WO2024004960A1 - 細胞の培養方法 - Google Patents

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WO2024004960A1
WO2024004960A1 PCT/JP2023/023664 JP2023023664W WO2024004960A1 WO 2024004960 A1 WO2024004960 A1 WO 2024004960A1 JP 2023023664 W JP2023023664 W JP 2023023664W WO 2024004960 A1 WO2024004960 A1 WO 2024004960A1
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WO
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cells
medium
serum
culture
cell
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PCT/JP2023/023664
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忍 桑江
圭悟 松野
Original Assignee
武田薬品工業株式会社
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    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a method of culturing/proliferating cells in a serum-free or low-serum medium, a medium additive and a medium composition for the method.
  • the present invention relates to a method for producing a cell population in which a desired number of cells is expanded in a serum-free or low-serum medium, and a medicament containing the cell population obtained by the method.
  • serum-containing medium fetal bovine serum
  • FBS fetal bovine serum
  • the xenogeneic components may become a source of infection with blood-borne pathogens or xenoantigens.
  • differences in serum between lots may cause variations in culture results. Therefore, in recent years, it has become mainstream to reduce the amount of serum used and to culture cells using a chemically defined medium. development is underway.
  • CAR-T cells chimeric antigen receptor T cells
  • CAR-T cell therapy such as Kymriah (trade name) and Yescarta (trade name), which have been approved in the United States, involves introducing the CAR gene into T cells collected from patients in vitro.
  • Autologous CAR-T cell therapy in which the CAR-T cells are manufactured and administered to a patient is common.
  • this method requires multiple steps over a long period of time, including activation/proliferation of T cells, preparation of viral vectors, and gene transfer into T cells, resulting in high costs associated with cell culture and viral vector preparation.
  • manufacturing costs increase due to such factors. Therefore, iPS cell-derived CAR-T cells that enable allogeneic CAR-T therapy have been developed.
  • a serum-containing medium is used in the step of producing iPS cell-derived CAR-T cells, particularly in the step of expanding culture, in order to obtain a sufficient cell proliferation effect.
  • GMP Good Manufacturing Practice
  • iPS cell-derived T cells are more susceptible to washing stress than primary T cells, there is a strong desire to use a serum-free or low-serum medium that does not require strong washing.
  • Non-Patent Document 1 the cell proliferation effect of boric acid via its transporter NaBC1 has been reported.
  • the medium used here is a serum-containing medium, and it is unclear whether a serum-free medium or a low-serum medium would have the same cell growth effect.
  • Patent Document 1 describes a serum-free medium containing borate and suitable for culturing diploid cells.
  • Non-Patent Document 2 describes that Taut, a taurine transporter, is important for the recall response of T cells.
  • An object of the present invention is to provide a method for culturing and sufficiently proliferating cells, particularly immunocompetent cells, in a serum-free or low-serum medium, and a medium additive and a medium composition used in the method. Furthermore, the present invention provides a method for producing a cell population in which the number of desired cells, particularly immunocompetent cells, is expanded in a serum-free or low-serum medium, and a medicament containing the cell population obtained by the method.
  • the challenge is to provide the following.
  • the present inventors prepared various factors to be added to a serum-free medium or a low-serum medium, and investigated their effects on cell culture and proliferation. As a result, it was confirmed that by adding boric acid or its salt, even when a serum-free medium or a low-serum medium was used, cell proliferation maintenance and promotion effects comparable to culture in a serum-containing medium were confirmed. Based on this knowledge, more suitable culture conditions were found and the present invention was completed. That is, the present invention is as follows. [1] A method for culturing cells, which includes the step of culturing cells in a serum-free medium or a low-serum medium containing boric acid or a salt thereof.
  • the immunocompetent cells are T cells.
  • the cells are derived from pluripotent stem cells.
  • the pluripotent stem cells are iPS cells.
  • the medium further contains taurine.
  • a method for growing cells which includes the step of culturing cells in a serum-free medium or a low-serum medium containing boric acid or a salt thereof.
  • the serum-free medium or low serum medium is a serum-free medium.
  • the medium further contains taurine.
  • a method for preventing and/or treating cancer which comprises administering a cell population obtained by the method according to any one of [14] to [16] above to a subject in need thereof.
  • cells that are susceptible to stress due to operations such as cell washing are preferably cultured in serum-free or low-serum media that do not require strong washing, and are suitable for culture under such conditions.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of a cell proliferation test of iPS cell-derived CAR-T cells to verify the effect of adding 0.3 mM boric acid in a 1% FBS-containing medium.
  • the upper row represents the cell proliferation rate from day 0 of expansion culture (Day 0), and the lower row represents the results of measuring the cell survival rate.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of a cell proliferation test of iPS cell-derived CAR-T cells to verify the effect of adding 0.3 mM boric acid in a serum-free expansion culture medium.
  • the upper row represents the cell proliferation rate from day 0 of expansion culture (Day 0), and the lower row represents the results of measuring the cell survival rate.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of a proliferation test of iPS cell-derived CAR-T cells when boric acid was added at different concentrations to a serum-free expansion culture medium.
  • the upper row represents the cell proliferation rate from day 0 of expansion culture (Day 0), and the lower row represents the results of measuring the cell survival rate.
  • the upper row represents the cell proliferation rate from day 0 of expansion culture (Day 0), and the lower row represents the results of measuring the cell survival rate.
  • w/o;without, w/;with It is a graph showing the results of a cell proliferation test of human primary T cell-derived CAR-T cells to verify the effect of adding taurine alone in a serum-free medium containing 0.3 mM boric acid.
  • the upper row represents the cell proliferation rate from day 0 of expansion culture (Day 0), and the lower row represents the results of measuring the cell survival rate. w/o;without, w/;with
  • the culture method or proliferation method of the present invention includes the step of culturing cells in a serum-free medium or a low-serum medium containing boric acid or a salt thereof.
  • Cells The cell type to be cultured in the culture method and proliferation method of the present invention is not particularly limited. Examples of such cell types include reproductive cells such as sperm and eggs, somatic cells constituting living organisms, stem cells (pluripotent stem cells, etc.), cells induced to differentiate from stem cells, progenitor cells, and cancer cells isolated from living organisms. , cells that have been isolated from a living body and have acquired immortality and are stably maintained outside the body (cell line), cells that have been isolated from a living body and have undergone artificial genetic modification, and cells that have been isolated from a living body and whose nucleus has been artificially modified. Includes replaced cells, etc.
  • Examples of cells induced to differentiate from somatic cells and stem cells that make up living bodies include, but are not limited to, immunocompetent cells (natural killer (NK) cells, macrophages, monocytes, mast cells, dendritic cells, Cells, Langerhans cells, neutrophils, eosinophils, basophils, B cells, T cells, etc.), fibroblasts, bone marrow cells, red blood cells, platelets, osteocytes, pericytes, keratinocytes, adipocytes, mesenchyme cells, epithelial cells, epidermal cells, endothelial cells, vascular endothelial cells, hepatic parenchymal cells, chondrocytes, cumulus cells, nervous system cells, glial cells, neurons, oligodendrocytes, microglia, astrocytes, cardiac cells, Included are esophageal cells, muscle cells (eg, smooth muscle cells or skeletal muscle cells), pancreatic beta cells, me
  • Somatic cells include, for example, skin, kidney, spleen, adrenal gland, liver, lung, ovary, pancreas, uterus, stomach, colon, small intestine, large intestine, bladder, prostate, testis, thymus, muscle, connective tissue, bone, cartilage, and vascular tissue. , blood (including umbilical cord blood), bone marrow, heart, eye, brain or neurological tissue.
  • Stem cells are cells that have the ability to both reproduce themselves and differentiate into multiple lineages of cells, including, but not limited to, embryonic tumor cells, pluripotent cells, These include sexual stem cells, neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, liver stem cells, pancreatic stem cells, muscle stem cells, reproductive stem cells, intestinal stem cells, cancer stem cells, hair follicle stem cells, etc.
  • Pluripotent stem cell means a cell that has self-renewal ability and differentiation/proliferation ability, and has the ability to differentiate into all tissues and cells that make up a living body.
  • Pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), embryonic germ cells (EG cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and pluripotent stem cells induced and selected by stress or cell stimulation. I can list them.
  • iPS cells are preferred as pluripotent stem cells. Confirmation that the cells are iPS cells can be performed using an undifferentiated marker, which is due to the undifferentiated nature of iPS cells, as an indicator.
  • undifferentiated markers examples include alkaline phosphatase, Oct3/4, Sox2, Nanog, ERas, and Esgl.
  • Methods for detecting these undifferentiated markers include methods for detecting mRNA (using primers and probes), immunological detection methods (using antibodies and labels), and the like.
  • a cell induced to differentiate from a stem cell is any cell that has been subjected to differentiation induction treatment so that the stem cell differentiates into a specific type of cell.
  • a cell line is a cell that has acquired unlimited proliferative ability through artificial manipulation in vitro, and examples thereof include, but are not limited to, CHO (Chinese Hamster Ovary Cell Line), HCT116 , Huh7, HEK293 (human embryonic kidney cells), HeLa (human uterine cancer cell line), HepG2 (human liver cancer cell line), UT7/TPO (human leukemia cell line), MDCK, MDBK, BHK, C-33A, HT- 29, AE-1, 3D9, Ns0/1, Jurkat, NIH3T3, PC12, S2, Sf9, Sf21, High Five (product name), Vero, etc.
  • the cells to be cultured are immunocompetent cells.
  • Immune-competent cells refer to cells that are involved in various immune reactions in vivo. Immune-competent cells include natural killer (NK) cells, macrophages, monocytes, mast cells, dendritic cells, Langerhans cells, neutrophils, eosinophils, basophils, B cells, T cells, etc. , preferably selected from dendritic cells, B cells, T cells, and natural killer (NK) cells. More preferably, the immunocompetent cell is a T cell.
  • T cells include CD4-positive CD8-negative T cells, CD4-negative CD8-positive T cells, ⁇ -T cells, ⁇ -T cells, regulatory T cells, NKT cells, and the like.
  • T cells can be subsets such as naive T cells, effector T cells, or memory T cells.
  • immunocompetent cells are cells isolated from humans (primary cells), they can be obtained by differentiation from stem cells such as pluripotent stem cells (e.g. iPS cells, ES cells), hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, etc.
  • the cells may be primary cells or cells obtained by differentiation from pluripotent stem cells (particularly iPS cells).
  • the primary cells human-derived primary T cells are preferred.
  • Induction of differentiation from stem cells into immunocompetent cells can be carried out by appropriate methods known in the art depending on the type of stem cells used and the target immunocompetent cells. As an example, induction of differentiation of T cells from iPS cells and induction of differentiation of NK cells from iPS cells can be performed by the method described in the Examples.
  • the target cells may be either autologous cells or allogeneic cells.
  • autologous cells refer to cells obtained from a subject receiving the culture method of the present invention or a cell population (described below) produced by the method of the present invention, or cells derived from the obtained cells.
  • Allogeneic cells means cells that are not the above-mentioned “autologous cells.”
  • the target cell may be a cell that has been artificially genetically modified.
  • examples include immunocompetent cells into which a CAR gene has been introduced (T cells into which a CAR gene has been introduced, natural killer cells into which a CAR gene has been introduced), T cells into which an extrinsic T cell receptor (TCR) has been introduced, and cytokines. and/or immunocompetent cells into which genes for expressing chemokines have been introduced.
  • CAR is a structure that contains, from the N-terminal side to the C-terminal side of the protein, a target-specific extracellular domain, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain for effector functions of immune cells.
  • the gene is the one that codes for this receptor.
  • the extracellular domain contains an antigen recognition site that exhibits target-specific binding.
  • a transmembrane domain exists between the extracellular domain and the intracellular signaling domain.
  • Intracellular signaling domains transmit signals necessary for immune cells to exert their effector functions. That is, when the extracellular domain binds to a target antigen, an intracellular signal domain is used that is capable of transmitting a signal necessary for activating immune cells.
  • Preferred examples of cells to which the culture method and proliferation method of the present invention are applied include T cells into which a CAR gene has been introduced (CAR-T cells), NK cells into which a CAR gene has been introduced (CAR-NK cells), and more.
  • CAR-T cells T cells into which a CAR gene has been introduced
  • CAR-NK cells NK cells into which a CAR gene has been introduced
  • pluripotent stem cell-derived CAR-T cells and CAR-NK cells more preferably iPS cell-derived CAR-T cells and iPS cell-derived CAR-NK cells, even more preferably iPS cell-derived CAR-T cells.
  • Examples include cells.
  • CAR-T cells and CAR-NK cells can be obtained by introducing a CAR gene into T cells and NK cells or their progenitor cells such as pluripotent stem cells, respectively.
  • CAR-T cells include cells obtained by differentiating cells such as iPS cells, ES cells, hematopoietic stem cells, and mesenchymal stem cells into T cells into which a CAR gene has been introduced, and iPS cells into which a CAR gene has been introduced. They may also be cells obtained by differentiating into T cells from.
  • iPS cell-derived CAR-T cells obtained by differentiating iPS cells into which a CAR gene has been introduced into T cells and CAR-T cells obtained by introducing a CAR gene into T cells obtained by differentiating iPS cells.
  • CAR-T cells derived from iPS cells are obtained by introducing a CAR gene into T cells obtained by differentiating iPS cells.
  • CAR-NK cells cells obtained by differentiating iPS cells, ES cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, etc. into NK cells into which the CAR gene has been introduced, or cells into which the CAR gene has been introduced.
  • the cells may be obtained by differentiating iPS cells into NK cells.
  • iPS cell-derived CAR-NK cells obtained by differentiating iPS cells into which a CAR gene has been introduced into NK cells, and CAR-NK cells obtained by introducing a CAR gene into NK cells obtained by differentiating iPS cells.
  • CAR-NK cells derived from iPS cells and these may be collectively referred to as "iPS cell-derived CAR-NK cells.” More preferably, CAR-NK cells derived from iPS cells are obtained by introducing a CAR gene into NK cells obtained by differentiating iPS cells.
  • Induction of differentiation from iPS cells (in which a CAR gene may be introduced, if desired) into T cells, or from iPS cells (into which a CAR gene may be introduced, if desired) into NK cells, can be carried out using known methods. Specifically, the method described in Examples can be used.
  • the CAR gene is usually introduced into cells using a CAR expression vector.
  • CAR expression vector means a nucleic acid molecule capable of transporting a nucleic acid molecule encoding a CAR gene into cells, regardless of whether it is DNA or RNA, and there are no particular restrictions on its form or origin.
  • vectors can be viral or non-viral vectors. Examples of viral vectors include retrovirus vectors, lentivirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes virus vectors, Sendai virus vectors, vaccinia virus vectors, and the like.
  • the target gene inserted into the vector is integrated into the host chromosome, and stable and long-term expression can be expected.
  • Each viral vector can be produced according to a conventional method or using a commercially available dedicated kit.
  • Non-viral vectors include plasmid vectors, liposome vectors, and positively charged liposome vectors (Felgner, PL, Gadek, TR, Holm, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84:7413-7417, 1987 ), YAC vectors, BAC vectors, artificial chromosome vectors, etc.
  • the CAR gene can be introduced into cells by the method described in the Examples.
  • the medium used in the culture method and propagation method of the present invention is a serum-free medium or a low-serum medium containing boric acid or a salt thereof (hereinafter may be collectively referred to as "the medium of the present invention").
  • boric acid is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include orthoboric acid, metaboric acid, tetraboric acid, and the like. Among these boric acids, orthoboric acid is preferably used.
  • Salts of boric acid are not particularly limited as long as they are pharmaceutically acceptable; alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts; aluminum salts; triethylamine and triethanol. Examples include organic amine salts such as amine, morpholine, piperazine, and pyrrolidine.
  • boric acid or a salt thereof may be in the form of a hydrate, such as borax.
  • the concentration of boric acid or its salt in the medium is not particularly limited as long as the desired effect is obtained, but it is usually 0.1-0.9mM, preferably 0.2-0.8mM, more preferably 0.2-0.8mM. 0.7mM, particularly preferably 0.3 to 0.6mM.
  • the concentration of boric acid or a salt thereof is a concentration converted to boric acid unless otherwise specified. If the concentration is too high, it will affect the cell survival rate, and if the concentration is too low, the cell proliferation promoting effect will be weak.
  • serum-free medium means a medium that does not substantially contain, preferably does not contain, unadjusted or unpurified serum, and does not contain purified blood-derived components or animal tissue-derived components (e.g., A medium containing a factor) is considered to be a serum-free medium.
  • a medium used for culturing animal cells hereinafter also referred to as basal medium for convenience
  • basal medium for perfusion culture is used.
  • substantially free means that it is not contained at all, or even if it is contained, it is below the detection limit.
  • basal medium examples include BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, Ham's medium, and RPMI 1640.
  • medium Fischer's medium, F12 medium, mixed medium thereof (eg, Advanced DMEM/F12 medium, etc.), but are not particularly limited.
  • Perfusion culture is a culture method in which a culture medium is continuously supplied to a culture system containing cells, and the same amount of culture supernatant that does not contain cells is continuously removed from the culture system to maintain the culture system in a steady state.
  • perfusion culture medium generally has a higher concentration of nutrient components than basal medium.
  • basal medium can be purchased from companies such as Invitrogen, SIGMA, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, and Sumitomo Pharma, and as long as they have the same name or brand name, the composition of the culture medium is the same regardless of the manufacturer.
  • the term "low serum medium” refers to a medium in which serum is added to a basal medium, and the concentration thereof is set to a commonly used serum-containing medium (serum concentration: 5 to 20% (in this specification, serum concentration: 5% to 20%). (expressed in v/v%)).
  • the serum concentration of the low serum medium can be less than 5%, less than 2%, less than 1%, less than 0.1%, less than 0.01%, less than 0.001%, but usually 0.1% or more, It can be 1% or more. Specifically, the serum concentration is preferably 0.1% or more and less than 5%, more preferably 1% or more and less than 4%.
  • the medium used in this step may also contain a serum substitute.
  • Serum substitutes include, for example, albumin (e.g. lipid-rich albumin), transferrin, fatty acids, collagen precursors, insulin, trace elements (e.g. zinc, selenium, etc.), ITS supplements (mixtures of insulin, transferrin, selenite). , B-27 supplement, N2 supplement, knockout serum replacement, 2-mercaptoethanol or 3' thiol glycerol, or equivalents thereof. These serum replacements are also commercially available. Knockout Serum Replacement is available from Invitrogen.
  • serum substitutes can be purchased from companies such as Invitrogen, SIGMA, Fujifilm Wako Pure Chemicals, and Sumitomo Pharma, and the composition may vary depending on the manufacturer if they are reagents or additives with the same name or brand name. are equivalent.
  • components preferable for cell proliferation can be added to the medium of the present invention.
  • Such components include, for example, sugars such as glucose, fructose, sucrose, and maltose; glycine, serine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, proline, threonine, cysteine, asparagine, glutamine, and aspartic acid.
  • N N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES), 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane Sulfonic acid (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonic acid (HEPES)), N-[tris(hydroxymethyl)methyl]glycine (Tris(hydroxymethyl)methyl) buffering agents such as ne))
  • Antibiotics such as amphotericin B, kanamycin, gentamicin, and streptomycin
  • Cell adhesion factors and extracellular matrix components such as Type I collagen, Type II collagen, fibronectin, laminin,
  • Cytokines and growth factors include hormones such as dexamethasone, hydrocortisone, estradiol, progesterone, glucagon, and insulin, and appropriate components can be selected depending on the type of cells to be cultured and used at appropriate concentrations.
  • taurine an amino acid derivative, can be added and typically used at a final concentration of 0.5-10 mM, preferably 2-5 mM.
  • the growth factor may be from an animal species other than humans, but is preferably derived from humans (and may be recombinant).
  • the medium may further contain additional factors to support cell survival and proliferation. Additional factors include type 1 cytokine family members, type 2 cytokine family members, TNF superfamily cytokines, IL-1 family cytokines, and other cytokines (such as TNF- ⁇ ), specifically IL-1 to IL- Preferred examples include IL-1, IL-2, IL-7, IL-15, IL-18, and IL-21.
  • the additive factor can be prepared according to a conventional method, or a commercially available product can also be used. The additive factor may be from an animal species other than humans, but is preferably derived from humans (and may be recombinant).
  • xeno-free refers to conditions in which components derived from a biological species different from that of the cells to be cultured are excluded.
  • the present invention also provides a method for culturing cells (hereinafter sometimes referred to as "the culture method of the present invention"), which is characterized by culturing in the medium of the present invention (described above).
  • the culture vessels used for cell culture are not particularly limited as long as they are capable of culturing cells, but include flasks, tissue culture flasks, dishes, petri dishes, tissue culture dishes, multi-dishes, microplates, and microwells. Mention may be made of plates, multiplates, multiwell plates, microslides, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, roller bottles, and bioreactors. It is selected as appropriate depending on the target cells.
  • the culture vessel may be cell-adhesive or non-cell-adhesive, and is appropriately selected depending on the purpose.
  • a cell-adhesive culture vessel may be coated with any cell-supporting substrate such as extracellular matrix (ECM) for the purpose of improving adhesion with cells on the surface of the culture vessel.
  • ECM extracellular matrix
  • the cell support substrate can be any material intended for cell attachment.
  • the culture temperature is not particularly limited, but may be about 30 to 40°C, preferably about 37°C.
  • the CO 2 concentration may be about 1-10%, preferably about 2-5%.
  • the oxygen partial pressure can be between 1 and 21%.
  • the frequency and culture period of medium exchange in cell culture generally depend on cell density, culture method (adherent culture/suspension culture), cell type to be cultured, medium composition, culture conditions (temperature, gas concentration), It is determined by comprehensively considering various conditions such as the amount of culture medium (total amount/partial amount), the cost of the culture medium, and the lifestyle of the worker.
  • the culture medium is usually replaced once every 2 to 3 days, once a day, or multiple times a day (e.g., twice), and the culture method and propagation method of the present invention also require such a frequency.
  • the medium can be exchanged by Moreover, continuous medium exchange can be performed by perfusion culture.
  • the culture period is usually about 4 days to 4 weeks, preferably about 4 days to 3 weeks, and more preferably about 1 to 2 weeks.
  • the cells cultured in a serum-free medium or low serum medium containing boric acid or a salt thereof are immunocompetent cells, preferably dendritic cells. , B cells, T cells, and natural killer (NK) cells, more preferably T cells and NK cells, and still more preferably T cells.
  • the cells cultured in the medium of the present invention are T cells derived from primary T cells and pluripotent stem cells (especially iPS cells), more preferably derived from primary T cells and pluripotent stem cells.
  • CAR-T cells derived from stem cells are cultured in the medium of the present invention.
  • the cells are primary NK cells and NK cells derived from pluripotent stem cells (especially iPS cells), more preferably CAR-NK cells derived from primary NK cells and pluripotent stem cells (especially iPS cells), and even more preferably CAR-NK cells derived from pluripotent stem cells (especially iPS cells).
  • culturing includes an activation step and an expansion step.
  • a recovery step may be included.
  • the cells can be cultured by any one of recovery culture consisting of a recovery step, activation culture consisting of an activation step, expansion culture consisting of an expansion step, or 2. It is a concept that includes one or all three.
  • the target is expanded culture.
  • Another embodiment of the invention provides CAR-T cells and CAR-NK cells, preferably CAR-T cells derived from pluripotent stem cells (especially iPS cells) and CAR-NK cells derived from pluripotent stem cells (especially iPS cells). It is a cell culture, which includes an activation step and an expansion step, and if necessary (such as when using cryopreserved cells) a recovery step.
  • This step is performed after thawing the cryopreserved cells. Remove cryoprotectant from cells immediately after thawing, as prolonged exposure of cells to cryoprotectant can cause damage. Thereafter, cell damage and cell dysfunction caused by freezing and thawing are restored.
  • the process/cultivation method varies depending on the target cells, the cryoprotectant used, the thawing method, etc., but is usually cultured in a medium containing no cryoprotectant for several days, preferably 1 to 5 days, and more preferably. Most of the cells will recover to normal by culturing them for about 3 days.
  • the method of this step is not particularly limited as long as the desired effect on the cells is obtained, but it can be carried out, for example, by contacting with a stimulating substance.
  • the culture is carried out in the presence of a stimulating substance, specifically in a medium containing a stimulating substance, for several days, preferably for 1 to 5 days, and more preferably for about 3 days.
  • the stimulant is a signal molecule that controls cell activity by autocrine, paracrine, endocrine, etc. methods, and may be a substance that can be secreted from all cells in the culture system or a substance that can be secreted from the outside. It may be added. Specifically, this is carried out by contacting with a substrate bound to a ligand, culturing in a medium containing a ligand, or the like.
  • the ligand used in the activation culture of CAR-T cells preferably CAR-T cells derived from pluripotent stem cells (particularly iPS cells), interacts with surface molecules of CAR-T cells and activates them.
  • CAR-T cells preferably CAR-T cells derived from pluripotent stem cells (particularly iPS cells)
  • CAR-T cells derived from pluripotent stem cells (particularly iPS cells)
  • CD3 which is coupled to TCR and plays a role in TCR-mediated signal transduction
  • surface molecules CD28, ICOS, CD137, OX40, CD27, GITR, BAFFR, TACI, BMCA, and CD40L which are known as costimulatory factors for T cell activation.
  • Examples include molecules that have the function of specifically binding to T cells and transmitting activation signals into T cells.
  • Such a molecule may be a physiological ligand (or receptor) for the T cell surface molecule, or a non-physiological ligand (or receptor) having
  • the T cell activation ligand used in the present invention includes an antibody against CD3.
  • Antibodies against CD3 are complete antibodies as long as they have the ability to specifically bind to CD3 expressed on target T cells that induce activation, stimulate surface molecules of these T cells, and transmit signals into T cells. or a fragment thereof (eg, Fab, F(ab') 2 , Fab', scFv, Fv, reduced antibody (rIgG), dsFv, sFv, diabody, triabody, etc.).
  • CAR-NK cells preferably CAR-NK cells derived from pluripotent stem cells (particularly iPS cells), interact with surface molecules of CAR-NK cells, and activate the CAR-NK cells.
  • CAR-NK cells preferably CAR-NK cells derived from pluripotent stem cells (particularly iPS cells)
  • iPS cells pluripotent stem cells
  • the non-physiological ligand includes an antibody against CD3.
  • Antibodies may be complete antibodies or fragments thereof (e.g., Fab, F(ab') 2 , Fab', scFv, Fv, reduced antibody (rIgG), dsFv, sFv, diabody, triabody, etc.). It's okay.
  • cytokines include IFN- ⁇ / ⁇ , 1FN- ⁇ , 1L-2, 1L-4, IL-7, 1L-12, 1L-15, IL-18, IL-21, and the like.
  • This step is a step of proliferating the cells activated as described above.
  • the method of expansion culture is not particularly limited as long as the desired effect on the activated cells can be obtained, and those skilled in the art can appropriately adjust the method while monitoring the number of cells and the like.
  • the cells can be cultured in a medium containing the following: for example, for 7 days or more, 9 days or more, or 11 days or more, with appropriate adjustment while monitoring the number of cells and the like.
  • the culture can be continued and the number of cells can be increased exponentially.
  • the upper limit of the culture period is not particularly limited, and is, for example, 28 days or less, preferably 21 days or less.
  • activated CAR-T cells preferably CAR-T cells derived from activated pluripotent stem cells (particularly iPS cells)
  • contain cytokines such as IL-7, IL-15 and IL-2.
  • This can be carried out by expanding culture in a medium for, for example, 2 days or more, preferably 3 days or more, more preferably 4 days or more, even more preferably 5 days or more, even more preferably 6 days or more.
  • Target cells are primary T cells (especially CAR-T cells) and NK cells (preferably pluripotent stem cell (especially iPS cell-derived)-derived NK cells (especially CAR-NK cells)), and the number of cells is increased. For example, for 2 days or more, preferably 4 days or more, more preferably 6 days or more in a medium containing cytokines such as IL-7, IL-15, IL-21, and IL-2. , more preferably for 8 days or more, even more preferably for 10 days or more, even more preferably for 11 days or more.
  • cytokines such as IL-7, IL-15, IL-21, and IL-2.
  • the production method of the present invention is a method for producing a cell population in which the number of desired cells is expanded. the step of culturing a cell population containing the cell population.
  • the term "serum-free medium or low-serum medium containing boric acid or a salt thereof” has the same meaning as described in (1) above for the culture method of the present invention and the propagation method of the present invention.
  • Desired cells are cells whose proliferation is aimed at, and include those listed in the section "1-1.
  • Cells in (1) above, preferably immunocompetent cells, more preferably. are T cells and NK cells, and particularly preferably T cells into which a CAR gene has been introduced, ie, CAR-T cells, and NK cells into which a CAR gene has been introduced, ie, CAR-NK cells.
  • CAR-T cells and CAR-NK cells derived from pluripotent stem cells preferably iPS cells
  • CAR-T cells derived from pluripotent stem cells especially iPS cells.
  • the "cell population containing desired cells” is not particularly limited in its origin as long as it contains desired cells, and may be naturally derived or artificially prepared.
  • the cell population may be collected, isolated, purified, or derived from body fluids such as blood (peripheral blood, umbilical cord blood, etc.), bone marrow fluid, etc.
  • body fluids such as blood (peripheral blood, umbilical cord blood, etc.), bone marrow fluid, etc.
  • Examples include cell populations including peripheral blood mononuclear cells (PBMC), blood cells, hematopoietic stem cells, and cord blood mononuclear cells.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • These cells may be collected from a living body or obtained through in vitro culture, for example, a cell population obtained by the production method of the present invention may be preserved as is or frozen.
  • Cell population containing desired cells is preferably a cell population containing immunocompetent cells, more preferably a cell population containing T cells or NK cells, particularly preferably T cells into which a CAR gene has been introduced, That is, it is a cell population containing CAR-T cells, or a cell population containing NK cells into which a CAR gene has been introduced, that is, CAR-NK cells. More preferably, it is a cell population comprising pluripotent stem cells, preferably iPS cell-derived CAR-T cells, or a cell population comprising pluripotent stem cells, preferably iPS cell-derived CAR-NK cells.
  • the desired number of cells has been expanded means that the number of desired cells in the cell population is greater than the number of cells obtained prior to expansion or without carrying out the present invention.
  • the number of desired cells in the cell population produced according to the invention is at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50% compared to the number of cells in the control. , 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%. Expanded to increase by 1000%.
  • the desired cells are CAR-T cells or CAR-NK cells
  • the cells are increased in number, that is, expanded, through activation culture and expansion culture (recovery culture if necessary), as described above. .
  • After expansion culture cells are washed and collected.
  • the medium used is a serum-free medium or a low-serum medium
  • a commonly used serum-containing medium (serum concentration: 5 to 20%) is used for culturing. Compared to the case of propagation, the washing operation is simpler and the time required for washing can be shortened.
  • the BSA contained in the serum reaches an acceptable amount for human administration.
  • Petting and centrifugation processes or (ii) continuous automated processes using techniques such as closed system centrifugation/spinning membrane filtration/hollow fiber membrane filtration need to be repeated multiple times.
  • the desired cell population can be recovered by repeating the procedure fewer times than when using a serum-containing medium (serum concentration: 5-20%).
  • a step of culturing the expanded cells in the presence of a stimulating substance is performed before the recovery operation.
  • This step enables efficient expansion culture and also has the advantage of increasing cell survival rate.
  • the expanded cultured CAR-T cell population or CAR-NK cell population may be subjected to a washing operation and cell separation step using bead separation or the like. According to this aspect, it is possible to increase the purity of a CAR-T cell population or a CAR-NK cell population that has higher efficacy.
  • the washing operation can be simplified and/or the time required for washing can be shortened. In this manner, the desired number of cells is expanded in the cell population obtained by the production method of the present invention.
  • the "cell population in which the number of desired cells is expanded" produced by the production method of the present invention can be used to appropriately produce medicines depending on the functions of the cells.
  • the cells are CAR-T cells or CAR-NK cells
  • the cell population containing CAR-T cells or CAR-NK cells produced by the culture method and proliferation method of the present invention can be used for cancer treatment, especially the It can be used to treat cancers that express target antigens of CAR-expressing immune cells.
  • the cancer may be a solid tumor or a hematologic tumor.
  • Specific cancers include various B-cell lymphomas (follicular malignant lymphoma, diffuse large B-cell malignant lymphoma, mantle cell lymphoma, MALT lymphoma, intravascular B-cell lymphoma, CD20-positive Hodgkin lymphoma, etc.), bone marrow Proliferative tumors, myelodysplastic/myeloproliferative tumors (CMML, JMML, CML, MDS/MPN-UC), myelodysplastic syndromes, acute myeloid leukemia, neuroblastoma, brain tumors, Ewing's sarcoma, osteosarcoma, retinal buds Cytoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, melanoma, bone and soft tissue sarcoma, kidney cancer, pancreatic cancer, malignant mesothelioma, prostate cancer, breast cancer, endometrial cancer, cervical cancer, ovarian cancer , colon cancer, etc., but are not limited to these.
  • the cancer is a solid tumor.
  • solid tumors include neuroblastoma, brain tumor, Ewing's sarcoma, osteosarcoma, retinoblastoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, melanoma, ovarian cancer, rhabdomyosarcoma, bone and soft tissue sarcoma, and kidney cancer.
  • pancreatic cancer malignant mesothelioma, prostate cancer, breast cancer, endometrial cancer, cervical cancer, ovarian cancer, and colorectal cancer.
  • the medicament of the present invention is administered in a therapeutically effective amount that is appropriately determined depending on the age, weight, body surface area, symptoms, etc. of the subject.
  • the subject in this disclosure is a mammal, particularly usually a human, preferably a cancer patient.
  • the medicament of the present invention can be administered, for example, at a dose of 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 10 at a time.
  • the route of administration is not particularly limited, and administration can be intratumoral, peritumoral, intraventricular, intravenous, intraarterial, intraportal, intradermal, subcutaneous, intramuscular, or intraperitoneal.
  • the cell populations of the present disclosure may be administered systemically or locally, and local administration includes direct injection into the target tissue, organ, or organ.
  • the administration schedule is appropriately determined depending on the subject's age, body weight, body surface area, symptoms, etc., and may be a single administration or continuous or periodic multiple administrations.
  • the medicament of the present invention may be used for autologous or allogeneic transplantation. It may also be used in combination with other medicines.
  • the medicament of the present invention can be administered with dimethyl sulfoxide (DMSO), serum albumin, etc. for the purpose of cell protection, and antibiotics, etc. for the purpose of preventing bacterial contamination. It may contain components such as various components (vitamins, cytokines, growth factors, steroids, etc.) for the purpose of activating, proliferating, or inducing differentiation.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • serum albumin etc.
  • antibiotics, etc. for the purpose of preventing bacterial contamination.
  • the composition can be prepared by a conventional method (for example, the method described in the Japanese Pharmacopoeia).
  • a culture medium additive (hereinafter also referred to as “the culture medium additive of the present invention") and a culture medium composition formed by adding the culture medium additive (hereinafter also referred to as “the culture medium composition of the present invention”)
  • the medium additive of the present invention contains boric acid or a salt thereof.
  • the medium additive of the present invention is used to add to a serum-free medium or a low-serum medium.
  • Boric acid or its salt has the same meaning as described in (1) above for the culture method of the present invention and the propagation method of the present invention.
  • the amount of boric acid or its salt added to the medium additive is not particularly limited as long as the desired effect is obtained, but it is usually 0.01 to 100% by weight, preferably 0.1 to 100% by weight, more preferably It may be 1 to 100% by weight, more preferably 5 to 100% by weight, particularly preferably 10 to 100% by weight.
  • the medium composition of the present invention is a composition containing a medium component obtained by adding the medium additive of the present invention to a serum-free medium or a low-serum medium.
  • serum-free medium or low-serum medium refers to the "serum-free medium or low-serum medium” described in the above (1) culture method of the present invention and growth method of the present invention, excluding boric acid or its salt. It is synonymous with
  • the concentration of boric acid or its salt is 0.1 to 0.9mM, preferably 0.2 to 0.8mM, more preferably 0.2 to 0.7mM, particularly preferably 0.3 to 0.
  • the medium additive of the present invention is added to a "serum-free medium or low serum medium” so that the concentration is in the range of .6mM.
  • BMP-4 bone morphogenetic protein-4
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • SCF stem cell factor
  • TPO thrombopoietin
  • FLT3L Fms-related tyrosine kinase 3 ligand
  • Fc-DLL4 Recombinant Human DLL4
  • DLL4 Delta-like protein 4
  • IL7 Interleukin-7
  • SDF1 ⁇ Stromal cell-derived factor 1 ⁇ ⁇ MEM:alpha Modified Eagle Minimum Essential Medium
  • TCR T-cell receptor
  • Example 1 Preparation of iPS Cell-Derived CAR-T Cells
  • the TCR gene was introduced into iPS cell line QHJI01S04 provided by Kyoto University iPS Cell Research Institute (CiRA) using a lentivirus vector.
  • the iPS cells into which the TCR gene was introduced were differentiated into hematopoietic progenitor cells with reference to the known method described in Nature Communication 2021; 12: 430. Specifically, the iPS cells were cultured for 4 days in the presence of CHIR99021, SB431542, BMP-4, bFGF, and VEGF to induce differentiation into mesoderm.
  • the cells were differentiated into hematopoietic progenitor cells using hematopoietic cytokines SCF, TPO, and FLT3L.
  • Differentiation of the obtained hematopoietic progenitor cells into cytotoxic T lymphocytes (CTLs) was performed according to the known patent method (WO2017/221975) and literature information (Nature Communication 2021; 12: 430).
  • CD34-positive cells were purified using magnetic beads (Myltenyi Biotec), and then placed on a plate immobilized with Fc-DLL4 and RetroNectin (Recombinant Human Fibronectin Fragment, TakaraBio).
  • the cells were cultured for 3 weeks in ⁇ MEM medium containing SCF, TPO, FLT3L, IL7, SDF1 ⁇ , and SB203580.
  • a CAR gene that recognizes a specific antigen was introduced into the obtained TCR-positive CTL using a retrovirus vector.
  • cells cryopreserved in liquid nitrogen were used as iPS cell-derived CAR-T cells.
  • iPS cell-derived CAR-T cells were cultured in an IMDM medium containing 15% Fetal Bovine Serum (FBS) with the additives shown in the "Recovery culture medium" column of Table 1 added. The cells were suspended at 500,000 cells/mL, seeded on G-Rex (registered trademark) 10M (Wilson Wolf), and cultured for 3 days at 5% CO 2 /37°C.
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • RetroNectin (trade name) was purchased from Takara Bio.
  • Anti-CD3 mAb GMP grade Anti-CD3 monoclonal antibody (Clone: OKT3) purchased from Takara Bio Inc. was used.
  • Activation culture of iPS cell-derived CAR-T cells After recovery culture, iPS cell-derived CAR-T cells were added to IMDM medium containing 15% FBS with the additives shown in the "Activation culture medium" column of Table 1. Suspend cells at 133,333 cells/mL in culture medium, seed in a T225 flask immobilized with anti-CD3 agonist antibody (OKT3) and RetroNectin (trade name), and store at 37°C in 5% CO2 . The cells were cultured for 3 days.
  • the cells were collected from the T225 flask, suspended in two types of expansion culture media at 40,000 cells/mL, and treated with G-Rex (registered trademark) 10M (Wilson Wolf). The cells were cultured under 5% CO 2 /37°C. Thereafter, on the fifth day of culture, some cells were collected from G-Rex (registered trademark) 10M, the number of cells was counted, and the medium was replaced with the respective medium. On the 6th day of culture, some cells were collected from G-Rex (registered trademark) 10M and the number of cells was counted.
  • G-Rex registered trademark
  • Test example 1 Proliferation test to verify the effect of adding 0.3mM boric acid in a 1% FBS-containing medium Item 6 of Example 1.
  • the cell number and survival rate of iPS cell-derived CAR-T cells were measured on days 3, 5, 6, 7, 12, and 14 of culture.
  • Figure 1 shows the cell proliferation rate from day 0 of expansion culture.
  • Proliferation of iPS cell-derived CAR-T cells was enhanced by adding 0.3 mM boric acid to the medium containing 1% FBS ( Figure 1).
  • Example 2 Recovery culture of iPS cell-derived CAR-T cells 500,000 iPS cell-derived CAR-T cells were cultured in a medium containing IMDM medium containing 15% FBS with the additives shown in the "Recovery culture medium" column of Table 2. The cells were suspended at a concentration of 100 mL/mL, seeded on G-Rex (registered trademark) 10M (Wilson Wolf), and cultured for 3 days at 37° C. in 5% CO 2 .
  • G-Rex registered trademark
  • 10M Woodson Wolf
  • RetroNectin (trade name) was purchased from Takara Bio.
  • Anti-CD3 mAb GMP grade Anti-CD3 monoclonal antibody (Clone: OKT3) purchased from Takara Bio Inc. was used.
  • Activation culture of iPS cell-derived CAR-T cells After recovery culture, iPS cell-derived CAR-T cells were added to IMDM medium containing 15% FBS with the additives shown in the "Activation culture medium” column of Table 2. Suspend cells at 133,333 cells/mL in culture medium, seed in T225 flasks immobilized with anti-CD3 agonist antibody (OKT3) and RetroNectin (trade name), and store at 37°C in 5 % CO2. It was cultured for 3 days.
  • Expansion culture of iPS cell-derived CAR-T cells in two types of serum-free media Expansion culture medium prepared by adding the additives shown in the "Expansion culture medium" column of Table 2 to Advanced DMEM/F12 medium (no boric acid) ) and a medium to which 0.3mM boric acid was added, a total of two types of expansion culture medium were prepared. After 3 days of activation culture, cells were collected from the T225 flask, suspended in two types of expansion culture media at 40,000 cells/mL, and cultured using G-Rex (registered trademark) 10M (Wilson Wolf). , and cultured under 5% CO 2 /37°C.
  • G-Rex registered trademark
  • Test example 2 Proliferation test to verify the effect of addition of boric acid in serum-free expansion culture medium
  • item 5. of Example 2 was conducted.
  • the cell number and survival rate of iPS cell-derived CAR-T cells were measured on days 3, 5, 6, 7, 10, 12, and 14 of culture.
  • Figure 2 shows the cell proliferation rate from day 0 of expansion culture.
  • Proliferation of iPS cell-derived CAR-T cells was enhanced by adding 0.3 mM boric acid to the serum-free medium (FIG. 2).
  • Example 3 Recovery culture of iPS cell-derived CAR-T cells 500,000 iPS cell-derived CAR-T cells were cultured in a medium containing IMDM medium containing 15% FBS and the additives shown in the "Recovery culture medium" column of Table 3. The cells were suspended at a concentration of 100ml/ml, seeded on G-Rex (registered trademark) 10M (Wilson Wolf), and cultured for 3 days at 37°C in 5% CO 2 .
  • G-Rex registered trademark
  • 10M Woodson Wolf
  • RetroNectin (trade name) was purchased from Takara Bio.
  • Anti-CD3 mAb GMP grade Anti-CD3 monoclonal antibody (Clone: OKT3) purchased from Takara Bio Inc. was used.
  • Activation culture of iPS cell-derived CAR-T cells After recovery culture, iPS cell-derived CAR-T cells were added to IMDM medium containing 15% FBS with the additives shown in the "Activation culture medium” column of Table 3. Suspend cells at 133,333 cells/mL in culture medium, seed in T225 flasks immobilized with anti-CD3 agonist antibody (OKT3) and RetroNectin (trade name), and store at 37°C in 5 % CO2. It was cultured for 3 days.
  • Expansion culture of iPS cell-derived CAR-T cells in five types of serum-free media The additives shown in the "Expansion culture medium” column of Table 3 were added to Advanced DMEM/F12 medium, and boric acid was added at 0. Five types of expansion culture media containing 2mM, 0.3mM, 0.4mM, 0.6mM, and 0.9mM were prepared. After 3 days of activation culture, cells were collected from the T225 flask, suspended in each expansion culture medium at 50,000 cells/mL, and cultured using a G-Rex (registered trademark) 24-well plate (Wilson Wolf). , and cultured under 5% CO 2 /37°C.
  • G-Rex registered trademark
  • Test example 3 Proliferation test of iPS cell-derived CAR-T cells when boric acid was added at different concentrations to a serum-free expansion culture medium. Item 5 of 3. The number of iPS cell-derived CAR-T cells was counted over time in the expanded culture. Figure 3 shows the cell proliferation rate from day 0 of expansion culture. Maximum fold growth was achieved at a final concentration of boric acid ranging from 0.3 to 0.6 mM. It was also confirmed that boric acid concentration in the range of 0.2mM to 0.9mM did not affect cell viability (FIG. 3).
  • Example 4 Recovery culture of iPS cell-derived CAR-T cells 500,000 iPS cell-derived CAR-T cells were cultured in a medium containing IMDM medium containing 15% FBS and the additives shown in the "Recovery culture medium" column of Table 4. The cells were suspended at a concentration of 100 mL/mL, seeded on G-Rex (registered trademark) 10M (Wilson Wolf), and cultured for 3 days at 37° C. in 5% CO 2 .
  • G-Rex registered trademark
  • 10M Woodson Wolf
  • RetroNectin (trade name) was purchased from Takara Bio.
  • Anti-CD3 mAb GMP grade Anti-CD3 monoclonal antibody (Clone: OKT3) purchased from Takara Bio Inc. was used.
  • Activation culture of iPS cell-derived CAR-T cells After recovery culture, iPS cell-derived CAR-T cells were added to IMDM medium containing 15% FBS with the additives shown in the "Activation culture medium” column of Table 4. Suspend cells at 133,333 cells/mL in culture medium, seed in a T225 flask immobilized with anti-CD3 agonist antibody (OKT3) and RetroNectin (trade name), and store at 37°C in 5% CO2 . The cells were cultured for 3 days.
  • Expansion culture of iPS cell-derived CAR-T cells in five types of serum-free media Expansion culture medium prepared by adding the additives shown in the "Expansion culture medium" column of Table 4 to Advanced DMEM/F12 medium (Thermo Fisher), and 0.3mM boric acid (Sigma-Aldrich), 0.3mM boric acid and 1xITS-X ((Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine Supplements)Gibco), and 0.3mM boric acid and 1xITS-X, respectively.
  • a total of 5 types of expansion culture media were added with 1mM taurine (Sigma-Aldrich), 0.3mM boric acid, 1xITS-X and 3mM taurine (additives in Table 4 only, additives in Table 4 + 0.3mM boric acid). Supplemented medium, Table 4 additives + 0.3mM boric acid + ITS-X supplemented medium, Table 4 additives + 0.3mM boric acid + ITS-X + 1mM taurine supplemented medium, Table 4 additives + 0.3mM boric acid + ITS-X + 3mM taurine supplemented medium) was prepared.
  • Test example 4 Proliferation test to verify the additive effect of ITS-X and taurine in serum-free medium containing 0.3mM boric acid Item 5 of Example 4.
  • the cell number and survival rate of iPS cell-derived CAR-T cells were measured on days 3, 5, 6, 7, 10, 12, and 14 after culture.
  • Figure 4 shows the cell proliferation rate from day 0 of expansion culture.
  • Proliferation of iPS cell-derived CAR-T cells was enhanced by further adding 1xITS-X and 1mM or 3mM taurine to a serum-free medium containing 0.3mM boric acid ( Figure 4), and 1mM or 3mM taurine The survival rate improved by 1 to 4% by adding .
  • Example 5 Activation culture of human-derived primary T cells
  • Human-derived primary T cells (Leukopak-SoloPak, Charles River Laboratories Cell Solutions) were cultured in OpTmizer medium (Thermo Fisher) containing 2% CTS Immune Cell SR (Thermo Fisher) according to Table 6. Suspend at 1,000,000 cells/mL in a medium containing the additives shown in the activation culture medium, seed in PL240 bag (OriGen), and culture for 2 days under 5% CO 2 /37°C. did.
  • OpTmizer medium Thermo Fisher
  • CTS Immune Cell SR Thermo Fisher
  • Reagent RetroNectin (trade name) was purchased from Takara Bio.
  • RetroNectin (trade name) and retrovirus on a culture plate RetroNectin (final concentration 150 ⁇ g/mL) dissolved in PBS at the required concentration was added to a PL120 bag, and then left at room temperature for 2 hours. After washing with PBS, a retrovirus solution was added and solidified overnight at 4°C while shaking at 50 rpm. After washing with PBS containing 1.5% HSA, it was subjected to the test.
  • human-derived primary T cells After activation culture, human-derived primary T cells were cultured in OpTmizer medium containing 2% CTS Immune Cell SR with the additives shown in the transduction culture medium in Table 6. The cells were suspended at 722,222 cells/mL and seeded in a PL120 bag immobilized with a retroviral vector containing RetroNectin (trade name) and a CAR gene that recognizes a specific antigen, and incubated at 5% CO 2 /mL. The cells were cultured at 37°C for 1 day.
  • Expansion culture of CAR-T cells derived from human primary T cells in four types of serum-free media Expansion culture medium prepared by adding the additives shown in Expansion Culture Medium 1 in Table 6 to OpTmizer medium containing 2% CTS Immune Cell SR, An expansion culture medium containing the components listed in Table 7 (hereinafter referred to as BM220720) with the additives shown in Expansion Culture Medium 2 in Table 6, and an additional 0.3mM boric acid (Sigma-Aldrich) or A total of four types of expansion culture media containing 0.3mM boric acid and 3mM taurine (Sigma-Aldrich) were used (OpTmizer medium with only the additives in Table 6, BM220720 medium with (i) only the additives in Table 6, (ii) A medium to which either the additives shown in Table 6 + 0.3mM boric acid or (iii) the additives shown in Table 6 + 0.3mM boric acid + 3mM taurine were added was prepared.
  • Test example 5 Proliferation test to verify the effect of addition of boric acid and taurine on CAR-T cells derived from human primary T cells. Item 5 of Example 5 for verification. In the expanded culture, the cell number and survival rate of CAR-T cells derived from human primary T cells were measured on days 4, 6, 10, and 11. Figure 5 shows the cell proliferation rate from day 0 of expansion culture. The proliferation of human primary T cell-derived CAR-T cells was enhanced by further adding 0.3 mM boric acid to the serum-free medium or 3 mM taurine to 0.3 mM boric acid (FIG. 5).
  • Example 6 Preparation of iPS cell-derived NK cells
  • the iPS cell FfI01s04 strain provided by Kyoto University iPS Cell Research Institute (CiRA) was used to differentiate into NK cells according to a known method (for example, the method described in WO2021/174004).
  • the obtained cells were cryopreserved in liquid nitrogen and used as iPS cell-derived NK cells.
  • iPS cell-derived NK cells were cultured 1.25 ⁇ in a recovery culture medium prepared by adding the additives shown in Table 8 to IMDM medium (Thermo Fisher Scientific) containing 15% Fetal Bovine Serum (FBS). They were suspended at 10 5 cells/mL, seeded on a G-Rex (registered trademark) 6-well plate (Wilson Wolf), and cultured in a 5% CO 2 /37°C incubator for 3 days (culture 0-3). day).
  • IMDM medium Thermo Fisher Scientific
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • iPS cell-derived NK cells were activated in IMDM medium (Thermo Fisher Scientific) containing 15% Fetal Bovine Serum (FBS) with the additives shown in Table 9 added. They were suspended in a medium to a density of 1.84 x 10 5 cells/mL, seeded in a 6-well plate (TPP), and cultured in a 5% CO 2 /37°C incubator for 3 days (days 3 to 6 of culture). ).
  • IMDM medium Thermo Fisher Scientific
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • Cells that had been activated and cultured for 3 days were suspended in 5 types of expansion culture media at a density of 1.25 x 10 5 cells/mL, and then seeded again on G-Rex (registered trademark) 24-well plates (Wilson Wolf).
  • the cells were cultured in a 5% CO 2 /37°C incubator for 2 days (6th to 8th day of culture).
  • the medium was changed to a medium containing the above five types of basal medium plus the additives shown in Table 10, and cultured in a 5% CO 2 /37°C incubator for 2 days (8th to 10th day of culture).
  • the cells were replated into G-Rex (registered trademark) 24-well plates (Wilson Wolf) at 1.25 x 10 5 cells/mL in the same medium, and incubated with 5% CO 2 / Culture was continued in a 37°C incubator until the 17th day of culture.
  • G-Rex registered trademark
  • Test example 6 Proliferation test to verify the additive effects of boric acid and taurine on iPS cell-derived NK cells Item 4 of Example 6 was used to verify the effects of boric acid and taurine addition in a serum-free expansion culture medium on iPS cell-derived NK cells. In the expanded culture, the cell number and survival rate of iPS cell-derived NK cells were measured over time. Table 11 shows the proliferation rate and cell survival rate on the 11th day of expansion culture. Proliferation of iPS cell-derived NK cells was enhanced by further adding 0.3mM boric acid and 1mM taurine or 3mM taurine to the serum-free basal medium (Table 11).
  • the present invention even when using a serum-free medium or a low-serum medium, it is possible to obtain cell proliferation maintenance and promotion effects comparable to those of culture in a serum-containing medium.
  • cells that are susceptible to stress due to operations such as cell washing are preferably cultured in serum-free or low-serum media that do not require strong washing, and are suitable for culture under such conditions.

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Abstract

本発明は、細胞、特に免疫担当細胞を無血清培地又は低血清培地でも十分に増殖させることを可能とする方法、該方法に使用する培地添加剤及び培地組成物の提供を課題とする。ホウ酸又はその塩を含有せしめることにより、無血清培地又は低血清培地中であっても血清含有培地での培養に匹敵する細胞増殖維持・促進効果を得ることができる。

Description

細胞の培養方法
　本発明は、無血清培地又は低血清培地中で細胞を培養／増殖する方法、該方法の為の培地添加剤及び培地組成物に関する。本発明は、無血清培地又は低血清培地中で所望の細胞の数が拡大された細胞集団を製造する方法、該方法によって得られた細胞集団を含有してなる医薬に関する。
（発明の背景）
　従来、細胞の培養は、血清を含有する培地（以下、「血清含有培地」とも称する）を用いて行なわれてきた。例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）等は、細胞増殖に重要な添加物として細胞培養に汎用されている。しかしながら培養後の細胞あるいはその派生物を医療目的で使用する場合、異種由来成分は、血液媒介病原菌の感染源や異種抗原となる可能性がある。また血清のロット間差により培養結果にばらつきが生じる可能性もある。そのため近年では、血清の使用量をできるだけ減らしたり、化学的組成が明らかな培地（chemically defined medium）を用いて細胞を培養したりすることが主流となってきており、無血清培地や低血清培地の開発が進められている。
　がん患者への免疫療法の一つとして、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）がもつＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に対して遺伝子改変を加え、直接的且つ選択的に腫瘍細胞をＣＴＬに認識させ、抗腫瘍効果を発揮するというキメラ抗原受容体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）Ｔ細胞（以下、単にＣＡＲ－Ｔ細胞とも称する）による治療が近年開発された。ＣＡＲ－Ｔ細胞によるがん治療は、従来の抗がん剤や放射線治療とは異なる機序でがん細胞を殺傷することから、難治性あるいは治療抵抗性のがんに対してもその有効性が期待されている。現在のＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、米国で承認されたＫｙｍｒｉａｈ（商品名）やＹｅｓｃａｒｔａ（商品名）のように、患者から採取したＴ細胞に生体外でＣＡＲ遺伝子を導入してＣＡＲ－Ｔ細胞を製造し、当該ＣＡＲ－Ｔ細胞を患者に投与するという自家ＣＡＲ－Ｔ細胞療法が一般的である。しかし、この方法では、Ｔ細胞の活性化／増殖、ウイルスベクターの調製、Ｔ細胞への遺伝子導入等、長期間に渡る多段階のステップが必要となるため、細胞培養やウイルスベクター調製にかかるコスト等により製造原価が高くなるという課題がある。そこで、他家ＣＡＲ－Ｔ療法を可能とするｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞が開発されている。この方法でもｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞を製造する工程、特に拡大培養する工程で、十分な細胞増殖効果を得るために血清含有培地を用いている。しかしながら、ＧＭＰ（Good Manufacturing Practice）の観点からは異種成分を含まないゼノフリーであることが好ましく、無血清あるいは低血清であることが望ましい。また、特にｉＰＳ細胞由来のＴ細胞は初代Ｔ細胞に比べて、洗浄ストレスに弱いこと等を考慮すると、強い洗浄を必要としない無血清あるいは低血清培地を用いることに強い要望があった。
　細胞培養において、所望の細胞増殖効果を維持する、あるいは細胞増殖効果を促進する方法については数多くの報告がある。例えば、ホウ酸の、そのトランスポーターであるＮａＢＣ１を介した細胞増殖効果について報告されている（非特許文献１）。しかしながら、ここで使用されている培地は血清含有培地であり、無血清培地や低血清培地でも同様に細胞増殖効果が発揮されるかは不明である。また、特許文献１には、ホウ酸塩を含有する、二倍体細胞の培養に好適な無血清培地が記載されている。また、非特許文献２には、タウリンのトランスポーターであるＴａｕｔがＴ細胞のリコール応答に重要であることが記載されている。
中国特許第１０５４６２９１２号公報
Park, Meeyoung et al., Mol Cell. 2004 Nov 5;16(3):331-41. Kaesler, Susanne et al., Eur. J. Immunol. 2012 42:831-841
　本発明は、細胞、特に免疫担当細胞を無血清培地又は低血清培地で培養し十分に増殖させる方法、該方法に使用する培地添加剤及び培地組成物の提供を課題とする。さらに、本発明は、無血清培地又は低血清培地中で所望の細胞、特に免疫担当細胞の数が拡大された細胞集団を製造する方法、該方法によって得られた細胞集団を含有してなる医薬の提供を課題とする。
　本発明者らは、上記課題に鑑み、無血清培地又は低血清培地に添加する各種因子を準備し、細胞培養乃至増殖に及ぼすそれらの効果を調べた。結果、ホウ酸又はその塩を添加することにより、無血清培地又は低血清培地を用いた場合でも、血清含有培地での培養に匹敵する細胞増殖維持・促進効果が確認された。かかる知見に基づき、より好適な培養条件を見出して、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下の通りである。
［１］ホウ酸又はその塩を含有する、無血清培地又は低血清培地中で細胞を培養する工程を含む、細胞の培養方法。
［２］ホウ酸又はその塩の培地中の最終濃度が０．１～０．９ｍＭである、上記［１］記載の方法。
［３］ホウ酸又はその塩の培地中の最終濃度が０．３～０．６ｍＭである、上記［１］記載の方法。
［４］前記無血清培地又は低血清培地が無血清培地である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］細胞が、免疫担当細胞である、上記［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］免疫担当細胞が、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びナチュラルキラー細胞から選択される、上記［５］記載の方法。
［７］免疫担当細胞がＴ細胞である、上記［６］記載の方法。
［８］細胞が多能性幹細胞由来である、上記［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、上記［８］記載の方法。
［１０］前記培地がさらにタウリンを含有する、上記［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］ホウ酸又はその塩を含有する、無血清培地又は低血清培地中で細胞を培養する工程を含む、細胞の増殖方法。
［１２］前記無血清培地又は低血清培地が無血清培地である、上記［１１］記載の方法。
［１３］前記培地がさらにタウリンを含有する、上記［１１］又は［１２］に記載の方法。
［１４］所望の細胞の数が拡大された細胞集団の製造方法であって、ホウ酸又はその塩を含有する、無血清培地又は低血清培地中で所望の細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む、方法。
［１５］前記無血清培地又は低血清培地が無血清培地である、上記［１４］記載の方法。
［１６］前記培地がさらにタウリンを含有する、上記［１４］又は［１５］に記載の方法。
［１７］上記［１４］～［１６］のいずれかに記載の方法によって得られた細胞集団を含有してなる、医薬。
［１８］がんの予防及び／又は治療に用いるための、上記［１７］記載の医薬。
［１９］ホウ酸又はその塩を含有する培地添加剤であって、該培地が無血清培地又は低血清培地であることを特徴とする、剤。
［２０］前記無血清培地又は低血清培地が無血清培地である、上記［１９］記載の剤。
［２１］前記培地がさらにタウリンを含有する、上記［１９］又は［２０］に記載の剤。
［２２］上記［１９］～［２１］のいずれかに記載の培地添加剤を無血清培地又は低血清培地に添加してなる、ホウ酸又はその塩を含有する培地組成物。
［２３］前記無血清培地又は低血清培地が無血清培地である、上記［２２］記載の培地組成物。
［２４］さらにタウリンを含有する、上記［２２］記載の培地組成物。
［２５］上記［１４］～［１６］のいずれかに記載の方法によって得られた細胞集団を、それを必要とする対象に投与することを含む、がんの予防及び／又は治療方法。
［２６］がんの予防及び／又は治療において使用するための、上記［１４］～［１６］のいずれかに記載の方法によって得られた細胞集団。
［２７］がんを予防及び／又は治療するための医薬の製造における、上記［１４］～［１６］のいずれかに記載の方法によって得られた細胞集団の使用。
　本発明によれば、無血清培地又は低血清培地を用いた場合でも、血清含有培地での培養に匹敵する細胞増殖維持・促進効果を得ることができる。特に、細胞の洗浄等の操作に対するストレスに弱い細胞は、強い洗浄を必要としない無血清培地又は低血清培地での培養が好ましく、そのような状況下での培養に適している。
図１は、１％ＦＢＳ含有培地における０．３ｍＭホウ酸の添加効果を検証するｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞増殖試験の結果を示すグラフである。上段は拡大培養０日目（Ｄａｙ０）からの細胞の増殖倍率を、下段は細胞の生存率を計測した結果をそれぞれ表す。w/o；without, w/；with 図２は、無血清の拡大培養培地における０．３ｍＭホウ酸の添加効果を検証するｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞増殖試験の結果を示すグラフである。上段は拡大培養０日目（Ｄａｙ０）からの細胞の増殖倍率を、下段は細胞の生存率を計測した結果をそれぞれ表す。w/o；without, w/；with 図３は、無血清の拡大培養培地にホウ酸を異なる濃度で添加したときのｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖試験の結果を示すグラフである。上段は拡大培養０日目（Ｄａｙ０）からの細胞の増殖倍率を、下段は細胞の生存率を計測した結果をそれぞれ表す。w/o；without, w/；with ０．３ｍＭホウ酸含有無血清培地におけるＩＴＳ－Ｘ単独、及びＩＴＳ－Ｘとタウリン併用の添加効果を検証するｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞増殖試験の結果を示すグラフである。上段は拡大培養０日目（Ｄａｙ０）からの細胞の増殖倍率を、下段は細胞の生存率を計測した結果をそれぞれ表す。w/o；without, w/；with ０．３ｍＭホウ酸含有無血清培地におけるタウリン単独の添加効果を検証するヒト由来初代Ｔ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞増殖試験の結果を示すグラフである。上段は拡大培養０日目（Ｄａｙ０）からの細胞の増殖倍率を、下段は細胞の生存率を計測した結果をそれぞれ表す。w/o；without, w/；with
（発明の詳細な説明）
　以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。
（１）細胞の培養方法（以下、「本発明の培養方法」とも称する）、細胞の増殖方法（以下、「本発明の増殖方法」とも称する）
　本発明の培養方法又は増殖方法は、ホウ酸又はその塩を含有する、無血清培地又は低血清培地中で細胞を培養する工程を含む。
１－１．細胞
　本発明の培養方法及び増殖方法で培養する対象となる細胞種は特に限定されない。かかる細胞種としては、例えば、精子や卵子等の生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞（多能性幹細胞等）及び幹細胞から分化誘導された細胞、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。生体を構成する体細胞及び幹細胞から分化誘導された細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、免疫担当細胞（ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、マスト細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、好中球、好酸球、好塩基球、Ｂ細胞、Ｔ細胞等）、線維芽細胞、骨髄細胞、赤血球、血小板、骨細胞、周皮細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえば、平滑筋細胞又は骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞（例えば、臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞）、及び単核細胞等が含まれる。体細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液（臍帯血を含む）、骨髄、心臓、眼、脳又は神経組織などの任意の組織から採取される細胞が含まれる。
　幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性腫瘍細胞、多能性幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞等が含まれる。
　「多能性幹細胞」とは、自己複製能及び分化／増殖能を有し、且つ生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ストレスや細胞刺激によって誘導・選抜される多能性幹細胞等を挙げることが出来る。体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した幹細胞も、多能性幹細胞としてまた好ましい（Nature, 385, 810 (1997); Science, 280, 1256 (1998); Nature Biotechnology, 17, 456 (1999); Nature, 394, 369 (1998); Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984 (1999); Nature Genetics, 24, 109 (2000)）。本発明において、多能性幹細胞として好ましいのはｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞であることの確認は、ｉＰＳ細胞の未分化な性質に起因する未分化マーカーを指標にして行うことができる。未分化マーカーとしては、アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ３/４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＥＲａｓ、Ｅｓｇｌ等が挙げられる。これら未分化マーカーを検出する方法としては、ｍＲＮＡを検出する方法（プライマーやプローブの利用）、免疫学的検出法（抗体や標識の利用）等が挙げられる。
　幹細胞から分化誘導された細胞（分化誘導細胞）は、幹細胞から特定の種類の細胞に分化するように分化誘導処理された任意の細胞である。
　細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＨＣＴ１１６、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮癌細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ－３３Ａ、ＨＴ－２９、ＡＥ－１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ（商品名）、Ｖｅｒｏ等が含まれる。
　好ましい一態様において、培養の対象となる細胞は免疫担当細胞である。免疫担当細胞とは、生体内で、様々な免疫反応に関与する細胞をいう。免疫担当細胞としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、マスト細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、好中球、好酸球、好塩基球、Ｂ細胞、Ｔ細胞等が挙げられるが、好ましくは樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から選択される。より好ましくは、免疫担当細胞はＴ細胞である。
　Ｔ細胞には、ＣＤ４陽性ＣＤ８陰性Ｔ細胞、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性Ｔ細胞、αβ－Ｔ細胞、γδ－Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、およびＮＫＴ細胞等が含まれる。Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、又はメモリーＴ細胞等のサブセットであり得る。
　免疫担当細胞は、ヒトから単離された細胞（初代細胞）であっても、多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞）、造血幹細胞、間葉系幹細胞などの幹細胞から分化させて得られた細胞であってもよく、好ましくは初代細胞、及び多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）から分化させて得られた細胞である。初代細胞としては、ヒト由来初代Ｔ細胞が好ましい。幹細胞から免疫担当細胞への分化誘導は、用いる幹細胞、目的とする免疫担当細胞の種類によって適宜当分野で知られている手法によって行うことができる。一例として、ｉＰＳ細胞からＴ細胞の分化誘導及びｉＰＳ細胞からＮＫ細胞の分化誘導は、実施例に記載する方法によって行うことができる。
　また、対象となる細胞は、自家の細胞または他家の細胞のいずれであってもよい。本発明において、「自家の細胞」とは、本発明の培養方法または本発明の方法により製造される細胞集団（後述）の投与をうける対象から得られた細胞、または得られた細胞から誘導された細胞を意味し、「他家の細胞」とは、前記「自家の細胞」でないことを意味する。
　本発明において、対象となる細胞は、人為的に遺伝子改変が成された細胞であってもよい。一例として、ＣＡＲ遺伝子が導入された免疫担当細胞（ＣＡＲ遺伝子が導入されたＴ細胞やＣＡＲ遺伝子が導入されたナチュラルキラー細胞）、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が導入されたＴ細胞、サイトカイン及び／又はケモカインを発現するための遺伝子が導入された免疫担当細胞が挙げられる。
　ＣＡＲは、タンパク質のＮ末端側からＣ末端側に向けて、標的に特異的な細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および免疫細胞のエフェクター機能のための細胞内シグナルドメインを含む構造体であり、ＣＡＲ遺伝子は、この受容体をコードする遺伝子である。細胞外ドメインは、標的に特異的な結合性を示す抗原認識部位を含む。膜貫通ドメインは、細胞外ドメインと細胞内シグナルドメインとの間に存在する。細胞内シグナルドメインは、免疫細胞のエフェクター機能の発揮に必要なシグナルを伝達する。即ち、細胞外ドメインが標的抗原と結合した際、免疫細胞の活性化に必要なシグナルを伝達することが可能な細胞内シグナルドメインが用いられる。これまでにＣＡＲを利用した実験、臨床研究などの報告がいくつかあり（例えばRossig C, et al. Mol Ther 10:5-18, 2004; Dotti G, et al. Hum Gene Ther 20:1229-1239, 2009; Ngo MC, et al. Hum Mol Genet 20 (R1):R93-99, 2011; Ahmed N, et al. Mol Ther 17:1779-1787, 2009; Pule MA, et al. Nat Med 14:1264-1270, 2008; Louis CU, et al. Blood 118:6050-6056, 2011; Kochenderfer JN, et al. Blood 116:4099-4102, 2010; Kochenderfer JN, et al. Blood 119 :2709-2720, 2012; Porter DL, et al. N Engl J Med 365:725-733, 2011; Kalos M, et al. Sci Transl Med 3:95ra73,2011; Brentjens RJ, et al. Blood 118:4817-4828, 2011; Brentjens RJ, et al. Sci Transl Med 5:177 ra38, 2013）、これらの報告を参考にして本発明におけるＣＡＲを構築することができる。
　本発明の培養方法及び増殖方法が適用される細胞の好ましい一例としては、ＣＡＲ遺伝子が導入されたＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）及びＣＡＲ遺伝子が導入されたＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞）、より好ましくは多能性幹細胞由来のＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＡＲ－ＮＫ細胞、いっそう好ましくはｉＰＳ細胞由来のＣＡＲ－Ｔ細胞及びｉＰＳ細胞由来のＣＡＲ－ＮＫ細胞、よりいっそう好ましくはｉＰＳ細胞由来のＣＡＲ－Ｔ細胞が挙げられる。ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＡＲ－ＮＫ細胞は、それぞれＴ細胞およびＮＫ細胞または多能性幹細胞等のそれらの前駆細胞に対するＣＡＲ遺伝子の導入により得ることができる。例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ遺伝子を導入した、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞などの細胞をＴ細胞に分化させて得られた細胞や、ＣＡＲ遺伝子を導入したｉＰＳ細胞からＴ細胞に分化させて得られた細胞であってもよい。好ましくは、ＣＡＲ遺伝子を導入したｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化させて得られたｉＰＳ細胞由来のＣＡＲ－Ｔ細胞、及びｉＰＳ細胞を分化させて得られたＴ細胞にＣＡＲ遺伝子を導入して得られたｉＰＳ細胞由来のＣＡＲ－Ｔ細胞であり、これらを「ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞」と総称する場合がある。より好ましくはｉＰＳ細胞を分化させて得られたＴ細胞にＣＡＲ遺伝子を導入して得られたｉＰＳ細胞由来のＣＡＲ－Ｔ細胞である。例えば、ＣＡＲ－ＮＫ細胞の場合は、ＣＡＲ遺伝子を導入した、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞などの細胞をＮＫ細胞に分化させて得られた細胞や、ＣＡＲ遺伝子を導入したｉＰＳ細胞からＮＫ細胞に分化させて得られた細胞であってもよい。好ましくは、ＣＡＲ遺伝子を導入したｉＰＳ細胞をＮＫ細胞に分化させて得られたｉＰＳ細胞由来のＣＡＲ－ＮＫ細胞、及びｉＰＳ細胞を分化させて得られたＮＫ細胞にＣＡＲ遺伝子を導入して得られたｉＰＳ細胞由来のＣＡＲ－ＮＫ細胞であり、これらを「ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－ＮＫ細胞」と総称する場合がある。より好ましくはｉＰＳ細胞を分化させて得られたＮＫ細胞にＣＡＲ遺伝子を導入して得られたｉＰＳ細胞由来のＣＡＲ－ＮＫ細胞である。
　ｉＰＳ細胞（所望によりＣＡＲ遺伝子が導入されていてもよい）からＴ細胞への分化誘導、あるいはｉＰＳ細胞（所望によりＣＡＲ遺伝子が導入されていてもよい）からＮＫ細胞への分化誘導は、公知の方法を用いて行うことができるが、具体的には実施例に記載の方法によって行うことができる。
　ＣＡＲ遺伝子の細胞への導入は、通常、ＣＡＲ発現ベクターにより行う。ＣＡＲ発現ベクターとは、ＣＡＲ遺伝子をコードする核酸分子を細胞内へ輸送することができる核酸性分子を意味し、ＤＮＡであるかＲＮＡであるかを問わず、また、形態、由来なども特に限定されず、様々な種類のベクターが利用可能である。ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターでありうる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等が挙げられる。この中でもレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターでは、ベクターに組み込んだ目的遺伝子が宿主染色体へと組み込まれ、安定かつ長期的な発現が期待できる。各ウイルスベクターは、常法に従い、または市販される専用のキットを用いて、作製することができる。非ウイルスベクターとしては、プラスミドベクター、リポソームベクター、正電荷型リポソームベクター（Felgner, P.L., Gadek, T.R., Holm, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84:7413-7417, 1987）、ＹＡＣベクター、ＢＡＣベクター、人工染色体ベクター等が挙げられる。
　一例として、ＣＡＲ遺伝子の細胞への導入は実施例に記載する方法によって行うことができる。
１－２．培地
　本発明の培養方法及び増殖方法で用いる培地は、ホウ酸又はその塩を含有する無血清培地又は低血清培地（以下、「本発明の培地」と総称する場合がある）である。
　本明細書において、ホウ酸としては、薬学的に許容される限り特に限定されないが、例えばオルトホウ酸、メタホウ酸、テトラホウ酸等が挙げられる。これらのホウ酸の中でも、好ましくはオルトホウ酸が用いられる。ホウ酸の塩としては、薬学的に許容される限り特に限定されないが、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；トリエチルアミン、トリエタノールアミン、モルホリン、ピペラジン、ピロリジン等の有機アミン塩等が挙げられる。また、ホウ酸又はその塩は、ホウ砂等のように、水和物の形態であってもよい。ホウ酸又はその塩の培地中の濃度は、所望の効果が得られる限り特に限定されないが、通常０．１～０．９ｍＭ、好ましくは０．２～０．８ｍＭ、更に好ましくは０．２～０．７ｍＭ、特に好ましくは０．３～０．６ｍＭが挙げられる。本明細書において、ホウ酸又はその塩の濃度は、特に明記しない限り、ホウ酸に換算された濃度である。濃度が高すぎると細胞生存率に影響を及ぼし、低すぎると細胞増殖促進効果が弱い。
　本明細書において「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を実質的に含まない、好ましくは含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。培地としては、通常、動物細胞を培養するのに用いられる培地（以下、便宜上、基礎培地とも称する）や灌流培養用培地が用いられる。ここで「実質的に含まない」とは、まったく含まないか、含まれていても検出限界未満であることを意味する。
　基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ　１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｆ１２培地及びこれらの混合培地（例、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地等）等が例示されるが、特に限定されない。
　灌流培養は細胞を含む培養系に培地を連続的に供給するとともにそれと同量の細胞を含まない培養上清を連続的に培養系外へ取り出し、培養系を定常状態に保つ培養方法である。通常の培養方法に比べ高細胞密度での培養を必要とするため、灌流培養用培地は基礎培地よりも栄養成分の濃度が高いのが一般的である。
　これらの培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＳＩＧＭＡ社、富士フイルム和光純薬社、住友ファーマ社などから購入可能であり、同一名称あるいは同一商品名の培地であれば培地の組成は製造元によらず同等である。
　本明細書において「低血清培地」とは、基礎培地に血清が添加された培地であるが、その濃度が通常用いられる血清含有培地（血清濃度：５～２０％(本明細書において、血清濃度はｖ／ｖ％で表される））に比べて低減されていることを特徴とする。低血清培地の血清濃度は、５％未満、２％未満、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、０．００１％未満であり得るが、通常、０．１％以上、１％以上であり得る。具体的には、前記血清濃度は、好ましくは０．１％以上５％未満、より好ましくは１％以上４％未満である。
　本工程で用いられる培地はまた、血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、インスリン、微量元素（例えば亜鉛、セレンなど）、ＩＴＳサプリメント（インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸の混合物）、Ｂ－２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント、２－メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などが挙げられる。これらの血清代替物もまた商業的に入手可能である。ノックアウトシーラムリプレースメントはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入可能である。その他の血清代替物については、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＳＩＧＭＡ社、富士フイルム和光純薬社、住友ファーマ社などから購入可能であり、同一名称あるいは同一商品名の試薬あるいは添加物であれば組成は製造元によらず同等である。
　また、本発明の培地は、基礎培地に加えて、さらに細胞増殖に好ましい成分を添加することもできる。かかる成分としては、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース等の糖；グリシン、セリン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン、テアニン、シトルリン、タウリン、ベタイン、カルニチン、クレアチン、パントテン酸等のアミノ酸又はアミノ酸誘導体；アルブミン、トランスフェリン等のタンパク質；グリシルグリシルグリシン、大豆ペプチド等のペプチド；血清；コリン、ビタミンＢ群（チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、シアノコバラミン、ビオチン、葉酸、パントテン酸、ニコチンアミド等）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＣ誘導体等のビタミン；オレイン酸、アラキドン酸、リノール酸等の脂肪酸；コレステロール等の脂質；アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、イノシン等のヌクレオシド；イノシン酸；ヒポキサンチン；塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸二水素ナトリウム等の無機塩；亜鉛、銅、セレン、バナジウム、マンガン、ニッケル、ケイ素、スズ、モリブデン、カドミウム、クロム、銀、アルミニウム、バリウム、コバルト、ゲルマニウム、ヨウ素、臭素、フッ素、ルビジウム、ジルコニウム等の微量元素；Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（Ｎ，Ｎ－ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＢＥＳ））、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ））、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｎ－［ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎｅ（Ｔｒｉｃｉｎｅ））等の緩衝剤；アンホテリシンＢ、カナマイシン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン等の抗生物質；Ｔｙｐｅ　Ｉ　コラーゲン、Ｔｙｐｅ　ＩＩ　コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ－Ｄ－リシン等の細胞接着因子および細胞外マトリックス成分；インターロイキン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－α、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－β、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アクチビンＡ等のサイトカインおよび増殖因子；デキサメサゾン、ヒドロコルチゾン、エストラジオール、プロゲステロン、グルカゴン、インスリン等のホルモン等が挙げられ、培養する細胞の種類に応じて適切な成分を選択して適切な濃度で用いることができる。特に、細胞の生存率および増殖を向上させるために、アミノ酸誘導体の１種であるタウリンを添加することができ、通常、０．５～１０ｍＭ、好ましくは２～５ｍＭの最終濃度で用いられ得る。増殖因子は、ヒト以外の動物種のものであってもよいが、ヒト由来のもの（組換え体であってもよい）であることが好ましい。
　培地には、細胞の生存および増殖を補助するため、さらに添加因子を含んでいてもよい。添加因子としては、１型サイトカインファミリーメンバー、２型サイトカインファミリーメンバー、ＴＮＦスーパーファミリーサイトカイン、ＩＬ－１ファミリーサイトカイン、その他サイトカイン（ＴＮＦ－β等）が挙げられ、具体的にはＩＬ－１～ＩＬ－４１等であり、好ましくはＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１等が挙げられる。添加因子は、常法に従って調製することができ、また、市販品を利用することもできる。添加因子は、ヒト以外の動物種のものであってもよいが、ヒト由来のもの（組換え体であってもよい）であることが好ましい。
　本明細書において、「ゼノフリー」とは、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物種由来の成分が排除された条件を意味する。
１－３．細胞培養
　本発明はまた、本発明の培地（上述）で培養することを特徴とする、細胞の培養方法（以下、「本発明の培養方法」と称することがある）を提供する。
　細胞の培養に用いられる培養器は、細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル、及びバイオリアクターが挙げられ得る。対象とする細胞に応じて適宜選択される。
　培養器は、細胞接着性であっても細胞非接着性であってもよく、目的に応じて適宜選ばれる。細胞接着性の培養器は、培養器の表面の細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等の任意の細胞支持用基質でコーティングされたものであり得る。細胞支持用基質は、細胞の接着を目的とする任意の物質であり得る。
　その他の培養条件は、適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約３０～４０℃、好ましくは約３７℃であり得る。ＣＯ２濃度は、約１～１０％、好ましくは約２～５％であり得る。酸素分圧は、１～２１％であり得る。
　細胞培養における培地交換の頻度及び培養期間は、一般的に、細胞密度、培養方法（接着培養／浮遊培養）、培養される細胞種、培地の組成、培養条件（温度、ガス濃度）、交換される培地の量（全量／一部の量）、培地のコスト、作業者のライフスタイル等の多種の条件を総合的に勘案して決定される。培地交換は、通常２～３日間毎に１回、１日に１回、または１日に複数回（例、２回）程度であり、本発明の培養方法及び増殖方法においてもこのような頻度により培地交換を行うことができる。また灌流培養により連続的に培地交換を行うこともできる。培養期間は、通常４日～４週間程度、好ましくは４日～３週間程度、より好ましくは１～２週間程度である。
　本発明の一実施態様において、ホウ酸又はその塩を含有する、無血清培地又は低血清培地（即ち、本発明の培地）で培養する細胞は、免疫担当細胞であり、好ましくは、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から選択され、より好ましくはＴ細胞及びＮＫ細胞であり、更に好ましくはＴ細胞である。本発明の別の一実施態様において、本発明の培地で培養する細胞は初代Ｔ細胞および多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）由来のＴ細胞であり、より好ましくは初代Ｔ細胞由来および多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）由来ＣＡＲ－Ｔ細胞であり、更に好ましくは多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）由来ＣＡＲ－Ｔ細胞である本発明の更に別の一実施態様において、本発明の培地で培養する細胞は初代ＮＫ細胞および多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）由来のＮＫ細胞であり、より好ましくは初代ＮＫ細胞由来および多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）由来ＣＡＲ－ＮＫ細胞であり、更に好ましくは多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）由来ＣＡＲ－ＮＫ細胞である。
　本発明の一実施態様において、培養は、活性化工程、及び拡大工程を含む。凍結保存された細胞を用いる場合には、回復工程を含み得る。本発明において、培養対象が凍結保存された細胞の場合、該細胞の培養は、回復工程からなる回復培養、活性化工程からなる活性化培養、拡大工程からなる拡大培養のいずれか１つ、２つ、あるいは３つ全てを含む概念である。好ましくは、拡大培養を対象とする。本発明の別の一実施態様は、ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＡＲ－ＮＫ細胞、好ましくは多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）由来ＣＡＲ－Ｔ細胞及び多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）由来ＣＡＲ－ＮＫ細胞の培養であり、活性化工程、及び拡大工程を含み、必要に応じ（凍結保存された細胞を用いる場合等）回復工程を含む。
（回復工程／回復培養）
　当該工程は、凍結保存された細胞を解凍した後に実施する工程である。細胞が長時間、凍結保護剤に曝露されると損傷の原因になるため、解凍後は速やかに細胞から凍結保護剤を取り除く。その後、凍結融解によって生じる細胞損傷や細胞の機能障害を回復させる。当該工程／培養の方法は、対象となる細胞や使用する凍結保護剤や解凍の方法等によっても異なるが、通常凍結保護剤を含有しない培地で数日間、好ましくは１日～５日間、より好ましくは３日間程度培養することで、ほとんどの細胞は正常に回復する。
（活性化工程／活性化培養）
　当該工程は、細胞に対する所望の効果が得られる限り特にその方法は限定されないが、例えば、刺激物質との接触によって実施することができる。通常、刺激物質の存在下、具体的には刺激物質を含有する培地で数日間、好ましくは１日～５日間、より好ましくは３日間程度培養する。刺激物質は、オートクライン、パラクライン、エンドクラインなどの方法で細胞の活動を制御するシグナル分子であり、培養系に含まれる、全ての細胞から分泌されうる物質であってもよいし、外から添加されるものであってもよい。具体的にはリガンドを結合させた基材との接触、あるいはリガンドを含む培地中での培養、等によって実施される。
　例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞、好ましくは多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化培養で用いるリガンドは、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞の表面分子と相互作用して、その活性化を促進する分子であれば特に制限はない。例えば、ＴＣＲと共役してＴＣＲを介したシグナル伝達を担うＣＤ３や、Ｔ細胞活性化の共刺激因子として知られる表面分子ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＴＡＣＩ、ＢＭＣＡ、ＣＤ４０Ｌ等に特異的に結合して、活性化シグナルを、Ｔ細胞内に伝達する機能を有する分子が挙げられる。そのような分子としては、上記Ｔ細胞表面分子に対する生理的なリガンド（又は受容体）であってもよいし、アゴニスト活性を有する非生理的なリガンド（又は受容体）であってもよい。非生理的なリガンドとして、好ましくはアゴニスト抗体を挙げることができる。
　より好ましくは、本発明で用いられるＴ細胞活性化リガンドとして、ＣＤ３に対する抗体が挙げられる。ＣＤ３に対する抗体は、それぞれ活性化を誘導する標的Ｔ細胞で発現するＣＤ３と特異的に結合し、これらＴ細胞の表面分子を刺激してＴ細胞内にシグナルを伝達する能力を有する限り、完全抗体であっても、そのフラグメント（例、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、還元抗体（ｒＩｇＧ）、ｄｓＦｖ、ｓＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ等）であってもよい。
　例えば、ＣＡＲ－ＮＫ細胞、好ましくは多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）由来ＣＡＲ－ＮＫ細胞の活性化培養で用いる分子は、例えば、ＣＡＲ－ＮＫ細胞の表面分子と相互作用して、その活性化を促進する分子であれば特に制限はない。例えば、上記ＮＫ細胞表面分子に対する生理的なリガンド（又は受容体）であってもよいし、アゴニスト活性を有する非生理的なリガンド（又は受容体）であってもよい。サイトカインであってもよい。非生理的なリガンドとして、好ましくはＣＤ３に対する抗体を挙げることができる。抗体は、完全抗体であっても、そのフラグメント（例、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、還元抗体（ｒＩｇＧ）、ｄｓＦｖ、ｓＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ等）であってもよい。サイトカインとしては、IFN-α/β、lFN-γ、lL-2、lL-4、IL-7、lL-12、lL-15、IL-18、IL-21等が挙げられる。
（拡大工程／拡大培養）
　当該工程は、上記のようにして活性化された細胞を増殖する工程である。拡大培養は、活性化された細胞に対する所望の効果が得られる限り特にその方法は限定されず、当業者であれば細胞の数などをモニターしながら適宜調整することが可能である。細胞数を増やすことを目的とする場合、例えば、２日間以上、好ましくは３日間以上、より好ましくは４日間以上、一層好ましくは５日間以上、より一層好ましくは６日間以上、上述の添加成分などを含む培地中で培養することができ、細胞数などをモニターしながら、例えば、７日間以上、９日間以上、１１日間以上も、適宜調整しながら培養することができる。また、活性化培養と拡大培養を交互に繰り返すことで、培養を継続し細胞数を指数的に増やすこともできる。培養期間の上限は特に限定されず、例えば２８日間以下、好ましくは２１日間以下である。例えば、活性化されたＣＡＲ－Ｔ細胞、好ましくは活性化された多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の場合、IL-7、IL-15およびIL-2等のサイトカインを含む培地中で、例えば、２日間以上、好ましくは３日間以上、より好ましくは４日間以上、一層好ましくは５日間以上、より一層好ましくは６日間以上拡大培養することで行うことができる。対象となる細胞が初代Ｔ細胞（特にＣＡＲ－Ｔ細胞）やＮＫ細胞（好ましくは多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞由来）由来ＮＫ細胞（特にＣＡＲ－ＮＫ細胞））であり、細胞数を増やすことを目的とする場合には、IL-7、IL-15、IL-21及びIL-2等のサイトカインを含む培地中で、例えば、２日間以上、好ましくは４日間以上、より好ましくは６日間以上、一層好ましくは８日間以上、より一層好ましくは１０日間以上、更に一層好ましくは１１間日以上、拡大培養することができる。
（２）細胞集団の製造方法（以下、「本発明の製造方法」とも称する）及び該細胞集団を含有してなる医薬（以下、「本発明の医薬」とも称する）
　本発明の製造方法は、所望の細胞の数が拡大された細胞集団の製造方法であり、該方法は、ホウ酸又はその塩を含有する、無血清培地又は低血清培地中で所望の細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む。
　「ホウ酸又はその塩を含有する、無血清培地又は低血清培地」については、上記（１）の本発明の培養方法、本発明の増殖方法で述べたものと同義である。
　所望の細胞とは、その増殖を目的とする細胞であって、上記（１）の「１－１．細胞」の項で例示したものが挙げられるが、好ましくは免疫担当細胞であり、より好ましくはＴ細胞及びＮＫ細胞であり、特に好ましくはＣＡＲ遺伝子が導入されたＴ細胞、即ちＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＡＲ遺伝子が導入されたＮＫ細胞、即ちＣＡＲ－ＮＫ細胞である。多能性幹細胞、好ましくはｉＰＳ細胞由来のＣＡＲ－Ｔ細胞およびＣＡＲ－ＮＫ細胞であることがいっそう好ましく、よりいっそう好ましくは、多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）由来のＣＡＲ－Ｔ細胞である。
　「所望の細胞を含む細胞集団」は、所望の細胞が含まれていればその由来は特に限定されず天然由来のものであっても人為的に調製されたものであってもよい。例えばＴ細胞等の免疫担当細胞が所望される場合には、該細胞集団は、血液（末梢血、臍帯血など）、骨髄液などの体液の他、これらより採取、単離、精製、誘導された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、血球系細胞、造血幹細胞、臍帯血単核球などを含む細胞集団が例示される。これらの細胞は生体から採取されたもの、あるいは生体外での培養を経て得られたもの、例えば本発明の製造方法により得られた細胞集団をそのままもしくは凍結保存したものであってもよい。また、単細胞の細胞集団に限らず、生検による組織塊の切片であってもよいが、好ましくは、単細胞の細胞集団である。液性の細胞集団の場合には、単一組織由来の細胞集団に限らず、異種組織由来の細胞集団の混合系であってもよい。「所望の細胞を含む細胞集団」は、好ましくは免疫担当細胞を含む細胞集団であり、より好ましくはＴ細胞又はＮＫ細胞を含む細胞集団であり、特に好ましくはＣＡＲ遺伝子が導入されたＴ細胞、即ちＣＡＲ－Ｔ細胞を含む細胞集団、又はＣＡＲ遺伝子が導入されたＮＫ細胞、即ちＣＡＲ－ＮＫ細胞を含む細胞集団である。多能性幹細胞、好ましくはｉＰＳ細胞由来のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む細胞集団又は多能性幹細胞、好ましくはｉＰＳ細胞由来のＣＡＲ－ＮＫ細胞を含む細胞集団であることがいっそう好ましい。
　「所望の細胞の数が拡大された（ｅｘｐａｎｄｅｄ）」とは、細胞集団における所望の細胞の数が、拡大される前、または本発明を実施せずに得られた細胞の数のような対照と比較して増加していることを指し、対照と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％増加させることを意味する。本発明の特定の実施形態では、本発明により製造される細胞集団における所望の細胞の数は、対照の細胞の数と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％。１０００％増加するよう、拡大される。
　所望の細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＮＫ細胞の場合、該細胞は、上述のとおり、活性化培養及び拡大培養（必要に応じ回復培養）を経て、その細胞数を増やす、つまり拡大される。拡大培養後は細胞を洗浄、回収する。本発明の培養方法及び増殖方法で培養または増殖した場合、使用する培地が無血清培地又は低血清培地であることから、通常用いられる血清含有培地（血清濃度：５～２０％）を用いて培養、増殖させた場合に比して、洗浄操作が簡便となり、洗浄に要する時間を短縮することができる。
　例えば、細胞を（ｉ）ピペッティングおよび遠心分離処理または（ｉｉ）閉鎖式自動細胞処理装置によって洗浄、回収する場合、血清に含まれるＢＳＡが人への投与許容量に到達するまで（ｉ）ピペッティングおよび遠心分離処理または（ｉｉ）閉鎖系遠心分離／スピニングメンブレンろ過／中空糸膜ろ過などの技術による連続的な自動処理を複数回繰り返す必要がある。この点、本発明の培養方法及び増殖方法で培養または増殖した場合には、複数回繰り返す必要がない（培養系に持ち込まれる血清由来のＢＳＡの量がもともと少ない）。あるいは、血清含有培地（血清濃度：５～２０％）を用いた場合に比して少ない回数の繰り返しにより所望の細胞集団を回収することができる。
　好ましい一態様では、回収操作の前に、拡大培養後の細胞を刺激物質の存在下で培養するステップを行う。このステップによれば、効率的な拡大培養が可能になり、また、細胞の生存率を高める利点もある。所望により、拡大培養後のＣＡＲ－Ｔ細胞集団又はＣＡＲ－ＮＫ細胞集団を、ビーズ分離等を用いた洗浄操作および細胞分離工程に付してもよい。本態様により、より高い効果を有するＣＡＲ－Ｔ細胞集団又はＣＡＲ－ＮＫ細胞集団の純度を高めることができる。本態様においても、本発明の培養方法及び増殖方法で培養または増殖した場合、洗浄操作を簡便なものとすることができ、及び／又は洗浄に要する時間を短縮することができる。
　このように本発明の製造方法によって得られる細胞集団では、所望の細胞の数が拡大されている。
　本発明の製造方法により製造された、「所望の細胞の数が拡大された細胞集団」は該細胞が有する機能に応じて適宜、医薬を製造することができる。該細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＮＫ細胞の場合、本発明の培養方法及び増殖方法により製造されるＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＮＫ細胞を含む細胞集団は、がんの治療、特に、当該ＣＡＲ発現免疫細胞の標的抗原を発現するがんの治療に用いることができる。がんは、固形腫瘍であっても血液腫瘍であってもよい。具体的ながんとしては、各種Ｂ細胞リンパ腫（濾胞性悪性リンパ腫、びまん性大細胞Ｂ細胞性悪性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、血管内Ｂ細胞性リンパ腫、ＣＤ２０陽性ホジキンリンパ腫など）、骨髄増殖性腫瘍、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍（ＣＭＭＬ，ＪＭＭＬ，ＣＭＬ，ＭＤＳ／ＭＰＮ－ＵＣ）、骨髄異形成症候群、急性骨髄生白血病、神経芽腫、脳腫瘍、ユーイング肉腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、メラノーマ、骨軟部肉腫、腎臓がん、膵臓がん、悪性中皮腫、前立腺がん、乳がん、子宮体がん、子宮頚がん、卵巣がん、大腸がん等が挙げられるが、これらに限定されない。好適な実施形態において、がんは、固形腫瘍である。固形腫瘍としては、例えば、神経芽腫、脳腫瘍、ユーイング肉腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、メラノーマ、卵巣がん、横紋筋肉腫、骨軟部肉腫、腎臓がん、膵臓がん、悪性中皮腫、前立腺がん、乳がん、子宮体がん、子宮頚がん、卵巣がん、大腸がん等が挙げられる。
　本発明の医薬は、対象の年齢、体重、体表面積、症状などに応じて適宜決定される治療上有効量で投与される。本開示における対象は、哺乳動物、特に、通常はヒトであり、好ましくはがん患者である。本発明の医薬は、例えば、１回あたり１ｘ１０４個～１ｘ１０１０個で投与されうる。投与経路は、特に限定されず、腫瘍内、腫瘍周辺、脳室内、静脈内、動脈内、門脈内、皮内、皮下、筋肉内、または腹腔内に投与することができる。本開示の細胞集団は、全身投与しても、局所投与してもよく、局所投与としては、目的の組織・臓器・器官への直接注入が挙げられる。投与スケジュールは、対象の年齢、体重、体表面積、症状などに応じて適宜決定され、単回投与であっても、連続的または定期的な複数回投与であってもよい。本発明の医薬は、自家移植に用いてもよく、他家移植に用いてもよい。また、他の医薬と併用してもよい。
　特に、本発明の医薬は、対象に投与すべき細胞集団に加えて、細胞の保護を目的としてジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等、細菌の混入阻止を目的として抗生物質等、細胞の活性化、増殖または分化誘導などを目的とした各種の成分（ビタミン類、サイトカイン、成長因子、ステロイド等）等の成分を含んでもよい。組成物は、常法（例えば、日本薬局方に記載の方法等）により調製することができる。
（３）培地添加剤（以下、「本発明の培地添加剤」とも称する）及び該培地添加剤を添加してなる培地組成物（以下、「本発明の培地組成物」とも称する）
　本発明の培地添加剤は、ホウ酸又はその塩を含有する。本発明の培地添加剤は、無血清培地又は低血清培地に添加する為に用いられる。「ホウ酸又はその塩」については、上記（１）の本発明の培養方法、本発明の増殖方法で述べたものと同義である。培地添加剤に配合されるホウ酸又はその塩の量は、所望の効果が得られる限り特に限定されないが、通常０．０１～１００重量％、好ましくは０．１～１００重量％、より好ましくは１～１００重量％、さらに好ましくは５～１００重量％、特に好ましくは１０～１００重量％で有り得る。
　本発明の培地組成物は、本発明の培地添加剤を無血清培地又は低血清培地に添加してなる培地成分を含む組成物である。ここで、「無血清培地又は低血清培地」は、上記（１）の本発明の培養方法、本発明の増殖方法で述べた「無血清培地又は低血清培地」からホウ酸又はその塩を除いたものと同義である。培地組成物中、ホウ酸又はその塩の濃度が０．１～０．９ｍＭ、好ましくは０．２～０．８ｍＭ、更に好ましくは０．２～０．７ｍＭ、特に好ましくは０．３～０．６ｍＭの範囲となるよう、本発明の培地添加剤を「無血清培地又は低血清培地」に添加する。
　以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は何ら限定されるものではない。使用する試薬及び材料は特に限定されない限り商業的に入手可能であるか、既知文献等によって調製可能である。また、同様の効果、作用を有するものであれば代替可能であることを当業者は理解している。
（略語一覧）
ＢＭＰ－４：bone morphogenetic protein-4
ｂＦＧＦ：basic fibroblast growth factor
ＶＥＧＦ：vascular endothelial growth factor
ＳＣＦ：stem cell factor
ＴＰＯ：thrombopoietin
ＦＬＴ３Ｌ：Fms-related tyrosine kinase 3 ligand
Ｆｃ－ＤＬＬ４：Recombinant Human DLL4 Fc Chimera Protein
ＤＬＬ４：Delta-like protein 4
ＩＬ７：Interleukin-7
ＳＤＦ１α：Stromal cell-derived factor 1α
αＭＥＭ：alpha Modified Eagle Minimum Essential Medium
ＴＣＲ：T-cell receptor
実施例１
１．ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の準備
　京都大学ｉＰＳ細胞研究所（ＣｉＲＡ）から供与されたｉＰＳ細胞 QHJI01S04株にレンチウイルスベクターを用いてＴＣＲ遺伝子を導入した。ＴＣＲ遺伝子が導入されたｉＰＳ細胞をNature Communication 2021; 12: 430に記載された公知の方法を参考に、造血前駆細胞へ分化させた。具体的には、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ４３１５４２、ＢＭＰ－４、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ存在下で４日間培養し、ｉＰＳ細胞を中胚葉に分化誘導させた。さらに造血系サイトカインであるＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌを用いて造血前駆細胞へと分化させた。得られた造血前駆細胞から細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；Cytotoxic T Lymphocyte）への分化は、公知の特許方法（ＷＯ２０１７／２２１９７５）や文献情報（Nature Communication 2021; 12: 430）に準じて行った。具体的には、得られた造血前駆細胞のうち、磁気ビーズ（Myltenyi Biotec）を用いてＣＤ３４陽性細胞を純化し、Ｆｃ－ＤＬＬ４とＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Recombinant Human Fibronectin Fragment, TakaraBio）を固相化したプレート上で、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ７、ＳＤＦ１α、ＳＢ２０３５８０を含んだαＭＥＭ培地中で、３週間培養した。得られたＴＣＲ陽性のＣＴＬに対して、レトロウイルスベクターを用いて特定の抗原を認識するＣＡＲ遺伝子を導入した。以下においては、該細胞を液体窒素にて凍結保存した細胞をｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞として使用した。
２．ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の回復培養
　ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞を、１５％ Fetal Bovine Serum（ＦＢＳ）を含むＩＭＤＭ培地に表１の「回復培養培地」の欄に示す添加剤を加えた培地で５００，０００細胞／ｍＬとなるように懸濁し、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍ（Wilson Wolf）に播種して、５％ＣＯ２／３７℃下で３日間培養した。
３．試薬、抗体
　レトロネクチン（商品名）は、タカラバイオ社から購入した。抗ＣＤ３アゴニスト抗体には、タカラバイオ社から購入したAnti-CD3 mAb GMP grade, Anti-CD3 monoclonal antibody（Ｃｌｏｎｅ：ＯＫＴ３）を用いた。
４．抗ＣＤ３アゴニスト抗体およびレトロネクチン（商品名）の培養プレートへの固相化
　必要な濃度でＰＢＳに溶解した抗ＣＤ３アゴニスト抗体（ＯＫＴ３、最終濃度３μｇ／ｍＬ）およびレトロネクチン（商品名）（最終濃度１５０μｇ／ｍＬ）をＴ２２５フラスコに添加した後、４℃下一晩静置した。ＰＢＳで洗浄した後に試験に供した。
５．ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化培養
　回復培養後のｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞を、１５％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地に表１の「活性化培養培地」の欄に示す添加剤を加えた培地で、１３３，３３３細胞／ｍＬとなるように懸濁し、抗ＣＤ３アゴニスト抗体（ＯＫＴ３）とレトロネクチン（商品名）が固相化されたＴ２２５フラスコに播種して、５％ＣＯ２／３７℃下で３日間培養した。
６．ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の２種類の１％ＦＢＳ含有培地での拡大培養
　１％ＦＢＳを添加したAdvanced DMEM/F12培地（Thermo Fisher）に表１の「拡大培養培地」の欄に示す添加物をさらに加えた培地、及びそれにさらに０．３ｍＭホウ酸（Sigma-Aldrich）を加えた計２種類の拡大培養培地（０ｍＭホウ酸添加培地と０．３ｍＭホウ酸添加培地）を調製した。活性化培養３日後にＴ２２５フラスコから細胞を回収し、それぞれ２種類の拡大培養培地に４０，０００細胞／ｍＬとなるように細胞を懸濁し、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍ（Wilson Wolf）を用いて、５％ＣＯ２／３７℃下で培養した。その後、培養５日目に一部の細胞をＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍから回収して細胞数を計測し、それぞれの培地で培地交換を行った。培養６日目に一部の細胞をＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍから回収して細胞数を計測した。培養７日目は一部の細胞をプレートから回収して細胞数を計測し、それぞれの培地を含むＧ－Ｒｅｘ（登録商標）２４穴プレート（Wilson Wolf）に１，３７５，０００細胞／ｍＬで播種した。その後、培養１０日目に一部の細胞をＧ－Ｒｅｘ（登録商標）２４穴プレートから回収して細胞数を計測し、それぞれの培地を含むＧ－Ｒｅｘ（登録商標）２４穴プレート（Wilson Wolf）に５０，０００細胞／ｍＬで播種した。培養１２日、１４日目も同様に一部の細胞をＧ－Ｒｅｘ（登録商標）２４穴プレートから回収して細胞数を計測し、それぞれの培地で培地交換を行った。
試験例１
１％ＦＢＳ含有培地における０．３ｍＭホウ酸の添加効果を検証する増殖試験
　実施例１の項目６．の拡大培養においてｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の、培養３日、５日、６日、７日、１２日、１４日目の細胞数と生存率を計測した。拡大培養０日目からの細胞の増殖倍率を図１に示した。ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞は、１％ＦＢＳ含有培地において０．３ｍＭホウ酸を培地に添加することで増殖が亢進した（図１）。
実施例２
１．ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の回復培養
　ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞を、１５％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地に表２の「回復培養培地」の欄に示す添加剤を加えた培地で５００，０００細胞／ｍＬとなるように懸濁し、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍ（Wilson Wolf）に播種して、５％ＣＯ２／３７℃下で３日間培養した。
２．試薬、抗体
　レトロネクチン（商品名）は、タカラバイオ社から購入した。抗ＣＤ３アゴニスト抗体には、タカラバイオ社から購入したAnti-CD3 mAb GMP grade, Anti-CD3 monoclonal antibody（Ｃｌｏｎｅ：ＯＫＴ３）を用いた。
３．抗ＣＤ３アゴニスト抗体およびレトロネクチン（商品名）の培養プレートへの固相化
　必要な濃度でＰＢＳに溶解した抗ＣＤ３アゴニスト抗体（ＯＫＴ３、最終濃度３μｇ／ｍＬ）およびレトロネクチン（商品名）（最終濃度１５０μｇ／ｍＬ）をＴ２２５フラスコに添加した後、４℃下で一晩静置した。ＰＢＳで洗浄した後に試験に供した。
４．ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化培養
　回復培養後のｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞を、１５％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地に表２の「活性化培養培地」の欄に示す添加剤を加えた培地で１３３，３３３細胞／ｍＬとなるように懸濁し、抗ＣＤ３アゴニスト抗体（ＯＫＴ３）とレトロネクチン（商品名）が固相化されたＴ２２５フラスコに播種して、５％ＣＯ２／３７℃下で３日間培養した。
５．ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の２種類の無血清培地での拡大培養
　Advanced DMEM/F12培地に表２の「拡大培養培地」の欄で示した添加物を添加した拡大培養培地（ホウ酸無添加）と、さらにホウ酸を０．３ｍＭ加えた培地の計２種類の拡大培養培地を調製した。活性化培養３日後にＴ２２５フラスコから細胞を回収し、それぞれ２種類の拡大培養培地に４０，０００細胞／ｍＬとなるように懸濁し、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍ（Wilson Wolf）を用いて、５％ＣＯ２／３７℃下で培養した。その後、培養５日目に一部の細胞をＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍから回収して細胞数を計測し、それぞれの培地で培地交換を行った。培養７日、１０日目は同様の方法で細胞を計測した後、５０，０００細胞／ｍＬでＧ－Ｒｅｘ（登録商標）２４穴プレートに播種し、それぞれの培地で培養した。培養１２日、１４日目も同様に一部の細胞をプレートから回収して細胞数を計測し、それぞれの培地で培地交換を行った。
試験例２
　無血清の拡大培養培地におけるホウ酸の添加効果を検証する増殖試験
　無血清の拡大培養培地におけるホウ酸の添加の影響を検証するために、実施例２の項目５．の拡大培養においてｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の、培養３日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１４日目の細胞数と生存率を計測した。拡大培養０日目からの細胞の増殖倍率を図２に示した。ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞は、無血清培地において０．３ｍＭホウ酸を培地に添加することで増殖が亢進した（図２）。
実施例３
１．ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の回復培養
　ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞を、１５％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地に表３の「回復培養培地」の欄に示す添加剤を加えた培地で５００，０００細胞／ｍＬとなるように懸濁し、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍ（Wilson Wolf）に播種して、５％ＣＯ２／３７℃下で３日間培養した。
２．試薬、抗体
　レトロネクチン（商品名）は、タカラバイオ社から購入した。抗ＣＤ３アゴニスト抗体には、タカラバイオ社から購入したAnti-CD3 mAb GMP grade, Anti-CD3 monoclonal antibody（Ｃｌｏｎｅ：ＯＫＴ３）を用いた。
３．抗ＣＤ３アゴニスト抗体およびレトロネクチン（商品名）の培養プレートへの固相化
　必要な濃度でＰＢＳに溶解した抗ＣＤ３アゴニスト抗体（ＯＫＴ３、最終濃度３μｇ／ｍＬ）およびレトロネクチン（商品名）（最終濃度１５０μｇ／ｍＬ）をＴ２２５フラスコに添加した後、４℃下で一晩静置した。ＰＢＳで洗浄した後に試験に供した。
４．ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化培養
　回復培養後のｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞を、１５％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地に表３の「活性化培養培地」の欄に示す添加剤を加えた培地で１３３，３３３細胞／ｍＬとなるように懸濁し、抗ＣＤ３アゴニスト抗体（ＯＫＴ３）とレトロネクチン（商品名）が固相化されたＴ２２５フラスコに播種して、５％ＣＯ２／３７℃下で３日間培養した。
５．ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の５種類の無血清培地での拡大培養
　Advanced DMEM/F12培地に表３の「拡大培養培地」の欄で示した添加物を添加し、さらにホウ酸をそれぞれ０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．６ｍＭ、０．９ｍＭ加えた５種類の拡大培養培地を調製した。活性化培養３日後にＴ２２５フラスコから細胞を回収し、それぞれの拡大培養培地に５０，０００細胞／ｍＬとなるように懸濁し、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）２４穴プレート（Wilson Wolf）を用いて、５％ＣＯ２／３７℃下で培養した。その後、培養５日目に一部の細胞をＧ－Ｒｅｘ（登録商標）２４穴プレートから回収して細胞数を計測し、それぞれの培地で培地交換を行った。培養７日目は同様の方法で細胞を計測した後、５０，０００細胞／ｍＬで新たなＧ－Ｒｅｘ（登録商標）２４穴プレートに播種し、それぞれの培地で培養した。培養１０日、１２日目も同様に一部の細胞をプレートから回収して細胞数を計測し、それぞれの培地で培地交換を行った。
試験例３
　無血清の拡大培養培地にホウ酸を異なる濃度で添加したときのｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖試験
　無血清の拡大培養培地における至適なホウ酸の添加濃度を検証するために、実施例３の項目５．の拡大培養においてｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞数を経時的に計測した。拡大培養０日目からの細胞の増殖倍率を図３に示した。ホウ酸の最終濃度０．３ｍＭから０．６ｍＭの範囲で増殖倍率が最大になった。またホウ酸濃度０．２ｍＭから０．９ｍＭの範囲では細胞生存率に影響を与えないことが確認された（図３）。
実施例４
１．ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の回復培養
　ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞を、１５％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地に表４の「回復培養培地」の欄に示す添加剤を加えた培地で５００，０００細胞／ｍＬとなるように懸濁し、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍ（Wilson Wolf）に播種して、５％ＣＯ２／３７℃下で３日間培養した。
２．試薬、抗体
　レトロネクチン（商品名）は、タカラバイオ社から購入した。抗ＣＤ３アゴニスト抗体には、タカラバイオ社から購入したAnti-CD3 mAb GMP grade, Anti-CD3 monoclonal antibody（Ｃｌｏｎｅ：ＯＫＴ３）を用いた。
３．抗ＣＤ３アゴニスト抗体およびレトロネクチン（商品名）の培養プレートへの固相化
　必要な濃度でＰＢＳに溶解した抗ＣＤ３アゴニスト抗体（ＯＫＴ３、最終濃度３μｇ／ｍＬ）およびレトロネクチン（商品名）（最終濃度１５０μｇ／ｍＬ）をＴ２２５フラスコに添加した後、４℃下一晩静置した。ＰＢＳで洗浄した後に試験に供した。
４．ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化培養
　回復培養後のｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞を、１５％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地に表４の「活性化培養培地」の欄に示す添加剤を加えた培地で、１３３，３３３細胞／ｍＬとなるように懸濁し、抗ＣＤ３アゴニスト抗体（ＯＫＴ３）とレトロネクチン（商品名）が固相化されたＴ２２５フラスコに播種して、５％ＣＯ２／３７℃下で３日間培養した。
５．ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の５種類の無血清培地における拡大培養
　Advanced DMEM/F12培地（Thermo Fisher）に表４の「拡大培養培地」の欄に示す添加物を加えた拡大培養培地と、さらにそれぞれ、０．３ｍＭホウ酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．３ｍＭホウ酸と１×ＩＴＳ－Ｘ（(Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine Supplements)Ｇｉｂｃｏ）、０．３ｍＭホウ酸と１×ＩＴＳ－Ｘと１ｍＭタウリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．３ｍＭホウ酸と１×ＩＴＳ－Ｘと３ｍＭタウリンを加えた計５種類の拡大培養培地（表４の添加物のみ、表４の添加物＋０．３ｍＭホウ酸添加培地、表４の添加物＋０．３ｍＭホウ酸＋ＩＴＳ－Ｘ添加培地、表４の添加物＋０．３ｍＭホウ酸＋ＩＴＳ－Ｘ＋１ｍＭタウリン添加培地、表４の添加物＋０．３ｍＭホウ酸＋ＩＴＳ－Ｘ＋３ｍＭタウリン添加培地）を調製した。活性化培養３日後にＴ２２５フラスコから細胞を回収し、それぞれの拡大培養培地に４０，０００細胞／ｍＬとなるように細胞を懸濁し、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍ（Wilson Wolf）を用いて、５％ＣＯ２／３７℃下で培養した。その後、培養５日目に一部の細胞をＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍから回収して細胞数を計測し、それぞれの培地で培地交換を行った。培養６日目に一部の細胞をＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１０Ｍから回収して細胞数を計測した。培養７日、１０日目は一部の細胞をプレートから回収して細胞数を計測し、それぞれの培地を含むＧ－Ｒｅｘ（登録商標）２４穴プレート（Wilson Wolf）に５０，０００細胞／ｍＬで播種した。培養１２日、１４日目も同様に一部の細胞をＧ－Ｒｅｘ（登録商標）２４穴プレートから回収して細胞数を計測し、それぞれの培地で培地交換を行った。
試験例４
　０．３ｍＭホウ酸含有無血清培地におけるＩＴＳ－Ｘ及びタウリンの添加剤効果を検証する増殖試験
　実施例４の項目５．の拡大培養においてｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の、培養後３日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１４日目の細胞数と生存率を計測した。拡大培養０日目からの細胞の増殖倍率を図４に示した。ｉＰＳ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞は、０．３ｍＭホウ酸含有無血清培地に１×ＩＴＳ－Ｘと１ｍＭまたは３ｍＭのタウリンをさらに添加することで増殖が亢進し（図４）、１ｍＭまたは３ｍＭのタウリンを添加することで生存率が１～４％向上した（表５）。
実施例５
１．ヒト由来初代Ｔ細胞の活性化培養
　ヒト由来初代Ｔ細胞（Leukopak-SoloPak、Charles River Laboratories Cell Solutions社）を、２％CTS Immune Cell SR （Thermo Fisher）を含むOpTmizer培地（Thermo Fisher）に表６の活性化培養培地に示す添加物を加えた培地で１，０００，０００細胞／ｍＬとなるように懸濁し、ＰＬ２４０　ｂａｇ（OriGen）に播種して、５％ＣＯ２／３７℃下で２日間培養した。
２．試薬
　レトロネクチン（商品名）は、タカラバイオ社から購入した。
３．レトロネクチン（商品名）およびレトロウイルスの培養プレートへの固相化
　必要な濃度でＰＢＳに溶解したレトロネクチン（最終濃度１５０μｇ／ｍＬ）をＰＬ１２０　ｂａｇに添加した後、室温で２時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、レトロウイルス溶液を加え、５０ｒｐｍで揺らしながら４℃下一晩固相化させた。１．５％ＨＳＡを含むＰＢＳで洗浄した後に試験に供した。
４．ヒト由来初代Ｔ細胞への形質導入培養
　活性化培養後のヒト由来初代Ｔ細胞を、２％CTS Immune Cell SRを含むOpTmizer培地に表６の形質導入培養培地に示す添加剤を加えた培地で、７２２，２２２細胞／ｍＬとなるように懸濁し、レトロネクチン（商品名）と特定の抗原を認識するＣＡＲ遺伝子を含むレトロウイルスベクターが固相化されたＰＬ１２０　ｂａｇに播種して、５％ＣＯ２／３７℃下で１日間培養した。
５．ヒト由来初代Ｔ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の４種類の無血清培地での拡大培養
　２％CTS Immune Cell SRを含むOpTmizer培地に表６の拡大培養培地１に示す添加物を加えた拡大培養培地、表７に記載の成分を含有する培地（以下、ＢＭ２２０７２０と称する）に表６の拡大培養培地２に示す添加物を加えた拡大培養培地、そこにさらに０．３ｍＭホウ酸（Sigma-Aldrich）又は０．３ｍＭホウ酸と３ｍＭタウリン（Sigma-Aldrich）を加えた計４種類の拡大培養培地（OpTmizer培地に表６の添加物のみ、ＢＭ２２０７２０培地に（ｉ）表６の添加物のみ、（ｉｉ）表６の添加物＋０．３ｍＭホウ酸、（ｉｉｉ）表６の添加物＋０．３ｍＭホウ酸＋３ｍＭタウリンのいずれかを添加した培地）を調製した。形質導入培養１日後にＰＬ１２０　ｂａｇから細胞を回収し、それぞれの拡大培養培地に２２０，０００細胞／ｍＬとなるように細胞を懸濁し、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）６Ｍ（Wilson Wolf）を用いて、５％ＣＯ２／３７℃下で培養した。その後、培養７日目に一部の細胞をＧ－Ｒｅｘ（登録商標）６Ｍから回収して細胞数を計測し、それぞれの培地に４０ＩＵ分のＩＬ－２を添加した。培養９日目は一部の細胞をＧ－Ｒｅｘ（登録商標）６Ｍから回収して細胞数を計測し、それぞれの培地を含む新たなＧ－Ｒｅｘ（登録商標）６Ｍに２２０，０００細胞／ｍＬで播種した。培養１３日、１４日目も同様に一部の細胞をＧ－Ｒｅｘ（登録商標）６Ｍから回収して細胞数を計測した。
試験例５
ヒト由来初代Ｔ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞に対するホウ酸及びタウリンの添加効果を検証する増殖試験
　異なる細胞種（ヒト由来初代Ｔ細胞）に対する、無血清の拡大培養培地におけるホウ酸及びタウリン添加の影響を検証するために実施例５の項目５．の拡大培養においてヒト由来初代Ｔ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の、４日、６日、１０日、１１日目の細胞数と生存率を計測した。拡大培養０日目からの細胞の増殖倍率を図５に示した。ヒト由来初代Ｔ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞は、無血清培地に０．３ｍＭホウ酸、又は０．３ｍＭホウ酸に３ｍＭのタウリンをさらに添加することで増殖が亢進した（図５）。
実施例６
１．ｉＰＳ細胞由来ＮＫ細胞の準備
　京都大学ｉＰＳ細胞研究所（ＣｉＲＡ）から供与されたｉＰＳ細胞ＦｆＩ０１ｓ０４株を用いて公知の方法（例えばＷＯ２０２１／１７４００４に記載の方法）に準じて、ＮＫ細胞へ分化させた。得られた細胞を液体窒素にて凍結保存した細胞をｉＰＳ細胞由来ＮＫ細胞として使用した。
２．ｉＰＳ細胞由来ＮＫ細胞の回復培養
　ｉＰＳ細胞由来ＮＫ細胞を、１５％ Fetal Bovine Serum（ＦＢＳ）を含むＩＭＤＭ培地（Thermo Fisher Scientific）に表８に示す添加物を加えた回復培養培地で１．２５×１０５細胞／ｍＬとなるように懸濁し、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）６穴プレート（Wilson Wolf）に播種して、５％ＣＯ２／３７℃インキュベーター内で３日間培養した（培養０～３日目）。
３．ｉＰＳ細胞由来ＮＫ細胞の活性化培養
　回復培養後のｉＰＳ細胞由来ＮＫ細胞を、１５％ Fetal Bovine Serum（ＦＢＳ）を含むＩＭＤＭ培地（Thermo Fisher Scientific）に表９に示す添加物を加えた活性化培養培地で１．８４×１０５細胞／ｍＬとなるように懸濁し、６穴プレート（ＴＰＰ）に播種して、５％ＣＯ２／３７℃インキュベーター内で３日間培養した（培養３～６日目）。
４．ｉＰＳ細胞由来ＮＫ細胞の５種類の無血清培地での拡大培養
　３日後、表７のＢＭ２２０７２０培地に、２ｇ／Ｌのヒト血清アルブミン（アルブミナー（商品名）、CSL Behring）を加えた基礎培地と、その基礎培地にさらにそれぞれ０．３ｍＭホウ酸（Sigma Aldrich）、０．３ｍＭホウ酸＋１ｍＭタウリン（Sigma Aldrich）、０．３ｍＭホウ酸＋３ｍＭタウリンを加えた４種類の基礎培地、並びにＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Lonza）１種類を加えた合計５種類の基礎培地に表９の添加物を加えて５種類の拡大培養培地とした。３日間活性化培養した細胞を５種類それぞれの拡大培養培地に１．２５×１０５細胞／ｍＬとなるように懸濁し、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）２４穴プレート（Wilson Wolf）に再播種し、５％ＣＯ２／３７℃インキュベーター内で２日間培養した（培養６～８日目）。
　２日後、上記５種類の基礎培地に表１０に示す添加物を加えた培地へ交換し、５％ＣＯ２／３７℃インキュベーター内で２日間培養した（培養８～１０日目）。
　その後、２～３日に一度、同培地にて１．２５×１０５細胞／ｍＬとなるようにＧ－Ｒｅｘ（登録商標）２４穴プレート（Ｗｉｌｓｏｎ　Ｗｏｌｆ）に再播種し、５％ＣＯ２／３７℃インキュベーター内で培養１７日目まで培養を続けた。
試験例６
ｉＰＳ細胞由来ＮＫ細胞に対するホウ酸及びタウリンの添加剤効果を検証する増殖試験 
　ｉＰＳ細胞由来ＮＫ細胞に対する、無血清の拡大培養培地におけるホウ酸及びタウリン添加の影響を検証するために実施例６の項目４．の拡大培養においてｉＰＳ細胞由来ＮＫ細胞の細胞数と生存率を経時的に計測した。拡大培養１１日目の増殖倍率と細胞生存率を表１１に示した。ｉＰＳ細胞由来ＮＫ細胞は、無血清の基礎培地に０．３ｍＭホウ酸と１ｍＭのタウリンまたは３ｍＭのタウリンをさらに添加することで増殖が亢進した（表１１）。
　本発明によれば、無血清培地又は低血清培地を用いた場合でも、血清含有培地での培養に匹敵する細胞増殖維持・促進効果を得ることができる。特に、細胞の洗浄等の操作に対するストレスに弱い細胞は、強い洗浄を必要としない無血清培地又は低血清培地での培養が好ましく、そのような状況下での培養に適している。
　本出願は、日本で出願された特願２０２２－１０２９８６（出願日：２０２２年６月２７日）を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (27)

  1. 　ホウ酸又はその塩を含有する、無血清培地又は低血清培地中で細胞を培養する工程を含む、細胞の培養方法。
  2. 　ホウ酸又はその塩の培地中の最終濃度が０．１～０．９ｍＭである、請求項１記載の方法。
  3. 　ホウ酸又はその塩の培地中の最終濃度が０．３～０．６ｍＭである、請求項１記載の方法。
  4. 　前記無血清培地又は低血清培地が無血清培地である、請求項１記載の方法。
  5. 　細胞が、免疫担当細胞である、請求項１記載の方法。
  6. 　免疫担当細胞が、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びナチュラルキラー細胞から選択される、請求項５記載の方法。
  7. 　免疫担当細胞がＴ細胞である、請求項６記載の方法。
  8. 　細胞が多能性幹細胞由来である、請求項１記載の方法。
  9. 　多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項８記載の方法。
  10. 　前記培地がさらにタウリンを含有する、請求項１記載の方法。
  11. 　ホウ酸又はその塩を含有する、無血清培地又は低血清培地中で細胞を培養する工程を含む、細胞の増殖方法。
  12. 　前記無血清培地又は低血清培地が無血清培地である、請求項１１記載の方法。
  13. 　前記培地がさらにタウリンを含有する、請求項１１記載の方法。
  14. 　所望の細胞の数が拡大された細胞集団の製造方法であって、ホウ酸又はその塩を含有する、無血清培地又は低血清培地中で所望の細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む、方法。
  15. 　前記無血清培地又は低血清培地が無血清培地である、請求項１４記載の方法。
  16. 　前記培地がさらにタウリンを含有する、請求項１４記載の方法。
  17. 　請求項１４に記載の方法によって得られた細胞集団を含有してなる、医薬。
  18. 　がんの予防及び／又は治療に用いるための、請求項１７記載の医薬。
  19. 　ホウ酸又はその塩を含有する培地添加剤であって、該培地が無血清培地又は低血清培地であることを特徴とする、剤。
  20. 　前記無血清培地又は低血清培地が無血清培地である、請求項１９記載の剤。
  21. 　前記培地がさらにタウリンを含有する、請求項１９記載の剤。
  22. 　請求項１９に記載の培地添加剤を無血清培地又は低血清培地に添加してなる、ホウ酸又はその塩を含有する培地組成物。
  23. 　前記無血清培地又は低血清培地が無血清培地である、請求項２２記載の培地組成物。
  24. 　さらにタウリンを含有する、請求項２２記載の培地組成物。
  25. 　請求項１４に記載の方法によって得られた細胞集団を、それを必要とする対象に投与することを含む、がんの予防及び／又は治療方法。
  26. 　がんの予防及び／又は治療において使用するための、請求項１４に記載の方法によって得られた細胞集団。
  27. 　がんを予防及び／又は治療するための医薬の製造における、請求項１４に記載の方法によって得られた細胞集団の使用。
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