CN106244526B - 心肌分化试剂盒及心肌细胞的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种心肌分化试剂盒及心肌细胞的培养方法。该心肌分化试剂盒包括心肌分化基础培养基、心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2以及心肌分化添加剂3；其中，心肌分化基础培养基为含糖1640培养基，心肌分化添加剂1包括1～3v％的B27、8～12ng/ml的BMP4以及4～8μM的CHIR99021；心肌分化添加剂2包括1～3v％的B27以及4～6μM的IWP2；心肌分化添加剂3包括1～3v％的B27。该试剂盒中不含动物源成分，分化的心肌细胞均一性好，电生理稳定，可重复性高；适用于包括药物开发和安全性评价在内的各种需求，为心血管药物开发和生理学研究奠定基础。

Description

心肌分化试剂盒及心肌细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种心肌分化试剂盒及心肌细胞的培养方法。

背景技术

日本学者中山申弥(Shinya Yamanaka)于2006年和2007年，首次通过导入四个转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)的方法，分别成功将小鼠(Takahashi and Yamanaka.,2006)和人(Takahashi et al.,2007)的皮肤成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)，并因此获得了2012年的诺贝尔医学和生理学奖。hiPS细胞(人诱导多能干细胞)具备hES细胞(人胚胎干细胞)的所有分化能力，并且没有伦理问题，在不久的将来会完全取代hES细胞，成为再生医学的最主要细胞来源，为临床应用带来了新的曙光。

冠心病(Coronary Artery Disease,CAD)是仅次于高血压的第二大心血管疾病，在全球范围内的发病率和死亡率非常高，近几年其发病率在我国也呈上升趋势。目前冠心病的主要临床治疗方法如药物治疗、经皮冠状动脉介入术(PCI)及冠状动脉搭桥术(CABG)，都不能显著恢复受损后的心脏功能。由于人心肌没有再生能力，一旦由于心梗等原因受损死亡后，一旦超过临界点，心脏会进入恶性代偿的循环，最终不可逆的发展进入心衰。根据中国的流行病学调查，人群中的慢性心衰患病率为0.9％，至少有1000万病人，总死亡率达32％。诱导多能干(iPS)细胞因其易扩增，可定向分化为心肌细胞，且无免疫排斥反应和伦理学问题，提供了治疗冠心病的新思路。最近的研究发现，移植人ES/iPS产生的心肌细胞后，心梗猪的心功能得到了显著程度的改善，形态学和生理学结果都显示移植的心肌整合进入宿主心脏并形成有效的收缩功能单元(Kawamura et al.,2012；Shiba et al.,2012)。

人心肌细胞与常用实验动物的心肌细胞相比，存在较大生理学差异。例如，人心脏生理条件下每分钟搏动60～90次，而小鼠为500～700次，大鼠为300～400次。而获取与人心脏生理接近的大动物心肌细胞非常昂贵而且困难，收集到的细胞均一性差，难以得到稳定可靠的结果。ES/hiPS产生的心肌之前，几乎不可能获任何人源心肌细胞用于药物开发，毒性测定和生理学研究。

因此，需要解决现有技术中因为心肌细胞无法长期培养和实现规模化量产，而无法用于药物开发，毒性测定和生理学研的技术问题。

发明内容

本发明旨在提供一种心肌分化试剂盒及心肌细胞的培养方法，以解决现有技术中因为心肌细胞无法长期培养和实现规模化量产，而无法用于药物开发，毒性测定和生理学研的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种心肌分化试剂盒，该心肌分化试剂盒包括心肌分化基础培养基、心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2以及心肌分化添加剂3；其中，心肌分化基础培养基为含糖1640培养基，心肌分化添加剂1包括1～3v％的B27、8～12ng/ml的BMP4以及4～8μM的CHIR99021；心肌分化添加剂2包括1～3v％的B27以及4～6μM的IWP2；心肌分化添加剂3包括1～3v％的B27。

进一步地，心肌分化试剂盒还包括心肌纯化基础培养基及心肌纯化添加剂；其中，心肌纯化基础培养基为无糖1640培养基；心肌纯化添加剂包括1～3v％的B27以及1～3mg/ml的乳糖；优选心肌纯化添加剂包括1.5～2.5v％的B27以及1.5～2.5mg/ml的乳糖；更优选，心肌纯化添加剂包括2v％的B27以及2mg/ml的乳糖。

进一步地，心肌分化添加剂1包括1.5～2.5v％的B27、9～11ng/ml的BMP4以及5～7μM的CHIR99021；心肌分化添加剂2包括1.5～2.5v％的B27以及4.5～5.5μM的IWP2；心肌分化添加剂3包括1.5～2.5v％的B27；更优选，心肌分化添加剂1包括2v％的B27、10ng/ml的BMP4以及6μM的CHIR99021；心肌分化添加剂2包括2v％的B27以及2 5μM的IWP2；心肌分化添加剂3包括2v％的B27。

进一步地，心肌分化基础培养基和心肌纯化基础培养基保存在4～8℃，心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2、心肌分化添加剂3以及心肌纯化添加剂分别置于-20～-80℃保存。

进一步地，心肌分化试剂盒在使用前还包括配制相应心肌分化培养基和心肌纯化培养基的步骤，配制相应心肌分化培养基和心肌纯化培养基的步骤包括：在2～8℃化冻心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2、心肌分化添加剂3及心肌纯化添加剂；将心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2以及心肌分化添加剂3分别与心肌分化基础培养基以1:40～60，优选1:50的体积比混合后形成心肌分化培养基1、心肌分化培养基2以及心肌分化培养基3；将心肌纯化添加剂与心肌纯化基础培养基以1:40～60，优选1:50的体积比混合后形成心肌纯化培养基。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种心肌细胞的培养方法，该培养方法包括以下步骤：将人多能干细胞接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中；向培养皿中依次加入心肌分化培养基1培养2～4天，心肌分化培养基3培养1～2天，心肌分化培养基2培养2～3天，得到分化细胞；其中，心肌分化培养基1、心肌分化培养基2以及心肌分化培养基3采用上述任一种心肌分化试剂盒中的心肌分化基础培养基、心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2以及心肌分化添加剂3配制而成。

进一步地，配制心肌分化培养基1、心肌分化培养基2以及心肌分化培养基3的步骤包括：将心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2以及心肌分化添加剂3分别与心肌分化基础培养基以1:40～60，优选1:50的体积比混合后形成心肌分化培养基1、心肌分化培养基2以及心肌分化培养基3。

进一步地，在得到分化细胞之后，培养方法还包括对分化细胞进行心肌细胞纯化的步骤，优选对心肌细胞纯化的步骤包括：去除心肌分化培养基2，然后向培养皿中加入心肌纯化培养基，每隔一天换一次心肌纯化培养基，纯化3～4天，获得纯化后的心肌细胞；其中，心肌纯化培养基采用上述任一种心肌分化试剂盒中的心肌纯化基础培养基及心肌纯化添加剂配制而成。

进一步地，配制心肌纯化培养基的步骤包括：将心肌纯化添加剂与心肌纯化基础培养基以1:40～60，优选1:50的体积比混合形成心肌纯化培养基。

进一步地，在获得纯化后的心肌细胞之后，培养方法还包括维持培养纯化后的心肌细胞的步骤；优选维持培养纯化后的心肌细胞的步骤包括：将纯化后的心肌细胞接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中，并向培养皿中添加心肌分化培养基3，每隔2天换一次心肌分化培养基3，培养60～100天。

应用本发明的技术方案，本发明的试剂盒中心肌分化相关培养基、纯化相关培养基成分明确，品质稳定；不含动物源成分，分化的心肌细胞均一性好，电生理稳定，可重复性高；可以达到人源心肌细胞稳定的获得和维持，并且适用于包括药物开发和安全性评价在内的各种需求，为心血管药物开发和生理学研究奠定基础。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1A至图1D示出了实验一中实施例5的培养基分化人诱导多能干细胞向心肌分化过程在不同阶段的图像；其中，图1A是分化前(day0)的iPSC，图1B是分化72h的细胞形态，图1C是分化结束获得的心肌细胞，图1D是纯化处理获得的纯度≧99％的心肌细胞。

图2A至图2B示出了实验一中实施例5的心肌细胞特异性标记物染色结果；其中，图2A中的左、中、右图分别示出的是诱导出的心肌细胞所表达主要的心肌特异性收缩蛋白Cardiac Troponin T、α-Sarcomeric-Actinin以及两者叠加之后的图，图2A显示了心肌细胞非常规则的肌理结构。图2B显示了实施例5的试剂盒诱导的心肌细胞由心室肌样细胞组成，其中，左图显示的是少量其他心肌细胞表达心房特异性轻链肌球蛋白MLC2a，中图显示的是心室肌样细胞表达心室特异性轻链肌球蛋白MLC2v，右图显示的是两者叠加后的图。

图3A和图3B示出了实验二中实施例5的心肌细胞分化效率和纯度鉴定结果；其中，图3A显示实施例1～5及对比例1的心肌细胞分化效率比较结果；图3B显示心肌细胞NKX2.5启动子调控下特异性的表达绿色荧光蛋白(GFP)，通过搏动和表达GFP的细胞比例可知，心肌细胞纯度达99％以上。

图4A及图4B示出了实验三中实施例5分化的心肌细胞转染GFP质粒的转染效率图，转染48h观察，其中图4A为白光下的图像；图4B为绿色荧光下的图像，经统计，GFP荧光比率达到50～60％，表明所分化的心肌细胞的GFP转染效率可达50～60％。

图5A、图5B及图5C示出了实验三中实施例5的试剂盒诱导分化的心肌细胞在接种后10～13天RTCA数据分析结果：其中，图5A显示心肌细胞质量均一稳定且具备正常人心肌细胞的搏动幅度与频率；图5B显示心肌细胞在1.1μM异丙肾上腺素(Isoprenaline)的作用下心率显著提高，其中，0.1％DMSO处理作为阴性参照；图5C显示心肌细胞在1.1μM胺碘酮(Amiodarone)的作用下心率显著降低，其中，0.1％DMSO处理作为阴性参照。

图6A和图6B示出了实验三中实施例5的试剂盒诱导分化的心肌细胞的膜片钳电生理检测结果，图6A显示诱导的心肌细胞具备典型的自发动作电位，图6B显示诱导的心肌细胞具备经典的自发离子通道。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

如背景技术所提到的，现有技术中，心肌细胞因为无法长期培养和实现规模化量产，因而无法用于药物开发，毒性测定和生理学研究。而动物自体分离的心肌细胞，不同批次差异较大，很不稳定，且电生理跟人差异极大，严重影响实验进度和结果。

为改善现有技术中的上述技术问题，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种心肌分化试剂盒。该试剂盒包括心肌分化基础培养基、心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2及心肌分化添加剂3；其中，心肌分化基础培养基为含糖1640培养基；心肌分化添加剂1包括1～3v％的B27、8～12ng/ml的BMP4以及4～8μM的CHIR99021；心肌分化添加剂2包括1～3v％的B27以及4～6μM的IWP2；心肌分化添加剂3包括1～3v％的B27。

本申请的心肌分化试剂盒成分明确，品质稳定且分化效率高，细胞谱系广，可以分化包括各种来源的人诱导多能干细胞，胚胎干细胞H9、HCN4等细胞。而且，分化的心肌细胞均一性好，电生理稳定，可重复性高；可以达到人源心肌细胞稳定的获得和维持，并且适用于包括药物开发和安全性评价在内的各种需求，为心血管药物开发和生理学研究奠定基础。

包含上述成分的心肌分化试剂盒已经能够分化出品质稳定的心肌细胞，并且能够满足包括药物开发和安全性评价在内的各种需求。为了进一步提高所分化的心肌细胞的纯度，在本申请的一种优选的实施例中，上述心肌分化试剂盒还包括：心肌纯化基础培养基和心肌纯化添加剂，其中，心肌纯化基础培养基为无糖1640培养基；心肌纯化添加剂包括1～3v％的B27以及1～3mg/ml的乳糖；优选心肌纯化添加剂包括1.5～2.5v％的B27以及1.5～2.5mg/ml的乳糖；更优选，心肌纯化添加剂包括2v％的B27以及2mg/ml的乳糖。

上述优选实施例中，通过包括上述组分及其含量的心肌纯化基础培养基和心肌纯化添加剂，使得本申请的心肌分化试剂盒除了具有分化心肌细胞、量产化心肌细胞的功能外，还具有对分化的心肌细胞进行纯化的功能，使得心肌细胞的纯度相对更纯，品质更稳定，更适合用于药物开发、毒性测定和生理学研究。

上述心肌分化试剂盒中的心肌分化基础培养基、心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2以及心肌分化添加剂3的成分及含量明确，诱导分化能力强，分化后的心肌细胞品质稳定。为了进一步优化上述心肌分化基础培养基及添加剂的相应功能，在本申请一种优选的实施例中，上述心肌分化添加剂1包括心肌分化添加剂1包括1.5～2.5v％的B27、9～11ng/ml的BMP4以及5～7μM的CHIR99021；心肌分化添加剂2包括1.5～2.5v％的B27以及4.5～5.5μM的IWP2；心肌分化添加剂3包括1.5～2.5v％的B27；更优选，心肌分化添加剂1包括2v％的B27、10ng/ml的BMP4以及6μM的CHIR99021；心肌分化添加剂2包括2v％的B27以及2 5μM的IWP2；心肌分化添加剂3包括2v％的B27。上述含量范围的各成分组成的心肌分化试剂盒具有更高效的心肌细胞诱导分化能力，得到的心肌细胞的品质更稳定。

上述试剂盒中，根据成分种类的不同，可以选择合适的保存方式以延长试剂盒中各种培养基成分的有效性，从而延长试剂盒的有效使用期。在本发明一种优选的实施例中，心肌分化基础培养基和心肌纯化基础培养基保存在4～8℃，心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2、心肌分化添加剂3以及心肌纯化添加剂分别置于-20～-80℃保存。各心肌分化添加剂及心肌纯化添加剂，在-20～-80℃保存可以保持性能稳定长达一年以上。

对于上述试剂盒的使用步骤，根据实际需要可以将各成分提前配制成母液或者现用现配。在本申请一种优选的实施例中，心肌分化试剂盒在使用前还包括配制相应心肌分化培养基和心肌纯化培养基的步骤，配制相应心肌分化培养基和心肌纯化培养基的步骤包括：在2～8℃化冻心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2、心肌分化添加剂3及心肌纯化添加剂；将心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2以及心肌分化添加剂3分别与心肌分化基础培养基以1:40～60，优选1:50的体积比混合后形成心肌分化培养基1、心肌分化培养基2以及心肌分化培养基3；将心肌纯化添加剂与心肌纯化基础培养基以1:40～60，优选1:50的体积比混合后形成心肌纯化培养基。优选的，心肌分化培养基和心肌纯化培养基在使用前0～14天配制，并在2～8℃保存。

在本申请另一种典型的实施方式中，还提供了一种心肌细胞的培养方法，该培养方法包括以下步骤：将人多能干细胞接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中；向培养皿中依次加入心肌分化培养基1培养2～4天，心肌分化培养基3培养1～2天，心肌分化培养基2培养2～3天，得到分化细胞。上述依次加入是指：加入心肌分化培养基1培养2～4天，然后将心肌分化培养基1去除，换成心肌分化培养基3培养1～2天，再将心肌分化培养基3去除，换成心肌分化培养基2培养2～3天，得到上述分化细胞；其中，心肌分化培养基1、心肌分化培养基2以及心肌分化培养基3采用上述任一种心肌分化试剂盒中的心肌分化基础培养基、心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2以及心肌分化添加剂3配制而成。

采用上述培养基按照上述培养方法培养，能够分化得到较多的心肌细胞，实现心肌细胞的量产，且得到的心肌细胞的品质性能稳定。

根据试剂盒成分保存方式的不同，在采用试剂盒中的成分进行心肌细胞培养时，可以采用不同的前处理步骤。比如，对已经化冻的心肌分化培养基的母液，直接按需求添入培养皿中即可。若试剂盒中各添加剂成分都是在-20℃～-80℃下保存，还需要先配置后续培养过程中使用的心肌分化培养基和心肌纯化培养基。

在本申请一种优选的实施例中，上述配制心肌分化培养基1、心肌分化培养基2以及心肌分化培养基3的步骤包括：将心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2以及心肌分化添加剂3分别与心肌分化基础培养基以1:40～60，优选1:50的体积比混合后形成心肌分化培养基1、心肌分化培养基2以及心肌分化培养基3。上述优选的实施例中，将各分化添加剂与分化基础培养基以上述体积比进行混合形成相应的分化培养基，具有诱导心肌细胞分化效率高，品质稳定的效果。当上述各分化添加剂处于-20℃～-80℃的冷冻状态时，配制上述各分化培养基之前，还需要先将各分化添加剂进行化冻，使各分化添加剂处于液体状态。

为了获得纯度更高、品质更稳定的心肌细胞，在本申请另一种优选的实施例中，在得到分化细胞之后，培养方法还包括对分化细胞进行心肌细胞纯化的步骤，优选心肌细胞纯化的步骤包括：去除心肌分化培养基2，然后向培养皿中加入心肌纯化培养基，每隔一天换一次心肌纯化培养基，纯化3～4天，获得纯化后的心肌细胞；其中，心肌纯化培养基采用上述任一种心肌分化试剂盒中的心肌纯化基础培养基及心肌纯化添加剂配制而成。

在本申请一种优选的实施例中，上述配制心肌纯化培养基的步骤包括：将心肌纯化添加剂与心肌纯化基础培养基以1:40～60，优选1:50的体积比混合形成心肌纯化培养基。而将心肌纯化添加剂与心肌纯化基础培养基以上述体积比进行混合形成的纯化培养基，对心肌细胞的纯化效率高，纯化得到的心肌细胞的品质性能稳定。当然，若上述心肌纯化添加剂处于-20℃～-80℃的冷冻状态时，配制上述纯化培养基之前，还需要先将纯化添加剂进行化冻成液体状态才能配制。

在得到上述纯化后的心肌细胞之后，根据研究目的和对心肌细胞的使用时间的不同，可以选择直接对心肌细胞进行试验或研究，或者持续培养以适应阶段性的研究需求。在本申请一种优选的实施例中，在获得纯化后的心肌细胞之后，培养方法还包括维持培养纯化后的心肌细胞的步骤；优选维持培养纯化后的心肌细胞的步骤包括：将纯化后的心肌细胞接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中，并向培养皿中添加心肌分化培养基3，每隔2天换一次心肌分化培养基3，培养60～100天。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

一、各组分的配制

在下列实施例中，心肌分化添加剂及心肌纯化添加剂通过以下步骤配置：

1)心肌分化添加剂1：

第一步：配制各种成分的储备液：①B27；②BMP4 10ug/ml；③CHIR99021 6mM。

第二步：在室温下将以上各种成分的储备液按照以上储备液编号顺序依次混合，成为终浓度为B27 1～3v％、BMP4 8～12ng/ml、CHIR99021 4～8μM的工作液。

2)心肌分化添加剂2：

第一步：配制各种成分的储备液：①B27；②IWP2 5mM。

第二步：在室温下将以上各种成分的储备液按照以上储备液编号顺序依次混合，成为终浓度为B27 1～3v％、IWP2 4～6μM的工作液。

3)心肌分化添加剂3：

第一步：配制各种成分的储备液：①B27

第二步：在室温下将以上储备液按照储备液编号与基础液混合，成为终浓度为B271～3v％的工作液。

4)心肌纯化添加剂：

第一步：配制各种成分的储备液：①B27②乳糖2g/ml。

第二步：在室温下将以上各种成分的储备液按照以上储备液编号顺序依次混合，成为终浓度为B27 1～3v％、乳糖1～3mg/ml的工作液。

二、实施例1-5的各心肌分化培养基和心肌纯化培养基的配制

实施例1-5及对比例1中的心肌分化培养基的组分如表1所示。

表1：

对比例1中的培养基为现有技术的体系。

将上述实施例1-5中的心肌分化培养基、纯化培养基按照如下步骤配制：

在2～8℃化冻心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2和心肌分化添加剂3，随后将心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2和心肌分化添加剂3分别按1ml:50ml的比例加入心肌分化基础培养基形成心肌分化培养基1、心肌分化培养基2和心肌分化培养基3，均可在2～8℃稳定储存达两周。

在2～8℃化冻心肌纯化添加剂，随后将心肌纯化添加剂按1ml:50ml的比例加入到心肌纯化基础培养基形成心肌纯化培养基，可在2～8℃稳定储存达两周。

三、心肌细胞分化实验

实验一：

1.实验材料：人肾上皮来源的诱导多能干细胞

2.培养基：实施例1-5中的心肌分化培养基

3.实验步骤：

1)人肾上皮来源的诱导多能干细胞的接种：将人肾上皮来源的诱导多能干细胞接种到铺有基质胶培养皿中，培养至汇合度达到85％左右；

2)向培养皿中依次加入心肌分化培养基1培养2天，心肌分化培养基3培养1天，心肌分化培养基2培养3天；

3)去除心肌分化培养基2，向培养皿中加入心肌纯化培养基，每隔一天换一次心肌纯化培养基，纯化3天；

4)将纯化的心肌细胞再接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中，换成心肌分化培养基3，每隔2天换一次心肌分化培养基3，可长期培养100天。

通过心肌细胞特异性标记物对各实施例及对比例诱导的心肌细胞进行染色鉴定。其中，图1A至图1D示出了实验一中实施例5的培养基分化人诱导多能干细胞在分化过程不同阶段的图像；其中，图1A是分化前(day0)的iPSC，图1B是分化72h的细胞形态，图1C是分化结束获得的心肌细胞，图1D是纯化处理获得的纯度≧99％的心肌细胞。

图2A和图2B示出的是心肌细胞特异性标记物染色的结果。图2A的左、中、右图分别示出的是诱导出的心肌细胞所表达主要的心肌特异性收缩蛋白Cardiac Troponin T、α-Sarcomeric-Actinin以及两者叠加之后的图；图2A显示了心肌细胞非常规则的肌理结构。图2B显示了实施例5的试剂盒诱导的心肌细胞由心室肌样细胞组成。其中，左图显示的是少量其他心肌细胞表达心房特异性轻链肌球蛋白MLC2a；中图显示的是心室肌样细胞表达心室特异性轻链肌球蛋白MLC2v；右图2显示的是两者叠加后的图，并对细胞核进行了特异染色。

实施例1～4的诱导分化过程及心肌细胞特异性标记物的染色结果与实施例5的结果类似，此处不再展示。

实验二：

1.实验材料：人ES细胞(该细胞的分离或获取不涉及违反社会公德的人胚胎的工业或商业目的的应用)

2.培养基：实施例1-5中的心肌分化培养基

3.实验步骤：

1)人ES细胞的接种：将人ES细胞接种到铺有基质胶的培养皿中，培养至汇合度达到85％左右；

2)向培养皿中加入心肌分化培养基1培养3天，心肌分化培养基3培养2天，心肌分化培养基2培养3天；

3)去除心肌分化培养基2，向培养皿中加入心肌纯化培养基，每隔一天换一次心肌纯化培养基，纯化3天；

4)将纯化的心肌细胞再接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中，换成心肌分化培养基3，每隔2天换一次心肌分化培养基3，可长期培养100天。

通过心肌细胞特异性标记物对各实施例及对比例进行染色鉴定，并根据染色结果统计各实施例及对比例的分化效率，实验结果如图3A和图3B所示。图3A示出了实施例1～5及对比例1的心肌细胞分化效率比较结果；图3B示出了实施例5的试剂盒诱导的心肌细胞NKX2.5启动子调控下特异性的表达绿色荧光蛋白(GFP)。由搏动和表达GFP的细胞比例显示，心肌细胞纯度达99％以上。图3B中，右上角的缩小图显示了整个视野下的分化后带荧光的细胞的比例，并以白光下的效果作为背景参照。

由图3A可以看出，在分化效率上，实施例5相比对比例1，提高了20％。在目前分化培养适合药物研发的心肌细胞的培养基种类相对较少的基础上，实施例5的培养基能够在对比例1的培养基的诱导分化效率基础上又提高20％多，是难以预料的。而且，分化效率的提高是实现心肌细胞的规模化量产的一个重要条件。此外，对比例1的培养基对分化后的心肌细胞的培养周期是难以达到100天的。而实施例5不仅分化效率大大提高，而且在需要的情况下可以被长期体外培养(可长达100天)，进而解决了现有技术难以实现心肌细胞大规模量产的问题。

实验三：

1.实验材料：人外周血来源的诱导多能干细胞

2.培养基：实施例1-5中的心肌分化培养基

3.实验步骤：

S1，人外周血来源的诱导多能干细胞的接种：将人外周血来源的诱导多能干细胞接种到铺有基质胶的培养皿中，培养至汇合度达到85％左右；

S2，向培养皿中加入心肌分化培养基1培养4天，心肌分化培养基3培养1天，心肌分化培养基2培养2天；

S3，去除心肌分化培养基2，向培养皿中加入心肌纯化培养基，每隔一天换一次心肌纯化培养基，纯化4天；

S4，将纯化的心肌细胞再接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中，换成心肌分化培养基3，每隔2天换一次心肌分化培养基3，可长期培养100天。

以实施例5分化的心肌细胞作为转染受体细胞，检测本申请的试剂盒诱导的心肌细胞的转染效率。检测结果如图4A和4B所示。图4A和4B分别显示心肌细胞转染GFP质粒(Lipofectamine LTX and PLUS Reagents)48h后在白光和荧光下的观察结果。经统计，GFP荧光比率达到50～60％。可见，本申请的试剂盒所诱导分化的心肌细胞的转染效率达50～60％。

此外，采用实时心肌细胞功能分析仪(RTCA)和膜片钳分别对上述实验一、实验二和实验三中各实施例及对比例所诱导分化及培养的心肌细胞的功能和电生理分别进行了检测。检测结果显示，本申请的试剂盒诱导的心肌细胞在无明显可见细胞死亡的情况下，维持存活达到3个月以上，并且能保持节律性的搏动。不仅能够用来排除具有心脏毒性的化合物，还能用于初步评价心血管类药物的疗效，极大地降低药物开发成本，并提高药物开发效率，是长期药物毒性实验和生理学研究的理想模型工具。

其中，图5A至图5C是实验三中实施例5的心肌功能分析结果。其中，图5A显示心肌细胞质量均一稳定且具备正常人心肌细胞的搏动幅度与频率。图5B显示心肌细胞在1.1μm异丙肾上腺素(Isoprenaline)的作用下心率显著提高，其中，0.1％DMSO处理作为阴性参照。图5C显示心肌细胞在1.1μm胺碘酮(Amiodarone)的作用下心率显著降低，其中，0.1％DMSO处理作为阴性参照。

图6A和图6B示出的是实验三中实施例5的膜片钳检测电生理的结果。图6A和图6B示出了实验三中实施例5的试剂盒诱导分化的心肌细胞的膜片钳电生理检测结果，图6A显示诱导的心肌细胞具备典型的自发动作电位，图6B显示诱导的心肌细胞具备经典的自发离子通道。

从上述实验一、实验二以及实验三的结果可以看出，本发明的心肌分化试剂盒成分明确，品质稳定且分化纯化效率高，细胞谱系广，可以分化包括各种来源的人诱导多能干细胞，胚胎干细胞H9、HCN4等细胞。而且，在需要的情况下可以培养长达100天，且能保持节律性的搏动。不仅能够用来排除具有心脏毒性的化合物，而且能够用于初步评价心血管类药物的疗效，极大地降低药物开发成本，并提高药物开发效率，是长期药物毒性实验和生理学研究的理想模型工具。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本申请的心肌分化试剂盒搭配合成包被基质使用，可以达到人源心肌细胞稳定的获得和维持，并且适用于包括药物开发和安全性评价在内的各种需求，为心血管药物开发和生理学研究奠定基础。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种心肌分化试剂盒，其特征在于，所述心肌分化试剂盒包括心肌分化基础培养基、心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2以及心肌分化添加剂3；

其中，所述心肌分化基础培养基为含糖1640培养基，

所述心肌分化添加剂1由2v％的B27、10ng/ml的BMP4以及6μM的CHIR99021组成；所述心肌分化添加剂2由2v％的B27以及2 5μM的IWP2组成；所述心肌分化添加剂3由2v％的B27组成；

所述心肌分化试剂盒还包括心肌纯化基础培养基及心肌纯化添加剂；其中，

所述心肌纯化基础培养基为无糖1640培养基；所述心肌纯化添加剂由2v％的B27以及2mg/ml的乳糖组成。

2.根据权利要求1所述的心肌分化试剂盒，其特征在于，所述心肌分化基础培养基和所述心肌纯化基础培养基保存在4～8℃，所述心肌分化添加剂1、所述心肌分化添加剂2、所述心肌分化添加剂3以及所述心肌纯化添加剂分别置于-20～-80℃保存。

3.根据权利要求2所述的心肌分化试剂盒，其特征在于，所述心肌分化试剂盒在使用前需配制成相应心肌分化培养基和心肌纯化培养基，所述配制成相应心肌分化培养基和心肌纯化培养基的步骤包括：

在2～8℃化冻所述心肌分化添加剂1、所述心肌分化添加剂2、所述心肌分化添加剂3及所述心肌纯化添加剂；

将所述心肌分化添加剂1、所述心肌分化添加剂2以及所述心肌分化添加剂3分别与所述心肌分化基础培养基以1:40～60的体积比混合后形成心肌分化培养基1、心肌分化培养基2以及心肌分化培养基3；

将所述心肌纯化添加剂与所述心肌纯化基础培养基以1:40～60的体积比混合后形成所述心肌纯化培养基。

4.根据权利要求2所述的心肌分化试剂盒，其特征在于，将所述心肌分化添加剂1、所述心肌分化添加剂2以及所述心肌分化添加剂3分别与所述心肌分化基础培养基以1:50的体积比混合后形成心肌分化培养基1、心肌分化培养基2以及心肌分化培养基3。

5.根据权利要求2所述的心肌分化试剂盒，其特征在于，将所述心肌纯化添加剂与所述心肌纯化基础培养基以1:50的体积比混合后形成所述心肌纯化培养基。

6.一种心肌细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：

将人多能干细胞接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中；所述人多能干细胞为人诱导多能干细胞；

向所述培养皿中依次加入心肌分化培养基1培养2～4天，心肌分化培养基3培养1～2天，心肌分化培养基2培养2～3天，得到分化细胞；

其中，所述心肌分化培养基1、所述心肌分化培养基2以及所述心肌分化培养基3分别采用如权利要求1至5中任一项所述的心肌分化试剂盒中的心肌分化基础培养基、以及心肌分化添加剂1、心肌分化添加剂2或心肌分化添加剂3配制而成。

7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，配制所述心肌分化培养基1、所述心肌分化培养基2以及所述心肌分化培养基3的步骤包括：

将所述心肌分化添加剂1、所述心肌分化添加剂2以及所述心肌分化添加剂3分别与所述心肌分化基础培养基以1:40～60的体积比混合后形成心肌分化培养基1、心肌分化培养基2以及心肌分化培养基3。

8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，将所述心肌分化添加剂1、所述心肌分化添加剂2以及所述心肌分化添加剂3分别与所述心肌分化基础培养基以1:50的体积比混合后形成心肌分化培养基1、心肌分化培养基2以及心肌分化培养基3。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的培养方法，其特征在于，在得到所述分化细胞之后，所述培养方法还包括对所述分化细胞进行心肌细胞纯化的步骤。

10.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于，对所述心肌细胞纯化的步骤包括：

去除所述心肌分化培养基2，然后向所述培养皿中加入心肌纯化培养基，每隔一天换一次所述心肌纯化培养基，纯化3～4天，获得纯化后的所述心肌细胞；

其中，所述心肌纯化培养基采用权利要求1至5中任一项所述的心肌分化试剂盒中的心肌纯化基础培养基及心肌纯化添加剂配制而成。

11.根据权利要求10所述的培养方法，其特征在于，配制所述心肌纯化培养基的步骤包括：

将所述心肌纯化添加剂与所述心肌纯化基础培养基以1:40～60的体积比混合形成所述心肌纯化培养基。

12.根据权利要求10所述的培养方法，其特征在于，配制所述心肌纯化培养基的步骤包括：

将所述心肌纯化添加剂与所述心肌纯化基础培养基以1:50的体积比混合形成所述心肌纯化培养基。

13.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于，在获得纯化后的所述心肌细胞之后，所述培养方法还包括维持培养纯化后的所述心肌细胞的步骤。

14.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于，维持培养纯化后的所述心肌细胞的步骤包括：

将纯化后的所述心肌细胞接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中，并向所述培养皿中添加心肌分化培养基3，每隔2天换一次所述心肌分化培养基3，培养60～100天。

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