JP2014521337A - 幹細胞由来の組織細胞中の代謝成熟 - Google Patents
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Abstract
Description
(発明の背景)
1.技術分野
胎児期の間、組織は、代謝のための一次エネルギー源として解糖を主に利用する(非特許文献1)。心臓および肝臓を含む多くの組織の周産期発生の間、代謝の基本的形態は、脂肪酸酸化(FAO)に切り替わり、それは次いで、クエン酸回路(TCA回路)の中間体を提供する。培地のほとんどは、一般に好気的呼吸またはミトコンドリアに依存することがほとんどなく、急速に成長し、主に解糖を通してエネルギーを生成するように代謝的に適合される、不死化した腫瘍由来の細胞株に対して設計される。したがって、ヒト胚幹細胞(hESC)およびヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)由来の細胞型の代謝成熟状態を改善するために、例えば、解糖とは対照的に、好気的呼吸およびその関連流入経路を促進することが必要である。
I.本発明の例示的な培地およびその使用
II.幹細胞由来の組織型
III.代謝成熟度を特徴付けるための方法
心筋細胞の特性化
心臓トロポニンT(cTnT);Nkx2.5、発達中の心臓中で持続する、初期マウス胚発達中の心臓中胚葉で発現する心臓転写因子;心房性ナトリウム利尿因子(ANF、発達中の心臓および胎児心筋細胞で発現させられるが、成人において下方制御される、ホルモン。それは、骨格筋細胞ではなく、心臓細胞において高度に特異的な方法で発現させられるため、心筋細胞に対する良好なマーカーと見なされる);ミオシン重鎖(MHC)、特に、心臓特異的であるβ鎖;チチン;トロポミオシン;α−サルコメアアクチニン;デスミン;GATA−4(心臓中胚葉で高度に発現させられ、発達中の心臓中で持続する転写因子。それは、多くの心臓遺伝子を調節し、心臓発生に関与する);MEF−2A、MEF−2B、MEF−2C、および/もしくはMEF−2D(心臓中胚葉で発現させられ、発達中の心臓中で持続する転写因子);心臓細胞間の付着を仲介する、N−カドヘリン;心筋細胞間のギャップ結合を形成する、コネキシン43;β1−アドレナリン受容体(β1−AR);心筋梗塞の後に血清中で上昇する、クレアチンキナーゼMB(CK−MB)および/またはミオグロビン;α−心臓アクチン、初期成長反応−I;ならびに/またはサイクリンD2を含んでもよい。
IV.実施例
A.胚幹細胞
B.誘導多能性幹細胞
C.誘導多能性幹細胞
V.細胞の遺伝子組み換え
VI.培養された心筋細胞の使用
VII.本発明のキット
実施例1
SF8培地は、IPSC由来の心筋細胞のET−1 BNP反応を改善した
実験計画
実験1
実験2、3、4:
実施例2
心筋細胞および肝細胞機能アッセイの実施例は、細胞の代謝成熟によって決まる
肝脂肪変性の細胞アッセイ:
hESCまたはhiPSC由来の肝毒性アッセイ:
乳酸脱水素酵素活性アッセイ:
参考文献
本明細書で言及される全ての特許および出版物は、本発明が関係する当業者のレベルを示す。個々の出版物のそれぞれが、参照によって組み込まれることを明確かつ個々に示された場合と同程度に、全ての特許および出版物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特許および特許出願
米国出願第12/478,154号
米国出願第12/723,063号
米国出願第12/735,060号
米国出願第61/184,546号
米国特許第5,843,780号
米国特許第6,200,806号
米国特許第6,833,269号
米国特許第7,029,913号
米国特許出願公開第2002/0168766号
米国特許出願公開第2003/0022367号
米国特許出願公開第2011/0097799号
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本発明およびその利点が詳細に記載されてきたが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の変更、置き換え、および修正が行われ得ることが理解される。さらに、本願の範囲は、本明細書に記載される工程、機械、製造、物質の組成物、手段、方法、およびステップの特定の実施形態に限定されることを目的としていない。当業者が本発明の開示から容易に理解するように、本明細書に記載される、対応する実施形態と実質的に同一の機能を果たすか、または実質的に同一の結果をもたらす、現在存在するか、または後に開発される工程、機械、製造、物質の組成物、手段、方法、またはステップが、本発明に従って利用され得る。したがって、添付の特許請求の範囲は、かかる工程、機械、製造、物質の組成物、手段、方法、またはステップをそれらの範囲内に含むよう意図される。
Claims (24)
- 幹細胞由来の細胞の代謝成熟度状態を改善する方法であって、本質的にグルコースを含まず、本質的に血清を含まず、1つ以上の脂肪酸を含む、定義された培地に、前記幹細胞由来の細胞を曝露し、それにより前記細胞の前記代謝成熟度状態を改善するステップを含む、方法。
- 前記定義された培地は、以下の成分のうちの1つ以上を含む、請求項1に記載の方法。
a)クレアチン、
b)L−カルニチン、
c)タウリン、
d)L−グルタミン、
e)ITS−A、および
f)非必須アミノ酸。 - 前記定義された培地は、ピルビン酸塩、β−メルカプトエタノール、またはオレイン酸のうちの1つ以上を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記培地はさらに、1つ以上の抗酸化物質を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記抗酸化物質は、ビタミンA、β−カロテン、ビタミンCおよびE、セレン、ならびにメラトニンからなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記培地はさらに、1つ以上のフリーラジカル捕捉剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記フリーラジカル捕捉剤は、アスコルビン酸、ビタミンE、およびβ−カロテンからなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記幹細胞由来の細胞は、肝細胞または心筋細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞は、遺伝子組み換えが行われている、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞は、1つ以上の好気的呼吸酵素の発現を強化するように、1つ以上の好気的呼吸基質の利用可能性を強化するように、および/または1つ以上の好気的呼吸酵素の機能もしくは発現を調節もしくは増強させるタンパク質の発現を強化するように、遺伝子組み換えが行われている、請求項9に記載の方法。
- 前記細胞は、脂肪酸トランスロカーゼ(Cd36)、原形質膜関連脂肪酸結合タンパク質、脂肪酸輸送タンパク質(FATP1、FATP2、FATP3、FATP4、FATP5、および/またはFATP6)、アシル‐CoAシンテターゼ、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ1(CPT1)、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ2(CPT2)、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)α、PPARβ、ならびにPPARδからなる群から選択される、1つ以上のタンパク質の発現を増加させるように、遺伝子組み換えが行われている、請求項10に記載の方法。
- 前記細胞は、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ペルオキシダーゼ、メチオニンレダクターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される酵素を発現させるように、遺伝子組み換えが行われている、請求項9に記載の方法。
- 前記曝露するステップはさらに、前記幹細胞由来の細胞の遺伝子組み換えを行うものとして定義される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞は、1つ以上の好気的呼吸酵素、1つ以上の好気的呼吸基質の発現を強化するように、および/または1つ以上の好気的呼吸酵素の機能もしくは発現を調節もしくは増強させるタンパク質の発現を強化するように、遺伝子組み換えが行われている、請求項13に記載の方法。
- 前記1つ以上の好気的呼吸酵素は、脂肪酸トランスロカーゼ(Cd36)、原形質膜関連脂肪酸結合タンパク質、脂肪酸輸送タンパク質(FATP1、FATP2、FATP3、FATP4、FATP5、および/またはFATP6)、アシル‐CoAシンテターゼ、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ1(CPT1)、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ2(CPT2)、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)α、PPARβ、ならびにPPARδからなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記細胞は、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ペルオキシダーゼ、メチオニンレダクターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される酵素を発現させるように、遺伝子組み換えが行われている、請求項13に記載の方法。
- 前記幹細胞由来の細胞は、少なくとも4日間、前記培地中で培養される、請求項1に記載の方法。
- 前記曝露するステップに続いて、前記方法はさらに、1つ以上の特性に対して、前記幹細胞由来の細胞を分析するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 測定されている前記1つ以上の特性は、前記細胞の代謝成熟度状態を必要とするか、またはそれによって強化される、請求項18に記載の方法。
- 前記1つ以上の特性は、1つ以上の遺伝子の発現又は細胞機能アッセイにおける反応を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記遺伝子は、CPT1、PPARa、NPPA、およびNPPbからなる群から選択される、請求項20に記載の方法。
- 幹細胞由来の細胞の代謝成熟度状態を改善する方法であって、解糖から好気的呼吸へ前記細胞の前記代謝を変換する条件に前記幹細胞由来の細胞を曝露し、それにより、前記細胞の前記代謝成熟度状態を改善するステップを含む、方法。
- 前記曝露するステップはさらに、本質的にグルコースを含まず、本質的に血清を含まず、1つ以上の脂肪酸を含む、定義された培地中で、前記細胞を培養するものとして定義される、請求項22に記載の方法。
- 前記定義された培地は、以下の特性のうちの1つ以上を有する、請求項23に記載の方法。
a)クレアチン、
b)L−カルニチン、
c)タウリン、
d)L−グルタミン、
e)ITS−A、及び
f)非必須アミノ酸
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