CN109744227A - 一种细胞冻存液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞领域，特别涉及细胞冻存液，及其应用。所述细胞冻存液由渗透性保护剂、非渗透性保护剂、提供能量的试剂等混合物构成。可应用于贴壁细胞及悬浮细胞的冻存和临床应用细胞的冻存。细胞在该细胞冻存液中冻存复苏后培养的存活率在98％以上，细胞的各项指标检测显示其功能保持完好，这表明本发明的细胞冻存液可以很好地保持细胞的生理学功能，无变异、无致瘤性等。本发明的细胞冻存液配制步骤简单、易于操作、应用范围广、便于研究及临床推广使用。

Description

一种细胞冻存液及其应用

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种细胞冻存液及其应用。

背景技术

在细胞培养的传代及日常维持过程中，细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。把细胞储存在液氮中，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样可以在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。

细胞冻存方法往往存在细胞复苏活率低、状态差等问题。液氮冷冻保存细胞不当，会使细胞内外的水分很快形成冰晶，引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。

本发明应用渗透性保护剂和非渗透性保护剂，结合了两者的优势。与单独使用渗透性保护剂相比能更大程度的减少细胞在冻存、复苏时的损伤。细胞冻存采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。加适量的海藻糖、葡聚糖等非渗透性的保护液，它可与渗透作用、细胞膜磷脂、不稳定蛋白的特异性相互作用，防止它们因干燥和氧化应激而受损和变性。复苏细胞时采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。在细胞冻存中使用渗透性保护剂和非渗透性保护剂，两者协同作用，减少了细胞内冰晶的形成同时抑制细胞外结冰，保护细胞膜，从而减少冰晶对细胞造成的损伤。该冻存液适用于贴壁细胞及悬浮细胞，如脂肪间充质干细胞、成纤维细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐血间充质干细胞、骨髓间充质干细胞等、NK细胞、CIK细胞、DC细胞、CAR-T细胞等。而且冻存复苏后细胞存活率在98％以上，经细胞特性分析、功能性分析和安全性等方面测定，显示细胞冻存后功能保持完好、无变异、无致瘤性，适用于各种临床应用细胞的冻存使用。

发明内容

本发明目的在于提供一种配制步骤简单、易于操作、应用范围广、便于研究及临床推广使用，冻存后复苏成活率高的细胞冻存液。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

细胞冻存液由渗透性保护剂：二甲基亚砜、甘油等；非渗透性保护剂：葡聚糖、海藻糖等；提供能量类试剂：人血白蛋白、马血清、胎牛血清、小牛血清；余量为培养基，如DMEN培养基、无血清培养等组成。

所述的渗透性保护剂二甲基亚砜的体积百分含量为9％～15％，所述的非渗透性保护剂海藻糖或葡聚糖的体积百分含量为0.5％～1％，所述的提供能量类试剂人血白蛋白的体积百分含量为1％～5％，所述的马血清、胎牛血清或小牛血清的体积百分含量为10％～20％，余量为DMEN培养基或无血清培养基等。

申请人发现各组分的浓度在该范围内，其细胞复苏后活力在98％以上。

一种细胞冻存液的制备方法，在DMEM培养基中加入人血白蛋白、胎牛血清或马血清、葡聚糖、海藻糖、二甲基亚砜。

本发明的渗透性保护剂二甲基亚砜可以防止细胞破裂，降低细胞内水的熔点，防止形成晶体。采用“慢冻快融”的方法，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。葡聚糖可以提高细胞外的渗透压，减少细胞内的自由水，进入细胞内，替代细胞内的自由水，减少因细胞冻存过程产生冰晶对细胞带来的损伤；可以很好的维持渗透压，在温度下降的过程中，仍能维持良好的渗透压环境，避免了细胞因温度下降、渗透压改变而出现细胞死亡的现象。作为细胞外保护剂，可保护细胞膜在冻存过程中不受到损伤；其与渗透性保护剂二甲基亚砜相辅相成，起到协同作用。人血白蛋白占血浆总蛋白的40％～60％。能够维持血浆胶体渗透压的恒定且承担一定的运输功能；人血白蛋白占血浆胶体渗透压的80％，主要调节组织与血管之间水分的动态平衡。在本发明中人血白蛋白可以维持细胞内外渗透压平衡；培养基可以为细胞提供营养，使其在复苏时更快的恢复生长。并且冻存后的细胞各项指标检测显示其功能保持完好，具有稳定性；检测安全性为无毒、无刺激、无菌、无热原，符合注射剂的规定，可用于细胞临床应用的细胞冻存。

上述冻存液进行细胞冻存的实验步骤是：

细胞冻存步骤：

a)配制细胞冻存液，在细胞培养基中加入人血白蛋白、马血清或胎牛血清、小牛血清，得到溶液I；在细胞培养基中加入葡聚糖、海藻糖、二甲基亚砜，得到溶液II；

b)从细胞培养瓶或细胞培养袋中收集所需冻存的细胞，经离心后获得细胞沉淀；

c)把溶液I缓慢加入细胞中，混匀细胞；

d)把溶液II缓慢滴入细胞悬液中，混匀；

e)按照浓度为1×10⁶～5×10⁶个/管的细胞悬浮液，分装上述细胞悬液；

f)置于-20℃冰箱2h，然后置于-80℃过夜后移入液氮保存；或选用程序降温仪操作后移入液氮保存。

细胞复苏步骤：

从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并摇动令其尽快融化。从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；离心；弃去上清液，加入相应细胞培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明提供了一种细胞冻存液，包括以下体积百分含量的组分：9％～12％二甲基亚砜、0.5％～1％海藻糖、1％～5％人血白蛋白、10％～20％马血清，余量为DMEM培养基；9％～12％二甲基亚砜、0.5％～1％海藻糖、1％～5％人血白蛋白、10％～20％胎牛血清或小牛血清，余量为DMEM培养基；9％～12％二甲基亚砜、0.2％～0.5％葡聚糖、1％～5％人血白蛋白，余量为无血清培养基。

本发明所述细胞冻存液优选按照以下方法制备得到：

在DMEM培养基中加入人血白蛋白或马血清，得到溶液I；溶液I缓慢与细胞混匀；在DMEM培养基中加入葡聚糖、海藻糖、二甲基亚砜得到溶液II，把其缓慢加入细胞悬液中，混匀后按照复苏所需细胞数分装细胞悬液然后将细胞悬浮液程序降温至-80℃，转入液氮保存。

本发明的冻存液可以冻存多种人体细胞，如脂肪间充质干细胞、成纤维细胞、脐带间充质干细胞、脐血间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、NK细胞、CIK细胞、DC细胞、CAR-T细胞等。

【实施例1】冻存液在成纤维细胞中的应用

本发明的细胞冻存液的一种实施例，所述冻存液由下述浓度的成分组成：9％二甲基亚砜、0.3％海藻糖、1％人血白蛋白、10％马血清，余量为DMEM培养基。

具体操作为：在DMEM培养基中加入1％人血白蛋白、10％马血清，得到溶液I在DMEM培养基中加入9％二甲基亚砜、0.3％海藻糖，得到溶液II。把培养至适合冻存期的成纤维细胞，用胰蛋白酶消化离心后收集细胞，获得细胞沉淀；把溶液I缓慢加入细胞中，混匀细胞；把溶液II缓慢滴入细胞悬液中，混匀细胞悬液。按照浓度为1×10⁶～5×10⁶个/管的细胞悬浮液，分装细胞悬液，置于-20℃冰箱2h，然后置于-80℃过夜后移入液氮保存；或选用程序降温仪操作后移入液氮保存。

细胞复苏：从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并摇动令其尽快融化。从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；离心，1000rpm，5min；弃去上清液，加入含10％马血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；继续培养。由计数结果和细胞生长密度可得，该细胞复苏后成活率在98％以上。

【实施例2】冻存液在脐带间充质干细胞中的应用

本发明的细胞冻存液的一种实施例，所述冻存液由下述浓度的成分组成：10％二甲基亚砜、0.5％海藻糖、5％人血白蛋白、15％马血清，余量为DMEM培养基。

具体操作为：在DMEM培养基中加入5％人血白蛋白、15％马血清，得到溶液I；在DMEM培养基中加入10％二甲基亚砜、0.5％海藻糖，得到溶液II。把培养至适合冻存期的脐带间充质干细胞，用胰蛋白酶消化离心后收集细胞，获得细胞沉淀；把得到溶液I慢加入细胞中，混匀细胞；把溶液II缓慢滴入细胞悬液中，混匀细胞悬液。按照浓度为1×10⁶～5×10⁶个/管的细胞悬浮液，分装细胞悬液；置于-20℃冰箱2h，然后置于-80℃过夜后移入液氮保存；或选用程序降温仪操作后移入液氮保存。

细胞复苏：从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并摇动令其尽快融化。从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；离心，1000rpm，5min；弃去上清液，加入含10％马血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养。由计数结果和细胞生长密度可得，该细胞复苏后成活率在98％以上。

【实施例3】冻存液在免疫细胞中的应用

本发明的细胞冻存液的一种实施例，所述冻存液由下述浓度的成分组成：10％二甲基亚砜、0.4％葡聚糖、5％人血白蛋白，余量为无血清培养基。

具体操作为：在无血清培养基中加入5％人血白蛋白，得到溶液I；在DMEM培养基中加入10％二甲基亚砜、0.4％海藻糖，得到溶液II。把培养至对数生长期的免疫细胞如：NK细胞、CIK细胞、DC细胞、CART细胞等，离心后收集细胞，获得细胞沉淀；把溶液I缓慢加入细胞中，混匀细胞；把溶液II缓慢滴入细胞悬液中，混匀细胞悬液。按照浓度为1×10⁶～5×10⁶个/管的细胞悬浮液，细胞悬液；置于-20℃冰箱2h，然后置于-80℃过夜后移入液氮保存；或选用程序降温仪操作后移入液氮保存。

细胞复苏：从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并摇动令其尽快融化。从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；离心，2100rpm，6min；弃去上清液，加入培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；次日补加一次培养液，继续培养。每天观察细胞的生长状况，可见细胞长势良好；待培养结束时，取样计数，所得细胞计数结果与正常培养细胞计数结果对比，基本无差异，该细胞复苏后成活率在98％以上，且细胞的状态和生长不受冻存的影响。

【实施例4】临床应用细胞的冻存

本发明的细胞冻存液的一种实施例，所述冻存液由下述浓度的成分组成：9％二甲基亚砜、0.3％海藻糖、1％人血白蛋白、10％马血清，余量为DMEM培养基。

具体操作为：在DMEM培养基中加入1％人血白蛋白、10％马血清，得到溶液I在DMEM培养基中加入9％二甲基亚砜、0.3％海藻糖，得到溶液II。把临床应用的间充质干细胞，用胰蛋白酶消化离心后收集细胞，获得细胞沉淀；把溶液I缓慢加入细胞中，混匀细胞；缓慢滴入溶液II，混匀细胞悬液。按照浓度为1×10⁶～5×10⁶个/管的细胞悬浮液，分装细胞悬液，置于-20℃冰箱2h，然后置于-80℃过夜后移入液氮保存；或选用程序降温仪操作后移入液氮保存。

冻存后细胞的临床应用。如从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并摇动令其尽快融化。从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；离心，弃去上清液，根据使用要求选择溶液，如用注射用生理盐水润洗细胞，即可按照临床使用要求进行使用。

Claims (10)

1.细胞冻存液，其特征在于，所述的细胞冻存液组分有渗透性保护剂：二甲基亚砜、甘油等；非渗透性保护剂：葡聚糖、海藻糖等；提供能量类试剂：人血白蛋白、马血清、胎牛血清、小牛血清等；余量为培养基，如DMEN培养基、无血清培养等。

2.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述的组分渗透性保护剂二甲基亚砜等的体积百分含量为9％～15％，所述非渗透性保护剂海藻糖或葡聚糖等的体积百分含量为0.5％～1％，所述的人血白蛋白的体积百分含量为1％～5％，所述的马血清、胎牛血清或小牛血清的体积百分含量为10％～20％，余量为DMEN培养基或无血清培养基。

3.根据权利要求1-2所述的细胞冻存液，其特征在于，所述提供能量试剂选自人血白蛋白、马血清、胎牛血清、小牛血清中的至少一种。

4.根据权利要求1-4任一项所述细胞冻存液制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将权利要求3所述的提供能量试剂加入培养基中混匀，得到溶液I；

(2)将权利要求1所述的二甲基亚砜加入混有葡聚糖或海藻糖的培养基中得到溶液II。

5.根据权利要求1-4的冻存液的使用方法为：需要冻存的细胞与溶液I混合均匀，然后把溶液II缓慢加入其中。

6.权利要求1-5任一项所述的细胞冻存液应用在细胞冻存及复苏中。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，冷冻保存细胞的具体方法为：向细胞中加入所述细胞冻存液，得到浓度为1×10⁶～5×10⁷个/管的细胞悬浮液；然后将细胞悬浮液程序降温至-80℃，转入液氮保存。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，冷冻保存的细胞复苏具体方法为：从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并摇动令其尽快融化；从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；离心；弃去上清液，加入相应细胞的培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述细胞为贴壁细胞和悬浮细胞如：脂肪间充质干细胞、成纤维细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐血间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、NK细胞、CIK细胞、DC细胞、CAR-T细胞等。

10.根据权利要求1-8所述的应用，其特征在于，冻存复苏后细胞存活率在98％以上，各项检测显示细胞功能保持完好、无变异、无致瘤性，可用于各种临床应用细胞的冻存。