decellularization by freeze-thaw process | |
CN107711823B (zh) | 一种常温保存的细胞冻存液及其应用 | |
US20130157250A1 (en) | Method for cryopreservation of human spermatozoa free from seminal plasma using a fast and simple aseptic vitrification-devitrification process; portable kit for carrying out the method; and use of the same for treatment of disorders related to reproductive failures | |
Halberstadt et al. | Corneal cryopreservation with dextran | |
CN103355285B (zh) | 一种烟草叶片愈伤组织细胞的冷冻保存方法 | |
JP2008104407A (ja) | 細胞保存方法 | |
CN111374123B (zh) | 中性氨基酸作为细胞低温保护剂的使用方法及其应用 | |
CN112056304A (zh) | 一种微载体细胞三维复合体冷冻保存液及应用 | |
Fuller et al. | Cryopreservation for cell banking: current concepts at the turn of the 21st century | |
KR101426804B1 (ko) | 혈소판 보존 조성물, 이를 포함하는 혈소판 보존 키트 및 이를 이용한 혈소판 보존 방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |