CN113755553A

CN113755553A - 心肌细胞培养基及其用于药物心脏毒性筛查的方法与应用

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Publication number: CN113755553A
Application number: CN202110979469.4A
Authority: CN
Inventors: 夏伟荣; 王倩; 陈涛涛; 王嘉显
Original assignee: Help Stem Cell Innovations Co ltd
Current assignee: Help Stem Cell Innovations Co ltd
Priority date: 2021-08-25
Filing date: 2021-08-25
Publication date: 2021-12-07

Abstract

本发明涉及生物技术领域,具体涉及心肌细胞培养基及其用于药物心脏毒性筛查方法与应用。本发明公开的心肌细胞培养基，在基础培养基中加入特定物质作为添加剂，当添加剂满足一定浓度范围时，使心肌细胞具有较成熟的电生理状态。另外本发明提供一种心肌细胞用于药物心脏毒性筛查的方法与应用。本发明中培养基配方的各组分明确，用于药物心脏毒性筛查时，药物的心脏毒性检测结果更加稳定。

Description

心肌细胞培养基及其用于药物心脏毒性筛查的方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种能够增强药物心脏毒性筛查准确性的培养基与筛查方法，及其所述心肌细胞培养基培养的心肌细胞在药物心脏毒性筛查中的应用。

背景技术

诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)技术是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞。其具有与胚胎干细胞相似的自我更新能力和多向分化潜能，但是避免了胚胎干细胞一直以来面临的伦理争议，诱导多能干细胞技术是干细胞研究领域的一项重大突破。日本科学家山中伸弥(ShinyaYamanaka)凭借对该技术的贡献获得诺贝尔生理学和医学奖。

iPS技术的不断发展，使体细胞重编程为诱导多能干细胞的效率大幅度提高，进一步促进了诱导性多能干细胞的产业应用。总所周知，新药上市后，如果出现毒性反应，将会被召回。在新药召回事件中，由于心脏毒性被召回的药物占42％，排第一位。为了避免由于心脏毒副作用引起的药物召回事件，FDA于 2003年将hERG试验作为临床前药物心脏毒性检测的新标准。系统通过hERG试验降低由于心脏毒性所引起的药物召回，但是由于hERG试验只检测了候选化合物对单一hERG钾离子通道的影响，在药物心脏毒性筛查方面有很大局限性，在一定程度上会阻碍新药的研发。美国FDA在2013年底启动了Comprehensive invitro Proarrhythmia Assay(CiPA)项目，旨在建立临床前药物心血管危险性评估的新体系和新标准，其最终的目标是提高临床前药物筛选的精准性和有效性，同时让绝大多数新药可以免于做QT人体临床试验，达到降低新药研发费用的目的。CiPA项目中的一个重要组成部分是将干细胞诱导分化的人源心肌细胞作为临床前心脏毒性筛查的标准之一。

诱导性多能干细胞和胚胎干细胞分化的心肌细胞相似，具有相同的形态结构，且随着培养时间的推移，功能性K⁺、Na⁺、Ca²⁺通道密度逐渐增加，心肌特异性基因的表达量增加，具有相似的动作电位和收缩性等特点，相当于幼稚型心肌细胞。可作为新型的细胞源用于心脏疾病的代替疗法、药物检测以及心脏发育生物学的基础研究。其中将诱导多能干细胞分化的心肌细胞已知作用药物的心脏毒性筛选，检测心肌细胞离子通道、动作电位、心脏损伤标志物、收缩功能的变化能够获得与临床相似的结果，建立多能干细胞分化的心肌细胞的体外评价模型，能大大减少药物研发的时间和成本，克服之前利用小鼠心肌细胞评价药物心脏毒性的种属间差异，推动心脏毒性体外评价方法的发展。

iPSC分化的心肌细胞应用在药物毒性筛查领域具有很多优点和巨大潜力，但现阶段也存在一些不足。如在实践中发现诱导性多能干细胞分化的心肌细胞往往是幼稚的心肌细胞，而心肌细胞的成熟度也影响其对药物心脏毒性筛查的结果。并且诱导性多能干细胞分化的心肌细胞往往是各类心肌细胞的混合体，包括心房肌、心室肌和传导细胞。在研究药物毒性筛查过程中，如果不能分离纯化心肌细胞，各类研究终究不能得到精准结果。

发明内容

本发明为解决上述问题，提高药物心脏毒性检测的准确性，研制出一种心肌细胞培养基及药物心脏毒性筛查方法，包括CardioExcyte 96心肌细胞筛选仪、心肌细胞和心肌细胞培养基，所述心肌细胞培养基中的心肌细胞，在待测药物的作用下，利用CardioExcyte 96心肌药物筛选仪检测所述心肌细胞的QT 时程及搏动频率，判断待测药物对心脏的毒性作用。 CardioExcyte 96药物心脏毒性筛选包括以下步骤：

S1：电极培养板包被；

S2：心肌细胞复苏及计数；

S3：心肌细胞接种；

S4：心肌细胞维持培养；

S5：药物添加。

进一步改进在于，在步骤S2中，心肌细胞用心肌细胞复苏液复苏后，接种于步骤S1用心肌细胞铺板液包被好的CardioExcyte 96孔板中；步骤S4，每 24小时进行细胞半换液，持续培养10-12天，待心肌细胞达到稳定状态，进行步骤S5。

进一步改进在于，在步骤S3中，CardioExcyte 96心肌药物筛选仪电极板以 50,000细胞/孔接种细胞接种，心肌细胞能够更快达到QT时程在230-280ms，搏动频率在60-100次/min。

进一步改进在于，药物心脏毒性的检测方法中，添加待测药物前，每24h更换心肌细胞培养基。

优选的，心肌细胞铺板液为HELPCE96用铺板液(货号HELP4007)，4℃储存，避免冷冻。购买自Sigma，Fibronectin human pLasma，Cat#0102Da2302A2，推荐使用浓度为20μg/mL，ddH2O进行稀释。心肌细胞复苏液(货号HELP4001)。

进一步改进在于，所述心肌细胞培养基由基础培养基和添加成分组成，其中，基础培养基选自RPMI培养液、DMEM培养液、MEM培养液、F12培养液或α －MEM培养液中的任一种，并加入以下添加成分：HEPES、肌酸、氨基酸、能量补充剂、半乳糖和透析血清。

优选的，所述氨基酸选自甲硫氨酸、L-肉毒碱、牛磺酸中的一种或多种；所述能量补充剂选自ITS-X、CDLC、谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸中的一种或多种。

天门东氨酸可与酸甲硫氨酸等效替换。

所述半乳糖可以替换为乳糖或乳酸中的任意一种。

进一步改进在于，所述心肌细胞培养基的浓度如下：

1-50mM的HEPES，

0.2-10mM的肌酸、

0.1％-10％的0.5M半乳糖或乳糖或乳酸，

0.5％-20％透析血清，能量补充剂与氨基酸；

所述能量补充剂包括0.1％-5％的ITS-X，和/或0.1％-5％的CDLC，和/或 0.1％-5％的谷氨酰胺，和/或0.1％-5％的丙酮酸钠，和/或0.1-5％的非必需氨基酸；

所述氨基酸包括0.8-30mM甲硫氨酸，和/或0.5-25mML-肉毒碱，和/或 0.5-25mM牛磺酸。

进一步改进在于，所述心肌细胞培养基的PH设置为7.0-7.4。

优选的非必需氨基酸浓度为1％时,能进一步促进心肌细胞的电生理成熟。因此含有NEAA的心肌细胞培养基能够缩短心肌细胞达到药物心脏毒性筛选平台的标准的时间，提供药物心脏毒性筛选效率。

进一步改进在于，所述心肌细胞中阳性表达cTnT的细胞量不少于95％，且所述心肌细胞的QT时程在230-280ms，搏动频率在60-100次/min。

通过该方法与心肌细胞培养基培养的心肌细胞适用于在药物心脏毒性筛查中的应用。

本申请中所涉及的心肌细胞是指由干细胞利用心肌细胞分化技术制备的一类由多种细胞构成的细胞群，可以但不限制于包括心室肌细胞、心房肌细胞、心脏成纤维细胞。

由以上技术方案可知，本发明的技术方案提供了如下有益效果：

其一、本发明提供一种心肌细胞培养基，以RPMI培养液、DMEM培养液、MEM 培养液、F12培养液或α－MEM任一种作为基础培养基，并以特定物质作为添加剂，使心肌细胞中cTnT阳性表达量能够较长时间内维持在95％以上，而且能够促进心肌细胞的电生理成熟及较长时间维持电生理参数稳定。

其二、本发明提供的心肌细胞培养基培养的心肌细胞可以应用于药物的毒性筛查，药物的心脏毒性检测结果稳定，有效的提高药物心脏毒性检测的准确性和灵敏度。

应当理解，前述构思以及在下面更加详细地描述的额外构思的所有组合只要在这样的构思不相互矛盾的情况下都可以被视为本公开的发明主题的一部分。

结合附图从下面的描述中可以更加全面地理解本发明教导的前述和其他方面、实施例和特征。本发明的其他附加方面例如示例性实施方式的特征和/或有益效果将在下面的描述中显见，或通过根据本发明教导的具体实施方式的实践中得知。

附图说明

附图不意在按比例绘制。为了清晰起见，在每个图中，并非每个组成部分均被标记。现在，将通过例子并参考附图来描述本发明的各个方面的实施例，其中：

附图1为常规培养基与本发明培养基培养的心肌细胞的搏动率(搏动/分钟) 的统计分析；

附图2为实施例1的D组心肌细胞培养基培养的心肌细胞cTnT阳性表达量，附图2a至附图2d分别是培养7天、14天、21天和28天时心肌细胞中cTnT的阳性表达量；

附图3为心肌细胞的场电位结果图谱，其中附图3a为实施例1的C组心肌细胞培养基培养心肌细胞第7天的场电位图谱，附图3b为H组培养心肌细胞第 7天的场电位图谱；附图3c为I组培养心肌细胞第7天的场电位图谱；

附图4为心肌细胞场电位波形图；其中，附图4a为实施例1的D组心肌细胞培养基培养心肌细胞第8天的心肌细胞场电位波形图；附图4b图为H组培养心肌细胞第8天心肌细胞场电位波形图；常规培养基为：Gibco Cardiomyocyte Maintenance Medium货号:A2920801；

附图5为奎尼丁加药前后对心肌细胞生理参数的影响分析图；其中，附图5a为对照组，附图5b为对照组为药物处理组；

附图6为异丙肾加药前后对心肌细胞生理参数的影响分析图；其中，附图6a为对照组，附图6b为对照组为药物处理组；

附图7为不同浓度异丙肾上腺素对心肌细胞跳动频率的影响；

附图8为不同浓度异丙肾上腺素对心肌细胞QT间期时长的影响。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图,对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例,本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。除非另作定义,此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性,而只是用来区分不同的组成部分。同样,除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一个”“一” 或者“该”等类似词语也不表示数量限制,而是表示存在至少一个。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现在“包括”或者“包含”前面的元件或者物件涵盖出现在“包括”或者“包含”后面列举的特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件,并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。“上”“下”“左”“右”等仅用于表示相对位置关系，当被描述对象的绝对位置改变后,则该相对位置关系也可能相应地改变。

除非特别指明，本发明采用的心肌细胞，来源于南京艾尔普再生医学科技有限公司(以下简称为艾尔普)由诱导多能干细胞分化的心肌细胞。除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可商购获得。

实施例，本发明的培养基的制备，以No glucose DMEM为基础培养基，并添加如下组分的添加剂；

表1添加剂的组分和比例

其中，mM表示mmol/L；M表示mol/L。

Noglucose DMEM为不含葡萄糖的DMEM；L-carnitine为L-肉毒碱；creatine 为肌酸；taurine为牛磺酸；nonessential amino acids为非必需氨基酸，本发明中后文将其缩写为NEAA。

Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine(ITS-X)100X为抗氧化添加剂，本发明中后文将其缩写为ITS-X；Chemically Defined Lipid Concentrate 为浓缩脂质乳液，本发明中后文将其缩写为CDLC；

HEPES为一种氢离子缓冲剂，用于控制pH值；CardioExcyte 96心肌药物筛选仪购自Nanion厂家。

CDLC是化学成分明确的浓缩脂质乳液，用于减少或代替细胞培养基中的胎牛血清。ITS-X抗氧化，能够有效提高心肌细胞活率。L-肉毒碱、肌酸和牛磺酸组合使用能够使心肌细胞具有稳定的阳性表达cTnT细胞的含量，并具有稳定的电生理状态。所述心肌细胞培养基中通过调整三个成分的浓度比例还可以起到心肌细胞电生理成熟的作用。

甲硫氨酸、L-肉毒碱、牛磺酸均属氨基酸；

ITS-X、CDLC、谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸均属生长补充剂。

实施例1，本发明培养基的制备

根据表1提供的组分和配比制备本发明的液体培养基，所述培养基的制备步骤为：

将不含葡萄糖的DMEM作为基础培养基，并分别按照A-G组的添加剂的浓度，溶于灭菌的去离子水中，配置好后，将培养基的PH调至7.0-7.4范围；搅拌均匀保存。

A-G组为按照本发明添加剂浓度制成的心肌细胞培养基；H-I组心肌细胞培养基是从ThermoFisher购买的心肌细胞培养基商品。

A组：3mM的HEPES、0.5mM的L-肉毒碱、0.2mM肌酸、0.5mM牛磺酸、0.5％透析血清、0.1％ITS-X、0.1％CDLC、0.1％谷氨酰胺、0.2％的0.5M半乳糖。

B组：50mM的HEPES、25mM的L-肉毒碱、0.8mM甲硫氨酸、10mM肌酸、25mM 牛磺酸、20％透析血清、5％ITS-X、5％CDLC、5％谷氨酰胺、1％的0.5M半乳糖。

C组：12.5mM的HEPES、5mM的L-肉毒碱、25mM甲硫氨酸、2mM肌酸、5mM 牛磺酸、6％透析血清、1％ITS-X、1％CDLC、3％谷氨酰胺、5％丙酮酸钠、2％的 0.5M乳糖。

D组：10mM的HEPES、3.5mM的L-肉毒碱、10mM甲硫氨酸、7.5mM肌酸、 5mM牛磺酸、6％透析血清、1％ITS-X、1％CDLC、1％谷氨酰胺、0.1％丙酮酸钠、 5％的0.5M乳糖。

E组：10mM的HEPES、3.5mM的L-肉毒碱、5mM甲硫氨酸、7.5mM肌酸、5mM 牛磺酸、0.1％NEAA、6％透析血清、1％ITS-X、1％CDLC、1％谷氨酰胺、2％丙酮酸钠、10％的0.5M乳酸。

F组：15mM的HEPES、3.5mM的L-肉毒碱、5mM甲硫氨酸、7.5mM肌酸、5mM 牛磺酸、5％NEAA、6％透析血清、1％ITS-X、1％CDLC、1％谷氨酰胺、2％丙酮酸钠、10％的0.5M乳酸。

G组：15mM的HEPES、3.5mM的L-肉毒碱、5mM甲硫氨酸、7.5mM肌酸、5mM 牛磺酸、1％NEAA、6％透析血清、1％ITS-X、1％CDLC、1％谷氨酰胺、2％丙酮酸钠、10％的0.5M乳酸。

H组：Gibco心肌细胞培养基，货号为A2920801。

I组：Gibco的透析血清作为心肌细胞培养基，货号为10099141C。

实施例2，心肌细胞电生理活性检测

用CardioExcyte 96心肌药物筛选仪检测由实施例1提供的9组心肌细胞培养基对心肌细胞的电生理活性的影响，操作步骤如下:

1、电极培养板包被

1)将CardioExcyte 96心肌药物筛选仪的电极板放入超净工作台，以200μL 移液器，推荐使用8通道联排移液器，在选定的实验孔中加入100μL/孔的心肌细胞铺板液。

2)将CardioExcyte 96心肌药物筛选仪的电极板放入37℃、5％CO₂细胞培养箱中，孵育4-6小时。孵育结束后移除心肌细胞铺板液，随即加入50uL心肌细胞复苏液，再将CardioExcyte 96心肌药物筛选仪的电极板放入37℃、5％CO₂细胞培养箱中，平衡10-20分钟。

并在普通96孔板中用同样的铺板液和铺板方法设置对照孔，以便观察细胞。

根据实验需求，选择对应的CardioExcyte 96心肌药物筛选仪的电极板，推荐0.6电极板做场电位检测，2.0电极板做阻抗检测；

优选的心肌细胞铺板液为HELP CE96用铺板液，货号HELP4007，4℃储存，避免冷冻。购买自Sigma，Fibronectin human pLasma，Cat#0102Da2302A2，推荐使用浓度为20μg/mL，ddH2O进行稀释。心肌细胞复苏液，货号HELP4001。

2、细胞复苏及计数

1)从干冰中取出心肌细胞，迅速将冻存管1/2下部没入水浴锅中，轻柔晃动1-2分钟至管中仅剩一小块冰，将其取出。

2)用75％酒精擦拭冻存管表面，放入生物安全柜中。拧开管盖，用2mL移液管将管中液体转移至15mL离心管中，再用移液管由慢到快的滴加7.5mL心肌细胞复苏液，同时轻柔晃动离心管。最后用1mL心肌细胞复苏液冲洗冻存管，将其中剩余液体也全部转移至15mL离心管，以300rcf离心5分钟。

3)取出15mL离心管，用75％酒精擦拭离心管表面，吸除上清液，取1-2mL 心肌细胞复苏液轻柔吹打细胞沉淀5-8次后，得到均一的细胞悬液。

4)在均一的细胞悬液中部取20μL，同体积混合0.8％台盼蓝，染色3min后进行活细胞计数。

3、心肌细胞接种

1)按照计数结果，将复苏后细胞在15mL离心管中以心肌细胞复苏液稀释至合适浓度，CardioExcyte 96心肌药物筛选仪的电极板每孔加入的细胞悬液为 150μL。细胞悬液应垂直加入CardioExcyte 96心肌药物筛选仪的电极板内，并按照30,000细胞/孔、40,000细胞/孔、50,000细胞/孔、55,000细胞/ 孔的密度接种至CardioExcyte 96心肌药物筛选仪的电极板的孔中。 CardioExcyte 96心肌药物筛选仪的电极板每孔总体积200μL。

2)接种完成后将CardioExcyte 96心肌药物筛选仪的电极板(后面简称为CE96 电极板)放入37℃、5％CO2细胞培养箱中，孵育24小时后取出放入超净工作台，以200μL移液器完全移除心肌细胞复苏液后，每孔加入200μL心肌细胞液体培养基。

3)完成换液后将CE96电极板放入CardioExcyte 96监测仪中；打开软件，设置对应参数，开始监测。

4、心肌细胞的维持培养

将冻存的心肌细胞(南京艾尔普再生医学科技有限公司由诱导多能干细胞分化的心肌细胞)复苏后，分别以50,000细胞/孔的密度接种至实施例1所涉及的9组心肌细胞培养基中，于37℃、5％CO₂条件下进行培养，每24h进行换液。

1)细胞开始监测后的第1-7天，需要每天进行半换液，每天最好在同一时间点进行换液。换液时移去上层100uL培养基，操作过程中勿触及底部芯片和细胞；每次进行换液时，需要暂停CardioExcyte 96监测，换液结束后继续监测。

2)若观察到CE96监测数据已经稳定，第7-8天进行全换液，并选取合适的孔作为实验孔，做好标记。

若第7天观察监测的CE96实时数据，细胞状态还未趋于稳定，可适当延后加药时间1-2天，期间仍然24小时进行半换液，直至加药前进行全换液。

5、药物的添加

1)实验前将要检测的药物以2×浓度提前配置好按照合适的条件存储。

2)进行药物添加前，需提前3-4小时进行全换液。继续监测3小时后在实验孔加入待测药物，加药时，先移去100μL上层培养基，再加入100μL含有2 ×工作药物浓度的新鲜培养基。继续将CE96电极板放入CardioExcyte 96监测仪中，记录扫描开始的时间。

3)如果药物持续监测时长超过24小时，需要每24小时进行半换液，先移去 100μL上层培养基，再加入100μL含有1×工作药物浓度的新鲜培养基。继续将CE96电极板放入CardioExcyte 96监测仪中持续监测。

实施例3、心肌细胞纯度检测

利用流式细胞术检测不同心肌细胞培养基培养的心肌细胞阳性表达cTnT的细胞含量，步骤如下：

取不同培养基培养的心肌细胞制成浓度为1×10⁶个细胞/mL的待测样品，并以同样细胞浓度的人胚胎肾细胞(HEK293)作为阴性对比；

将待测样品与阴性对照分别加入100μL的4％PFA进行固定，室温下静置15 分钟，加入100μL的DPBS进行清洗；

将待测样品与阴性对照分别加入100μL的cTnT抗体工作液，室温下避光放置30分钟，加入DPBS进行清洗；

加入200μL的DPBS制成细胞悬液，并将细胞悬液转移至2mL圆底EP管中，进行流式细胞仪分析；

使用CYtExpert软件进行数据分析，根据阴性对照组样品画面得到待检测心肌细胞表达cTnT的细胞比例。

实施例4、不同来源的心肌细胞培养基对心肌细胞纯度的影响

根据实施例3提供的心肌细胞纯度检测方法，实施例1提供的9组心肌细胞培养基对心肌细胞纯度的影响结果如表2所示。

表2，不同组别心肌细胞培养基对心肌细胞纯度的影响

通过表2可看出：心肌细胞在A组-G组心肌细胞培养基培养过程中，cTnT阳性表达量相较于所述心肌细胞培养基添加之前均在不同程度上有增加，其中D组 -G组培养基培养的心肌细胞的cTnT阳性表达量明显增加，其中附图2为D组培养基培养第14天、21天、28天和35天的阳性表达cTnT的细胞量。D组培养基能在较长时间内维持心肌细胞cTnT的阳性表达率。而对照组H组心肌细胞培养基虽然能在一定程度上增加cTnT阳性表达量，但是效果不如A-G组培养基对心肌细胞中阳性表达cTnT细胞含量的影响。另外，I组培养基随着培养时间的延长，心肌细胞中阳性表达cTnT的细胞含量下降。

实施例5、心肌细胞在利用CardioExcyte 96心肌药物筛选仪进行药物心脏毒性筛查方面的应用

根据实施例2提供的心肌细胞电生理活性检测，利用CardioExcyte 96心肌药物筛选仪检测实施例1提供的心肌细胞培养基对心肌细胞生理活性的影响。

附图3a为C组心肌细胞培养基培养心肌细胞第7天的场电位图谱，附图3b 为H组心肌细胞培养基培养同一批次心肌细胞第7天的场电位图谱；附图3c为 I组心肌细胞培养基培养同一批次心肌细胞第7天的场电位图谱。通过观察，图 3a不同孔间的场电位波形具有均一性，而附图3b和附图3c培养基培养的心肌细胞的场电位波形缺乏均一性和稳定性，孔间差异明显。

心肌细胞动作电位图波形图：

参照附图4a与附图4b，将实施例1的D组心肌细胞培养基培养心肌细胞第 8天的心肌细胞场电位波形图与H组培养心肌细胞第8天的心肌细胞场电位波形图对比可看出；

本发明优化后(D组)的心肌细胞CE96场电位波形图能完整反映以上0-4 期。

常规培养基(H组)无法准确反映2期和3期。

补充：0期：为心肌细胞的去极化过程；主要是快钠通道开放，Na+内流引起。1期：为快速复级初期，主要由瞬时K+外流造成。2期：为平台期，膜电位复极缓慢，电位接近于0mV水平，平台期是心肌特有的时期。3期：为快速复极末期，主要由K+外流造成；4期：为静息期。

心肌细胞中阳性表达cTnT的细胞量不少于95％，且所述心肌细胞的QT时程在230-280ms，搏动频率在60-100次/min。附图1可知，常规培养基培养出来的心肌细胞，搏动频率在30-50次/min。

然而经过本实施例1种的培养基优化后，能够提高心肌细胞的电生理参数，能够提高心肌细胞电生理参数稳定状态的维持时间。本方案培养基优化后的心肌细胞电生理参数正常范围约QT时程在230-280ms，搏动频率在60-100次/min。

其中，当实施例1中D组制成的心肌细胞培养基，所述心肌细胞培养基培养的心肌细胞电生理活性在QT时程为230-280ms，搏动频率为60-100次/min的状态下能够维持7-10天。

实施例6、实验结果

下文A孔、B孔、C孔和D孔中培养基分别对应本方案实施例1中A组、C 组、D组和F组的浓度的培养基。表3为本发明优化后的培养基对心肌细胞QT 间期时长与跳动频率的影响影响。具体为第20天铺板至CE96，第25天时不同孔别的FPD(max)值与Beat Rate值。

除特别说明外，下表中FPD(max)单位为s，BeatRate单位为：次/分钟。

表3

由上表可知，在第25天时,A孔、B孔、C孔和D孔中培养基的FPD(max)值与BeatRate的值,仍处心肌细胞电生理参数正常范围，约QT时程在230-280ms，搏动频率在60-100次/min。

表4为本发明优化后的培养基处理对心肌细胞QT间期时长的影响。具体为第20天铺板至CE96，第27天时不同时间段不同孔别的FPD(max)值。

表4

由上表可知，第27天时不同时间段，A孔、B孔、C孔和D孔中培养基的FPD(max) 值仍处心肌细胞电生理参数正常范围。

表5为本发明优化后的培养基处理对心肌细胞跳动频率的影响。具体为第20 天铺板至CE96，第27天时不同时间段不同孔别的Beat Rate值。

表5

由上表可知，由上表可知，第27天时不同时间段，A孔、B孔、C孔和D孔中培养基的Beat Rate值仍处心肌细胞电生理参数正常范围。

本发明培养方法与培养基优化后的正常心肌细胞满足cTnT阳性表达率不小于95％，且心肌细胞的QT时程在230-280ms，搏动频率为60-100次/min。

实施例7，阳性药物反应结果

心肌细胞达到稳定状态，开始进行实验,在CardioExcyte 96心肌药物筛选仪的96孔电极培养板中加入两组相同的心肌细胞及细胞培养基，其中一组含有阳性药物。未加阳性药物的为Control组，含有阳性药物的为药物处理组。A孔、B孔、C孔和D孔中的培养基分别是本方案实施例1中A组、C组、D组和F组的浓度的培养基。检测阳性药物处理对心肌细胞的影响，加入30uM奎尼丁和30uM 异丙肾上腺素，3小时后检测不同药物对心肌细胞跳动频率和心肌细胞QT间期时长的影响。

1)奎尼丁处理对心肌细胞跳电生理影响

表6a，奎尼丁对心肌细胞跳动频率的影响

由上表可知，奎尼丁作用于心肌细胞后，心肌细胞跳动频率缩短。

表6b，奎尼丁对心肌细胞FPD(max)的影响

由上表可知，奎尼丁作用于心肌细胞后，将延长心肌细胞QT间期。

参考附图5及表6a、6b可得出检测阳性药物添加前后对电生理参数(搏动频率和QT时程)的影响，即加入奎尼丁后，超出正常细胞心肌细胞电生理参数值(QT时程230-280ms，搏动频率60-100次/min)。搏动频率减小，且QT时程延长，引起心率失常的风险较大。

2)异丙肾上腺素处理对心肌细胞跳电生理影响

表7a，异丙肾上腺素对心肌细胞跳动频率的影响

由上表可知，异丙肾上腺素作用于心肌细胞后，心肌细胞跳动频率加快。

表7b，异丙肾上腺素对心肌细胞FPD(max)的影响

由上表可知，异丙肾上腺素作用于心肌细胞后，将缩短心肌细胞QT间期。

图6中的附图6b是异丙肾上腺素对心肌细胞电生理参数的影响，结合附图6 及综合表7a和7b可得出，加入异丙肾上腺素后，超出正常细胞心肌细胞电生理参数值。心肌细胞搏动频率增大，且QT时程缩短，引起心率失常的风险较大。

实施例8，异丙肾上腺素处理分组，异丙肾上腺素浓度为0.01uM、0.1uM、1uM、10uM。

图7不同浓度异丙肾上腺素对心肌细胞跳动频率的影响。定义，Beat Rate 是评价检测期间心肌细胞跳动频率的指标，数值越大表示心肌细胞跳动频率越快，心肌细胞跳动频率的增大或减小都存在引起心率失常的风险。空白对照组 (Control组)的心肌细胞跳动频率约在50-70次/分钟；药物处理组，各实验组心肌细胞因换液产生跳动频率减弱现象，后逐渐恢复。

图7反应了不同浓度异丙肾上腺素处理对心肌细胞跳动频率的影响。 0.01uM、1uM、10uM异丙肾上腺素处理后短时间内使心肌细胞跳动频率快速变化至90-120次/分钟，在检测期内随时间延长呈缓慢下降趋势，低浓度0.01uM异丙肾上腺素对心肌细胞跳动频率影响不明显，与Control组趋势相近。

图8反应了不同浓度异丙肾上腺素处理对心肌细胞QT间期时长的影响。定义，FPD(max)是评价检测期间心肌细胞QT间期时长的指标，数值越大表示心肌细胞QT间期时长越长。心肌细胞QT间期时长的延长或缩短都存在引起心率失常的风险。空白对照组(Control组)的心肌细胞QT间期时长约在0.18-0.22s，药物处理组，各实验组心肌细胞因换液产生QT间期延长的现象，后逐渐恢复。药物各个浓度组均缩短了心肌细胞的QT间期时长，低浓度药物影响较小。心肌细胞的QT时程变化量和药物浓度呈线性关系，说明心肌细胞的QT时程变化量具有药物浓度灵敏性。

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

Claims

1.一种药物心脏毒性筛查方法，其特征在于，包括CardioExcyte 96心肌细胞筛选仪、心肌细胞和心肌细胞培养基，所述心肌细胞培养基中的心肌细胞，在待测药物的作用下，利用CardioExcyte 96心肌药物筛选仪检测所述心肌细胞的QT时程及搏动频率，判断待测药物对心脏的毒性作用。

2.如权利要求1所述的一种药物心脏毒性筛查方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：电极培养板包被；

S2：心肌细胞复苏及计数；

S3：心肌细胞接种；

S4：心肌细胞维持培养；

S5：药物添加。

3.如权利要求2所述的一种药物心脏毒性筛查方法，其特征在于，在步骤S2中，心肌细胞用心肌细胞复苏液复苏后，接种于步骤S1心肌细胞铺板液包被好的CardioExcyte 96孔板中；步骤S4，每24小时进行细胞半换液，持续培养10-12天，待心肌细胞达到稳定状态，进行步骤S5。

4.如权利要求2所述的一种药物心脏毒性筛查方法，其特征在于，在步骤S3中，CardioExcyte 96心肌药物筛选仪电极板以50，000细胞/孔接种细胞接种。

5.如权利要求1所述的一种药物心脏毒性筛查方法，其特征在于，所述心肌细胞培养基由基础培养基和添加成分组成，其中，基础培养基选自RPMI培养液、DMEM培养液、MEM培养液、F12培养液或α－MEM培养液中的任一种，并加入以下添加成分：HEPES、肌酸、氨基酸、能量补充剂、半乳糖和透析血清。

6.如权利要求1所述的一种药物心脏毒性筛查方法，其特征在于，所述氨基酸选自甲硫氨酸、L-肉毒碱、牛磺酸中的一种或多种；所述能量补充剂选自ITS-X、CDLC、谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸中的一种或多种。

7.如权利要求1所述的一种药物心脏毒性筛查方法，其特征在于，所述半乳糖可以替换为乳糖或乳酸中的任一种。

8.如权利要求5所述的一种药物心脏毒性筛查方法，其特征在于，所述心肌细胞培养基的浓度如下：

1-50mM的HEPES，

0.2-10mM的肌酸，

0.1％-10％的0.5M半乳糖或乳糖或乳酸，

0.5％-20％透析血清，还包括能量补充剂和氨基酸；

所述能量补充剂包括0.1％-5％的ITS-X，和/或0.1％-5％的CDLC，和/或0.1％-5％的谷氨酰胺，和/或0.1％-5％的丙酮酸钠，和/或0.1-5％的非必需氨基酸；

所述氨基酸包括0.8-30mM甲硫氨酸，和/或0.5-25mML-肉毒碱，和/或0.5-25mM牛磺酸。

9.如权利要求8所述的一种药物心脏毒性筛查方法，其特征在于，所述心肌细胞培养基的PH设置为7.0-7.4。

10.如权利要求1所述的一种药物心脏毒性筛查方法，其特征在于，所述心肌细胞由正常人源诱导多能干细胞分化制成。

11.如权利要求1所述的一种药物心脏毒性筛查方法，其特征在于，所述心肌细胞中阳性表达cTnT的细胞量不少于95％，且所述心肌细胞的QT时程在230-280ms，搏动频率在60-100次/min。

12.一种如权利要求1-11中任一项所述的药物心脏毒性筛查方法，其特征在于，通过该方法与心肌细胞培养基培养的心肌细胞适用于在药物心脏毒性筛查的应用。