CN110192552B - 甘酪二肽条件培养基在间充质干细胞冻存和制备商品化冻存保护剂方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了甘酪二肽条件培养基在间充质干细胞冻存和制备商品化冻存保护剂方面的应用。本发明研究发现甘酪二肽可以保证在不明显影响人羊水间充质干细胞表型、增殖活力和多向分化能力的前提下提高人羊水间充质干细胞的冻存复苏率，甘酪二肽以及含有甘酪二肽的条件培养基可以用于制备人羊水间充质干细胞的冻存保护剂。

Description

甘酪二肽条件培养基在间充质干细胞冻存和制备商品化冻存 保护剂方面的应用

技术领域

本发明属于干细胞领域，涉及干细胞冻存，具体涉及甘酪二肽条件培养基在间充质干细胞冻存和制备商品化冻存保护剂方面的应用。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化潜能，是细胞治疗及基因治疗的理想种子细胞。已有研究显示：骨髓和脐血中均可以培养出MSCs，但骨髓源性MSCs存在病毒污染的可能和随着年龄增长细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势的缺点，而脐血MSCs培养存在收益率低，不稳定等缺点，应用都受到一定的限制。最近研究显示羊水是MSCs新的来源，相对骨髓和脐血而言，具有来源广阔、取材无创等优势。对羊水间充质干细胞(Amniotic fluid-derivedmesenchymal stem cells，AF-MSCs)的分离培养、冻存复苏、生物学特性的研究也逐渐增多。

冯建勋等研究了超低温冻存对人羊水间充质干细胞生物学特性的影响，通过羊膜腔穿刺取得人孕16～23周羊水，分离培养出人AF-MSC，将第4代人AF-MSC经短期超低温冻存、复苏后，通过细胞活性率测定、形态学比较、细胞增殖功能测定、细胞周期分析及细胞表面抗原检测，观察超低温冻存对人AF-MSC生物学特性的影响，结果第4代人AF-MSC冻存、复苏前后的两组细胞无论在细胞活性率、细胞形态、细胞增殖能力、细胞周期、细胞表面抗原的表达等方面均无显著性差异，证明短期的超低温冻存对人AF-MSC的生物活性无明显影响(超低温冻存对人羊水间充质干细胞生物学特性的影响，中国现代医学杂志，2010)。冯建勋等采用的冻存方法为：取约90％融合的生长旺盛的第4代AF-MSC，消化离心，去除上清，加入含50％α-MEM、40％胎牛血清及10％DMSO的冻存保护液，制成细胞悬液，以10⁶/mL的密度，总体积为1mL，装入2mL的冻存管中，将冻存管先置于4℃冰箱1h，然后转移至-80℃低温冰箱中过夜，最后投入液氮罐内(-196℃)长期冻存。遗憾的是，该文献并没有公开-196℃冻存时间，导致其参考价值大打折扣。

王一茹等对人羊水来源间充质干细胞冻存后的生物学特征进行了研究，其采用的冻存方案为：采用不同比例的DMEM培养基、胎牛血清和DMSO，梯度降温至-80℃过夜，次日投入液氮冻存12周，且最优条件下细胞存活率仅为82％～83％(人羊水来源间充质干细胞冻存后生物学特征研究，中国修复重建外科杂志，2012)。

结合文献报道和实践，如何提高人羊水来源间充质干细胞的冻存效果，采用何种组成的冻存培养基，采用何种冻存方案，冻存时间如何选择都面临很多技术难题需要克服。目前，为了提高人羊水来源间充质干细胞的冻存复苏率，基本都会使用到液氮超低温冻存，但是，液氮超低温冻存的冻存、复苏过程步骤较多，复苏过程的温度骤变对细胞的损伤也不容忽视。一个月左右的短期冻存采用零下八十度更为实际，但是需要保证足够的冻存复苏率。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供甘酪二肽条件培养基在人羊水间充质干细胞冻存和制备商品化冻存保护剂方面的应用，以保证在不明显降低人羊水间充质干细胞增殖活力和多向分化能力的前提下提高人羊水间充质干细胞的冻存复苏率。

本发明目的通过以下方案实现：

甘酪二肽条件培养基在人羊水间充质干细胞冻存方面的应用。。

进一步地，所述甘酪二肽条件培养基为含有甘酪二肽的低糖DMEM培养基。

更进一步地，甘酪二肽浓度为100nM。

进一步地，用于在不明显影响人羊水间充质干细胞表型、增殖活力和多向分化能力的前提下提高人羊水间充质干细胞的冻存复苏率。

甘酪二肽在制备用于提高人羊水间充质干细胞冻存复苏率的培养基方面的应用应用。

进一步地，用于在不明显影响人羊水间充质干细胞表型、增殖活力和多向分化能力的前提下提高人羊水间充质干细胞的冻存复苏率。

一种甘酪二肽条件培养基，由甘酪二肽和低糖DMEM培养基组成。

进一步地，甘酪二肽浓度为100nM。

上述甘酪二肽条件培养基在制备人羊水间充质干细胞冻存保护剂方面的应用。

技术效果：

本发明研究发现甘酪二肽可以保证在不明显影响人羊水间充质干细胞表型、增殖活力和多向分化能力的前提下提高人羊水间充质干细胞的冻存复苏率，甘酪二肽以及含有甘酪二肽的条件培养基可以用于制备人羊水间充质干细胞的冻存保护剂。

附图说明

图1为人羊水间充质干细胞的形态学观察，可见细胞排列较整齐，似成纤维样细胞，漩涡状生长，符合人羊水间充质干细胞的形态学特征；

图2为人羊水间充质干细胞细胞表面标志物的流式检测结果，CD44、CD29、CD105阳性表达，CD34、CD45、HLA-DR阴性表达，符合人羊水间充质干细胞的表面标志物特征；

图3为细胞存活率检测结果，与冻存前相比，对照组冻存复苏后的细胞存活率显著降低，实验组冻存复苏后的细胞存活率降低不明显；

图4为冻存前后干细胞表型测定结果，实验组冻存后与冻存前表型基本一致，说明本发明冻存保护剂不会影响人羊水间充质干细胞的表型；

图5为冻存前和实验组复苏后的人羊水间充质干细胞的增殖曲线，二者增殖曲线基本一致，说明本发明冻存保护剂不会影响人羊水间充质干细胞的增殖能力；

图6为茜素红染色和油红O染色结果图，可见实验组复苏后的人羊水间充质干细胞的多向分化能力与冻存前人羊水间充质干细胞的多向分化能力基本一致，说明本发明冻存保护剂不会影响人羊水间充质干细胞的多向分化能力能力。

具体实施方式

实施例1：细胞冻存、复苏及特性检测

一、实验材料

羊水间充质干细胞HuFACs-11为实验室液氮冻存，原始购自上海雅吉生物。

小牛血清购自上海素尔生物科技有限公司，品牌为Gibco。

碱性成纤维生长因子购自美国Sigma公司。

低糖DMEM培养基L-DMEM购自美国Gibco公司。

FITC或PE标记的小鼠抗人抗体CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、HLA-DR及同型对照购自BD Biosciences。

甘酪二肽(CAS号658-79-7)购自武汉市森迪泰科技有限公司，纯度99％。

程序降温盒的品牌为Nalgene。

二、实验方法

1、人羊水间充质干细胞的培养

将液氮冻存的人羊水间充质干细胞复苏后用含有20％小牛血清和2ng/mL碱性成纤维生长因子的低糖DMEM培养基(L-DMEM)于体积分数5％CO₂、37℃培养箱中培养，细胞生长达到80％融合时按1:4的比例传代。

2、人羊水间充质干细胞的鉴定

2.1形态学观察

取对数生长期的人羊水间充质干细胞置于倒置显微镜下观察细胞形态。

2.2细胞表型检测

取对数生长期的人羊水间充质干细胞，PBS洗涤3次后用PBS制成浓度为2×10⁶/mL的细胞悬液。取多支流式管，分别加入FITC或PE标记的小鼠抗人抗体CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、HLA-DR及同型对照，然后将人羊水间充质干细胞悬液加入已加入抗体试剂的流式管内，充分混匀，置4℃冰箱避光孵育30min，离心取细胞沉淀，PBS洗涤3次后用PBS制成细胞悬液，上流式细胞仪检测，CellQuest软件分析结果。

3、分组、冻存和复苏

取对数生长期的人羊水间充质干细胞，随机分为对照组和实验组，对照组以体积比为5:4:1的低糖DMEM培养基、小牛血清和DMSO混合液体作为冻存保护剂，实验组以体积比为5:4:1的低糖DMEM条件培养基、小牛血清和DMSO混合液体作为冻存保护剂，低糖DMEM条件培养基为含有100nM甘酪二肽的低糖DMEM培养基，将对照组和实验组分别用对应的冻存保护剂调节细胞密度为2×10⁷/mL，吸入到1.8mL冻存管中，每支冻存管中装量为1mL。每管贴上标签，放入程序降温盒，放入-80℃冰箱。

冻存一个月后，将冻存管自-80℃冰箱中取出，迅速投入到40℃温水中，持续振荡，促使冻存管内容物在两分钟内溶解，4℃离心弃上清，用4℃预冷的生理盐水重悬细胞，离心收集细胞，再用生理盐水洗涤两次，用低糖DMEM培养基重悬调节密度为1×10⁶/mL。

4、细胞存活率检测(台盼蓝拒染法)

用台盼蓝拒染法分别测定冻存前、对照组和实验组人羊水间充质干细胞的存活率。冻存前存活率测定的样本为冻存之前的对数生长期人羊水间充质干细胞，用低糖DMEM培养基重悬调节密度为1×10⁶/mL；对照组和实验组测定的样本为冻存复苏后用低糖DMEM培养基重悬调节密度为1×10⁶/mL的对照组和实验组细胞。各组设置三个平行。按台盼蓝拒染法标准流程对不同样本染色后于镜下观察并计数染色细胞，按照公式“细胞存活率＝(1-台盼蓝染色细胞数/总细胞数)×100％”计算各样本的细胞存活率。

5、冻存后干细胞表型测定

将上述实验组复苏后的人羊水间充质干细胞于体积分数5％CO₂、37℃培养箱中培养6h后，PBS洗涤3次，用PBS制成浓度为2×10⁶/mL的细胞悬液，按照“2.2细胞表型检测”方法测定冻存后人羊水间充质干细胞的表型。

6、细胞增殖活力检测(MTT绘制增殖曲线法)

分别取冻存前和实验组复苏后的人羊水间充质干细胞，用含有20％小牛血清和2ng/mL碱性成纤维生长因子的低糖DMEM培养基以1×10⁵/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，一共7块板，每块板上各组设6个复孔，于体积分数5％CO₂、37℃培养箱中培养，每两天更换培养液，从第2天起，每隔24h随机取出1块96孔板，加入20μL浓度为5g/L的MTT溶液继续培养4h，弃上清液，每孔加入150μLDMSO，置摇床上低速连续振荡10min。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光度值，每次测定以同一批次的DMSO校零。最后，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

7、细胞多向分化能力检测(成骨和成脂分化能力)

分别取冻存前和实验组复苏后的人羊水间充质干细胞，用含有20％小牛血清和2ng/mL碱性成纤维生长因子的低糖DMEM培养基以1×10⁵/mL的密度接种于6孔板，每孔3mL，于体积分数5％CO₂、37℃培养箱中培养，24h后，更换为成骨诱导培养基或成脂诱导培养基进行成骨诱导或成脂诱导培养，每3d更换一次培养基。成骨诱导培养基为含有20％小牛血清、100nmol/L地塞米松、50μmol/L抗坏血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠的低糖DMEM培养基，成脂诱导培养基为含有20％小牛血清、1μmol/L地塞米松、1mmol/L IBMX、10μg/mL胰岛素、100μmol/L吲哚美辛的低糖DMEM培养基。诱导培养17d后，成骨诱导培养孔进行茜素红染色，成脂诱导培养孔进行油红O染色，倒置荧光显微镜下观察染色结果。

8、数据处理与分析

采用SPSS 17.0进行数据处理，数据以均值±标准偏差表示，不同组间样本比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

三、实验结果

1、形态学观察结果

观察结果如图1所示，可见细胞排列较整齐，似成纤维样细胞，漩涡状生长，符合人羊水间充质干细胞的形态学特征。

2、细胞表面标志物的流式检测结果

流式检测结果如图2所示，CD44、CD29、CD105阳性表达，CD34、CD45、HLA-DR阴性表达，符合人羊水间充质干细胞的表面标志物特征。

3、人羊水间充质干细胞的存活率检测结果

存活率检测结果如表1和图3所示，与冻存前相比，对照组冻存复苏后的细胞存活率显著降低，实验组冻存复苏后的细胞存活率降低不明显。

表1存活率检测结果

组别	平行A(％)	平行B(％)	平行C(％)	均值±标准偏差(％)
					冻存前	98.15	96.54	98.62	97.77±1.09
对照组	78.83	81.06	77.14	79.01±1.97
					实验组	93.02	94.79	95.27	94.36±1.19

4、冻存后干细胞表型测定结果

实验组复苏后的人羊水间充质干细胞表型测定结果如表2和图4所示，CD44、CD29、CD105阳性表达，CD34、CD45、HLA-DR阴性表达，与冻存前表型基本一致，说明本发明冻存保护剂不会影响人羊水间充质干细胞的表型。

表2干细胞表型测定结果

组别	CD44	CD29	CD105	CD34	CD45	HLA-DR
							冻存前	94.86	95.15	92.79	0.58	1.15	1.63
实验组	95.22	93.97	93.86	0.73	0.98	1.84

5、细胞增殖活力检测结果

冻存前和实验组复苏后的人羊水间充质干细胞的增殖曲线如图5所示，二者增殖曲线基本一致，说明本发明冻存保护剂不会影响人羊水间充质干细胞的增殖能力。

6、细胞多向分化能力检测结果

茜素红染色和油红O染色结果如图6所示，实验组复苏后的人羊水间充质干细胞的多向分化能力与冻存前人羊水间充质干细胞的多向分化能力基本一致，说明本发明冻存保护剂不会影响人羊水间充质干细胞的多向分化能力能力。

综合以上实验结果，甘酪二肽可以保证在不明显影响人羊水间充质干细胞表型、增殖活力和多向分化能力的前提下提高人羊水间充质干细胞的冻存复苏率，甘酪二肽以及含有甘酪二肽的条件培养基可以用于制备人羊水间充质干细胞的冻存保护剂。

实施例2：一种甘酪二肽条件培养基

一种甘酪二肽条件培养基，由低糖DMEM培养基和甘酪二肽组成，甘酪二肽的浓度为100nM。该甘酪二肽条件培养基可以用于制备人羊水间充质干细胞的冻存保护剂。

实施例3：一种人羊水间充质干细胞的冻存保护剂

一种人羊水间充质干细胞冻存保护剂由体积比为5:4:1的低糖DMEM条件培养基、小牛血清和DMSO组成，低糖DMEM条件培养基为含有100nM甘酪二肽的低糖DMEM培养基。

Claims (1)

1.甘酪二肽条件培养基在人羊水间充质干细胞-80℃冻存方面的应用， 其中，所述甘酪二肽条件培养基为含有100nM甘酪二肽的低糖DMEM培养基。

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