CN116144580A - 肺组织类器官的制备方法和培养基 - Google Patents
肺组织类器官的制备方法和培养基 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116144580A CN116144580A CN202211653800.4A CN202211653800A CN116144580A CN 116144580 A CN116144580 A CN 116144580A CN 202211653800 A CN202211653800 A CN 202211653800A CN 116144580 A CN116144580 A CN 116144580A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lung tissue
- final concentration
- cells
- organoid
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 title claims abstract description 152
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 title claims abstract description 94
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 118
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 69
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 19
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 13
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 27
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 23
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 18
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 claims description 16
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 14
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 claims description 14
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 13
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 12
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 claims description 12
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004864 Fibroblast growth factor 10 Human genes 0.000 claims description 11
- 108090001047 Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 claims description 11
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 claims description 11
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 11
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 11
- 229940098448 fibroblast growth factor 7 Drugs 0.000 claims description 11
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 11
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 10
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 9
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 9
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 claims description 9
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 9
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 9
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000011435 rock Substances 0.000 claims description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 7
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 7
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 claims description 7
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 claims description 7
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 claims description 7
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 claims description 7
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 6
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 5
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims description 5
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 claims description 5
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 claims description 5
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims description 4
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 claims description 4
- 229960002648 alanylglutamine Drugs 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 claims description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 3
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 2
- 125000003338 L-glutaminyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 claims 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 18
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 8
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008021 deposition Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 18
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 16
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000000306 component Substances 0.000 description 4
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 101001011890 Xenopus laevis Matrix metalloproteinase-18 Proteins 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- 101150095289 FGF7 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- OLIIUAHHAZEXEX-UHFFFAOYSA-N N-(6-fluoro-1H-indazol-5-yl)-6-methyl-2-oxo-4-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-3,4-dihydro-1H-pyridine-5-carboxamide Chemical compound C1C(=O)NC(C)=C(C(=O)NC=2C(=CC=3NN=CC=3C=2)F)C1C1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1 OLIIUAHHAZEXEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 238000003255 drug test Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000004065 mitochondrial dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0688—Cells from the lungs or the respiratory tract
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/02—Compounds of the arachidonic acid pathway, e.g. prostaglandins, leukotrienes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
- C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
- C12N2509/10—Mechanical dissociation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了一种肺组织类器官的制备方法和培养基。本发明提供的方法包括将肺组织细胞与干细胞混合并进行共培养。该方法能够显著提高肺组织类器官，尤其是炭末沉积肺组织类器官培养的成功率。配合本发明提供的肺组织分离培养基和类器官扩增培养基，还能进一步提高肺组织类器官的成功率和扩增效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种肺组织类器官的制备方法。
背景技术
随着科学技术的发展，应用于肿瘤研究的临床前模型包括细胞系、二维肿瘤细胞培养、动物移植瘤模型和患者来源的肿瘤类器官(Patient-derived organoids，PDO)等，其中，PDO是通过对原代肿瘤组织进行三维培养获得的具有与体内肿瘤类似的生物学特征的细胞团。相比于其他模型，PDO能够很好地保留原代肿瘤组织的形态学和遗传学特性，并且在体外模拟原代肿瘤组织的生理特性和药物敏感性，具有增殖速度快、培养周期短、培养成功率高、传代稳定性高等优点，十分适合高通量药物测试和筛选，对于精准药物治疗具有极好的指导作用。
肺癌是一类个体差异和肿瘤异质性巨大的疾病，患者在临床表现、组织学特征和表观遗传学等方面的表现具有很大差异，肺癌的这些特性驱动着对肺癌的治疗方案需要走个体化精准医疗路线。PDO为这种精准医疗提供了极佳的试验平台。然而，目前肺癌类器官的培养成功率较低，总体成功率小于70％，其中，肺腺癌类器官的培养成功率仅为50％上下，尤其是对于有明显肺部碳沉积的患者而言，采用其手术切除的肺组织进行类器官培养的成功率还不足10％，这极大限制了PDO在肺癌类器官临床和临床前研究中的应用。
目前针对肺癌类器官培养的研究主要集中在培养基方面，研究人员主要通过在基础培养基中添加各种培养因子的方式来提高肺癌组织的类器官培养成功率。但是这种方式收到的成效较差，尤其是对炭末沉积肺组织进行类器官培养的成功率较低，获得的类器官的扩增效率也很低。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的对肺癌组织，尤其是对炭末沉积肺组织进行类器官培养时成功率和类器官扩增效率低等问题，提供一种肺组织类器官的制备方法和培养基，该方法能够显著提高肺组织类器官，尤其是炭末沉积肺组织类器官培养的成功率。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种肺组织类器官的制备方法，所述方法包括将肺组织细胞与干细胞混合并进行共培养。
本发明第二方面提供第一方面所述的方法中所用的肺组织分离培养基和类器官扩增培养基。
通过上述技术方案，本发明至少能够取得如下有益效果：
(1)本发明的方法采用间充质干细胞与肺上皮细胞进行共培养，间充质干细胞一方面能够提供肺组织类器官培养所需的细胞因子，减少了人工添加细胞因子带来的培养成本，另一方面，间充质干细胞还能促进炎症肺组织的修复，提高上皮细胞活细胞比例，提升炭末沉积样本类器官的构建效率。
(2)本发明的方法有效提高了肺组织类器官，尤其是炭末沉积肺组织类器官培养的成功率，配合本发明提供的肺组织分离培养基和类器官扩增培养基，同时还提高了肺组织类器官的扩增效率。
附图说明
图1是实施例1和对比例1中采用炭末沉积肺组织进行肺组织类器官构建的结果对比图(图中比例尺为200μm)，其中图1A为实施例1构建的肺组织类器官的显微图片，图1B为对比例1中构建肺组织类器官的结果图，从中可以看出，采用对比例1中的方法没有明显的肺组织类器官生成。
图2是实施例2中采用健康小鼠肺组织进行肺组织类器官构建的结果图(图中比例尺为200μm)。
图3是对比例2中采用炭末沉积肺组织进行肺组织类器官构建的结果图(图中比例尺为200μm)。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
由于炭末沉积肺组织中的细胞状态较差，采用这种肺组织进行类器官培养时，相比采用正常肺组织更容易产生细胞死亡、崩解的现象，甚至出现细胞的纤维化改变，导致类器官培养成功率极低的问题。本发明的发明人在研究中巧妙地发现，通过将干细胞(尤其是间充质干细胞)与炭末沉积肺组织中提取的细胞(例如肺上皮细胞等)混合共培养，不仅能有效提高炭末沉积肺组织类器官的构建效率，而且还减少了培养基中细胞因子的用量，降低类器官构建成本。
基于上述发现，本发明一方面提供一种肺组织类器官的制备方法，所述方法包括将肺组织细胞与干细胞混合并进行共培养。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述肺组织细胞选自肺上皮细胞。优选为由炭末沉积肺组织中提取获得的肺上皮细胞。
优选地，所述炭末沉积肺组织获取自肺癌患者。
本发明中，“炭末沉积肺组织”是指从炭末沉积肺中提取的肺组织。通常，对进行肺癌切除的患者而言，在手术中有50％的肺组织出现灰黑色，用生理盐水冲洗后灰黑色无明显降低的即可判断为炭末沉积肺。
本发明的发明人在研究中发现，炭末沉积肺组织中存在一定程度的线粒体功能障碍，从而导致采用炭末沉积肺组织细胞进行类器官培养的成功率大幅降低，而当炭末沉积肺组织细胞在与干细胞(例如间充质干细胞)共培养时，干细胞分泌的一些生物活性物质(例如蛋白质、microRNA等)能够对炭末沉积肺组织细胞起到治疗作用，促进炭末沉积肺组织细胞的修复，提高肺上皮细胞的活性和活细胞比例，从而有效提高炭末沉积肺组织类器官的构建效率。而且，干细胞本身能够产生多种细胞因子，在共培养过程中无需额外添加其他细胞因子，大幅降低了炭末沉积肺组织类器官的构建成本。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述干细胞选自多能干细胞。优选为间充质干细胞。
本发明提供的方法中，对于肺组织细胞和干细胞共培养时的细胞用量比没有特别限制，只要能够提高肺组织类器官构建效率即可。为了获得更好的培养效果，进一步提高肺组织类器官的构建效率和扩增效率，优选地，所述肺组织细胞与干细胞在培养体系中的细胞数之比为3-10：1。优选为3-5：1。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述方法还包括在培养前采用基质胶将肺组织细胞和干细胞进行包埋处理。
本发明中，对于将肺组织细胞和干细胞进行包埋处理的方式没有特别限制，任意本领域中常用于类器官构建和培养时进行细胞包埋的方式均可适用于本发明。
为了提高类器官构建的成功率，根据本发明的优选实施方式，其中，所述包埋处理的方式包括将肺组织细胞与间充质干细胞混合后，采用基质胶对细胞混合物进行包埋，再对包埋产物进行共培养，以获得肺组织类器官。
优选地，所述包埋的方式包括：将原代肺组织细胞与间充质干细胞(按照前述细胞数比例)混合配制成1×104-5×106个细胞/mL的细胞悬液(优选为1×104-1×105个细胞/mL)，再将该细胞悬液按照3-5∶1的体积比与融化的基质胶混匀。优选采用肺组织分离培养基配制所述细胞悬液。
本发明中采用的基质胶可以为任意本领域中能够用于类器官构建或细胞3D培养的基质胶，其既可以是根据现有技术自行制备获得的，也可以是直接通过商购获得的相关产品(例如Coming公司生产的Matrigel matrix基质胶等)。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述方法还包括获得肺组织细胞的步骤。
优选地，所述获得肺组织细胞的步骤包括对肺组织进行机械分离和消化，获得肺组织原代细胞，并采用肺组织分离培养基将该原代细胞配制成肺组织细胞悬液。
为了提高肺组织细胞的提取率和提取效率，更优选地，所述机械分离(例如使用眼科剪或手术刀对肺组织进行剪切)使得肺组织被分离成体积不超过3mm3，优选为0.5-1.5mm3的碎块。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述消化采用的消化液包括中性蛋白酶和/或胶原蛋白酶4。优选所述消化液含有胶原蛋白酶4，优选浓度为1-10mg/mL(通常采用PBS、培养基或DMSO配制)。
优选地，所述消化的条件包括：肺组织与消化液的体积比为1∶1-5，温度35-38℃，时间20-40min。为了避免过度消化导致细胞坏死，优选在消化过程中每隔5-10min对肺组织的消化情况进行观察，至大部分组织(至少达到80％以上)分离消化后，加入培养基或PBS终止消化。
本发明的发明人在研究中还发现，对包埋好的肺组织细胞和干细胞进行共培养时，采用特定配方的培养基(即本发明中的“肺组织分离培养基”)能够进一步提高肺组织类器官的构建成功率和构建效率。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述肺组织分离培养基包括基础培养基A和小分子组合物A。优选所述基础培养基A选自DMEM培养基。优选所述小分子组合物A包括谷氨酰胺补充剂、Wnt信号通路激活剂、头蛋白(Noggin)、纤维母细胞生长因子7(FGF7)、纤维母细胞生长因子10(FGF10)、ROCK抑制剂、TGF-β抑制剂、前列腺素、烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸和抗生素。
优选地，所述小分子组合物A的用量使得肺组织分离培养基中：谷氨酰胺的终浓度为0.5-5mM，Wnt信号通路激活剂的终浓度为0.5-5mM，头蛋白的终浓度为50-500ng/mL，纤维母细胞生长因子7的终浓度为10-100ng/mL，纤维母细胞生长因子10的终浓度为10-200ng/mL，ROCK抑制剂的终浓度为2-10μM，TGF-β抑制剂的终浓度为1-15μM，前列腺素的终浓度为0.1-ImM，烟酰胺的终浓度为0.1-10mM，N-乙酰半胱氨酸的终浓度为0.5-5mM，抗生素的终浓度为5-20U/mL。
更优选地，所述小分子组合物A的用量使得肺组织分离培养基中：谷氨酰胺的终浓度为2-3.5mM，Wnt信号通路激活剂的终浓度为1-2mM，头蛋白的终浓度为50-200ng/mL，纤维母细胞生长因子7的终浓度为10-50ng/mL，纤维母细胞生长因子10的终浓度为20-80ng/mL，ROCK抑制剂的终浓度为5-10μM，TGF-β抑制剂的终浓度为1-5μM，前列腺素的终浓度为0.1-0.5mM，烟酰胺的终浓度为0.5-2mM，N-乙酰半胱氨酸的终浓度为0.5-2mM，抗生素的终浓度为5-10U/mL。
本发明中，肺组织分离培养基中：谷氨酰胺的终浓度可以为2mM、2.2mM、2.5mM、2.8mM、3mM、3.2mM、3.5mM，或者也可以为上述任意两个值的任意中间值。
Wnt信号通路激活剂的终浓度可以为1mM、1.2mM、1.4mM、1.6mM、1.8mM、2mM，或者也可以为上述任意两个值的任意中间值。
头蛋白的终浓度可以为50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL、200ng/mL，或者也可以为上述任意两个值的任意中间值。
纤维母细胞生长因子7的终浓度可以为10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL，或者也可以为上述任意两个值的任意中间值。
纤维母细胞生长因子10的终浓度可以为20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL，或者也可以为上述任意两个值的任意中间值。
ROCK抑制剂的终浓度可以为5μM、5.5μM、6μM、6.5μM、7μM、7.5μM、8μM、8.5μM、9μM、9.5μM、10μM，或者也可以为上述任意两个值的任意中间值。
TGF-β抑制剂的终浓度可以为1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM，或者也可以为上述任意两个值的任意中间值。
前列腺素的终浓度可以为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM，或者也可以为上述任意两个值的任意中间值。
烟酰胺的终浓度可以为0.5mM、0.8mM、1mM、1.2mM、1.5mM、1.8mM、2mM，或者也可以为上述任意两个值的任意中间值。
N-乙酰半胱氨酸的终浓度可以为0.5mM、0.8mM、1mM、1.2mM、1.5mM、1.8mM、2mM，或者也可以为上述任意两个值的任意中间值。
抗生素的终浓度可以为5U/mL、5.5U/mL、6U/mL、6.5U/mL、7U/mL、7.5U/mL、8U/mL、8.5U/mL、9U/mL、9.5U/mL、10U/mL，或者也可以为上述任意两个值的任意中间值。
本发明中，谷氨酰胺补充剂是指能够提供谷氨酰胺的化合物。任意本领域中能够在细胞培养或类器官培养时能够为培养物提供谷氨酰胺的物质均可作为谷氨酰胺补充剂用于本发明中。
更优选地，所述谷氨酰胺补充剂选自L-谷氨酰胺和/或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。本发明中，对于谷氨酰胺补充剂的来源没有特别限制，其既可以是根据现有技术自行制备的产物，也可以是商购获得的相关产品(例如GlutaMAXTM)。
更优选地，所述Wnt信号通路激活剂选自SNH-284和/或CHIR99021。
更优选地，所述ROCK抑制剂选自Y-27632和/或GSK429286A
中的至少一种。
更优选地，所述TGF-β抑制剂选自SB-431542和/或LY2109761。
更优选地，所述前列腺素选自前列腺素E2。
更优选地，所述抗生素选自原代细胞抗生素(例如PrimocinTM)。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述方法还包括对获得的类器官进行扩增和传代培养的步骤。
本发明的发明人在研究中发现，采用特定配方的培养基对采用上述方法获得的肺组织类器官进行扩增和传代，能够有效提高扩增效率、类器官的存活率和质量。
优选地，采用类器官扩增培养基对获得的类器官进行扩增和传代。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述类器官扩增培养基包括基础培养基B和小分子组合物B。优选所述基础培养基B选自DMEM培养基。优选所述小分子组合物B包括谷氨酰胺补充剂、Wnt信号通路激活剂、头蛋白、纤维母细胞生长因子7、纤维母细胞生长因子10、TGF-β抑制剂、前列腺素、烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸和抗生素。
优选地，所述小分子组合物B的用量使得类器官扩增培养基中：谷氨酰胺的终浓度为0.5-5mM，Wnt信号通路激活剂的终浓度为0.5-5mM，头蛋白的终浓度为50-500ng/mL，纤维母细胞生长因子7的终浓度为10-100ng/mL，纤维母细胞生长因子10的终浓度为10-200ng/mL，TGF-β抑制剂的终浓度为0.1-1μM，前列腺素的终浓度为0.1-1mM，烟酰胺的终浓度为1-10mM，N-乙酰半胱氨酸的终浓度为0.5-5mM，抗生素的终浓度为5-20UU/mL。
更优选地，所述谷氨酰胺补充剂选自L-谷氨酰胺和/或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。
更优选地，所述Wnt信号通路激活剂选自SNH-284和/或CHIR99021。
更优选地，所述TGF-β抑制剂选自SB-431542和/或LY2109761。
更优选地，所述前列腺素选自前列腺素E2。
更优选地，所述抗生素选自青霉素和/或链霉素。
本发明进一步提供上述方法中所用的肺组织分离培养基和类器官扩增培养基。所述肺组织分离培养基和类器官扩增培养基的成分和特征如前所述，在此不再赘述。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于示例性地进一步解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
以下实施例中，炭末沉积肺组织来源于肺癌患者胸外科手术切除样本(已获得相关人员知情同意)，间充质干细胞购自普诺赛生物科技有限公司。未作特殊说明的试剂和材料均为购自正规化学或生物试剂/材料供应商的商购产品，试剂均为分析纯。
制备例1
按照如下表1的配方，以DMEM培养基为基础培养基，分别配制肺组织分离培养基和类器官扩增培养基。
表1
按照表2的配方配制组织消化液。
表2
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的方法进行肺组织类器官制备的效果。
(一)肺组织的分离消化
1、组织清洗：在超净台内，将手术切除的炭末沉积肺组织放置于直径100mm无菌培养皿中，用含有约100U/mL青链霉素的PBS抽吸冲洗3次。
2、组织机械分离：利用无菌的手术刀和眼科剪，将清洗后的肺组织剪切成大约1mm3的细小碎片。
3、组织消化：将机械分离后的肺组织碎片移至15mL无菌离心管中，按照肺组织与消化液(配方如表2所示)的体积比为1：4的用量加入组织消化液。用1mL枪头轻轻吹打组织，使其在消化液中充分分散后，置于37℃培养箱中，120rpm振荡消化30min，期间每5min取出在镜下观察分离效果，当约90％的组织消化后加入约10mL无菌PBS终止消化。
4、配制肺组织细胞悬液：用100μm筛网过滤消化产物，滤液引入新的15mL无菌离心管中，然后4℃下1200g离心5min，去上清后用PBS清洗一次细胞沉淀，再次4℃下1200g离心5min。去上清后，用肺组织分离培养基(配方如表1所示，后同)将细胞沉淀配制成约104或106个细胞/mL的肺组织细胞悬液备用(用台盼蓝法计数)。
(二)细胞混合和包埋
1、实验准备：提前一天取出Matrigel matrix基质胶放在-20℃，使其自然融化，实验前取出放在冰上。所有与基质胶接触的物品(如培养皿、离心管、移液枪头等)均放置在-20℃预冷，使用前取出放在冰上。24孔低吸附细胞培养板和DMEM培养基放置37℃预热。
2、间充质干细胞悬液制备：将10cm培养皿中培养至融合度80％左右的人间充质干细胞(MSC)采用胰蛋白酶消化，待细胞分离度到达90％以上时用预热的DMEM培养基终止消化并用15mL离心管收集消化液。室温下150℃离心3min，去上清后，用肺组织分离培养基重悬细胞沉淀，获得细胞密度约为1×104或1×105个/mL的MSC悬液(用台盼蓝法计数)。
3、细胞混合：按照肺组织细胞与MSC的细胞数比为4：1的比例，取肺组织细胞悬液和MSC悬液在新的15mL离心管中轻轻混合，获得的混合细胞悬液在冰上冷却10min。
4、细胞包埋：将冷却后的混合细胞悬液在4℃下100g离心5min，小心去除上清，使剩余体积不超过10μL。加入少量肺组织分离培养基重悬混合细胞，制成细胞密度约为1×104或1×105个/mL的细胞悬液(该细胞悬液的中的细胞密度与肺组织细胞悬液和MSC悬液的细胞密度保持一致，即，采用106个/mL的肺组织细胞悬液和MSC悬液混合后重悬制成1×106个/mL的混合细胞悬液)。按照细胞悬液与基质胶体积比为1：1的比例混合，用预冷的200μL枪头缓慢混匀。
(三)肺组织类器官培养
将与基质胶混匀的细胞悬液按照70μL/孔的量滴加在预热的24孔板中，37℃孵育20min，使基质胶凝固。然后在含有胶滴的培养孔中按照500μL/孔的用量加入肺组织分离培养基，放入37℃，5％CO2培养箱中培养。每隔3-5天更换一次培养基。
培养期间，每天观察镜下观察类器官生长情况。图1A中示例性地示出了采用细胞密度约为1×105的细胞悬液构建获得的肺组织类器官的显微图片，从图中可以看出有明显的类器官生成。经过观察还发现，该肺组织类器官的初始数量较多，增殖速度基本与正常组织一致。采用细胞密度约为1×104的细胞悬液构建获得的肺组织类器官也具有与之类似的形态和增殖特点，相比之下，只是增殖速度略有降低、形成的类器官体积略小。
当大部分类器官生长到直径达到100-500μm时，采用表1中的类器官扩增培养基进行类器官传代。具体传代过程包括：冰上溶胶后，用移液枪吹打机械破碎类器官，获得类器官悬液。然后按照体积比为1：1的比例将类器官悬液与新鲜的基质胶，再按照70μL/孔的量滴加在预热的24孔板中，37℃孵育20min，使基质胶凝固。然后在含有胶滴的培养孔中按照500μL/孔的用量加入肺组织分离培养基，放入37℃，5％CO2培养箱中培养，每隔3-5天更换一次培养基。
实施例2
按照实施例1中的方法进行肺组织类器官构建，不同的是，采用健康小鼠肺组织替代实施例1中的炭末沉积肺组织，间充质干细胞替换为鼠间充质干细胞。
结果与实施例1类似。图2中示例性地示出了采用小鼠肺组织为原材料构建出的小鼠肺组织类器官，从图中可以看出，该小鼠肺组织类器官的直径达到100-500μm。经过进一步对比发现，该小鼠肺组织类器官的数量和形态均与实施例1中采用人炭末沉积肺组织构建的肺组织类器官类似。
对比例1
按照实施例1中的方法进行肺组织类器官构建，不同的是，仅采用分离出的肺组织细胞进行类器官构建，不添加间充质干细胞，同时，在肺组织分离培养基中添加前列腺素E2至终浓度为1mM。
结果如图1B所示，从图中可以看出，当不添加间充质干细胞时，没有明显类器官生成。由此说明，即使在培养基中额外添加间充质干细胞分泌的前列腺素E2，在缺失间充质干细胞的情况下，肺组织类器官的构建情况仍然较差。
对比例2
按照实施例1中的方法进行肺组织类器官构建，不同的是，采用表3中的肺组织分离培养基进行肺组织类器官构建。
表3
| 成分 | 终浓度 |
| L-谷氨酰胺 | 2mM |
| CHIR99021 | 1mM |
| 头蛋白 | 50ng/mL |
| 纤维母细胞生长因子7 | 10ng/mL |
| 纤维母细胞生长因子10 | 20ng/mL |
| Y27632 | 5μM |
| 前列腺素E2 | 0.1mM |
| 烟酰胺 | 0.5mM |
| N-乙酰半胱氨酸 | 0.5mM |
| 原代细胞抗生素 | 5U/mL |
结果如图3所示。由此可见，有了间充质干细胞的参与，即使省略部分培养基成分(例如SB431542)，也会有类器官产生，但是经过显微镜观察检测发现，与实施例1相比，采用省略部分成分的培养基时，获得的肺组织类器官的数量和体积均有所降低。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种肺组织类器官的制备方法，其特征在于，所述方法包括将肺组织细胞与干细胞混合并进行共培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肺组织细胞选自肺上皮细胞，优选为由炭末沉积肺组织中提取获得的肺上皮细胞；
优选地，所述炭末沉积肺组织获取自肺癌患者。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述干细胞选自多能干细胞，优选为间充质干细胞；
优选地，所述肺组织细胞与干细胞在培养体系中的细胞数之比为3-10∶1，优选为3-5∶1。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述方法还包括在培养前采用基质胶将肺组织细胞和干细胞进行包埋处理。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述包埋处理的方式包括将肺组织细胞与间充质干细胞混合后，采用基质胶对细胞混合物进行包埋，再对包埋产物进行共培养，以获得肺组织类器官；
优选地，所述包埋的方式包括：将原代肺组织细胞与间充质干细胞混合配制成1×104-5×106个细胞/mL的细胞悬液，再将该细胞悬液按照0.5-1.5∶1的体积比与融化的基质胶混匀，优选采用肺组织分离培养基配制所述细胞悬液。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括获得肺组织细胞的步骤；
优选地，所述获得肺组织细胞的步骤包括对肺组织进行机械分离和消化，获得肺组织原代细胞，并采用肺组织分离培养基将该原代细胞配制成肺组织细胞悬液。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，所述肺组织分离培养基包括基础培养基A和小分子组合物A，优选所述基础培养基A选自DMEM培养基，优选所述小分子组合物A包括谷氨酰胺补充剂、Wnt信号通路激活剂、头蛋白、纤维母细胞生长因子7、纤维母细胞生长因子10、ROCK抑制剂、TGF-β抑制剂、前列腺素、烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸和抗生素；
优选地，所述小分子组合物A的用量使得肺组织分离培养基中：谷氨酰胺的终浓度为0.5-5mM，Wnt信号通路激活剂的终浓度为0.5-5mM，头蛋白的终浓度为50-500ng/mL，纤维母细胞生长因子7的终浓度为10-100ng/mL，纤维母细胞生长因子10的终浓度为10-200ng/mL，ROCK抑制剂的终浓度为2-10μM，TGF-β抑制剂的终浓度为1-15μM，前列腺素的终浓度为0.1-1mM，烟酰胺的终浓度为0.1-10mM，N-乙酰半胱氨酸的终浓度为0.5-5mM，抗生素的终浓度为5-20U/mL；
更优选地，所述谷氨酰胺补充剂选自L-谷氨酰胺和/或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽；
更优选地，所述Wnt信号通路激活剂选自SNH-284和/或CHIR99021；
更优选地，所述ROCK抑制剂选自Y-27632和/或GSK429286A中的至少一种；
更优选地，所述TGF-β抑制剂选自SB-431542和/或LY2109761；
更优选地，所述前列腺素选自前列腺素E2；
更优选地，所述抗生素选自原代细胞抗生素。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中，所述方法还包括对获得的类器官进行扩增和传代培养的步骤；
优选地，采用类器官扩增培养基对获得的类器官进行扩增和传代。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述类器官扩增培养基包括基础培养基B和小分子组合物B，优选所述基础培养基B选自DMEM培养基；优选所述小分子组合物B包括谷氨酰胺补充剂、Wnt信号通路激活剂、头蛋白、纤维母细胞生长因子7、纤维母细胞生长因子10、TGF-β抑制剂、前列腺素、烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸和抗生素；
优选地，所述小分子组合物B的用量使得类器官扩增培养基中：谷氨酰胺的终浓度为0.5-5mM，Wnt信号通路激活剂的终浓度为0.5-5mM，头蛋白的终浓度为50-500ng/mL，纤维母细胞生长因子7的终浓度为10-100ng/mL，纤维母细胞生长因子10的终浓度为10-200ng/mL，TGF-β抑制剂的终浓度为0.1-1μM，前列腺素的终浓度为0.1-1mM，烟酰胺的终浓度为0.1-10mM，N-乙酰半胱氨酸的终浓度为0.5-5mM，抗生素的终浓度为5-20U/mL；
更优选地，所述谷氨酰胺补充剂选自L-谷氨酰胺和/或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽；
更优选地，所述Wnt信号通路激活剂选自SNH-284和/或CHIR99021；
更优选地，所述TGF-β抑制剂选自SB-431542和/或LY2109761中的至少一种；
更优选地，所述前列腺素选自前列腺素E2；
更优选地，所述抗生素选自青霉素和/或链霉素。
10.权利要求7或9所述的方法中所用的肺组织分离培养基和类器官扩增培养基。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211653800.4A CN116144580A (zh) | 2022-12-20 | 2022-12-20 | 肺组织类器官的制备方法和培养基 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211653800.4A CN116144580A (zh) | 2022-12-20 | 2022-12-20 | 肺组织类器官的制备方法和培养基 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116144580A true CN116144580A (zh) | 2023-05-23 |
Family
ID=86359270
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211653800.4A Pending CN116144580A (zh) | 2022-12-20 | 2022-12-20 | 肺组织类器官的制备方法和培养基 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116144580A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117586943A (zh) * | 2024-01-17 | 2024-02-23 | 山东伯桢生物科技有限公司 | 体外构建类器官的方法及类器官 |
-
2022
- 2022-12-20 CN CN202211653800.4A patent/CN116144580A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117586943A (zh) * | 2024-01-17 | 2024-02-23 | 山东伯桢生物科技有限公司 | 体外构建类器官的方法及类器官 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7122371B1 (en) | Modular cell culture bioreactor | |
| US9255248B2 (en) | Method of producing erythrocytes without feeder cells | |
| KR101195838B1 (ko) | 분리된 전분화능 성체줄기세포 및 그의 분리 및 배양 방법 | |
| CN112266898B (zh) | 结直肠癌类器官的培养方法和培养液 | |
| US8278101B2 (en) | Stem cell bioprocessing and cell expansion | |
| CN106414722B (zh) | 红系细胞的体外扩增 | |
| JP2010508851A5 (zh) | ||
| US20220395537A1 (en) | Methods of stem cell culture for obtaining products, and implementations thereof | |
| CN116144580A (zh) | 肺组织类器官的制备方法和培养基 | |
| CN116024159A (zh) | 构建鼠类皮肤类器官的方法 | |
| CN117004572A (zh) | 病人来源的移植瘤类器官模型pdxo的构建方法与应用 | |
| US20210032596A1 (en) | Method of producing erythrocytes | |
| CN110564687B (zh) | 用于扩增造血干细胞的组合物、培养基、方法和试剂盒 | |
| CN112852709B (zh) | 小鼠肺类器官培养方法 | |
| KR20190124817A (ko) | 포자를 닮은 세포들의 계군 및 그 용도 | |
| CN113583947B (zh) | 间充质干细胞和造血干细胞体外培养方法和系统 | |
| Islami et al. | A review of evaluating hematopoietic stem cells derived from umbilical cord blood's expansion and homing | |
| CN117625537A (zh) | 用于培养结直肠癌类器官的新型培养基 | |
| CN115094027A (zh) | 一种胰腺癌类器官无血清专用培养基 | |
| JPWO2019026910A1 (ja) | 凍結保存用組成物、凍結保存物の製造方法、細胞製剤、細胞製剤の製造方法、凍結保存用キット | |
| US20220098553A1 (en) | Method for mesenchymal stem cell isolation and osteoblast differentiation | |
| CN114672455A (zh) | 一种利用多能干细胞诱导骨髓基质细胞的方法 | |
| Rebel et al. | Culture of purified stem cells from fetal liver results in loss of in vivo repopulating potential | |
| EP2585585B1 (en) | Method for harvesting cells cultured in 3d hydrogel matrices | |
| TWI757274B (zh) | 初代細胞培養法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20240128 Address after: 102200 910, unit 1, building 1, yard 1, Longyu middle street, Huilongguan town, Changping District, Beijing Applicant after: Beijing sailada Biotechnology Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: B1/F, Building 3, Comprehensive R&D Base, No. 9 Shengshengyuan Road, Changping District, Beijing, 102206 Applicant before: Zheng Lemin Country or region before: China Applicant before: Beijing sailada Biotechnology Co.,Ltd. Country or region before: China |