CN113957048A

CN113957048A - 一种利用脐带血单个核细胞生产自然杀伤细胞的方法

Info

Publication number: CN113957048A
Application number: CN202111276129.1A
Authority: CN
Inventors: 刘韬; 林建炜; 薛祯智
Original assignee: Shenzhen Morecell Biomedical Technology Development Co ltd
Current assignee: Shenzhen Morecell Biomedical Technology Development Co ltd
Priority date: 2021-10-29
Filing date: 2021-10-29
Publication date: 2022-01-21

Abstract

本申请属于生物技术领域，尤其涉及一种利用脐带血单个核细胞生产自然杀伤细胞的方法，将从脐带血中分离的单个核细胞混合物与同源脐带间充质干细胞共进行共培养处理，从而将所有种类的单个核细胞扩增3‑15倍，然后将单个核细胞混合物中除NK细胞以外的其他细胞诱导分化为NK细胞，再进行扩增处理，扩增倍数可达195倍以上，最大效率利用单位脐带血中的单个核细胞，采用本方法扩增生产的NK细胞与原单位脐带血中的NK细胞相比，数量上可增加几百甚至数千倍。

Description

一种利用脐带血单个核细胞生产自然杀伤细胞的方法

技术领域

本申请属于生物技术领域，尤其涉及一种利用脐带血单个核细胞生产自然杀伤细胞的方法。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓及胸腺微环境，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。NK细胞不同于T、B细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞。在免疫系统中，NK细胞充当身体防御的前线，它们可以识别并杀死癌细胞以及被病毒感染的细胞，由于这一重要功能，目前许多研究都集中在研究如何将NK细胞用作免疫治疗癌症的基础。

然而，分离外周血以获得大量的NK细胞已被证明是困难的，因为只有5％-15％的循环血液淋巴细胞是NK细胞，此外，从外周血淋巴细胞中分离通常会导致淋巴细胞的异质性群体，NK细胞的产量仅为10-20％。由于外周血原代NK细胞在低温保存后细胞毒性降低，因此它们的使用更加复杂。虽然冷冻保存的低产量和细胞毒性损失可以通过细胞因子支持和饲养细胞扩增部分克服，但这种方法使外周血NK细胞不是“现成”治疗的最佳选择。

相比之下，脐带血来源的NK细胞在冷冻保存后恢复良好，是使用原代NK细胞进行“现成”治疗的潜在候选者，尽管脐带血中NK细胞的百分比高于外周血中的NK细胞，但缺点是每个脐带血单位的NK细胞数量有限，难以获取大规模NK细胞。

发明内容

本申请的目的在于提供一种利用脐带血单个核细胞生产自然杀伤细胞的方法，旨在一定程度上解决难以获取大量自然杀伤细胞的问题。

为实现上述申请目的，本申请提供一种利用脐带血单个核细胞生产自然杀伤细胞的方法，包含以下步骤：

对脐带血进行分离处理得到脐带血单个核细胞；

对与脐带血同源的脐带进行分离与培养处理得到脐带间充质干细胞，分离与培养处理的第一完全培养基中包含一种或多种第一细胞因子；

对脐带血单个核细胞和脐带间充质干细胞进行共培养处理得到扩增后脐带血单个核细胞，共培养处理的第二完全培养基中包含一种或多种第二细胞因子；

将扩增后脐带血单个核细胞进行诱导分化处理得到NK细胞，诱导分化处理的诱导分化培养基中包含一种或多种第三细胞因子；

将NK细胞进行扩增处理得到扩增后NK细胞，扩增处理的扩增培养基中包含一种或多种第四细胞因子。

进一步地，第一完全培养基包含UltraCULTURE Serum-free Medium无血清培养基、XF Basal Medium间充质干细胞无血清培养基、MSC XF基础培养基中的一种或多种，和/或

第一细胞因子包含Ultroser G serum substitute血清替代物、XF Supplements、MSC XF补充剂混合物；

第二完全培养基包含Stemline I扩增培养基、Stemline II扩增培养基、SFEM扩增培养基、SFEM II扩增培养基中的一种或多种，和/或

第二细胞因子包含SCF、G-CSF和GM-CSF；

诱导分化培养基包含RPMI 1640基础培养基、SCGM无血清培养基、KBM581无血清培养基、X-VIVO 10无血清培养基中的一种或多种，和/或

第三细胞因子包含Flt3L、SCF、OK432、IL-2、IL-7、IL-15和IL-21中；和/或

扩增培养基包含SCGM无血清培养基、KBM581无血清培养基、X-VIVO 10无血清培养基中的一种或多种，和/或

第四细胞因子包含OK432、IL-2、IL-15及IL-21。

进一步地，第一完全培养基中各第一细胞因子的含量如下：Ultroser G serumsubstitute血清替代物含量以体积计为2.5％-10％、XF Supplements含量以体积计为2.5％-10％、MSC XF补充剂混合物含量以体积计为2.5％-10％；

第二完全培养基中各第二细胞因子的含量如下：SCF含量为10-100ng/ml、G-CSF含量为10-100ng/ml、GM-CSF含量为10-100ng/ml；和/或

诱导分化培养基中各第三细胞因子的含量如下：Flt3L含量为5-15ng/ml、SCF含量为5-25ng/ml、OK432含量为1-20ug/ml、IL-2含量为100-1000IU/ml、IL-7含量为10-30ng/ml、IL-15含量为6-25ng/ml、IL-21含量为8-20ng/ml；和/或

扩增培养基中各第四细胞因子的含量如下：OK432含量为1-20ug/ml、IL-2含量为100-1000IU/ml、IL-15含量为5-50ng/ml、IL-21含量为5-50ng/ml。

进一步地，分离处理采用密度梯度离心法进行。

进一步地，经过共培养处理得到的扩增后脐带血单个核细胞中的单个核细胞数量为脐带血单个核细胞的单个核细胞的3-15倍。

进一步地，共培养处理包括以下步骤：

将脐带血单个核细胞和脐带间充质干细胞接种于第一培养容器的第二完全培养基中进行共培养；

共培养至第4-6天，收集第一培养容器中悬浮的细胞进行离心处理后，转移至第二培养容器的第二完全培养基中进行单独培养，同时，第一培养容器中的共培养持续进行；

共培养至第8-10天，收集第一培养容器中悬浮的细胞进行离心处理后，转移至第二培养容器的第二完全培养基中进行单独培养；

单独培养至第13-20天，收集第二培养容器中的所有细胞得到扩增后脐带血单个核细胞。

进一步地，共培养处理使用的脐带间充质干细胞为经培养处理的P8代以内的脐带间充质干细胞。

进一步地，扩增后脐带血单个核细胞进行诱导分化处理的细胞起始密度为0.5-2×10⁶/ml；和/或

NK细胞进行扩增处理的细胞起始密度为(0.5-3)×10⁶/ml。

进一步地，诱导分化处理的时长为21-28天。

进一步地，NK细胞在进行扩增处理前还经过NK细胞流式检测处理。

本申请提供的利用脐带血单个核细胞生产自然杀伤细胞的方法，将从脐带血中分离的单个核细胞混合物与同源脐带间充质干细胞共进行共培养处理，从而将所有种类的单个核细胞扩增3-15倍，然后将单个核细胞混合物中其他细胞(除NK细胞以外)诱导分化为NK细胞，再进行扩增处理，扩增倍数可达195倍以上，最大效率利用单位脐带血中的单个核细胞，采用本方法扩增生产的NK细胞与原单位脐带血中的NK细胞相比，数量上可增加几百甚至数千倍。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本申请实施例提供的脐带血单个核细胞在共培养处理过程中的增殖曲线图；

图2是本申请实施例提供的NK细胞在扩增处理过程中的增殖曲线图；

图3是本申请实施例提供的扩增后脐带血单个核细胞在诱导分化处理过程中的CD3-/CD56+表型的NK细胞流式检测图，其中，图3(a)是诱导分化处理第21天的CD3-/CD56+表型的NK细胞流式检测图，图3(b)是诱导分化处理第28天的CD3-/CD56+表型的NK细胞流式检测图；

图4是本申请实施例提供的扩增后脐带血单个核细胞在诱导分化处理过程中的NKG2D表型的NK细胞流式检测图，其中，图4(a)是诱导分化处理第21天的NKG2D表型的NK细胞流式检测图，图4(b)是诱导分化处理第28天的NKG2D表型的NK细胞流式检测图；

图5是本申请实施例提供的扩增后脐带血单个核细胞在诱导分化处理过程中的NKp46表型的NK细胞流式检测图，其中，图5(a)是诱导分化处理第21天的NKp46表型的NK细胞流式检测图，图5(b)是诱导分化处理第28天的NKp46表型的NK细胞流式检测图；

图6是本申请实施例提供的扩增后脐带血单个核细胞在诱导分化处理过程中的CD94表型的NK细胞流式检测图，其中，图6(a)是诱导分化处理第21天的CD94表型的NK细胞流式检测图，图6(b)是诱导分化处理第28天的CD94表型的NK细胞流式检测图；

图7是本申请实施例提供的扩增后脐带血单个核细胞在诱导分化处理过程中的CD34表型的NK细胞流式检测图，其中，图7(a)是诱导分化处理第21天的CD34表型的NK细胞流式检测图，图7(b)是诱导分化处理第28天的CD34表型的NK细胞流式检测图。

具体实施方式

为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包含单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a，b或c中的至少一项(个)”，或，“a，b和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a，b，c，a-b(即a和b)，a-c，b-c，或a-b-c，其中a，b，c分别可以是单个，也可以是多个。

应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。

在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包含多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。

术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包含一个或者更多个该特征。

随着免疫疗法在癌症治疗中的应用不断增加，生产足够数量的自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)，特别是自体NK细胞作为治疗实体已经变得至关重要。然而，现有技术大多从外周血淋巴细胞中分离NK细胞，此种方法分离困难，且分离产率仅为10-20％，且外周血原代NK细胞在低温保存后细胞毒性降低，治疗效果降低，本申请实施例提供一种利用脐带血单个核细胞生产自然杀伤细胞的方法，用以大规模生产NK细胞，该方法包含以下步骤：

S10：对脐带血进行分离处理得到脐带血单个核细胞；

S20：对与脐带血同源的脐带进行分离与培养处理得到脐带间充质干细胞，分离与培养处理的第一完全培养基中包含一种或多种第一细胞因子；

S30：对脐带血单个核细胞和脐带间充质干细胞进行共培养处理得到扩增后脐带血单个核细胞，共培养处理的第二完全培养基中包含一种或多种第二细胞因子；

S40：将扩增后脐带血单个核细胞进行诱导分化处理得到NK细胞，诱导分化处理的诱导分化培养基中包含一种或多种第三细胞因子；

S50：将NK细胞进行扩增处理得到扩增后NK细胞，扩增处理的扩增培养基中包含一种或多种第四细胞因子。

本实施例提供的方法，将从脐带血中分离的单个核细胞混合物与同源脐带间充质干细胞共进行共培养处理，由于脐带血中分离的单个核细胞混合物中不仅仅包含NK细胞，还包含T细胞、NKT细胞以及其他单个核细胞，共培养处理过程将所有种类的单个核细胞扩增3-15倍，然后将单个核细胞混合物中其他细胞，即除NK细胞以外的所有单个核细胞，如T细胞、NKT细胞等，诱导分化为NK细胞，再进行扩增处理，扩增倍数可达195倍以上，本实施例提供的方法将脐带血中所有的单个核细胞扩增3-15倍后再诱导分化成NK细胞，为NK细胞在体外的大规模扩增提供了条件，降低后续NK细胞大规模生产中对脐带血原料的需求，将此部分NK细胞作为种子NK细胞再进行数百倍的扩增，最大效率利用了脐带血中的单个核细胞，采用本方法扩增生产的NK细胞与原单位脐带血中的NK细胞相比，数量上可增加几百甚至数千倍。

实施例中，S10的具体步骤如下：采集新鲜的脐带血，采用梯度离心法对脐带血进行离心分离，离心后的下层血液加入缓冲液中，添加淋巴细胞分离液，再进行离心处理，离心管中液体由上至下分为四层，需要说明的是，第一层为缓冲液层，第二层为环状乳白色单个核细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层，分离出环状乳白色单个核细胞层，将其补加缓冲液离心弃去上清液，所得细胞沉淀即为脐带血单个核细胞。

还需说明的是，分离处理采用包括但不限于采用梯度离心法处理脐带血，还应包括本领域技术人员熟知的或容易获知的分离出脐带血中单个核细胞混合物的其他方法。

在本申请实施例中，缓冲液包括但不限于杜氏磷酸缓冲液(DPBS)，还应包括本领域技术人员熟知的或容易获知的可用于维持离体细胞结构和生理学上的完整性的缓冲平衡盐溶液。

在本申请实施例中，脐带血单个核细胞用无血清细胞冻存液(深圳默赛尔，#MCL-001)重悬后分装于细胞冻存管中，进行程序降温冻存后转移至液氮中储存，缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶，导致细胞损害，一般来说，冻存的细胞密度为(5-20)×10⁶/ml，分装于2ml细胞冻存管中，1ml/管。

实施例中，在步骤S20中，分离与培养处理得到脐带间充质干细胞的步骤如下：在无菌条件下取脐带血相同供者的脐带，洗涤灭菌后分离出羊膜与血管之间的白色结缔组织——华通氏胶，将华通氏胶置于含有第一细胞因子的第一完全培养基中进行培养得到脐带间充质干细胞。

在本申请实施例中，第一完全培养基包含UltraCULTURE Serum-free Medium无血清培养基、XF Basal Medium间充质干细胞无血清培养基、MSC XF基础培养基中的一种或多种，第一完全培养基中的第一细胞因子包含Ultroser G serum substitute血清替代物、XFSupplements、MSC XF补充剂混合物，进一步地，Ultroser G serum substitute血清替代物的含量以体积计为2.5％-10％、XF Supplements的含量以体积计为2.5％-10％、XF补充剂混合物的含量以体积计为2.5％-10％。

在本申请实施例中，将华通氏胶3-5mm长度的立方小块，每个10ml培养皿中置入20-30块华通氏胶，需要说明的是，应该尽量使剪切的华通氏胶立方小块边缘整洁、光滑、无絮状，以便于后续的组织块贴壁及细胞爬出，每个培养皿中培养基刚好完全覆盖皿底，使得华通氏胶立方小块得以均匀贴于培养皿底，便于脐带间充质干细胞爬出。

在本申请实施例中，步骤S20中，在二氧化碳气氛和恒温恒湿条件下培养脐带间充质干细胞，每隔1-3天更换培养基一次，培养到细胞克隆团的面积百分比到达70％-80％时，将细胞转移至培养瓶中培养，避免细胞密度过于密集而影响细胞生长。

在本申请实施例中，步骤S20中，还需要将得到脐带间充质干细胞进行传代培养，进一步地，将P1代脐带间充质干细胞传代培养至P2代，冻存P1或P2代脐带间充质干细胞作为种子细胞继续传代培养至P5到P8代，用于后续与脐带血单个核细胞进行共培养处理，避免原代培养因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭进而影响细胞生长扩增的问题，需要说明的是，在本申请实施例中共培养处理使用的脐带间充质干细胞为P8代以内的脐带间充质干细胞，具体地，可以是P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7或P8代脐带间充质干细胞，由于P8代以后的脐带间充质干细胞在多次传代培养中可能分化或者丢失干细胞性能，故用于与单个核细胞共培养处理的脐带间充质干细胞优选为P8代以内的代脐带间充质干细胞。

实施例中，步骤S30的具体步骤如下：

S31:将脐带血单个核细胞和脐带间充质干细胞接种于第一培养容器的第二完全培养基中进行共培养；

S32：共培养至第4-6天，收集第一培养容器中悬浮的细胞进行离心处理后，转移至第二培养容器的第二完全培养基中进行单独培养，同时，第一培养容器中的共培养持续进行；

S33：共培养至第8-10天，收集第一培养容器中悬浮的细胞进行离心处理后，转移至第二培养容器的第二完全培养基中进行单独培养；

S34：单独培养至第13-20天，收集第二培养容器中的所有细胞得到扩增后脐带血单个核细胞。

脐带血供者相同来源的脐带间充质干细胞可以提供一些特殊的生长因子，如EGF、b-FGF、PDGF、IGF、TGF-β，为脐带血中的单个核细胞提供一个促进增殖的微环境，将脐带血单个核细胞与脐带间充质干细胞进行共培养处理，可将脐带血单个核细胞中的各单个核细胞扩增3-15倍，即扩增后脐带血单个核细胞中的各单个核细胞数量是脐带血单个核细胞中的各单个核细胞数量的3-15倍。

需要说明的是，脐带间充质干细胞为贴壁细胞，在共培养过程中，脐带间充质干细胞会自动贴附于第一培养容器的内壁，而脐带血单个核细胞中的各单个核细胞悬浮于第一培养容器的培养基中，因此，在4-6天和8-10天收集的悬浮的细胞即为脐带血单个核细胞中的各单个核细胞扩增后的各单个核细胞，分两次收集转移的原因是，防止单个核细胞因密度过高而影响扩增倍数，将收集的第一培养容器中的悬浮的细胞在第二培养容器中单独培养至第13-20天，收集第二培养容器中的所有细胞得到扩增后脐带血单个核细胞。

在本实施例中，第二完全培养基包含RPMI 1640基础培养基、SCGM无血清培养基、KBM581无血清培养基、X-VIVO 10无血清培养基中的一种或多种，第二细胞因子包含SCF、G-CSF和GM-CSF中的一种或多种，第二完全培养基和第二细胞因子有利于脐带间充质干细胞分泌细胞因子，分泌的细胞因子能够更好促进单个核细胞增殖，进一步地，第二完全培养基中各第二细胞因子的含量如下：SCF含量为10-100ng/ml、G-CSF含量为10-100ng/ml、GM-CSF含量为10-100ng/ml。

实施例中，在步骤S40中，诱导分化培养基包含RPMI 1640基础培养基、SCGM无血清培养基、KBM581无血清培养基、X-VIVO 10无血清培养基中的一种或多种，第三细胞因子包含Flt3L、SCF、OK432、IL-2、IL-7、IL-15和IL-21中的一种或多种，RPMI 1640基础培养基、SCGM无血清培养基、KBM581无血清培养基、X-VIVO 10无血清培养基，其中，诱导分化培养基和第三细胞因子能够维持脐带间单个核细胞的生长，便于单个核细胞分化成为NK细胞，进一步地，诱导分化培养基中各第三细胞因子的含量如下：Flt3L含量为5-15ng/ml、SCF含量为5-25ng/ml、OK432含量为1-20ug/ml、IL-2含量为100-1000IU/ml、IL-7含量为10-30ng/ml、IL-15含量为6-25ng/ml、IL-21含量为8-20ng/ml；

在本实施例中，扩增后脐带血单个核细胞进行诱导分化处理的细胞起始密度为0.5-2×10⁶/ml，细胞密度过低，细胞自分泌的物质浓度少，容易生长不良；细胞密度过高，细胞太过拥挤，生长扩增所需的营养不足，也容易生长不良。

在本实施例中，诱导分化处理的时长为21-28天，在此时间范围内，扩增后脐带血单个核细胞中的T细胞和其他单个核细胞被诱导分化成NK细胞，使得细胞混合物中的NK细胞的含量从5-15％增加至80-95％，即通过本实施例提供的诱导分化处理得到的NK细胞中的NK细胞的含量不少于80％。

在本实施例中，在对NK细胞进行扩增处理之前，还经过NK细胞流时检测处理，确认扩增后脐带血单个核细胞中的T细胞和其他单个核细胞被成功诱导分化为NK细胞，具体地，采用流式细胞术检测诱导分化处理第21和28天的CD3、CD56、NKG2D、NKp46、CD94及CD34等细胞免疫表型的表达变化，从而确认NK细胞NK细胞在数量和含量上均高于扩增后脐带血单个核细胞。

实施例中，在步骤S50中，扩增培养基包含SCGM无血清培养基、KBM581无血清培养基(康宁，#88-581-CM)、X-VIVO 10无血清培养基(Lonza，#04-380Q)中的一种或多种，第四细胞因子包含OK432、IL-2、IL-15及IL-21，扩增培养基和第四细胞因子有利于NK细胞的大量扩增，其中，扩增培养基中各第四细胞因子的含量如下：OK432含量为1-20ug/ml、IL-2含量为100-1000IU/ml、IL-15含量为5-50ng/ml、IL-21含量为5-50ng/ml。

在本实施例中，NK细胞进行扩增处理的细胞起始密度为(0.5-3)×10⁶/ml，细胞密度过高或者过低均不利于NK细胞的扩增。

为使本申请上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本申请实施例一种脐带血单个核细胞生产NK细胞的方法的进步性能显著的体现，以下通过实施例来举例说明上述技术方案。

实施例1

1.脐带血单个核细胞分离处理

1)采集新鲜的脐带血于抗凝管中，以700g离心20min(降速最低)，收集上层血浆，56℃灭活30min，然后-20℃放置15min，最后2000g离心15min后，吸取上层血清4℃保存备用。

2)取50ml离心管，加入20ml回温后的淋巴细胞分离液。上述血液离心后的下层加入DPBS至血液原体积混匀，将血液与分离液按1：1比例添加，血液需悬浮于分离液上方，注意保持清楚的界面，以800g离心15min(缓升缓降)后，离心管中由上至下分为四层。第一层为DPBS层，第二层为环状乳白色单个核细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。

3)收集第二层环状乳白色单个核细胞层加入到一个50ml离心管中，补加DPBS至50ml，600g离心10min，弃上清液，再用50ml DPBS重悬细胞，细胞计数，500g离心10min，弃上清液，细胞沉淀即为脐带血单个核细胞。

4)根据细胞计数结果，细胞沉淀用无血清细胞冻存液(深圳默赛尔，#MCL-001)重悬，使细胞密度为1×107/ml，分装于2ml细胞冻存管中，1ml/管，将细胞进行程序降温冻存，12h后转移至液氮中储存。

2.同源脐带间充质干细胞分离培养处理

1)取脐带血相同供者新生儿来源无菌条件下采集的足月婴儿脐带，0.9％氯化钠注射液冲洗脐带，重复2～3次，去除血渍。75％乙醇浸没整根脐带消毒灭菌。0.9％氯化钠注射液重复洗涤去除残留乙醇。无菌手术剪将脐带剪成约2～3cm数段，清除脐带小段血管中淤血和凝块。剔除脐带的两条动脉，一条静脉。位于羊膜与血管之间的白色结缔组织即为华通氏胶，用有齿镊将其撕下，放入无菌平皿中，加入适量0.9％氯化钠注射液，洗涤胶体。

2)将华通氏胶置于含5～10mL脐带间充质干细胞完全培养基的10cm皿中，剪成约3～5mm长度的立方小块。尽量使剪切的组织小块边缘整洁、光滑、无絮状，以便于后续的组织块贴壁及细胞爬出。取手持式高圈不锈钢细胞筛，将剪好的组织块倒到细胞筛上，用0.9％氯化钠注射液洗涤液冲洗至流过筛网的液体不粘稠后，收集末次洗涤液(至少30mL)送无菌检测，将组织块倒入一个10cm培养皿中，加入脐带间充质干细胞完全培养基。

3)取10cm培养皿，用培养基润洗，确保培养基完全覆盖皿底，每个皿保留1.5mL培养基，吸出多余培养基，将组织块均匀贴到皿中，组织块之间保持一定间距(20～30块/皿)。

4)将培养皿放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱。组织块培养过程中每隔2天换液一次，培养到第16～18天，细胞克隆团的面积百分比到达70％～80％时，消化收获，将细胞转移至培养瓶中培养。

5)将脐带间充质干细胞传代培养至P2代，冻存种子细胞，取1支种子细胞继续培养传代至P5代，用于后续与脐带血脐带血单个核细胞共培养。

3.脐带血单个核细胞与脐带间充质干细胞共培养

1)复苏脐带血单个核细胞，于37℃水浴融化后，迅速加入到10倍体积的DPBS中稀释，1800rpm离心10min，去除离心上清后重悬浮于共培养完全培养基，共培养的完全培养基为Stemline II扩增培养基(Sigma，#S0192)，添加细胞因子为SCF(10-100ng/ml)，G-CSF(10-100ng/ml)，GM-CSF(10-100ng/ml)。

2)共培养接种的初始培养体积为50ml，将复苏的脐带血单个核细胞与P5代脐带间充质干细胞按照1:10的数量比接种于T175瓶中进行共培养。期间每隔2天进行等量补液。

3)细胞共培养至第4-6天，将悬浮的细胞收集至离心管，1800rpm离心10min，用等量的新鲜培养基重悬后转移至细胞培养袋中培养。T175培养瓶中剩余细胞加入50ml培养基继续培养。

4)细胞共培养至第8-10天，再次将T175培养瓶中悬浮的细胞收集至离心管，1800rpm离心10min，用等量的新鲜培养基重悬细胞，将细胞转移至上述的细胞培养袋中与第6天转移的细胞混合。

5)细胞培养至第13-20天，收集细胞培养袋中的细胞(即扩增后脐带血单个核细胞)，细胞计数，细胞用于后续NK细胞的诱导分化处理。

共培养处理结果如图1所示：脐带血单个核细胞的单个核细胞起始接种数量为25×10⁶，经过13天的培养，扩增至125.6×10⁶，扩增倍数为5.024倍。

4.扩增后脐带血单个核细胞诱导分化为NK细胞

1)NK细胞诱导分化培养基组成：RPMI 1640基础培养基加入Flt3L(5-15ng/ml)、SCF(5-25ng/ml)、OK432(1-20ug/ml)、IL-2(100-1000IU/ml)、IL-7(10-30ng/ml)、IL-15(6-25ng/ml)及IL-21(8-20ng/ml)。

2)将收集的扩增后脐带血单个核细胞，按5×10⁵/ml的起始细胞密度接种于NK细胞诱导分化培养基中培养，每3-4天半量换液，共培养21-28天，得到NK细胞。

5.NK细胞流式检测

1)采用流式细胞术检测诱导分化处理的第21、28天的扩增后脐带血单个核细胞中单个核细胞的CD3、CD56、NKG2D、NKp46、CD94及CD34等细胞免疫表型的表达变化，NK细胞流式检测结果如表1所示。

2)具体步骤：取对应天数的细胞，2000rpm离心10min，加入DPBS缓冲液重悬细胞，加入待测流式抗体，室温避光孵育30min，然后用DPBS缓冲液洗涤细胞2次，最后用500μlDPBS缓冲液重悬，用流式细胞仪检测。

表1.诱导分化处理的扩增后脐带血单个核细胞的不同表型检测结果

如图3-图7所示，流式检测结果显示，第21天NK细胞比例(CD3-CD56+细胞群)为89.32％，第28天NK细胞(CD3-CD56+细胞群)比例为91.47％，说明NK细胞诱导成功，NK细胞激活性受体NKG2D和CD94表达超过85％，间接说明NK细胞诱导成功，即扩增后脐带血单个核细胞经过诱导21-28天，已成功分化诱导为NK细胞。

6.NK细胞扩增处理

1)NK细胞扩增培养基组成：SCGM无血清培养基(德国CellGenix公司，#20802-0500)加入OK432(1-20ug/ml)、IL-2(100-1000IU/ml)、IL-15(5-50ng/ml)及IL-21(5-50ng/ml)。

2)将上述诱导处理得到的NK细胞按1×10⁶/ml的起始密度接种于NK细胞扩增培养基中培养，每隔2天双倍补液，共培养14-21天，细胞计数，统计细胞扩增倍数。

扩增后NK细胞扩增处理结果如图2所示，扩增后NK细胞的细胞起始接种数量为10.85×10⁶，经过18天的培养，扩增至2128×10⁶，扩增倍数为196.13倍。

以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种利用脐带血单个核细胞生产自然杀伤细胞的方法，其特征在于，包含以下步骤：

对脐带血进行分离处理得到脐带血单个核细胞；

对与所述脐带血同源的脐带进行分离处理与培养处理得到脐带间充质干细胞，所述分离与培养处理的第一完全培养基中包含一种或多种第一细胞因子；

对所述脐带血单个核细胞和所述脐带间充质干细胞进行共培养处理得到扩增后脐带血单个核细胞，所述共培养处理的第二完全培养基中包含一种或多种第二细胞因子；

将所述扩增后脐带血单个核细胞进行诱导分化处理得到NK细胞，所述诱导分化处理的诱导分化培养基中包含一种或多种第三细胞因子；

将所述NK细胞进行扩增处理得到扩增后NK细胞，所述扩增处理的扩增培养基中包含一种或多种第四细胞因子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一完全培养基包含UltraCULTURESerum-free Medium无血清培养基、XF Basal Medium间充质干细胞无血清培养基、MSC XF基础培养基中的一种或多种，和/或

所述第一细胞因子包含Ultroser G serum substitute血清替代物、XF Supplements、MSC XF补充剂混合物；

所述第二完全培养基包含Stemline I扩增培养基、Stemline II扩增培养基、SFEM扩增培养基、SFEMII扩增培养基中的一种或多种，和/或

所述第二细胞因子包含SCF、G-CSF和GM-CSF；

所述诱导分化培养基包含RPMI 1640基础培养基、SCGM无血清培养基、KBM581无血清培养基、X-VIVO 10无血清培养基中的一种或多种，和/或

所述第三细胞因子包含Flt3L、SCF、OK432、IL-2、IL-7、IL-15和IL-21；和/或

所述扩增培养基包含SCGM无血清培养基、KBM581无血清培养基、X-VIVO 10无血清培养基中的一种或多种，和/或

所述第四细胞因子包含OK432、IL-2、IL-15及IL-21。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一完全培养基中各所述第一细胞因子的含量如下：Ultroser G serum substitute血清替代物含量以体积计为2.5％-10％、XFSupplements含量以体积计为2.5％-10％、MSC XF补充剂混合物含量以体积计为2.5％-10％；和/或

所述第二完全培养基中各第二细胞因子的含量如下：SCF含量为10-100ng/ml、G-CSF含量为10-100ng/ml、GM-CSF含量为10-100ng/ml；和/或

所述诱导分化培养基中各第三细胞因子的含量如下：Flt3L含量为5-15ng/ml、SCF含量为5-25ng/ml、OK432含量为1-20ug/ml、IL-2含量为100-1000IU/ml、IL-7含量为10-30ng/ml、IL-15含量为6-25ng/ml、IL-21含量为8-20ng/ml；和/或

所述扩增培养基中各第四细胞因子的含量如下：OK432含量为1-20ug/ml、IL-2含量为100-1000IU/ml、IL-15含量为5-50ng/ml、IL-21含量为5-50ng/ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离处理采用密度梯度离心法进行。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，经过所述共培养处理得到的所述扩增后脐带血单个核细胞中的单个核细胞数量为所述脐带血单个核细胞的单个核细胞的3-15倍。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共培养处理包括以下步骤：

将所述脐带血单个核细胞和所述脐带间充质干细胞接种于第一培养容器的第二完全培养基中进行共培养；

共培养至第4-6天，收集所述第一培养容器中悬浮的细胞进行离心处理后，转移至第二培养容器的第二完全培养基中进行单独培养，同时，所述第一培养容器中的共培养持续进行；

共培养至第8-10天，收集所述第一培养容器中悬浮的细胞进行离心处理后，转移至所述第二培养容器的第二完全培养基中进行单独培养；

单独培养至第13-20天，收集所述第二培养容器中的所有细胞得到所述扩增后脐带血单个核细胞。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述共培养处理使用的所述脐带间充质干细胞为经培养处理的P8代以内的脐带间充质干细胞。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增后脐带血单个核细胞进行所述诱导分化处理的细胞起始密度为0.5-2×10⁵/ml；和/或

所述NK细胞进行所述扩增处理的细胞起始密度为(0.5-3)×10⁶/ml。

9.根据权利要求1-6、8任一项所述的方法，其特征在于，所述诱导分化处理的时长为21-28天。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NK细胞在进行所述扩增处理前还包括对所述NK细胞进行流式检测处理的步骤。