CN110447636A - 一种外周血单个核细胞的冻存液、冻存方法及复苏方法 - Google Patents

一种外周血单个核细胞的冻存液、冻存方法及复苏方法 Download PDF

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何安涛
李莉
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Abstract

本发明涉及一种外周血单个核细胞的冻存液、冻存方法及复苏方法，冻存液，包括如下体积百分比的组分：无血清培养基40‑60％、非渗透性保护剂15‑25％、渗透性保护剂5‑15％、透明质酸钠5‑15％和抗氧化物质5‑15％。本发明采用无血清培养基+非渗透性保护剂+渗透性保护剂+抗氧化物质的冻存液组合，可以有效的冻存细胞，在复苏后仍然具有较高的活细胞率，具有较高的应用价值，值得推广。

Description

一种外周血单个核细胞的冻存液、冻存方法及复苏方法
技术领域
本发明涉及细胞冻存技术领域，具体涉及一种外周血单个核细胞的冻存液、冻存方法及复苏方法。
背景技术
外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)是外周血中具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞(lymphocyte)、单核细胞(monocyte)、树突状细胞(Dendritic Cells,DC)等。对外周血单个核细胞进行冻存并能够有效的维持其活力和功能，对于基础医学和临床应用均具有重要的意义。对外周血单个核细胞进行冻存储存处理，可以有效解决现有的免疫细胞诱导周期长，且多次诱导和多次采血等问题，还可以把人在健康状态时最佳的免疫细胞储存起来，以备未来所需，如可用于储存者的肿瘤细胞治疗及抗衰老等。
冻存液的选择以及复苏的方式对于PBMC冻存和复苏活性至关重要，选择不当的冻存液或复苏不当可能会给PBMC造成不可逆的损伤。外界温度降低至-80℃时，PBMC的活性将随着冷冻时间的延长而骤降，一旦温度降低至-196℃时，PBMC的所有生物学过程几乎停滞，因此要长期保存PBMC，液氮温度是最佳的储存温度。目前为止使用较多的冷冻保护剂是二甲基亚砜(DMSO)，可以迅速渗透入细胞，增加细胞膜对水的通透性，使水分在细胞冻结前渗出细胞外，并形成冰晶，保护细胞膜和细胞器免受损伤。DMSO是一种有毒溶剂，高浓度DMSO对细胞伤害较大，所以必须添加其他成分降低DMSO浓度，减少对冻存细胞的伤害。
专利公开号CN104026118A公开了一种采用DMSO，人供体血浆及免疫细胞基础培养基的冻存液，虽然该方法不会引入外源性蛋白，但该冻存细胞的存活率仍然较低。
专利公开号CN104719282A公开了一种采用DMSO，右旋糖酐-40和勃脉力A的冻存方案，使用该方案获得的PBMC复苏活率平均在84.03％，还有待提高。而且该专利仅记载细胞冻存液(20％DMSO+2％右旋糖酐40+勃脉力A)的复苏数据，DSMO的用量依然较高，而低用量DMSO用量的细胞活率不可知，但是可以很显而易见的推测，随着DMSO用量降低会导致细胞活率的降低。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种外周血单个核细胞的冻存液、冻存方法及复苏方法，可以有效的冻存细胞，在复苏后仍然具有较高的活细胞率，具有较高的应用价值，值得推广。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种外周血单个核细胞的冻存液，包括如下体积百分比的组分：
优选地，由如下体积百分比的组分组成：
其中，所述无血清培养基为X-VIVO15无血清培养基。
其中，所述非渗透性保护剂为人白蛋白、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、海藻糖和聚乙烯比咯烷酮中的至少一种。
优选地，所述非渗透性保护剂为人白蛋白。
其中，所述渗透性保护剂为DMSO、甘油、丙二醇和乙二醇中的至少一种。
优选地，所述渗透性保护剂为DMSO。
其中，所述抗氧化物质为抗坏血酸、硫辛酸、虾青素、花青素、叶黄素和白藜芦醇中的至少一种。
一种外周血单个核细胞的冻存方法，包括如下步骤：将外周血单个核细胞悬液离心后去除上清液，加入上述的外周血单个核细胞的冻存液，使细胞密度不高于2*107cells/mL，然后放置于程度降温盒内，并转移至-80℃冰箱过夜，次日移入液氮罐。
一种外周血单个核细胞的复苏方法，包括如下步骤：将上述的外周血单个核细胞的冻存方法得到的冻存液置于37℃水浴溶解，然后吸取冻存细胞液转移至含有10wt％自体血浆的的X-VIVO15无血清培养基中，离心，清洗细胞，接种在X-VIVO15无血清培养基，计算细胞活率。
本发明的有益效果在于：本发明采用无血清培养基+非渗透性保护剂+渗透性保护剂+抗氧化物质的冻存液组合，可以有效的冻存细胞，在复苏后仍然具有较高的活细胞率，具有较高的应用价值，值得推广。
附图说明
图1是实施例4的活细胞率-复苏时间的折线图。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1冻存液1
冻存液由如下组分组成：500μL X-VIVO15无血清培养基，200μL人白蛋白，100μL0.5wt％透明质酸钠，100μL50μg/mL抗坏血酸，100μL DMSO。
在其它的可替代的实施例中，冻存液可以由如下组分组成：400μLX-VIVO15无血清培养基，150μL人白蛋白，150μL 0.5wt％透明质酸钠，150μL50μg/mL抗坏血酸，150μL DMSO组成；也可以由如下组分组成：600μLX-VIVO15无血清培养基，250μL人白蛋白，50μL0.5wt％透明质酸钠，50μL50μg/mL抗坏血酸，50μL DMSO。
对比例1冻存液2
冻存液由如下组分组成：500μLX-VIVO15无血清培养基，200μL人白蛋白，100μL0.2M海藻糖，100μL50μg/mL抗坏血酸，100μL DMSO。
对比例2冻存液3
冻存液由如下组分组成：500μLX-VIVO15无血清培养基，200μL人白蛋白，100μL0.2M海藻糖，100μL 75mg/mL葡萄糖，100μL DMSO
对比例3冻存液4
冻存液为Corning KM Banker II即用型细胞冻存液
对比例4冻存液5
冻存液为Biolife CryoStor CS10Freeze Media
对比例5冻存液6
冻存液为Zenoaq STEM-CELLBANKER○R GMP grade
实施例2PBMC分离
抗凝收集外周血，离心后上层血浆，备用。按照1:1的比例，将离心管中去除血浆的组分沿着管壁逐渐加入到淋巴细胞分离液上层，离心后吸取白膜层细胞，加入X-VIVO15无血清培养基清洗3次，重悬计数。
实施例3PBMC冻存
将计数后的细胞悬液等分转移至15ml离心管中，离心后弃上清，转移至6个冻存管中并分别加入冻存液1-6，每个冻存管冻存1.87*107cells，冻存体积1mL。将冻存管封口，置于程度降温盒内，并迅速转移至-80℃冰箱，隔夜后将冻存管转移至-196℃的液氮罐内。
实施例4PBMC复苏
7d后取出冻存管，迅速置37℃水浴中轻轻晃动，当冻存管中融化至还剩少许冰块时为止，迅速吸取冻存管中的冻存细胞，置于含有10％自体血浆的X-VIVO15无血清培养基中(37℃水浴预热)，15mL离心管500g离心10分钟，清洗1次细胞，接种在X-VIVO15无血清培养基，台盼蓝染色，进行细胞计数。
活细胞率(％)＝[L/(D+L)]*100％
L：显微镜下观察计数板中活细胞数
D：被染成蓝色的死细胞数。
结果：
采用6种冻存液冻存细胞，复苏后的活细胞率趋势如图1所示。我们发现采用本发明方法冻存PBMC，在复苏8h后的活细胞率仍然较高，达到85％以上，明显高于部分市售的冻存液，具有较高的应用价值。
从冻存液1和冻存液2的对比可知，透明质酸钠作为细胞和细胞间质的主要成分可以有效保护细胞，提高活细胞率；从冻存液2和冻存液3的对比可知，增加营养成分(葡萄糖)的冻存液虽然在复苏前期具有较高的活细胞率，但是相对加入抗氧化物质(抗坏血酸)的冻存液在复苏后期活细胞率下降明显，最终不如加入抗氧化物质(抗坏血酸)的冻存液；从冻存液1和冻存液4-6的对比可知，本发明的冻存液明显优于部分市售的冻存液。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：包括如下体积百分比的组分：
2.根据权利要求1所述的一种外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：由如下体积百分比的组分组成：
3.根据权利要求1所述的一种外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：所述无血清培养基为X-VIVO15无血清培养基。
4.根据权利要求1所述的一种外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：所述非渗透性保护剂为人白蛋白、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、海藻糖和聚乙烯比咯烷酮中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的一种外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：所述非渗透性保护剂为人白蛋白。
6.根据权利要求1所述的一种外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：所述渗透性保护剂为DMSO、甘油、丙二醇和乙二醇中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的一种外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：所述渗透性保护剂为DMSO。
8.根据权利要求1所述的一种外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：所述抗氧化物质为抗坏血酸、硫辛酸、虾青素、花青素、叶黄素和白藜芦醇中的至少一种。
9.一种外周血单个核细胞的冻存方法，其特征在于：包括如下步骤：将外周血单个核细胞悬液离心后去除上清液，加入权利要求1-8任意一项所述的外周血单个核细胞的冻存液，使细胞密度不高于2*107cells/mL，然后放置于程度降温盒内，并转移至-80℃冰箱过夜，次日移入液氮罐。
10.一种外周血单个核细胞的复苏方法，其特征在于：包括如下步骤：将权利要求9所述的外周血单个核细胞的冻存方法得到的冻存液置于37℃水浴溶解，然后吸取冻存细胞液转移至含有10wt％自体血浆的的X-VIVO15无血清培养基中，离心，清洗细胞，接种在X-VIVO15无血清培养基，计算细胞活率。
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