CN112458044A - 一种适用的人胎盘间充质干细胞的复苏方法 - Google Patents

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Abstract

本发明专利公开了一种适用的人胎盘间充质干细胞的复苏方法，具体涉及组织复苏的技术领域。一种适用的人胎盘间充质干细胞的复苏方法，包括如下步骤：将无血清培养基放置于恒温水浴锅内；将冻存管至于恒温水浴锅中，待冻存管内的冰晶快完全融化前取出；向离心管内加入4ml的培养基，再将冻存管内的细胞悬液吸入离心管的培养基内，轻轻吹打混合，将离心管进行离心处理；将离心管内的上清液弃掉，再将弃掉上清液的细胞和培养基共同置于培养瓶中培养；将培养瓶放置于37℃的二氧化碳恒温培养箱中培养，培养箱内二氧化碳气体的含量为5％。采用本发明技术方案解决了现有的胎盘组织复苏方法存在效率低的问题，可用于胎盘间充质干细胞的复苏。

Description

一种适用的人胎盘间充质干细胞的复苏方法
技术领域
本发明涉及组织复苏的技术领域，特别涉及一种适用的人胎盘间充质干细胞的复苏方法。
背景技术
胎盘是宝宝赖以生存的各种营养物质输送的纽带，由羊膜、绒毛膜和底蜕膜构成。羊膜和绒毛膜来源于胎儿，底蜕膜则起源于母体。胎盘除在胎儿发育、营养支持和维持耐受中发挥重要作用外，还是一个机体的干细胞储备库。
胎盘中有多种多能干细胞，目前已知的至少有三类胎盘干细胞。胎盘中第一类多能干细胞为间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，MSCs是一类能够自我更新，具有多向分化能力的多能干细胞，可以分化为骨、软骨、脂肪、神经和肝细胞等组织细胞。
目前，胎盘组织分离干细胞的方法和技术还不是完全成熟，而且每一份胎盘组织的处理和分离后的细胞培养都需要一定的时间和人员的消耗。因此将胎盘组织冻存并且在有需要的时候复苏进行干细胞分离的做法相对更符合成本效益。因此，急需一中简单和高效的胎盘组织冻存和复苏方法，以满足医药、科研、临床等领域的需求。
发明内容
本发明意在提供一种适用的人胎盘间充质干细胞的复苏方法，解决了现有的胎盘组织复苏方法存在效率低的问题。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种适用的人胎盘间充质干细胞的复苏方法，包括如下步骤：
包括如下步骤：
S102、将无血清培养基放置于37℃的恒温水浴锅内，水浴15min；
S104、将冻存管至于S102中的恒温水浴锅中，待冻存管内的冰晶快完全融化前取出；
S106、取一离心管并向离心管内加入4ml的无血清培养基，再将S104中冻存管内的细胞悬液吸入离心管的无血清培养基内，轻轻吹打混合，将离心管在转速为1000rpm下离心8min，离心过程中温度保持在24℃；
S108、将S106中离心管内的上清液弃掉，再将弃掉上清液的细胞和8ml的无血清培养基共同置于75T的培养瓶中培养，并轻轻来回摇动培养瓶，使细胞分散均匀；
S110、将S108中培养瓶放置于37℃的二氧化碳恒温培养箱中培养，培养箱内二氧化碳气体的含量为5％。
进一步的，定时将步骤S110中的培养瓶倒置于显微镜下观察细胞形态，待细胞出现变色后更换培养瓶内的无血清培养基。
进一步的，步骤S110中无血清培养基的更换方法是：
S1101、吸出S110中培养瓶内的无血清培养基，并向培养瓶内加入2ml的PBS缓冲液进行清洗；
S1102、吸出S1101中培养瓶内的PBS缓冲液，再向培养瓶内加入7ml的无血清培养基；
S1103、将步骤S110中的培养瓶倒置于显微镜下观察细胞形态，待细胞未出现变色即完成无血清培养基更换。
通过上述设置，可实现细胞培养基的更换，从而可有效的提高经本方案复苏的细胞的存活率。
与现有技术相比，本方案的有益效果：本方案可实现胎盘间充质干细胞快速复苏，并且复苏后的细胞存活率高。
附图说明
图1是实施例中P5代人胎盘间充质干细胞复苏后1d和4d的示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
实施例
如附图1所示：一种适用的人胎盘间充质干细胞的复苏方法，包括如下步骤：
S102、提前30min将超净台上的紫外灯开启，然后将恒温水浴锅放置在超净台上，并将无血清培养基放置于恒温水浴锅内，水浴时间为15min，水浴过程中温度保持在37℃。
S104、将冻存管至于S102中的恒温水浴锅中，待冻存管内的细胞冰晶快完全融化前取出；本实施例中冻存管内细胞传代冻存采用如下的方法：
S1、提前30min将超净台上的紫外灯开启，然后将恒温水浴锅放置在超净台上，再分别将装有无血清培养基、带血清培养基、以及胰蛋白酶的试管放置在上述的恒温水浴锅内，水浴时间为15min，水浴过程中温度保持在37℃。
S2、当细胞融合度达到80-90％时进行传代冻存，将需要冻存的细胞置于培养瓶中；此时将S1中无血清培养基加入培养瓶内。
S3、将S2中培养瓶内的无血清培养基吸出，并向培养瓶内加入2ml的PBS缓冲液进行清洗。
S4、将S2中培养瓶内的PBS缓冲液吸出，并向培养瓶内加入1ml的胰蛋白酶，随即旋紧瓶盖，并轻轻摇晃培养瓶，用掌心拍打瓶身，待培养瓶内的胰蛋白酶反应1-2min后将培养瓶倒置于显微镜下观察细胞形态。
S5、向S4的培养瓶内加入1ml带血清培养基以终止瓶内的反应，然后通过吹打的方式(10次左右)使培养瓶内的细胞和培养基混合均匀，混合后吸取细胞悬液于离心管中，再将离心管放置在离心机内进行离心处理，离心机的转速调节为1000rpm、离心时间为8min，离心过程中温度保持在24℃。
S6、将S5中离心后的离心管内的上清液弃掉，再向离心管内加入1ml的无血清培养基，再通过吹打的方式(15次左右)使离心管内的细胞与培养基混合，将离心管内混合后的细胞悬液取900ul置于冻存管，再向冻存管内加入100ul的DMSO并进行吹打混合，最后利用封口膜对冻存管的管口进行封口处理，并立即将冻存设备中，保存于-80℃。
在将上述无血清培养基与离心管内的细胞吹打混合后，还可吸取10ul的细胞悬液于血球计数板中，并将血球计数板倒置于显微镜下进行观察计数，并分别计数4个16小方格内的细胞数量，取其平均数，从而得到细胞密度为该平局数*104。
S106、取一离心管并向离心管内加入4ml的无血清培养基，再将S104中冻存管内的细胞悬液吸入离心管的无血清培养基内，轻轻吹打混合，将离心管在转速为1000rpm下离心8min，离心过程中温度保持在24℃；
S108、将S106中离心管内的上清液弃掉，再将弃掉上清液的细胞和8ml的无血清培养基共同置于75T的培养瓶中培养，并轻轻来回摇动培养瓶，使细胞分散均匀(上述细胞的接种密度需要达到50％以上)；
S110、将S108中培养瓶放置于37℃的二氧化碳恒温培养箱中培养，培养箱内二氧化碳气体的含量为5％。定时将上述的培养瓶倒置于显微镜下观察细胞形态，待细胞出现变色后更换培养瓶内的无血清培养基。
上述培养瓶内培养基的更换方法是：
S1101、吸出S110中培养瓶内的培养基，并向培养瓶内加入2ml的PBS缓冲液进行清洗；
S1102、吸出S1101中培养瓶内的PBS缓冲液，再向培养瓶内加入7ml的无血清培养基；
S1103、将步骤S110中的培养瓶倒置于显微镜下观察细胞形态，待细胞未出现变色即完成培养基更换。
经实验就研究发现传代次数不宜过多，P6代的细胞不适合实验，自然分化成纤维细胞。
以上的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (3)

1.一种适用的人胎盘间充质干细胞的冻存和复苏方法，其特征在于：包括如下步骤：
S102、将无血清培养基放置于37℃的恒温水浴锅内，水浴15min；
S104、将冻存管至于S102中的恒温水浴锅中，待冻存管内的冰晶快完全融化前取出；
S106、取一离心管并向离心管内加入4ml的无血清培养基，再将S104中冻存管内的细胞悬液吸入离心管的无血清培养基内，轻轻吹打混合，将离心管在转速为1000rpm下离心8min，离心过程中温度保持在24℃；
S108、将S106中离心管内的上清液弃掉，再将弃掉上清液的细胞和8ml的无血清培养基共同置于75T的培养瓶中培养，并轻轻来回摇动培养瓶，使细胞分散均匀；
S110、将S108中培养瓶放置于37℃的二氧化碳恒温培养箱中培养，培养箱内二氧化碳气体的含量为5％。
2.根据权利要求1所述的一种适用的人胎盘间充质干细胞的复苏方法，其特征在于：定时将步骤S110中的培养瓶倒置于显微镜下观察细胞形态，待细胞出现变色后更换培养瓶内的无血清培养基。
3.根据权利要求2所述的一种适用的人胎盘间充质干细胞的复苏方法，其特征在于：步骤S110中无血清培养基的更换方法是：
S1101、吸出S110中培养瓶内的无血清培养基，并向培养瓶内加入2ml的PBS缓冲液进行清洗；
S1102、吸出S1101中培养瓶内的PBS缓冲液，再向培养瓶内加入7ml的无血清培养基；
S1103、将步骤S110中的培养瓶倒置于显微镜下观察细胞形态，待细胞未出现变色即完成无血清培养基更换。
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