CN110074096A

CN110074096A - 一种无血清细胞冻存液及其制备方法和应用

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Publication number: CN110074096A
Application number: CN201910452286.XA
Authority: CN
Inventors: 刘立成
Original assignee: Suzhou Bot Long Immune Technology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Bot Long Immune Technology Co Ltd
Priority date: 2019-05-28
Filing date: 2019-05-28
Publication date: 2019-08-02
Anticipated expiration: 2039-05-28
Also published as: CN110074096B

Abstract

本发明提供了一种无血清细胞冻存液及其制备方法和应用，涉及细胞培养技术领域。该冻存液包括无血清培养基、二甲基亚砜、羟乙基淀粉、儿茶素、四硼酸钠、透明质酸钠和维生素C，不含牛血清或其他蛋白成分，避免了引入造成细胞种子污染的外源因子。该冻存液毒性低，冻存效果显著，冻存3个月之后的细胞存活率达到95％以上。另外，该无血清细胞冻存液的使用方法操作简单，无需繁琐的程序降温操作，可广泛用于各种哺乳动物细胞的冷冻保存。

Description

一种无血清细胞冻存液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种无血清细胞冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，其目的是在低温环境下减缓细胞的代谢活动并维持生命。在细胞悬液的冷冻过程中，冰晶的形成是导致细胞死亡的主要原因之一。影响细胞冻存的主要因素包括细胞冻存液和冻存速率。细胞冻存液作为细胞冻存时必须使用的一种溶液，其作用是将需要冻存的细胞悬浮，并供给细胞生命代谢所需的营养物质，同时防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤。冻存速率对细胞存活率的影响有两种，一种是慢速冻存下的损伤，由于细胞脱水和细胞外培养基浓度过高所致；一种是快速冻存下的损伤，细胞死亡和冰晶的形成有较大相关性，不同的细胞所需的冻存速率不同。

冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂有甘油、二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇、丙二醇、甲醇、乙醇、甲酰胺等，主要作用是防止细胞内的冰晶形成、避免高浓度冻存剂的毒性和使细胞在耐受度内脱水。非渗透性冷冻保护剂有海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、羟乙基淀粉(HES)和聚乙烯吡咯烷酮等，它们能够在较低浓度下保护细胞，但对冷冻速率的要求更高。在细胞冻存过程中，除了需要冷冻保护剂以外，还需要一定的营养物质来维持细胞的基本活性。目前，大多数细胞冻存液会加入培养基、胎牛血清(FBS)、人血清或白蛋白等营养物质。在现有技术中，常用的细胞冻存液主要包括10％的DMSO、20％-90％的FBS和完全培养基。但仍存在一定的缺陷：DMSO具有一定的毒性，高浓度的DMSO有较大毒性，会对细胞体造成伤害；FBS属于动物源性物质，可能携带动物源性病毒的风险，人血清也有可能含有人源病毒，在临床应用上存在潜在的风险，也增加了污染的几率。

随着细胞培养技术的不断发展，无血清培养细胞的技术已被广泛应用，相应的无血清细胞冻存技术也逐渐完善。目前，中国专利CN109380214A公开了一种无血清细胞冻存剂及其制备方法、使用方法，该冻存剂包括5％-10％的DMSO、血清替代物和海藻糖，不含有任何血清成分，细胞复苏率为90％-95％，冻存过程中需要程序性降温。中国专利CN108450458A公开了一种无血清细胞冻存液，该冻存液包括CD培养基90％-99％和二甲基亚砜1％-10％，冻存细胞复苏后活性可达到80％-90％，冻存过程中也需要程序性降温。虽然现有的无血清细胞冻存技术相较于传统的细胞冻存技术，明显提高了复苏后的细胞存活率，降低了动物病源污染的可能性。但仍存在一定的缺陷，比如：复苏后的细胞存活率及其活性仍需提高；无血清细胞冻存剂的毒性较高；冻存过程中需要进行程序性降温，不同细胞所需的冻存速率不同，且冻存速率对细胞冻存的影响较大，冻存过程复杂，耗时较长，且冻存效果不稳定等。

因此，针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种新型无血清细胞冻存液及其制备方法和应用，该无血清细胞冻存液具有高效、低毒、无外源因子和易于使用等优点，可广泛用于各种哺乳动物细胞的冷冻保存。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型无血清细胞冻存液及其制备方法和在细胞冻存中的应用。克服了现有技术存在的缺陷，不含牛血清或其他蛋白成分，避免了引入造成细胞种子污染的外源因子，该无血清细胞冻存液具有高效、低毒、无外源因子和易于使用等优点。

本发明一方面提供了一种无血清细胞冻存液，所述的冻存液包括无血清培养基、二甲基亚砜(DMSO)、羟乙基淀粉、儿茶素、四硼酸钠、透明质酸钠和维生素C；

所述的无血清培养基为DMEM高糖培养基、DMEM低糖培养基和1640培养基中的任一种。

优选地，所述的冻存液包括无血清培养基80％-85％(v/v)、二甲基亚砜10％(v/v)、羟乙基淀粉2％-4％(w/v)、儿茶素0.5％-2％(w/v)、四硼酸钠0.2％-0.8％(w/v)、透明质酸钠0.8％-2％(w/v)和维生素C 0.5％-1.2％(w/v)。

优选地，所述的羟乙基淀粉和儿茶素的质量浓度比为1-8:1；进一步优选地，所述的羟乙基淀粉和儿茶素的质量浓度比为1-5:1。

优选地，所述的四硼酸钠和透明质酸钠的质量浓度比为1-10:10；进一步优选地，所述的四硼酸钠和透明质酸钠的质量浓度比为1-5:10。

本发明另一方面提供了一种无血清细胞冻存液的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：

(1)将上述无血清培养基和二甲基亚砜按照比例混合均匀，制得混合液1；

(2)将上述羟乙基淀粉、儿茶素、四硼酸钠、透明质酸钠和维生素C粉末按照比例加入到步骤(1)得到的混合液1中，旋涡溶解，混匀，灭菌，得到无血清细胞冻存液。

具体地，一种无血清细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：

(1)在无菌环境中将无血清培养基和二甲基亚砜按照比例混合，室温搅拌5分钟，使无血清培养基和二甲基亚砜在无血清细胞冻存液中的终浓度分别为80％-86％(v/v)和10％(v/v)，混合均匀，制得混合液1；

(2)在无菌环境中将羟乙基淀粉、儿茶素、四硼酸钠、透明质酸钠和维生素C粉末按照比例加入到步骤(1)得到的混合液1中，使羟乙基淀粉、儿茶素、四硼酸钠、透明质酸钠和维生素C在无血清细胞冻存液中的终浓度分别为2％-4％(w/v)、0.5％-2％(w/v)、0.2％-0.8％(w/v)、0.8％-2％(w/v)和0.5％-1.2％(w/v)，旋涡溶解20分钟，混匀，120℃灭菌40分钟，得到无血清细胞冻存液。

本发明另一方面还提供了上述无血清细胞冻存液在细胞冻存中的应用。

优选地，所述的应用包括以下步骤：

A.将活细胞和上述无血清细胞冻存液混合均匀，得到细胞冻存悬液；

B.将步骤A得到的细胞冻存悬液直接放入-80℃冰箱保存。

优选地，所述的活细胞为哺乳动物单个核细胞，比如：Hela、RD、HEK-293、293T、SP2/0、K562和P815等多种细胞。

优选地，所述的细胞冻存悬液中的活细胞密度为1-5×10⁷个/mL。

与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：

本发明提供了一种无血清细胞冻存液及其制备方法和应用。该无血清细胞冻存液不含牛血清或其他蛋白成分，避免了引入造成细胞种子污染的外源因子，比如各种牛源病毒和支原体等；对无血清细胞冻存液各组分配比进行了优化，降低了无血清细胞冻存液的毒性，显著提高了复苏后细胞的存活率，冻存3个月之后的细胞存活率达到95％以上，且非常适合用于冻存那些在使用常规含牛血清冻存液过程中容易聚团的细胞，如各种293细胞等，明显减少了细胞聚团的现象。另外，该无血清细胞冻存液的使用方法操作简单，无需繁琐的程序降温操作。

附图说明

图1是本发明实验例2中HEK-293细胞复苏后培养24h的细胞生长情况图。

具体实施方式

以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。

实施例1：一种无血清细胞冻存液

1.一种无血清细胞冻存液包括：无血清DMEM低糖培养基83％(v/v)、二甲基亚砜10％(v/v)、羟乙基淀粉2％(w/v)、儿茶素2％(w/v)、四硼酸钠0.2％(w/v)、透明质酸钠2％(w/v)和维生素C 0.8％(w/v)。

其中羟乙基淀粉和儿茶素的质量浓度比为1:1；四硼酸钠和透明质酸钠的质量浓度比为1:10。

2.该无血清细胞冻存液的制备方法包括以下步骤：

(1)在无菌环境中，将无血清DMEM低糖培养基和二甲基亚砜按照比例混合，室温搅拌5分钟，使无血清DMEM低糖培养基和二甲基亚砜在无血清细胞冻存液中的终浓度分别为83％(w/v)和10％(v/v)，混合均匀，制得混合液1；

(2)在无菌环境中，将羟乙基淀粉、儿茶素、四硼酸钠、透明质酸钠和维生素C粉末按照比例加入到步骤(1)得到的混合液1中，使羟乙基淀粉、儿茶素、四硼酸钠、透明质酸钠和维生素C在无血清细胞冻存液中的终浓度分别为2％(w/v)、2％(w/v)、0.2％(w/v)、2％(w/v)和0.8％(w/v)，旋涡溶解20分钟，混匀，120℃灭菌40分钟，得到无血清细胞冻存液。

3.无血清细胞冻存液在细胞冻存中的应用，包括以下步骤：

A.在细胞超净台无菌环境下，将Hela细胞和上述无血清细胞冻存液混合均匀，活细胞密度为1×10⁷个/mL，得到细胞冻存悬液；

B.将步骤A得到的细胞冻存悬液直接放入-80℃冰箱保存。

实施例2：一种无血清细胞冻存液

1.一种无血清细胞冻存液包括：无血清DMEM高糖培养基84％(v/v)、二甲基亚砜10％(v/v)、羟乙基淀粉3％(w/v)、儿茶素1％(w/v)、四硼酸钠0.4％(w/v)、透明质酸钠1％(w/v)和维生素C 0.6％(w/v)。

其中羟乙基淀粉和儿茶素的质量浓度比为3:1；四硼酸钠和透明质酸钠的质量浓度比为4:10。

2.该无血清细胞冻存液的制备方法包括以下步骤：

(1)在无菌环境中，将无血清DMEM高糖培养基和二甲基亚砜按照比例混合，室温搅拌5分钟，使无血清DMEM高糖培养基和二甲基亚砜在无血清细胞冻存液中的终浓度分别为84％(w/v)和10％(v/v)，混合均匀，制得混合液1；

(2)在无菌环境中，将羟乙基淀粉、儿茶素、四硼酸钠、透明质酸钠和维生素C粉末按照比例加入到步骤(1)得到的混合液1中，使羟乙基淀粉、儿茶素、四硼酸钠、透明质酸钠和维生素C在无血清细胞冻存液中的终浓度分别为3％(w/v)、1％(w/v)、0.4％(w/v)、1％(w/v)和0.6％(w/v)，旋涡溶解20分钟，混匀，120℃灭菌40分钟，得到无血清细胞冻存液。

3.无血清细胞冻存液在细胞冻存中的应用，包括以下步骤：

A.在细胞超净台无菌环境下，将293T细胞和上述无血清细胞冻存液混合均匀，活细胞密度为3×10⁷个/mL，得到细胞冻存悬液；

B.将步骤A得到的细胞冻存悬液直接放入-80℃冰箱保存。

实施例3：一种无血清细胞冻存液

1.一种无血清细胞冻存液包括：无血清1640培养基85％(v/v)、二甲基亚砜10％(v/v)、羟乙基淀粉2.5％(w/v)、儿茶素0.5％(w/v)、四硼酸钠0.5％(w/v)、透明质酸钠1％(w/v)和维生素C 0.5％(w/v)。

其中羟乙基淀粉和儿茶素的质量浓度比为5:1；四硼酸钠和透明质酸钠的质量浓度比为5:10。

2.该无血清细胞冻存液的制备方法包括以下步骤：

(1)在无菌环境中，将无血清1640培养基和二甲基亚砜按照比例混合，室温搅拌5分钟，使无血清1640培养基和二甲基亚砜在无血清细胞冻存液中的终浓度分别为85％(w/v)和10％(v/v)，混合均匀，制得混合液1；

(2)在无菌环境中，将羟乙基淀粉、儿茶素、四硼酸钠、透明质酸钠和维生素C粉末按照比例加入到步骤(1)得到的混合液1中，使羟乙基淀粉、儿茶素、四硼酸钠、透明质酸钠和维生素C在无血清细胞冻存液中的终浓度分别为2.5％(w/v)、0.5％(w/v)、0.5％(w/v)、1％(w/v)和0.5％(w/v)，旋涡溶解20分钟，混匀，120℃灭菌40分钟，得到无血清细胞冻存液。

3.无血清细胞冻存液在细胞冻存中的应用，包括以下步骤：

A.在细胞超净台无菌环境下，将RD细胞和上述无血清细胞冻存液混合均匀，活细胞密度为2×10⁷个/mL，得到细胞冻存悬液；

B.将步骤A得到的细胞冻存悬液直接放入-80℃冰箱保存。

实施例4：一种无血清细胞冻存液

1.一种无血清细胞冻存液包括：无血清1640培养基83％(v/v)、二甲基亚砜10％(v/v)、羟乙基淀粉4％(w/v)、儿茶素0.5％(w/v)、四硼酸钠0.8％(w/v)、透明质酸钠0.8％(w/v)和维生素C 0.9％(w/v)。

其中羟乙基淀粉和儿茶素的质量浓度比为8:1；四硼酸钠和透明质酸钠的质量浓度比为10:10，即1:1。

2.该无血清细胞冻存液的制备方法包括以下步骤：

(1)在无菌环境中，将无血清1640培养基和二甲基亚砜按照比例混合，室温搅拌5分钟，使无血清1640培养基和二甲基亚砜在无血清细胞冻存液中的终浓度分别为83％(w/v)和10％(v/v)，混合均匀，制得混合液1；

(2)在无菌环境中，将羟乙基淀粉、儿茶素、四硼酸钠、透明质酸钠和维生素C粉末按照比例加入到步骤(1)得到的混合液1中，使羟乙基淀粉、儿茶素、四硼酸钠、透明质酸钠和维生素C在无血清细胞冻存液中的终浓度分别为4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.8％(w/v)、0.8％(w/v)和0.9％(w/v)，旋涡溶解20分钟，混匀，120℃灭菌40分钟，得到无血清细胞冻存液。

3.无血清细胞冻存液在细胞冻存中的应用，包括以下步骤：

A.在细胞超净台无菌环境下，将K562细胞和上述无血清细胞冻存液混合均匀，活细胞密度为5×10⁷个/mL，得到细胞冻存悬液；

B.将步骤A得到的细胞冻存悬液直接放入-80℃冰箱保存。

实施例5：一种无血清细胞冻存液

1.一种无血清细胞冻存液包括：无血清DMEM高糖培养基80％(v/v)、二甲基亚砜10％(v/v)、羟乙基淀粉4％(w/v)、儿茶素2％(w/v)、四硼酸钠0.8％(w/v)、透明质酸钠2％(w/v)和维生素C 1.2％(w/v)。

其中羟乙基淀粉和儿茶素的质量浓度比为2:1；四硼酸钠和透明质酸钠的质量浓度比为4:10。

2.该无血清细胞冻存液的制备方法包括以下步骤：

(1)在无菌环境中，将无血清DMEM高糖培养基和二甲基亚砜按照比例混合，室温搅拌5分钟，使无血清DMEM高糖培养基和二甲基亚砜在无血清细胞冻存液中的终浓度分别为80％(w/v)和10％(v/v)，混合均匀，制得混合液1；

(2)在无菌环境中，将羟乙基淀粉、儿茶素、四硼酸钠、透明质酸钠和维生素C粉末按照比例加入到步骤(1)得到的混合液1中，使羟乙基淀粉、儿茶素、四硼酸钠、透明质酸钠和维生素C在无血清细胞冻存液中的终浓度分别为4％(w/v)、2％(w/v)、0.8％(w/v)、2％(w/v)和1.2％(w/v)，旋涡溶解20分钟，混匀，120℃灭菌40分钟，得到无血清细胞冻存液。

3.无血清细胞冻存液在细胞冻存中的应用，包括以下步骤：

A.在细胞超净台无菌环境下，将SP2/0细胞和上述无血清细胞冻存液混合均匀，活细胞密度为2×10⁷个/mL，得到细胞冻存悬液；

B.将步骤A得到的细胞冻存悬液直接放入-80℃冰箱保存。

对比例1：一种无血清细胞冻存液

该无血清细胞冻存液与实施例2的区别仅在于，无血清DMEM高糖培养基82.5％(v/v)、羟乙基淀粉5％(w/v)和儿茶素0.5％(w/v)，该冻存液中羟乙基淀粉和儿茶素的质量浓度比为10:1。

对比例2：一种无血清细胞冻存液

该无血清细胞冻存液包括：无血清DMEM高糖培养基78％(v/v)、二甲基亚砜10％(v/v)、羟乙基淀粉5％(w/v)、儿茶素2.5％(w/v)、四硼酸钠1％(w/v)、透明质酸钠2.5％(w/v)和维生素C 1％(w/v)。

该无血清细胞冻存液的制备方法与实施例2的区别仅在于，步骤(1)中的无血清DMEM高糖培养基的终浓度为78％(v/v)；步骤(2)中羟乙基淀粉、儿茶素、四硼酸钠、透明质酸钠和维生素C的终浓度分别为5％(w/v)、2.5％(w/v)、1％(w/v)、2.5％(w/v)和1％(w/v)。

其在细胞冻存中的应用与实施例2相同。

对比例3：一种无血清细胞冻存液

该无血清细胞冻存液包括：无血清DMEM高糖培养基70％(v/v)、DMSO10％(v/v)和胎牛血清(FBS)20％(v/v)。

其在细胞冻存中的应用与实施例2相同。

实验例1

将实施例1-5和对比例1-3保存的细胞悬液在冻存24h、1个月和3个月后，用37℃水进行水浴复苏，通过台盼蓝染色计算细胞存活率，结果见表1；并将细胞培养在24孔板中检测细胞的贴壁能力及生长能力。

表1：冻存细胞复苏后的存活率

由表1可知，利用本发明提供的无血清细胞冻存液冻存哺乳动物细胞，冻存细胞复苏后的存活率显著提高，冻存3个月后的存活率在95％以上，且细胞的贴壁能力和生长能力与冻存前无明显差别。

实验例2

用三种无血清细胞冻存液冻存HEK-293细胞，所用的冻存液如下：

冻存液1：本发明实施例2所述的无血清细胞冻存液；

冻存液2：对比例3所述的无血清细胞冻存液(常规冻存液)；

冻存液3：体积百分比为10％的DMSO和体积百分比为90％的FBS(常规冻存液)。

三种无血清细胞冻存液在HEK-293细胞冻存中的应用，具体如下：

冻存液1：

A.在细胞超净台无菌环境下，将HEK-293细胞和冻存液1混合均匀，活细胞密度为3×10⁷个/mL，得到细胞冻存悬液；

B.将步骤A得到的细胞冻存悬液直接放入-80℃冰箱保存。

冻存液2：

A.在细胞超净台无菌环境下，将HEK-293细胞和冻存液2混合均匀，活细胞密度为3×10⁷个/mL，得到细胞冻存悬液；

B.开启程序性降温，降温速率为1℃/min，最后降温至-80℃进行冻存。

冻存液3：

A.在细胞超净台无菌环境下，用无血清DMEM高糖培养基均匀混悬细胞，冻存液3在冰水混合物中预冷，逐滴加入冻存液3，无血清DMEM高糖培养基与冻存液3的体积比控制在1:4，活细胞密度为3×10⁷个/mL，得到细胞冻存悬液；

在冻存1个月后，用37℃水进行水浴复苏，将细胞培养在6孔板中24h后，检测细胞的生长情况，结果如图1所示。

检测结果表明，利用本发明提供的无血清细胞冻存液及其应用方法冻存哺乳动物细胞，细胞复苏后生长情况明显优于常规的细胞冻存液，细胞密度高、形态伸展、细胞聚团现象减少，死细胞数量下降；冻存过程无需程序性降温，操作更为简便。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种无血清细胞冻存液，其特征在于，所述的冻存液包括无血清培养基、二甲基亚砜、羟乙基淀粉、儿茶素、四硼酸钠、透明质酸钠和维生素C；

2.根据权利要求1所述的无血清细胞冻存液，其特征在于，所述的冻存液包括无血清培养基80％-85％(v/v)、二甲基亚砜10％(v/v)、羟乙基淀粉2％-4％(w/v)、儿茶素0.5％-2％(w/v)、四硼酸钠0.2％-0.8％(w/v)、透明质酸钠0.8％-2％(w/v)和维生素C0.5％-1.2％(w/v)。

3.根据权利要求1所述的无血清细胞冻存液，其特征在于，所述的羟乙基淀粉和儿茶素的质量浓度比为1-8:1。

4.根据权利要求3所述的无血清细胞冻存液，其特征在于，所述的羟乙基淀粉和儿茶素的质量浓度比为1-5:1。

5.根据权利要求1所述的无血清细胞冻存液，其特征在于，所述的四硼酸钠和透明质酸钠的质量浓度比为1-10:10。

6.一种无血清细胞冻存液的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：

(1)将权利要求1-5任意一项所述的无血清培养基和二甲基亚砜按照比例混合均匀，制得混合液1；

(2)将权利要求1-5任意一项所述的羟乙基淀粉、儿茶素、四硼酸钠、透明质酸钠和维生素C按照比例加入到步骤(1)得到的混合液1中，旋涡溶解，混匀，灭菌，得到无血清细胞冻存液。

7.根据权利要求1-5任意一项所述的无血清细胞冻存液在细胞冻存中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的应用包括以下步骤：

A.将活细胞和权利要求1-5任意一项所述的无血清细胞冻存液混合均匀，得到细胞冻存悬液；

B.将步骤A得到的细胞冻存悬液直接放入-80℃冰箱保存。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的活细胞为哺乳动物单个核细胞。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的细胞冻存悬液中的活细胞密度为1-5×10⁷个/mL。