CN106414722B - 红系细胞的体外扩增 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及红系细胞体外扩增的方法，该方法包括使用多孔结构经三维堆叠和填充培养红系细胞的步骤。通过使用本发明的组合物，红系细胞可以非常有效地体外扩增。

Description

红系细胞的体外扩增
技术领域
本发明由大韩民国卫生福利部的第HI10C17400200号项目支持，该项目从2013年4月1日至2014年3月31日通过韩国健康产业发展研究院管理的延世大学工业学术合作基金会在项目名为“针对干细胞有效分化为红系祖细胞及机理的研究”中题为“先进医疗技术发展”的研究项目下运作。
本发明还由大韩民国卫生福利部的第HI12C0202号
项目支持，该项目从2013年8月1日至2014年7月31日通过韩国健康产业发展研究院管理的汉阳大学工业学术合作基金会在项目名为“通过干细胞分化和成熟诱导的骨髓增生异常综合征的药物发展”中的题为“先进医疗技术发展”的研究项目下运作。
本申请要求2014年4月7日提交的韩国专利申请第10-2014-0041320号的优先权，其通过引用并入本文。
本发明涉及用于红细胞体外扩增的方法。
背景技术
近期人口快速老龄化和对医疗服务的渐增需求已经导致可输入血液的供应短缺和所使用血液制剂量的增加。随着疾病如克雅氏病、疟疾和AIDS的流行，对相对于感染安全的血液有不断增长的需求。因此，目前可输入血液的全球短缺引起了病人手术和治疗的困难。该血液短缺在未来会变得更为严重。根据韩国保健及社会事务研究所的数据(2005)，2030年韩国的血液短缺预计为所需量的55.5％。输血传播的感染风险在受血者中引起了严重问题。在发展检测感染风险的检验方法和体系中蒙受巨额成本，但是完全检测出感染是不可能的[1]。出于这些原因，对开发体外制备的安全血红细胞有持续的需求。
在韩国，每年使用的红细胞制剂大约为210万单位。以1个单位存在2×1012个细胞的假设来计算，该值相当于至少约4×1018个细胞。据报道，仅在美国，每年需至少3×1019个细胞来代替红细胞输血(1500万个单位，每个单位有2×1012个细胞)。可以操作用于培养确认的动物细胞如CHO细胞的最大生物反应器在20000L的体积中以5×107个细胞的最大密度培养细胞。在目前的现有技术下，在该密度下制备红细胞理论上需要30000批次培养。即，在现存的方法和体系中，例如静置培养、悬浮培养、固定床反应器和气升式反应器中，为培养条件设计的动物细胞培养方法实际上不可能应用于需要天文数字细胞和足够大的培养基和空间以容纳细胞的红细胞培养。填充细胞培养在节省空间方面是最有效的。然而，尽我们所知，先前并没有用于制备红细胞的成红血细胞填充细胞培养的报道。
本研究小组已经用介导的黏附相关信号证明了在高细胞浓度下，红系细胞在细胞成熟、去核速率、细胞存活率和脊髓发育不良方面显示出更好效果，即通过使成熟红系祖细胞彼此发生物理接触而增加红细胞的生成效率[3]。另外，本研究小组显示了在试管中红系细胞的3D填充细胞培养在红细胞的制备中也是有效的。同样，在以前的其他研究中，已经尝试了增加在2D平板培养或3D生物反应器中全部培养基的每体积的细胞密度。本发明人已经确定了第一研究目标为通过3D填充引起细胞间的直接接触。
骨髓中的红系细胞彼此三维黏附以制造称为幼红细胞岛的空间，在这里其成熟并增殖。骨髓中的这种造血空间分为薄骨小梁以防止细胞被挤压。基于骨髓环境，本发明人成功发现了用于红系细胞培养的最佳填充规模、足以支撑填充规模的孔径、用于细胞培养的多孔结构的最佳孔隙规模、和用于多孔结构的生物相容性材料。本发明人还成功通过减少细胞坏死以优化用于红细胞大量生产的方法，该细胞坏死由三维填充细胞培养和由将细胞填充在旋转过滤器中造成，该旋转过滤器用于在细胞培养期间提供新鲜培养基以促进培养基的交换和供给。这是关于红系细胞三维填充细胞培养的首次报道，是用于生产红细胞如人体骨髓中红细胞的创新方法，其要求最小的培养空间和最小量的培养基。
说明书全文参考和引用了论文和专利文献，其公开内容通过引用全部并入本文以更清晰地公开本发明以及本发明所属的现有技术。
发明内容
技术问题
本发明人认真地进行研究以开发用于红系细胞体外扩增的方法，结果发现了多孔结构中红系细胞的三维填充细胞培养在红系细胞体外扩增中是高效的。基于该发现完成本发明。
因此，本发明的目的是提供用于红系细胞体外扩增的方法，包括使用多孔结构使红系细胞经受三维填充细胞培养。
由以下详细说明、权利要求和附图，本发明的其他目的和优点会变得更加明显。
技术方案
本发明的一个方面提供用于红系细胞体外扩增的方法，包括使红系细胞经受使用多孔结构的三维填充细胞培养。
本发明人认真地进行研究以开发用于红系细胞体外扩增的方法，结果发现使用多孔结构的红系细胞三维填充细胞培养在红系细胞的体外扩增中是最有效的。
如本文所使用的，术语“红系细胞”包括来自红系祖细胞的成熟阶段的细胞。红系祖细胞可以从各种来源中获得，例如外周血、脐带血和骨髓。CD34+细胞作为红系祖细胞可以通过本领域众所周知的适当方法分离，例如，使用CD34+抗体的免疫磁珠选择法。根据本发明的优选实施方案，CD34+细胞可以是来源于脐带血的细胞。红系祖细胞经由红细胞生成分化为成熟红细胞，该红细胞生成由以下阶段组成：(a)从造血干细胞分化为原红细胞；(b)从原红细胞分化为早幼红细胞；(c)从早幼红细胞分化为中幼红细胞；(d)从中幼红细胞分化为晚幼红细胞；(e)从晚幼红细胞分化为多染红细胞；(f)从多染红细胞分化为红细胞。优选地，本发明中使用的红系细胞包括成熟阶段(d)、(e)和(f)中的细胞。
如本文所使用的，术语“红系祖细胞”指包括红细胞生成阶段中的全部细胞，除了完成其成熟阶段的红细胞。
如本文所使用的，术语“三维填充细胞培养”指一种培养方法，其中使用培养皿尤其试管沉淀和填充红系细胞，该培养皿的高度足够大以使得红系细胞可以被填充。
如本文所使用的，术语“多孔结构”指由于存在几微米至几毫米大小的若干孔而协助细胞培养的结构。不特别限定多孔结构的形状和大小，可以根据本发明实践的模式和规模适当地选择。多孔结构的材料包括但不限于聚乙烯、二氧化硅、纤维素、DEAE-右旋糖酐、玻璃、聚苯乙烯塑料、丙烯酰胺、和胶原。对细胞培养不产生不利影响的任何适合材料可以用于多孔材料。特别地，例如，多孔结构可以是“微载体”或“支架”结构。微载体指用于细胞培养的多孔支撑结构，其具有约100μm至约几个mm的直径，并包括具有约30μm至约500μm大小的孔。使用用于红系细胞培养的若干微载体单元的集合能够控制培养规模。这种微载体的具体实例包括Cytopore和Cytoline 1，其用于以下实施例章节中。支架指用于细胞培养的支撑结构，其包括具有约几十至几百μm大小的孔。不同于微载体使用若干单元结构的集合，支架是一片式结构，其直径和高度根据培养规模调节。支架可以具有约10μm至约1mm的孔径。支架的孔径优选为30μm至600μm，更优选为30μm至500μm，还更优选为50μm至500μm，更优选为50μm至400μm。用于支架的材料无特别地限制，可以选自金属、陶瓷、合成聚合物、和/或天然聚合物。用于支架的合适材料的具体实例包括胶原、丝绸、海藻酸盐、聚乙烯(PE)、聚(乳酸)(PLA)、聚(羟基乙酸)(PGA)、PLA和PGA共聚物、聚四氟乙烯(PTEE)、聚氯乙烯(PVC)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚已内酯(PCL)、聚氨酯(PU)、矾土、羟磷灰石、镍、钛、钴-铬合金、和/或不锈钢。用于支架的可商购产品实例是Honeycomb(KOKEN，东京，日本)和Biomerix 3D(Biomerix，佛利蒙，加州)。
多孔结构自身是多孔的。任选地，多孔结构可以是不含孔的亚单元集合。在这种情况下，亚单元之间存在间隙，其作用类似于多孔结构的孔。这与多孔结构由多孔亚单元组成的事实相反。然而，亚单元之间的间隙作用类似于可以对红系细胞填充细胞培养发挥作用的孔。特别地，亚单元可以是具有足以产生30μm至1500μm间隙的尺寸的微珠。用于微珠的材料是不受限的。作为亚单元，还可以使用微载体圆盘，其用于以下实施例章节中。
在本发明的一个实施方案中，多孔结构包括具有30μm至1500μm的尺寸分布的孔。表述“包括具有30μm至1500μm的尺寸分布的孔”理解为并不排斥该范围之外的孔。30μm至1500μm的孔径代表了用于红系细胞扩增的多孔微载体的优选孔径分布。一些孔可以在该孔径范围之外。孔可以具有相同或相似的尺寸。任选地，孔可以具有30μm至1500μm的不同尺寸。孔径范围的下限意味着使红系细胞进入孔从而产生3D填充环境的最小尺寸。孔径范围的上限设置为提供类似于骨髓环境的环境。孔径分布优选为30μm至1000μm，更优选为30μm至700μm，还优选为30μm至500μm，最优选为50μm至500μm。当孔具有最优选的孔径分布时，通过红系细胞三维填充最大化培养效果。
在本发明的一个实施方案中，多孔结构是大孔微载体。本文所使用的术语“微载体”指用于细胞培养的支撑结构，其具有约100μm至约几个mm的尺寸。微载体包括多个孔。根据孔的直径，微载体可以分为大孔微载体、介孔微载体和微孔微载体。大孔结构具有约50μm或更大的平均孔径。介孔结构具有约2μm至约50μm的平均孔径，微孔结构具有约2μm或更小的平均孔径。大孔微载体指包括具有约50μm或更大的平均直径的若干孔的微载体。本发明人得到了结论：使用大孔载体对红系细胞体外扩增是有效的。本发明人发现，大孔载体具有用于红系细胞三维填充细胞培养的足够孔径，其可以防止细胞挤压以及气体或营养物交换困难，这些是在过大规模下填充时遇到的问题。通过微载体的流动性最大化气体或营养物交换效率。相比大规模固定化结构用于培养时，当使用可流动结构时，气体或营养物可以有效交换，同时保持用于三维填充细胞培养的环境。当旨在扩增红系细胞的三维填充细胞培养规模以增加每单位底面积的红系细胞数时，微载体的多孔结构维持了细胞填充规模最佳效果。因此，使用多孔微载体促进了红系细胞培养规模的扩增。
本发明中使用的培养基可以包括用于动物细胞培养的一般成分。培养基可以是本领域已知的基础培养基。合适的培养基实例包括Eagle的最小基本培养基(Eagle的MEM)[Eagle,H.Science 130:142(1959)]、α-MEM[Stanner,C.P.等人,NAT.New Biol.230:52(1971)]、Iscove的MEM[Iscove,N.等人,J.Exp.Med.147:923(1978)]、199培养基[Morgan等人,Proc.Soc.Exp.BioMed.,73:1(1950)],CMRL 1066,RPMI 1640[Moore等人,J.Amer.Med.Assoc.199:519(1967)]、F12[Ham,Pro.Natl.Acad.Sci.USA 53:288(1965)]、F10[Ham,R.G.Exp.CellRes.29:515(1963)]、DMEM[Dulbecco改良的Eagle培养基,Dulbecco,R.等人,virology 8:396(1959)]、DMEM和F12的混合物[Barnes,D.等人,Anal.Biochem.102:225(1980)]、Way-mouth的MB752/l[Waymouth,C.J.Natl.CancerInst.22:1003(1959)]、Iscove改良的Dulbecco培养基、Iscove改良的Fisher培养基或Iscove改良的Eagle培养基、McCoy的5A[McCoy,T.A.等人,Pro.soc.Exp.Bio.Med.100:115(1959)]、MCDB系列[Ham,R.G.等人,In vitro 14:11(1978)]、AIM-V培养基、和其改良的培养基。培养基的详细说明可以见于R.Ian Freshney,Culture of Animal Cells,A Manualof Basic Technique,Alan R.Liss,Inc.,纽约，其公开内容通过引用并入本文。
出于促进红系组细胞增殖和分化的目的，本发明所使用的培养基还包括选自干细胞因子(SCF)、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-11、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和红细胞生成素(EPO)中的至少一种组分。更优选地，本发明使用的培养基在原红细胞到早幼红细胞的分化阶段包含氢化可的松、SCF、IL-3和EPO，在早幼红细胞到中幼红细胞的分化阶段的SCF、IL-3和EPO，以及从中幼红细胞到晚幼红细胞的分化阶段的EPO。培养基不包括从晚幼红细胞到多染红细胞(即网织红细胞)分化阶段(即去核)的细胞因子。
在本发明的一个实施方案中，红系细胞的培养在通过持续流动施加剪应力的培养基中进行。本文所使用的“持续流动”意味着在规律循环或不规律循环中或持续地搅拌或交换培养基。该持续流动能够使得基本生长元素包括氧足量供应至填充培养的细胞层，协助细胞扩增。
在本发明的一个实施方案中，通过搅拌制造用于红系细胞培养的持续流动。特别地，可以例如使用磁力搅拌器或在旋转瓶中实施搅拌。
在本发明的一个实施方案中，通过搅拌制造流动。流动通常通过以1rpm至50rpm的搅拌制造，优选1rpm至40rpm，更优选5rpm至35rpm，还更优选5rpm至30rpm。如果搅拌速率(rpm)高于以上定义的上限，可能会对培养的细胞施加过高的剪应力，导致填充细胞结构崩解，减少细胞的三维接触。
在本发明的一个实施方案中，在培养基中的过滤器中进行培养。过滤器用于防止红细胞在持续流动期间脱离多孔微载体。通过对微载体和红系细胞施加剪应力，使用过滤器最小化三维填充细胞培养环境的变化，并使得培养基平稳流动，协助有效的细胞扩增。
在本发明的一个实施方案中，过滤器具有1μm至8μm的筛孔尺寸。过滤器的筛孔尺寸优选为1μm至5μm，更优选为2μm至5μm，还更优选为3μm至4μm。过滤器的筛孔尺寸小于红细胞的平均直径。使用过滤器可以增强培养基的流动效果，同时防止红细胞从微结构的孔脱离并在培养基中浮动。在本发明的一个实施方案中，红系细胞是由造血干细胞分化的细胞。特别地，红系细胞是那些几乎完成了其成熟阶段的红系细胞，优选包括那些进入末期成熟阶段的红系细胞。在末期成熟阶段最后，红系细胞经历去核。进入了末期成熟阶段的红系细胞在其特征和生长环境上不同于造血干细胞。证实了在由造血干细胞分化的红系细胞中、特别是进入末期成熟阶段的红系细胞，多孔微结构中优异的三维填充细胞培养效果。当旨在将红系细胞的三维填充细胞培养规模增加至超过最佳水平时，会出现许多问题，例如细胞挤压和气体或营养物交换的困难，导致细胞培养的低效率。因此，本发明人首次引入了使用红系细胞三维填充细胞培养的多孔微结构，其使得红系细胞的填充细胞培养能够处于最佳细胞密度水平之上，可以通过微载体的孔维持红系细胞的填充细胞培养规模。
在本发明的一个实施方案中，3D培养的红系细胞表达至少一种黏附相关基因，其选自肝癌缺失1(DLC1)、细胞间黏附分子-4(ICAM-4)和迟现抗原-4(VLA-4)。通过表达黏附相关基因激活细胞间信号交换，导致红系细胞的产量增加。还可以人工地将DLC 1、ICAM-4和/或VLA-4蛋白添加到培养基中。
在本发明的一个实施方案中，在三维填充细胞培养期间，红系细胞与选自间充质干细胞、内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞和组织细胞的细胞混合并共同培养。间充质干细胞、内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞和组织细胞是骨髓的成分，并用来制成类似骨髓环境的红系细胞培养环境。本发明人得出结论：红系细胞与骨髓成分的共同培养有助于红系细胞的成熟。当两种或更多种成分选自间充质干细胞、内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞和组织细胞时，混合比例不特别地限定，但优选类似体内环境。
在本发明的一个实施方案中，选自间充质干细胞、内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞和组织细胞的细胞数与红系细胞数的比例可以是1:10至2:1。混合比例确定为制造类似体内环境的环境。然而，为了本发明的目的，即为了红系细胞的培养，可以适当地增加红系细胞的数量。
有益效果
本发明的特点和优点总结如下：
(a)使用用于红系细胞三维填充细胞培养的多孔结构的本发明在红系细胞体外扩增中是有效的；
(b)本发明可以显著改善来自红系祖细胞的红细胞的体外产量；
(c)本发明促进了红系细胞填充细胞培养规模，通过微载体的孔在维持红系细胞填充细胞培养规模上是有效的；
(d)本发明能够生成临床级红细胞。
附图说明
图1显示2D平板培养、2D高密度培养、使用大孔微载体型Cytoline 1的红系细胞填充细胞培养、使用Cytopore的红系细胞填充细胞培养、使用Biomatrix3D的红系细胞填充细胞培养、使用Honeycomb的红系细胞填充细胞培养、和用于培养基循环条件的旋转瓶、旋转器和圆柱旋转过滤器。
图2显示(A)中幼红细胞/晚幼红细胞的2D平板培养和3D填充细胞培养1天和2天后且Wright-Giemsa染色后观察的图(×200)：星号表示末期成熟阶段的无核红系细胞，箭头表示晚幼红细胞；(B)比较在(A)中显示的条件下不同成熟阶段的细胞比例和红细胞产率。
图3显示在不同密度下晚幼红细胞的2D平板培养和晚幼红细胞的3D高密度填充细胞培养1天和2天后获得的结果：(A)显示晚幼红细胞上W right-Giemsa染色的结果(×200)，红色星号、蓝色箭头、黑色箭头、白色星号和块状星号分别显示在末期成熟阶段的无核红系细胞、晚幼红细胞、骨髓细胞、经历去核的细胞和发育异常的细胞；(B)比较在图(A)中显示的条件下不同成熟阶段的细胞比例和红细胞产率。
图4显示(a)Cytopore和Cytoline 1作为多孔微载体(左)、微载体中细胞培养(中)和试管中细胞培养(右)的SEM图像(上端较宽部分的直径为6.5mm)；(b)圆柱旋转过滤器(左)(直径6.5mm，高度15mm)和在12孔板中以107个细胞/ml培养基的密度生长的红系细胞。
图5显示在Cytopore中培养了1天、2天和3天的存活红系细胞。
图6显示在Cytoline 1中填充细胞培养后的存活细胞。
图7显示在Cytoline中培养1天和2天后、在不同成熟阶段的细胞比例。
图8比较填充1天后来自另一脐带血的实例2的细胞，在对照组和实验组II中的晚幼红细胞的比例分别为39％和94.1％，显示了显著增加的细胞成熟。关于在Cytoline 1存在下的3D填充细胞培养，细胞间接触增加，细胞成熟是有效的(见图8和图9)。
图10显示(A)使成红血细胞固定于旋转瓶中，没有微载体培养，同时以RPM25旋转后所获得的图像，和成红血细胞2D平板培养后获得的图；(B)随着培养时间增加在不同成熟阶段的细胞比例。
图11显示在旋转瓶中使用Cytopore培养细胞后获得的结果。
图12比较在旋转瓶中使用Cytoline 1的3D培养后在不同成熟阶段的细胞比例。
图13显示在不同流动条件下以RPM 0和RPM 25使用Cytoline 1和过滤器以及Wright-Giemsa染色的细胞培养后观察到的图(×200)，红色星号、蓝色箭头、黑色星号和黑色箭头分别表示无核红系细胞、晚幼红细胞、死亡细胞和多染红细胞。
图14显示在图13中所示条件下不同成熟阶段的细胞比例。
图15比较来自源于不同于图13中所示实例的脐带血细胞的红细胞产率。
图16至图18显示红系细胞的2D高密度培养和3D高密度填充细胞培养后观察到的结果。特别地，图16显示细胞Wright-Giemsa染色后观察到的图(×200)。红色星号、蓝色星号和黑色箭头分别表示末期成熟阶段的无核红系细胞、死亡细胞和未成熟细胞，剩余细胞为晚幼红细胞。图17显示在图16所示条件下不同成熟阶段的细胞比例。图18显示使用由不同材料制成且具有不同孔径的多孔结构培养红系细胞后获得的结果：左图显示在多孔结构中培养后收集的成熟红系细胞球，右图显示细胞存活率。
图19显示红系细胞的2D高密度培养和3D填充细胞培养且Wright-Giemsa染色后观察到的图(×200)：红色星号表示无核红细胞；比例尺表示50μm。
图20显示比较不同多孔结构上培养后不同成熟阶段的红系细胞比例的图。
图21显示在3D填充细胞培养3天后通过红细胞生产标记(ICAM-4、GATA-l、Hb-β和Hb-γ)和黏附相关信号(DLC-1和ICAM-4)的qPCR获得的结果。
图22是显示体外制得的红细胞与健康供体外周血功能相似的图。
图23显示可以用于红系细胞三维填充细胞培养的各种结构。
图24显示将黏附细胞(MSC)和成骨细胞置于多孔结构中，维持3小时直到细胞黏附于多孔结构，加入红系细胞之后获得的细胞分布(上列“3小时”；实验组A)，同时加入3种细胞并共同培养192小时后获得的细胞分布(下列“混合”；实验组B)。
图25显示包含巨噬细胞和单核细胞的骨髓细胞与红系细胞在3D多孔结构中共培养72小时后获得的实验结果。共培养引起多孔结构中的空间相互作用以影响红系细胞的成熟和在末期成熟阶段的红系细胞制备。左边显微镜图显示培养48小时后结构的内部形态，右图显示培养48小时和72小时后的染色细胞(黑色箭头、红色箭头和白色星号分别表示未成熟红系细胞、成熟红系细胞和巨噬细胞，其余细胞为单核细胞)。
具体实施方式
参考以下实施例会更详细地解释本发明。然而，对本领域技术人员明显的是，提供的这些实施例仅用于说明目的，而并非理解为限制本发明的范围。
实施例
实验方法
实施例1：细胞培养和计数
将CD34+细胞通过使用免疫磁性微球选择法和EasySep CD34分离试剂盒(StemCell Technologies)从健康供体脐带血中分离。一些CD34+细胞在分离后立即用于培养或冷藏直到使用。在无基质无血清条件下培养细胞17天[3，4]。
加入几种细胞因子以引起CD34+细胞分化和增殖。从第0天到第7天，在用1μM的氢化可的松(Sigma)、100ng/ml的干细胞因子(SCF；R&D Systems)、10ng/ml的白介素(IL)-3(R&D Systems)和6IU/ml的红细胞生成素(EPO；Calbiochem)补充的培养基中培养细胞。从第7天到第13天，在用50ng/ml的SCF、10ng/ml的IL-3和3IU/ml的EPO补充的培养基中培养早幼红细胞。从第13天到第17天，加入2IU/ml的EPO[3，4]。在第17天，当多染红细胞和晚幼红细胞的比例达到≥50％时，进行3D培养实验用于比较。在培养的第17天，加入2IU/ml的EPO和来源于血清的5％脐带血血浆用于3D培养[5]。
每隔一天重填培养基。在37℃和5％的CO2下，在CO2培养箱(Sanyo)中培养细胞。通过台盼蓝染色计算存活细胞数。用Wright-Giemsa染色(Sigma-Aldrich)以盲选方式通过计数每组至少400个细胞分析细胞完整性和成熟阶段。通过不知道细胞培养条件的两个研究员以盲选方式进行分析。
实施例2：红系细胞成像
使用细胞离心机(Cellspin，Hanil Science Industrial)将细胞置于载玻片上，然后Wright-Giemsa染色(Sigma-Aldrich)。分析染色细胞的成熟阶段、脊髓发育不良和细胞完整性。
实施例3：2D平板培养和3D填充细胞培养
在培养的第15天至第17天，分离末期成熟阶段的红系细胞(多染红细胞/晚幼红细胞)，在图1所示条件下培养。在6孔2D平板中，以1×106个细胞/mL的密度培养对照细胞。在实验组中，在试管中使细胞以2×107个细胞/mL的密度填充，并在试管直立的状态中培养。在对照和实验组中使用的基础培养基用5％的血源性血清补充[5]。培养24小时和48小时后，确定细胞数和存活率，使用Wright-Giemsa染色确定细胞的成熟阶段。
实施例4：确定3D培养阶段
在该实施例中，确定了用于成红血细胞填充细胞培养的最佳成熟阶段。当剩余50％或更多早幼红细胞(在培养第13天)和多染红细胞/晚幼红细胞的比例是50％或更多时，开始填充细胞培养。
实施例5：2D平板培养和3D填充细胞培养(100μl，200μl)
随着细胞数增加，营养素扩散到细胞填充部分或有毒代谢物如CO2和乳酸排出是困难的。在该实施例中，确定了用于多染红细胞/晚幼红细胞填充细胞培养的最佳填充规模。为了这个目的，比较了红细胞在各个条件下的产率和去核速率。在6孔平板中以1×106个细胞/mL的密度培养对照细胞。在实验组I中，使细胞置于锥形管中并以1×107个细胞/mL的密度填充并培养。在实验组II中，细胞以2×107个细胞/2mL的密度培养。实验组II的细胞填充规模为实验组I的体积的2倍。试管具有使得实验组I和II的细胞足够填充以生成3D填充环境的尺寸。使用相同的培养溶液。在培养24小时和48小时后，确定细胞数和存活率，使用Wright-Giemsa染色确定细胞的成熟阶段。
实施例6：2D培养和多孔结构中的3D填充细胞培养
在该实施例中，提高多染红细胞/晚幼红细胞的填充规模以复制骨小梁的三维环境。为了这个目的，选择和比较适用于人体和具有类似骨小梁空间的维度的材料。第一材料是由100％纤维素制成的Cytopore(GE healthcare)，其是具有30μm的平均孔径、1.03g/ml的密度、200μm至280μm的粒径、1.1m2/g的有效表面积和40ml/g的体积的多孔载体。第二材料是由聚乙烯和二氧化硅制成的Cytoline 1(GE healthcare)，其具有1μm至400μm的孔径、1.32g/ml的密度、120cm/分钟至220cm/分钟的沉降速度、1.7cm至2.5cm的长度、0.4cm至1.1cm的厚度和0.3m2/g或更大的表面积，其与骨小梁空间类似。
3D实验组的对照与用于2D平板培养的条件相同。将Cytopore置于试管中(实验组I)，将Cytoline 1置于试管中(实验组II)(见图4)，向其中添加多染红细胞/晚幼红细胞，以1×107个细胞/ml的密度填充和培养。持续培养直至达到末期成熟阶段。培养24小时和48小时后，确定细胞数和存活率，使用Wright-Giemsa染色确定细胞的成熟阶段。
实施例7：旋转瓶中的3D填充
在该实施例中，确定了在成熟阶段的细胞是否对由弱流引起的剪应力有耐受性，以及在3D填充情况下是否被挤压。通过如上的相同步骤测试对照细胞。对于实验组，将细胞以l.0×107个细胞/ml的密度添加到旋转瓶中的Cytoline1并培养。通常，细胞在填充床生物反应器中是固定的。在该实施例中，将类似于粘连细胞而非漂浮细胞的成红血细胞置于在孔中，但其中一些通过培养基流动从微载体脱离并漂浮到微载体外。
在各种RPM条件下确定了成红血细胞非常易受由流体流动造成的剪应力影响的事实。因此，在生物反应器的旋转速度调整为RPM 25以最小化剪应力影响后，培养细胞直至达到末期成熟阶段。RPM 25是生物反应器的最低旋转速度。每24小时，通过台盼蓝染色计算对照组和实验组中的存活细胞数，使用Wright-Giemsa染色分析细胞的成熟阶段。
实施例8：使用旋转瓶中的Cytopore和Cytoline 1的3D填充
考虑到骨髓情况为了扩大培养，研究了即使填充大体积和大量细胞，用于最佳培养基交换而没有细胞挤压的条件。为了该目的，将Cytopore或Cytoline 1添加到旋转瓶中并培养。对照使用相同条件。在旋转瓶中，以1×107个细胞/mL的密度培养实验组。每24小时，使用Wright-Giemsa染色分析细胞的成熟阶段。
实施例9：在旋转瓶旋转过滤器中使用Cytoline 1的3D培养(培养基交换)
选择Cytoline 1为用于3D填充细胞培养的多孔结构，因为其更适合用于体外骨髓环境的复制。发现非粘连红系细胞在多孔微载体中不是固定的，其中一些脱离载体并以悬浮形式漂浮。在该情况下，红系细胞不会彼此接触。在该实施例中，将红系细胞填充并在孔中生长，其与载体一起捕获在圆柱旋转过滤器中用于简单的培养基交换，在培养箱中固定和培养。填充，由于过滤器的大孔径，属于最小细胞型的红系细胞容易经由8μm过滤器从生物反应器脱离。因此，在该实施例中，将红系细胞捕获在筛孔尺寸为3μm的小旋转过滤器中，当使得培养溶液缓慢交换时培养。如上使用相同的对照。在实验组I中，细胞被捕获并以1×107个细胞/ml的密度在Cytoline 1中静态培养(以RPM0)。在实验组II中，当以RPM 25振动时培养细胞。每24小时分析对照组和实验组的细胞成熟阶段。
实施例10：2D高密度培养和使用Cytoline 1的3D填充细胞培养
从以上实验结果总结出，3D填充细胞培养在细胞存活率和细胞成熟方面比2D平板培养更有利。使用多孔结构降低了3D填充细胞培养的细胞存活率，但导致细胞成熟的显著增加。这些结果可以解释为体外骨髓环境的复制，可以认为其对于在末期成熟阶段以高密度制备红系细胞是创新的。
本发明人之前已经报道了，当细胞以比普通细胞密度更高的密度被培养时，其在2D平板底部彼此接触，获得高的细胞存活率和更好的细胞成熟。本发明人已经进行了比较实验，3D培养相比2D高密度平板培养是否制备更大量的红系细胞归结于更频繁接触和用培养基交换干涉的填充。使用相同的培养溶液。在24孔的2D平板中，以1×106个细胞/mL的密度培养对照细胞。在实验组1中，在试管中和Cytoline 1以1×107个细胞/mL的密度培养细胞。在实验组II中，在旋转瓶中和Cytoline 1以1×107个细胞/mL的密度培养细胞。每24小时，通过台盼蓝染色确定对照组和实验组的存活细胞数，使用Wright-Giemsa染色分析细胞的成熟阶段。
实施例11：用于选择合适多孔材料的附加实验
将处于末期成熟阶段的红系细胞在大孔微载体和支架例如3D多孔结构上以高密度经受填充细胞培养，以确定3D多孔结构对红系细胞培养的影响。3D多孔结构应该具有若干孔以模拟细胞的相互作用，复制体内骨小梁的多孔性，由无害细胞的生物相容性材料制成。为了筛选合适的多孔结构，表1中示出了应用的各种孔径、骨架形状和构成成分。在6孔的2D平板上，以1×106个细胞/mL的密度培养对照细胞。
表1
Figure BDA0001159914890000141
在旋转过滤器中的每个多孔结构中，以l×107个细胞/mL的密度培养处于成熟阶段的红系细胞3天。每天用新鲜培养基替换全部培养基的一半，通过Wright-Giemsa染色确认细胞形态。
实施例12：测量经培养的细胞的输送氧能力
使用Hemox analyzer(TCS Scientific)测量在3D支架中通过填充细胞培养制备的成红血细胞的氧平衡曲线，并与作为对照的健康对象外周血的氧平衡曲线比较。
实施例13：用于选择红系细胞3D培养结构的附加实验
在该实施例中，确定了适用于红系细胞培养的孔径和材料。为了该目的，使用各种3D结构进行细胞填充实验。为了选择具有500μm或更小的孔径用于复制细胞内骨架结构和足够强度以支撑骨髓成分以及能够在培养后容易收集的结构的材料，在3D打印支架、微载体、无孔盘和金属材料(Ni和不锈钢)上进行实验。对照组和实验组的细胞密度和培养基条件与以上实验条件相同。表2显示3D结构的规格。
表2
Figure BDA0001159914890000151
实施例14：鉴定与骨髓成分共培养的效果
在3D结构中通过骨髓成分和红系细胞的共培养复制骨髓中实际红细胞岛，该3D结构模拟造血过程活跃发生的造血骨小梁空间。在红细胞岛中促进细胞成熟。共同培养间充质干细胞(MSC)、成骨细胞和成熟红系细胞192小时，同时维持其比例常数(2:1:10)。结果与2D平板培养中获得的结果比较。使用以9:1比例的stem line II和Dulbecco改良Eagle培养基低葡萄糖培养基的混合物作为适于这3种细胞共同培养的基础培养基。全部培养基仅一部分每天用新鲜培养基替换。其后，通过流式细胞术确定细胞群体(CD45用于骨髓细胞、CD71用于红系细胞，CD51和CD90用于MSC)。进行各种实验以建立最佳培养条件。为了该目的，同时培养成分细胞。任选地，首先培养MSC和成骨细胞，3小时后与红系细胞共培养。
实验结果
1.早幼红细胞/多染红细胞(2D平板培养和3D填充细胞培养)的填充效果
从脐带血分离的造血干细胞在培养基中分化13至17天。当早幼红细胞/多染红细胞的比例达到≥50％时，细胞以高密度填充。对照细胞在平板中培养。在实验组中，在试管中以2×107个细胞/mL的密度填充细胞。在培养的第1天和第2天，观察红系细胞的成熟阶段和存活率(见图2A)。与在2D平板培养中不同，培养红系细胞同时保持其在3D试管中彼此紧密接触，这类似于骨髓中的红细胞岛(见图2A)。在培养1天和2天之后，对照中的晚幼红细胞比例分别为38.5％和57.8％。相反，经历3D填充的实验组中晚幼红细胞比例分别为50.9％和49.6％(见图2B)。在3D填充细胞培养后实验组中的无核红细胞数(20.6％和25.2％)相比对照组(13.7％和7.5％)增加。在培养的第2天，实验组中晚幼红细胞比例少于对照组中的比例，这可能是因为实验组中更多晚幼红细胞去核为红细胞。在培养的第1天和第2天，对照组(5.1％和6.1％)和实验组(2.3％和3.1％)减少了脊髓发育不良。脊髓发育不良是当由于劣质培养环境而核不足以分裂且裂开或几个核留在1个细胞质中时出现的失调。因此，可以总结出3D填充细胞培养环境更适于细胞成熟和红细胞制备。
2.晚幼红细胞的填充规模
在以上实验中，确认了3D高密度填充细胞培养在细胞成熟方面相比2D平板细胞培养更有效，这是因为其复制了细胞间接触增加的体内骨髓环境。为了找到用于3D高密度填充细胞培养的最佳细胞填充规模，比较了实验组I和II中处于成熟阶段的成红血细胞和在2D平板细胞培养对照中的成红血细胞。在实验组I中，在可以产生3D填充环境的窄管中，细胞以1×107个细胞/ml的密度经受填充细胞培养。在实验组II中，细胞以2×107个细胞/ml的密度经受填充细胞培养。在培养1天和2天之后，对照组的晚幼红细胞比例分别为40.7％和22.6％，实验组I的比例分别为43.3％和23.1％，实验组II的比例分别为36.0％和18.2％。这些结果证明了实验组I的条件对于3D填充细胞培养的细胞成熟更有效(见图3的(A)和(B))。由于去核效应，在培养的第1天和第2天，实验组I(23.8％和46.1％)和实验组II(23.0％和30.1％)中处于末期成熟阶段的红系细胞比例相比对照组(16.1％和22.6％)更高。实验组I和II中填充的去核红细胞数增加解释了这些结果。观察到实验组I的填充效果比实验组II更显著。在第2天，对照组、实验组I和II经过填充的脊髓发育不良分别降至3.8％、2.7％和2.6％。在第1天，相比对照，实验组I和II的细胞存活率分别增加了4.6％和5.4％。在第2天，相比对照，实验组I和II的细胞存活率分别增加了5.7％和5.9％(见图3B)。
3.多孔结构中的3D填充细胞培养
在体外骨小梁环境中培养处于成熟阶段的细胞。为了这个目的，在对照中培养的处于成熟阶段的成红血细胞与在Cytopore和Cytoline l中培养的成红血细胞相比较(见图4)。
在培养的第1天、第2天和第3天，Cytopore中的红系细胞存活率低于对照的红系细胞存活率。这认为是由于孔空间太小而不能引起细胞接触和培养基流通，如图4所示(见图5)。
对于Cytoline 1，经过填充细胞培养的细胞成熟是有效的(见图6)。结果是，在培养1天和2天后，对照中的晚幼红细胞比例分别是38.3％和15.6％，Cytoline 1的实例1的晚幼红细胞比例分别是67.5％和14.1％。经过填充的Cytoline 1的实例1和2中去核红细胞比例(26.9％和80.0％)相比对照(6.1％和7.2％)高得多。脊髓发育不良在对照(26.9％和4.0％)和Cytoline 1(2.8％和0.0％)中降低(见图7)。在填充1天后，比较源自另一脐带血的实例2细胞。对照的晚幼红细胞比例为39％，实验组II为94.1％。实验组II中晚幼红细胞的较高比例显示了细胞成熟的极大增加。经过在Cytoline 1存在下的3D填充细胞培养，细胞间接触增加，细胞更有效地成熟(见图8和图9)。因为对照中的活细胞不是红系细胞而是其他族的细胞，没有比较对照中的细胞存活率。
4.比较无孔旋转瓶中的成红血细胞培养
在该实施例中，确定了处于成熟阶段的多染红细胞/晚幼红细胞对由旋转瓶中弱流导致的剪应力(流体力学损害)是否有抵抗力(见图10A)。在以RPM25搅拌下培养细胞4天，其中将剪应力最小化。在该速率，将细胞固定在瓶底而不漂浮。每24小时观察晚幼红细胞在对照中的比例(9.1％、5.9％、46.2％和41.6％)和在实验组I中的比例(35.0％、12.8％、36.0％和12.8％)。相比对照(0.0％、2.7％、5.8％和3.4％)，在使用旋转瓶的实验组I中的红细胞产量(6.5％、9.0％、26.0％和59.3％)较高，因此，在旋转瓶中在Cytoline 1存在下的培养在细胞成熟和红细胞制备方面也是有效的。然而，相比对照，实验组I晚幼红细胞的细胞存活率较低，红细胞形态由剪应力而不能很好维持。因此，免除剪应力的孔是适用于培养的(见图10A)。
5.旋转瓶中在Cytopore存在下的培养
为了大体积减少细胞挤压和剪应力，添加Cytopore和Cytoline 1，在用于3D填充细胞培养的单独旋转瓶中培养。对于Cytopore，如之前实验所获得的结果，甚至在旋转瓶中成熟红系细胞数没有增加。因此，Cytopore确认为不适用于红系细胞培养(见图11)。
6.旋转瓶中在Cytoline 1存在下的培养
晚幼红细胞在对照中的比例为11.8％、3.9％和34.7％，在实验组为34.1％、9.7％和3.1％。当添加Cytoline 1并在用于3D填充细胞培养的旋转瓶中培养时，细胞间接触增加，细胞更有效地成熟(见图12)。由于去核效应，在培养的第1天、第2天和第3天，实验组中的去核红细胞比例(12.2％、32.3％和90.6％)相比对照(0％、2.3％和4.2％)较高。因此，可以得到结论：由于在Cytoline 1中处于成熟阶段的细胞当维持其填充效果时较少受剪应力的影响，Cytoline 1的存在对于处于末期阶段的红系细胞制备是有效的。
7.比较旋转瓶旋转过滤器和Cytoline 1和振动RPM对3D培养的效果
为了防止细胞脱离微载体和免受由培养基流造成的剪应力而不被填充，将微载体和细胞捕获在旋转过滤器(3μm)中使在培养溶液缓慢交换同时维持细胞填充效果不改变。在实验组I中，将细胞捕获在旋转过滤器中，并用Cytoline 1培养。考虑到剪应力，将细胞以RPM 0搅拌。在实验组II中，为了更好的培养基交换，将细胞以RPM 25振动培养。在培养1天和2天之后，对照中晚幼红细胞比例为51.4％和64.2％，实验组I中的比例为66.4％和70.0％，实验组II中的比例为63.2％和59.4％。实验组I中的去核红细胞数为15.0％和25.6％，实验组II中的数为25.5％和32.3％，其相比对照(8.6％和10.7％)更大。具体地，实验组II中观察到更大去核红细胞数。在培养的第1天，相比对照，在实验组I和II(5.7％、1.0％和2.0％)中观察到较少脊髓发育不良(图13至图15)。在旋转过滤器中没有观察到细胞碎片。即，使用多孔结构维持了细胞的填充效果，使用旋转过滤减少了由培养基流造成的剪应力，并使得培养溶液容易交换。因此，多孔结构和旋转过滤器的组合对于细胞成熟和红系细胞制备最有效。
8.2D高密度培养和使用Cytoline 1的3D填充细胞培养
为了再次证明以上实验结果，本发明人重复了具有更好结果的实验。在2D平板上以高密度培养对照细胞，在试管中在Cytoline 1存在下使实验组I的细胞经受3D填充细胞培养，使实验组II的细胞在旋转过滤器中与Cytoline 1一起经受3D填充细胞培养。在培养1天和2天之后，对照组的晚幼红细胞比例分别为60.0％和66.7％，实验组I的比例分别为45.1％和56.5％，实验组II的比例分别为31.7％和44.3％。经过3D填充细胞培养，实验组的条件确认为在细胞成熟方面更有效(图16至图18)。由于去核效应，实验组I中的去核红细胞比例(22.5％和43.5％)和实验组II(24.4％和50.4％)高于对照(7.2％和24.2％)中更高。在实验组中，细胞间接触增加，有助于有效填充。脊髓发育不良在对照组(2.0％和1.0％)、实验组I(4.2％和0.0％)和实验组II(0.0％和1.7％)中减少(见图16至图18)。
9.多孔结构的选择
在培养3天期间，相比对照，在3D多孔结构中观察到红细胞的快速成熟。血红蛋白被累积，使得细胞团的颜色变为深红。在培养的第1天，相比其他支架，在Cytoline 1中观察到显著的红色细胞团。随着培养天数过去，在支架Bioemrix 3D和Honeycomb中培养的细胞团也为红色。尽管细胞的成熟速率会依赖于结构种类而变化，但全部3D填充细胞培养环境确认为对红细胞制备是有效且合适的。图19示出了染色细胞的图(左)，图20示出了处于不同成熟阶段的细胞比例。具体来说，随着培养天数增加，在支架Bioemrix 3D和Honeycomb中培养的细胞存活率比对照中的更高(见图18，右)，在培养的第4天，Bioemrix 3D中经历去核的染色红细胞数增加(见图19)。
在高密度填充细胞培养后(3天)，分析细胞中的细胞信号，并与培养(oh)前细胞中的细胞信号比较。测量作为成红血细胞黏附相关标记的肝癌缺失1(DLC-1)和细胞间黏连分子4(ICAM-4)、作为转录因子的GATA-1、作为红系细胞成熟标记的Hb-β和Hb-γ的mRNA表达水平(见图21)。在培养的第1天，Bioemrix 3D和ICAM-4中DLC-1的mRNA表达水平分别比Oh对照中的mRNA表达水平高253.2倍和104.9倍。在培养的第2天，Bioemrix 3D中培养的红系细胞的GATA-1mRNA表达水平增加了9.1倍。在培养的第3天，Bioemrix3D和Honeycomb中的Hb-βmRNA表达水平分别增加了313.0倍和298.2倍。在培养的第3天，Bioemrix 3D中的Hb-γmRNA表达水平增加了203.3倍。这些结果证明了多孔结构中的成熟红系细胞的填充细胞培养导致细胞间接触增加，产生了极大增强的细胞黏附和细胞成熟。
10.测量培养的细胞的运输氧能力
图22示出了培养后的成熟红细胞团(左)。成熟红系细胞运输O2的能力确定为类似于对照(制备的红细胞和对照分别为p50＝20.8和p50＝25.8)(见图22)
11.确认与骨髓细胞成分共培养的效果
红系细胞与骨髓成分共培养。结果是，在2种条件下细胞群不同。在3D结构中全部细胞的共培养确认为对红系细胞分化有帮助(见图24)。
图24示出了在多孔结构中成熟红系细胞与间充质干细胞(MSC)和作为骨髓细胞的成骨细胞共培养后获得的结果。在实验组A中，将黏附细胞MSC和成骨细胞置于多孔结构中，使其静置3小时直到细胞黏附到多孔结构，添加红系细胞并培养。在实验组B中，将3种细胞同时加入并共培养192小时。在细胞同时培养的实验组B中，192小时后，3D培养中表示MSC的CD51+CD90+的百分比增加了3.1％，其相比于2D培养保持了稳定。表示未成熟红系细胞的CD45+CD71+的百分比增加了16.0％，表示成熟红系细胞的CD45-CD71+的百分比与对照相似。在红系细胞比黏附细胞稍晚加入的实验组A中，192小时后，细胞标记CD51+CD90+细胞的百分比下降了约0.7％，但相比2D培养，3D培养中的CD45+CD71+百分比高了21.4％，揭示了实验组A的条件在3D多孔结构中维持和增殖红系细胞是有效的。骨髓中的红系细胞彼此三维黏附以产生称为幼红细胞岛的空间，在这里其成熟并增殖。骨髓中的幼红细胞岛是重要空间，在这里未成熟红系细胞为了其成熟与组织细胞紧密相互作用。相似地，红系细胞的成熟和最终红细胞的制备通过红系细胞和包括组织细胞和单核细胞的骨髓细胞在3D多孔结构中共培养可以最大化，这是由经验确定的。为了这个目的，将骨髓单核细胞(BM MNC)以1×108个细胞/mL的密度添加到3D不锈钢多孔结构，用3μm的旋转过滤器环绕，培养72小时(实验组)。2D对照的条件、培养基和培养基交换条件与上述相同。使用显微镜在24小时间隔下观察多孔结果中的细胞黏附和3D填充(见图25，左)。在相同的时间间隔下，使用Wright-Giemsa染色确定了多孔结构中通过立体细胞间相互作用的红系细胞成熟(见图25，右)。在培养48小时后，相比2D对照，3D实验组中观察到了显著的未成熟红系细胞(黑色箭头表示未成熟红系细胞，其余细胞是单核细胞和组织细胞)。同样，在培养72小时后，相比对照，在实验组中清晰观察到成熟红系细胞和组织细胞(黑色箭头表示未成熟红系细胞，红色箭头表示成熟红细胞，白色箭头表示组织细胞)。这揭示了3D多孔结构中骨髓细胞之间的立体相互作用在红系细胞成熟中起到重要作用。
尽管已经详细地描述了本发明的具体实施方式，然而本领域技术人员会领会这些详细描述仅仅是优选的实施方案，而本发明的范围不限于此。因此，本发明的真实范围应该由所附的权利要求和其等同物界定。
参考文献
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Claims (10)

1.一种用于红系细胞体外扩增的方法，其包括使红系细胞经受使用多孔结构的三维填充细胞培养，其中在三维填充细胞培养期间，红系细胞与间充质干细胞和成骨细胞混合并共培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多孔结构具有30μm至500μm的孔径分布。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养在通过持续流动施加剪应力的培养基中进行。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述流动由搅拌产生。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述流动由以1rpm至50rpm搅拌产生。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述培养在培养基的过滤器中进行，以防止红细胞在持续流动期间脱离多孔结构。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述过滤器具有1μm至8μm的筛孔尺寸。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述红系细胞是进入末期成熟阶段的细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其中三维填充细胞培养的红系细胞表达至少1种黏附相关的基因，其选自肝癌缺失1(DLC1)、细胞间黏附分子-4(ICAM-4)和迟现抗原-4(VLA-4)。
10.根据权利要求1所述的方法，其中间充质干细胞和成骨细胞的细胞数与红系细胞数的比例为1:10至2:1。
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