CN115088708A - 外周血单个核细胞长期保存方法 - Google Patents

外周血单个核细胞长期保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种外周血单个核细胞长期保存方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将外周血单个核细胞混悬液与细胞冻存液混合；和(2)进行程序降温至‑70至‑90℃，然后转移至液氮中冷冻保存；其中，所述细胞冻存液为不含有DMSO、人白介素和白蛋白的细胞冻存液。本发明的外周血单个核细胞冻存方法，在保存12月的情况下，使得复苏细胞存活率达到95％以上，细胞生物学特性不发生变化，保证了外周血单个核细胞的生物学活性；本发明的外周血单个核细胞冻存液中不含动物血清以及DMSO、人白介素和白蛋白，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，不会对人体免疫治疗产生影响，降低了成本。

Description

外周血单个核细胞长期保存方法
技术领域
本发明属于细胞冻存技术领域，具体涉及一种外周血单核细胞长期保存方法。
背景技术
外周血单个核细胞(peripheral blood monouclear cells，PBMCs)包括淋巴细胞和单核细胞。其中，外周血单个核细胞和许多疾病，如重症肌无力、川崎病、原发性肾病综合征、类风湿性关节炎等有关，所以低温长时间保存外周血单个核细胞在实验研究与临床应用方面有重要意义。细胞的冷冻保存实际上是一个脱水过程，在这一过程中，细胞常受到机械性和渗透性的损伤.在冻存过程中如何最大限度地使细胞免受损伤是需要解决的课题。选择合适的冷冻保护剂可以避免细胞在冷冻时细胞内冰晶的形成，保护细胞膜和细胞器免受损伤。细胞冻存经常采用渗透性保护剂，例如甘油和二甲基亚砜(DMSO)两种，而甘油作为冷冻保护剂冻储存的免疫细胞存活率较低，但DMSO却可以迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，使水分在细胞冻结前透出细胞外形成冰晶，成为免疫细胞冻存最理想的冷冻保护剂。
目前国内冻存方法多采用的是DMSO、动物血清和细胞培养液按不同比例搭配成的冻存液，例如CN102301992A公开的用于冻存单个核细胞的冻存液，其包含血浆和二甲基亚砜，但不仅限于此，还可以包含动物血清和培养基等成分。采用该冻存液的优点是细胞保存时间长，然而该冻存液中含有的动物血清引入了外源蛋白，同时增加了动物病原污染的可能性。目前也有一些采用冻存液中不含动物血清的文献，例如，中国专利申请CN104026118A公开的免疫细胞冻存液，其包含二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基。采用该冷冻液的优点在于不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，然而该冷冻液冻存细胞的存活率以及细胞活性仍较低。
为了避免采用DMSO作为保护剂，目前一些文献采用不含有DMSO的冻存液，例如，中国专利申请CN108651439A公开了一种外周血单个核细胞完全无血清冻存液及其方法，包括以下组分：重组人白介素-2、人血白蛋白、聚乙二醇、海藻糖，以及基础培养基或注射用氯化钠。该文献采用将重组人白介素-2(IL-2)添加到外周血单个核细胞冻存液中，可大幅度提高复苏后培养免疫细胞的活性稳定性，使其保持原有细胞高活性，从而使免疫细胞很好地保持了细胞复苏后的生理功能和生物学特性，可有效解决细胞复苏后直接规模化扩增问题。再例如，中国授权专利CN105638642B公开了一种免疫细胞冻存液及其应用，所述免疫细胞冻存液包括重组人白介素-2、聚乙二醇、1,2-丙二醇，以及基础培养基或注射用氯化钠；具体的，所述免疫细胞冻存液包括：重组人白介素-2 50-200U/mL；聚乙二醇0.1-0.4g/mL；1,2-丙二醇0.2-0.4g/mL；基础培养基或注射用氯化钠90-99体积％。通过将本发明所述的免疫细胞冻存液用于免疫细胞冻存，可使复苏细胞存活率达到93％以上，细胞生物学特性不发生变化，保证了免疫细胞的生物学活性；另外，由于免疫细胞冻存液中不含动物血清，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，而且有效解决了免疫细胞无法存储、长时间运输的问题。
基于上述文献可知，现有技术中用于不含DMSO的冻存液，都不可避免的采用了重组人白介素-2。这主要是由于外周血的T细胞、B细胞和NK细胞膜表面均存在白介素-2(IL-2)受体，IL-2与其受体结合后可以调节该细胞的增生，调节免疫球蛋白的生成；促进T细胞、B细胞和NK细胞的增殖、分化并能提高NK细胞的杀伤活性。然而，采用重组人白介素-2作为冻存液的组分之一，一方面存在成本方面的问题，另一方面，重组人白介素-2会调节免疫球蛋白的生成，对于部分人群存在严重的过敏反应。因此，如何提供一种不使用重组人白介素-2又能够实现外周血单个核细胞长期保存的冻存液是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
基于上述背景技术，本发明所要解决的技术问题在于提供一种外周血单个核细胞长期保存方法。为了实现本发明的发明目的，拟采用如下技术方案：
本发明一方面涉及一种外周血单个核细胞保存方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将外周血单个核细胞混悬液与细胞冻存液混合；和(2)进行程序降温至-70至-90℃，然后转移至液氮中冷冻保存；其中，所述细胞冻存液为不含有DMSO、人白介素和白蛋白的细胞冻存液。
在本发明的一个优选实施方式中，所述细胞冻存液含有聚乙二醇、银杏叶多糖和基础培养基。
在本发明的一个优选实施方式中，所述聚乙二醇的含量为0.05-0.3g/mL，银杏叶多糖的含量为0.05-0.1g/mL，基础培养基为99体积％。
在本发明的一个优选实施方式中，所述聚乙二醇的含量为0.08-0.12g/mL，银杏叶多糖的含量为0.08-0.12g/mL。
在本发明的一个优选实施方式中，所述聚乙二醇的平均分子量为500-3000；优选为1800-2200。
在本发明的一个优选实施方式中，所述细胞冻存液的基础培养基为无血清培养基；优选为DMEM/F12培养基。
在本发明的一个优选实施方式中，所述用于程序降温的外周血单个核细胞的浓度为0.8-1.2×106个/mL。
在本发明的一个优选实施方式中，所述外周血单个核细胞在液氮中保存12个月的情况下，其复苏细胞存活率达95％以上；优选为98％以上。
有益效果
本发明的外周血单个核细胞冻存方法，在保存12月的情况下，使得复苏细胞存活率达到95％以上，细胞生物学特性不发生变化，保证了外周血单个核细胞的生物学活性；本发明的外周血单个核细胞冻存液中不含动物血清以及DMSO、人白介素和白蛋白，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，不会对人体免疫治疗产生影响，降低了成本。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1：制备外周血单个核细胞冻存液：按体积含量0.1g/mL的聚乙二醇-2000、0.1g/mL的银杏叶多糖和99％的DMEM/F12培养基混匀，制得外周血单个核细胞冻存液，于4℃保存备用。
实施例2：制备外周血单个核细胞冻存液：按体积含量0.1g/mL的聚乙二醇-600、0.1g/mL的银杏叶多糖和99％的DMEM/F12培养基混匀，制得外周血单个核细胞冻存液，于4℃保存备用。
实施例3：制备外周血单个核细胞冻存液：按体积含量0.2g/mL的聚乙二醇-2000、0.1g/mL的银杏叶多糖和99％的DMEM/F12培养基混匀，制得外周血单个核细胞冻存液，于4℃保存备用。
实施例4：制备外周血单个核细胞冻存液：按体积含量0.2g/mL的聚乙二醇-600、0.1g/mL的银杏叶多糖和99％的DMEM/F12培养基混匀，制得外周血单个核细胞冻存液，于4℃保存备用。
实施例5：制备外周血单个核细胞冻存液：按体积含量0.2g/mL的聚乙二醇-2000、0.05g/mL的银杏叶多糖和99％的DMEM/F12培养基混匀，制得外周血单个核细胞冻存液，于4℃保存备用。
实施例6：制备外周血单个核细胞冻存液：按体积含量0.2g/mL的聚乙二醇-600、0.05g/mL的银杏叶多糖和99％的DMEM/F12培养基混匀，制得外周血单个核细胞冻存液，于4℃保存备用。
实施例7：采用实施例1-6外周血单个核细胞冻存液进行细胞的冻存
外周血经2000转/分钟，离心10分钟，分离去除上层血浆于4℃备用，下层全血经淋巴细胞分离液密度梯度400g离心35分钟，分离获得外周血单个核细胞，单个核细胞以6×106个细胞/mL，与冻存液按照1：5体积混合放入5mL冻存管中。将冻存管放入程序降温盒，然后放入-80℃深低温冰箱24小时，再放入液氮罐(-196℃)中存储。取出冻存管快速置于37℃水浴1-2分钟，振荡直至细胞悬液完全融化，经离心，以淋巴细胞无血清培养基洗涤2次，即可。
使用实施例1-6外周血单个核细胞冻存液冻存1个月、3个月、6个月和12个月后，其复苏后的单个核细胞活性(冻存密度1.0×106个细胞/ml)结果如表1所示。
表1：复苏后的单个核细胞活性
组别 1个月(％) 3个月(％) 6个月(％) 12个月(％)
实施例1 99.2±0.6 99.0±0.7 98.6±0.6 98.4±0.8
实施例2 98.3±0.7 97.5±0.8 97.0±1.1 96.3±1.1
实施例3 98.8±0.8 98.2±1.0 97.8±1.2 97.2±0.9
实施例4 97.6±0.9 97.1±0.9 96.9±1.2 96.5±0.8
实施例5 97.5±1.0 97.2±1.87 97.0±1.1 96.5±0.9
实施例6 96.4±1.1 96.0±1.0 95.5±1.0 95.2±1.2
实验结果：由表可以看出：使用实施例1-6的免疫细胞冻存液冻存1个月、3个月、6个月和12个月后复苏的细胞活性均在95％以上，即，本发明有效解决了外周血单个核细胞无法存储、长时间运输的问题，实现了本地采集、制备、存储、应用等。其中，实施例1冻存的细胞复苏后的活性最高，由此说明聚乙二醇与银杏叶多糖配比对于细胞冻存复苏后的活性存在一定的影响。在聚乙二醇与银杏叶多糖配比相同的情况下，实施例1、3、5冻存的细胞复苏后的活性高于对应的实施例2、4和6，由此说明聚乙二醇的分子量对于细胞冻存复苏后的活性存在一定的影响，其中聚乙二醇-2000比聚乙二醇-600冻存效果更好。另外，实施例1-6的免疫细胞冻存液冻存1个月、3个月、6个月和12个月后复苏的细胞均没有镜下可见异物、细菌、真菌、内毒素、支原体的污染。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (8)

1.一种外周血单个核细胞保存方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将外周血单个核细胞混悬液与细胞冻存液混合；和(2)进行程序降温至-70至-90℃，然后转移至液氮中冷冻保存；其中，所述细胞冻存液为不含有DMSO、人白介素和白蛋白的细胞冻存液。
2.根据权利要求1所述的方法，所述细胞冻存液含有聚乙二醇、银杏叶多糖和基础培养基。
3.根据权利要求2所述的方法，所述聚乙二醇的含量为0.05-0.3g/mL，银杏叶多糖的含量为0.05-0.1g/mL，基础培养基为99体积％。
4.根据权利要求3所述的方法，所述聚乙二醇的含量为0.08-0.12g/mL，银杏叶多糖的含量为0.08-0.12g/mL。
5.根据权利要求2-4任意一项所述的方法，所述聚乙二醇的平均分子量为500-3000；优选为1800-2200。
6.根据权利要求2所述的方法，所述细胞冻存液的基础培养基为无血清培养基；优选为DMEM/F12培养基。
7.根据权利要求2所述的方法，所述用于程序降温的外周血单个核细胞的浓度为0.8-1.2×106个/mL。
8.根据权利要求1所述的方法，所述外周血单个核细胞在液氮中保存12个月的情况下，其复苏细胞存活率达95％以上；优选为98％以上。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104026118A (zh) * 2013-11-13 2014-09-10 杭州易文赛生物技术有限公司 一种免疫细胞冻存液、其制备方法及应用
CN105638642A (zh) * 2016-01-27 2016-06-08 上海润泉生物技术有限公司 一种免疫细胞冻存液及其应用
CN107912419A (zh) * 2017-10-11 2018-04-17 重庆金时代生物技术有限公司 一种人外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法
CN108651439A (zh) * 2018-04-13 2018-10-16 上海韵飞生物科技有限公司 一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法
CN110140716A (zh) * 2019-07-08 2019-08-20 方艳秋 一种外周血单个核细胞改良冻存液
CN110447636A (zh) * 2019-08-07 2019-11-15 广东万海细胞生物科技有限公司 一种外周血单个核细胞的冻存液、冻存方法及复苏方法
WO2021223274A1 (zh) * 2020-05-06 2021-11-11 青岛瑞思德生物科技有限公司 免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存方法及其细胞库建立

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104026118A (zh) * 2013-11-13 2014-09-10 杭州易文赛生物技术有限公司 一种免疫细胞冻存液、其制备方法及应用
CN105638642A (zh) * 2016-01-27 2016-06-08 上海润泉生物技术有限公司 一种免疫细胞冻存液及其应用
CN107912419A (zh) * 2017-10-11 2018-04-17 重庆金时代生物技术有限公司 一种人外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法
CN108651439A (zh) * 2018-04-13 2018-10-16 上海韵飞生物科技有限公司 一种外周血单核细胞完全无血清冻存液及其方法
CN110140716A (zh) * 2019-07-08 2019-08-20 方艳秋 一种外周血单个核细胞改良冻存液
CN110447636A (zh) * 2019-08-07 2019-11-15 广东万海细胞生物科技有限公司 一种外周血单个核细胞的冻存液、冻存方法及复苏方法
WO2021223274A1 (zh) * 2020-05-06 2021-11-11 青岛瑞思德生物科技有限公司 免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存方法及其细胞库建立

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
任兴: "银杏叶、果中多糖的提取及抗氧化研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》 *
臧中昊: "银杏叶多糖降解产物对巨噬细胞抗炎抗氧化活性的影响", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》 *

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