CN117625537A - 用于培养结直肠癌类器官的新型培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种用于培养结肠直癌类器官的新型培养基，所述培养基包括基础培养基、无菌水和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括胰岛素生长因子和Gremlin1、ALK 5抑制剂、ROCK抑制剂、MAPK抑制剂、R‑Spondin、B27和Gastrin1。该培养基能够提高结直肠癌类器官构建的成功率并且保证类器官具有高活性，能够稳定的传代冻存和复苏，并且同时适用于结直肠癌类器官的长期培养和类器官库扩建。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤类器官培养技术领域，具体地，本发明涉及一种用于培养结直肠癌类器官的新型培养基。
背景技术
结直肠癌(CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率已上升至世界恶性肿瘤的第三位，被广泛认为是一种细胞和分子水平的异质性疾病，其发病机制涉及多种基因改变和途径。好发部位为直肠及直肠与乙状结肠交界处，占60％。对于结直肠癌的研究与治疗往往都是以来源于病人的细胞系作为对象。但是细胞系在长期培养过程中，由于适应了二维生长的环境，从而丢失了体内原有生理特征和肿瘤的异质性。因此非常有必要建立一种全新的结直肠癌样本体外培养系统，为研究和治疗提供新途径。
因此，有需要开发一种适于结直肠癌类器官体外培养的培养基，以及简便、稳定、成功率高的结直肠癌类器官的体外培养方法。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
类器官是指将干细胞在体外3D培养，产生的“类似”器官样，具有自我更新和自我组织能力，结构和功能与来源组织或器官高度相似的微型器官，是目前唯一一个人源性组织水平的研究手段。拥有类似真实器官的复杂结构，并能部分模拟来源组织或器官的生理功能。因此，在各种器官生理病理的基础研究、精准医疗、药物筛选和开发、基因治疗、再生医学等方面，显示出巨大的应用前景。
虽然多种肿瘤组织使用不同的方法、不同的培养条件下可在体外成功培养为类器官，但是目前关于结直肠癌类器官的培养方法的研究还需进一步探索。该体系能够提高结直肠癌类器官构建的成功率并且保证类器官具有活性，能够稳定的传代、冻存、复苏，并且同时适用于结直肠癌类器官长期培养和类器官库扩建，对于结直肠癌的治疗研究有极大地帮助作用。
因此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种培养基。根据本发明的实施例，所述培养基包括基础培养基、无菌水和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括胰岛素生长因子和BMP拮抗剂的至少之一、ALK 5抑制剂、ROCK抑制剂、MAPK抑制剂、R-Spondin、B27和Gastrin1。发明人经过不断试验发现，当培养基中加入上述特异性添加因子后，能够提高结直肠癌类器官构建的成功率并且保证类器官具有高活性，能够稳定的传代冻存和复苏，并且同时适用于结直肠癌类器官的长期培养和类器官库扩建。
根据本发明的实施例，所述培养基进一步包括如下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述特异性添加因子包括胰岛素生长因子、ALK 5抑制剂、ROCK抑制剂、MAPK抑制剂、R-Spondin、B27和Gastrin1。发明人经过不断试验发现，当培养基中含有上述的添加物时，能够快速有效的建立起可在体外长期培养的结直肠癌类器官模型，对结直肠癌类器官的生长有明显的促进作用。
根据本发明的实施例，所述特异性添加因子包括Gremlin1、ALK 5抑制剂、ROCK抑制剂、MAPK抑制剂、R-Spondin、B27和Gastrin1。发明人经过不断试验发现，当培养基中含有上述的添加物时，能够快速有效的建立起可在体外长期培养的结直肠癌类器官模型，对结直肠癌类器官的生长有明显的促进作用，此外当培养基中添加所述Gremlin1，能够维持细胞干性，类器官可以持续传代。
根据本发明的实施例，所述特异性添加因子包括胰岛素生长因子、Gremlin1、ALK5抑制剂、ROCK抑制剂、MAPK抑制剂、R-Spondin、B27和Gastrin1。发明人经过不断试验发现，当培养基中同时添加所述胰岛素生长因子和Gremlin1时，能够快速有效的建立起可在体外长期培养的结直肠癌类器官模型，对结直肠癌类器官的生长有明显的促进作用。
根据本发明的实施例，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
根据本发明的实施例，所述胰岛素生长因子为IGF-1。发明人发现当培养基中添加所述胰岛素生长因子，能够促进类器官快速生长，促进细胞增殖。
根据本发明的实施例，所述ALK 5抑制剂为A83-01。
根据本发明的实施例，所述ROCK抑制剂为Y27632。
根据本发明的实施例，所述MAPK抑制剂为SB202190。
根据本发明的实施例，所述基础培养基和无菌水的质量比为99:1。
需要说明的是，本申请所述的“胰岛素生长因子”为IGF-1，是一种在分子结构上与胰岛素类似的多肽蛋白物质，是生长激素产生生理作用过程中必须的物质；本申请所述的“BMP拮抗剂”为Gremlin 1重组蛋白，Gremlin可能在癌变和后肾器官发生过程中发挥重要作用，作为早期肢体生长和维持FGF4-SHH反馈回路模式所需的BMP拮抗剂；本申请中所涉及的“ALK 5抑制因子”为A83-01(A83-01是一个强有力的TGF-βⅠ型受体ALK-5(IC50：12nm)/ALK4((IC50：45nm)/ALK 7(IC50：7.5nm)激酶的抑制剂，A83-01对ALK-5的抑制作用很强)；本申请中所涉及的“ROCK抑制剂”为Y27632(ROCK为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，ROCK蛋白在肿瘤中的发生发展中起着重要作用)；本申请所述的“MAPK抑制剂”为SB202190，其会与ATP竞争抑制p38 MAP激酶活性。
根据本发明的实施例，所述基础培养基进一步包括氢离子缓冲剂，Glutamax、青霉素和链霉素。因此，能够满足细胞生长的基本营养需求，进一步确保该培养基能够有利于结直肠癌类器官的培养，避免结直肠癌类器官被污染。
根据本发明的实施例，所述氢离子缓冲剂为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，即HEPES。
根据本发明的实施例，所述氢离子缓冲剂在所述培养基中的终浓度为5～15mM。
根据本发明的实施例，所述Glutamax在所述培养基中的终浓度为1～3mM。
根据本发明的实施例，所述青霉素在所述培养基中的终浓度450～550U/ml。
根据本发明的实施例，所述链霉素在所述培养基中的终浓度450～550U/ml。
根据本发明的实施例，所述ALK 5抑制剂在所述培养基中的终浓度为450～550nM，所述ROCK1抑制剂在所述培养基中的终浓度为5～15μm，所述MAPK抑制剂在所述培养基中的终浓度为5～15μm，所述R-Spondinl在所述培养基中的终浓度为0.5-1.5μg/ml，所述B27在所述培养基中的终浓度为1×，所述Gastrin1在所述培养基中的终浓度为5～15nM。发明人经过不断试验发现，当培养基中的成分在此浓度范围内能够提高结直肠癌类器官构建的成功率并且保证类器官具有活性，能够稳定的传代、冻存、复苏，为后续科研人员对结直肠癌的治疗研究有极大的帮助作用。
需要说明的是“所述B27在所述培养基中的终浓度为1×”是指B27产品为50×的浓度，在配置培养基时，B27在培养基中的终浓度稀释成1×。
根据本发明的实施例，所述胰岛素生长因子在所述培养基中的浓度为20～70ng/ml。当培养基中的胰岛素生长因子在此浓度范围内能够有效促进细胞增殖。
根据本发明的实施例，所述Gremlin1在所述培养基中的浓度为150～250ng/ml。当培养基中的Gremlin1在此浓度范围内能够维持类器官长期稳定传代培养。
根据本发明的实施例，所述胰岛素生长因子在所述培养基中的浓度为20～70ng/ml，所述Gremlin1在所述培养基中的浓度为150～250ng/ml。当培养基中胰岛素生长因子和BMP拮抗剂在此浓度范围内能够实现类器官的长期传代培养和细胞扩增。
在本发明的另一个方面，本发明提出了前面所述的培养基在培养结直肠癌类器官中的用途。
在本发明的又一个方面，本发明提出了一种制备结直肠癌器官的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将结直肠癌细胞在前面所述培养基中进行培养处理，以便获得结直肠癌类器官。通过此方法培养的结直肠癌类器官具有较好的形态，能够提高结直肠癌类器官构建的成功率并且保证类器官具有活性，并且同样适用于结直肠癌类器官长期培养和类器官库扩建。
根据本发明的实施例，所述结直肠癌细胞分离自结直肠癌组织。
有益效果：
①本发明的培养基含有结直肠癌类器官培养所需的组分，能够培养来源于结肠、直肠等多样本源的肿瘤组织。
②本发明的培养基组分中不需要加入细胞培养中最常见的组分Noggin，使结直肠癌组织细胞在培养的过程中能够保持非常高的细胞和组织活性，能够更加稳定的体外培养人结直肠癌组织类器官。
③本发明的培养基适合结直肠癌类器官的培养，培养的结直肠癌类器官维持了原发组织的形态结构和基因特征，提高结直肠癌类器官培养的成功率和存活率。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例1的结直肠癌类器官光学显微镜图；
图2是根据本发明对比例1的结直肠癌类器官光学显微镜图；
图3是根据本发明对比例2的结直肠癌类器官光学显微镜图；
图4是根据本发明对比例3的结直肠癌类器官光学显微镜图；
图5是根据本发明对比例4的结直肠癌类器官光学显微镜图；
图6是根据本发明对比例5的结直肠癌类器官光学显微镜图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
所涉及相关试剂的如下：
Advanced DMEM/F12购自Gibco公司
IGF1购自R&D Systems公司
Gremlin1购自R&D Systems公司
A8301购自MCE公司
Y-27632购自伯桢生物科技(上海)有限公司
SB202190购自MCE公司
R-Spondinl购自Sigma-Aldrich公司
B27购自Gibco公司
HEPES购自Gibco公司
Glutamax购自Gibco公司
青霉素购自Gibco公司
链霉素购自Gibco公司
FBS购自Nobimpex公司
消化液购自伯桢生物科技(上海)有限公司
红细胞裂解液购自伯桢生物科技(上海)有限公司
Gastrin1购自R&D Systems公司
青霉素链霉素混合液1.2X购自Gibco公司
基质胶购自Corning公司
实施例1
配置结直肠癌类器官的培养基，所述培养基包括基础培养基Advanced DMEM/F12、特异性添加因子和无菌水。其中，Advanced DMEM/F12和无菌水按质量比为99:1配置混合液，加入终浓度为10mM HEPES、2mM Glutamax、500U/mL青霉素、500U/mL链霉素，然后在混合液中加入特异性添加因子：100ng/ml IGF1、100ng/ml Gremlin1重组蛋白、500nM A8301、10μM Y-27632、10μM SB202190、1μg/ml R-Spondinl、1×B27、10nM Gastrin1；上述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的浓度为准。
结直肠癌类器官的培养方法，包括：
1)将新鲜的结直肠癌手术切除标本装入准备好的含有1％双抗的Advanced DMEM/F12培养基中保存，12小时内送入实验室预处理。
2)样本洗涤：将组织转入15ml离心管中，然后用5ml含有1％双抗的AdvancedDMEM/F12培养基震荡洗涤30秒，去掉上清，重新加入5ml含有1％双抗的Advanced DMEM/F12培养基洗涤。按照上述方法反复洗涤3次去除组织表面的杂质。
3)样本剪切：在生物安全柜中，将样本转移至6cm培养皿，用已消毒的手术剪在冰上操作将组织剪碎至大小1-3mm3，剪碎过程不应超过10分钟以避免细胞损伤。
4)组织第一次消化：将剪碎后的组织转移至15ml离心管，加入10ml消化液(消化液为含有70～80单位/mL的胶原蛋白水解酶、120～130μg/mL中性蛋白酶、2900～3100单位/mL脱氧核糖核酸酶、青酶素链霉素混合液、DMEM培养液)后在37℃震荡消化60分钟。第一次消化结束后，加入终浓度为2％FBS终止消化，然后300rcf离心3min，保留沉淀去除上清。
5)细胞过滤：将步骤4)中的消化液用100μm滤网过滤，去除未消化的大组织块。将过滤后的细胞液300rcf离心3min，小心去除上清得到细胞团沉淀。
6)红细胞裂解：加入1ml红细胞裂解液至步骤5)中的细胞团沉淀，轻轻吹打重悬细胞沉淀，室温裂解2-3min。
7)细胞收集：将步骤6)中的液体300rcf离心3min，小心去除上清得到细胞团沉淀备用。
8)取适量上述配置的结直肠癌类器官的培养基与基质胶等比混合，然后用混合液重悬步骤7)得到的细胞团沉淀，再用移液器将混有细胞的凝胶滴到24孔板中，每孔约25μl。
9)将接种凝胶滴后的培养板放入CO 2培养箱内静置15-20min，待其充分凝固。
10)在培养皿内加入上述的配制结直肠癌类器官的培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养。
11)每隔2天更换一次培养基，培养7天后可得到直肠癌类器官，在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图1所示。
对比例1
配置结直肠癌类器官的培养基，所述培养基包括基础培养基Advanced DMEM/F12、特异性添加因子和无菌水。其中，Advanced DMEM/F12和无菌水按质量比为99:1配置混合液，加入终浓度为10mM HEPES、2mM Glutamax、500U/mL青霉素、500U/mL链霉素，在混合液中加入特异性添加因子：100ng/ml gremlin1、500nM A8301、10μM Y-27632、10μMSB202190、1μg/ml R-Spondinl、1×B27、10nM Gastrin1；上述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的浓度为准。(与实施例1相比，特异性添加因子少了IGF1)
采用实施例1的培养方法和本对比例的培养基培养结直肠癌类器官。
结果发现，在步骤(11)培养4天后结直肠癌类器官生长缓慢，7天后将细胞进行收集，然后用台盼蓝染色计数，细胞总数量、活细胞比例显著少于实施例1，如图2和表1所示。这说明特异性添加剂IGF1有利于结直肠癌类器官细胞生长。
对比例2
配置结直肠癌类器官的培养基，所述培养基包括基础培养基Advanced DMEM/F12、特异性添加因子和无菌水。其中，Advanced DMEM/F12和无菌水按质量比为99:1配置混合液，加入终浓度为10mM HEPES、2mM Glutamax、500U/mL青霉素、500U/mL链霉素，在混合液中加入特异性添加因子：100ng/ml IGF1、1μg/ml R-Spondinl、500nM A8301、10μMY-27632、10μM SB202190、1μg/ml R-Spondinl、1×B27、10nM Gastrin1；上述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的浓度为准。(与实施例1相比，特异性添加因子少了Gremlin1重组蛋白)
采用实施例1的培养方法和本对比例的培养基培养结直肠癌类器官。
结果发现，在步骤(11)培养4天后直肠癌类器官生长缓慢，7天后将细胞进行收集，然后用台盼蓝染色计数，细胞总数量、活细胞比例也显著少于实施例1，如图3和表1所示。说明特异性添加剂Gremlin1重组蛋白有利于结直肠癌类器官细胞生长。
对比例3
配置结直肠癌类器官的培养基，所述培养基包括基础培养基Advanced DMEM/F12、特异性添加因子和无菌水。其中，Advanced DMEM/F12和无菌水按质量比为99:1配置混合液，加入终浓度为10mM HEPES、2mM Glutamax、500U/mL青霉素、500U/mL链霉素，在混合液中加入特异性添加因子：1μg/ml R-Spondinl、500nM A8301、10μM Y-27632、10μMSB202190、1μg/ml R-Spondinl、1×B27、10nM Gastrin1上述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的浓度为准。(与实施例1相比，特异性添加因子少了IGF1和Gremlin1重组蛋白)
采用实施例1的培养方法和本对比例的培养基培养结直肠癌类器官。
结果发现，在步骤(11)培养4天后直肠癌类器官生长缓慢，7天后将细胞进行收集，然后用台盼蓝染色计数，细胞总数量、活细胞比例显著少于实施例1，如图4和表1所示。说明特异性添加剂IGF1和Gremlin1重组蛋白有利于结直肠癌类器官细胞生长。
对比例4
配置结直肠癌类器官的培养基，所述培养基包括基础培养基Advanced DMEM/F12、特异性添加因子和无菌水。其中，Advanced DMEM/F12和无菌水按质量比为99:1配置混合液，加入终浓度为10mM HEPES、2mM Glutamax、500U/mL青霉素、500U/mL链霉素，在混合液中加入特异性添加因子：100ng/ml IGF1、100ng/mlNoggin、500nM A8301、10μMY-27632、10μMSB202190、1μg/ml R-Spondinl、1×B27、10nM Gastrin1；上述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的浓度为准。(与实施例1相比，具有BMP拮抗剂相同作用的Noggin替代Gremlin1重组蛋白)
采用实施例1的培养方法和本对比例的培养基培养结直肠癌类器官。
结果发现，在步骤(11)培养7天后直肠癌类器官生长稳定，7天后将细胞进行收集，然后用台盼蓝染色计数，细胞总数量、活细胞比例略少于实施例1，如图5和表1所示。说明Gremlin1重组蛋白作为BMP拮抗剂有利于结直肠癌类器官细胞生长。
对比例5
配置结直肠癌类器官的培养基，所述培养基包括基础培养基Advanced DMEM/F12、特异性添加因子和无菌水。其中，Advanced DMEM/F12和无菌水按质量比为99:1配置混合液，加入终浓度为10mM HEPES、2mM Glutamax、500U/mL青霉素、500U/mL链霉素，在混合液中加入特异性添加因子：50ng/ml IGF、50ng/ml gremlin1、500nM A8301、10μMY-27632、10μMSB202190、1μg/ml R-Spondinl、1×B27、10nM Gastrin1；上述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的浓度为准。(与实施例1相比，特异性添加因子IGF1和Gremlin浓度减低一半)
采用实施例1的培养方法和本对比例的培养基培养结直肠癌类器官。
结果发现，在步骤(11)培养7天后结直肠癌类器官生长缓慢，7天后将细胞进行收集，然后用台盼蓝染色计数，细胞总数量、活细胞比例少于实施例1，如图6和表1所示。这说明适宜浓度的特异性添加剂IGF1和Gremlin1有利于结直肠癌类器官细胞生长。
表1
综上，本发明的培养基适用广泛，能够培养来源于人结肠癌样本源的肿瘤组织；组分中不需要加入细胞培养中最常见的Noggin，用胰岛素生长因子IGF1，Gremlin1重组蛋白来替代Noggin的作用,该培养液使得结直肠癌组织细胞在培养的过程中能够保持非常高的细胞和组织活性，能够更加稳定的体外培养人结直肠癌组织类器官的方法。本发明的培养基适合肠癌类器官的培养，培养的肠癌类器官维持了原发组织的形态结构和基因特征，提高结直肠癌类器官培养的成功率和存活率。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (13)
1.一种培养基，其特征在于，包括基础培养基、无菌水和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括胰岛素生长因子和Gremlin1、ALK 5抑制剂、ROCK抑制剂、MAPK抑制剂、R-Spondin、B27和Gastrin1。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述特异性添加因子包括胰岛素生长因子、ALK 5抑制剂、ROCK抑制剂、MAPK抑制剂、R-Spondin、B27和Gastrin1。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述特异性添加因子包括BMP拮抗剂、ALK 5抑制剂、ROCK抑制剂、MAPK抑制剂、R-Spondin、B27和Gastrin1。
4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述特异性添加因子包括胰岛素生长因子、Gremlin1、ALK 5抑制剂、ROCK抑制剂、MAPK抑制剂、R-Spondinl、B27和Gastrin1。
5.根据权利要求1～4任一项所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基；
任选地，所述胰岛素生长因子为IGF-1；
任选地，所述ALK 5抑制剂为A83-01；
任选地，所述ROCK抑制剂为Y27632；
任选地，所述MAPK抑制剂为SB202190；
任选地，所述基础培养基和无菌水的质量比为99:1。
6.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基进一步包括氢离子缓冲剂、Glutamax、青霉素和链霉素；
任选地，所述氢离子缓冲剂为4-羟乙基哌嗪乙磺酸；
任选地，所述氢离子缓冲剂在所述培养基中的终浓度为5～15mM；
任选地，所述Glutamax在所述培养基中的终浓度为1～3mM；
任选地，所述青霉素在所述培养基中的终浓度450～550U/ml；
任选地，所述链霉素在所述培养基中的终浓度450～550U/ml。
7.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述ALK 5抑制剂在所述培养基中的终浓度为450～550nM，所述ROCK1抑制剂在所述培养基中的终浓度为5～15μm，所述MAPK抑制剂在所述培养基中的终浓度为5～15μm，所述R-Spondin,在所述培养基中的终浓度为0.5-1.5μg/ml，所述B27在所述培养基中的终浓度为1×，所述Gastrin1在所述培养基中的终浓度为5～15nM。
8.根据权利要求2或7所述的培养基，其特征在于，所述胰岛素生长因子在所述培养基中的终浓度为20～70ng/ml。
9.根据权利要求3或7所述的培养基，其特征在于，所述Gremlin1在所述培养基中的终浓度为150～250ng/ml。
10.根据权利要求4或7所述的培养基，其特征在于，所述胰岛素生长因子在所述培养基中的终浓度为20～70ng/ml，所述Gremlin1在所述培养基中的终浓度为150～250ng/ml。
11.权利要求1～10任意一项所述培养基在培养结直肠癌类器官中的用途。
12.一种制备结直肠癌器官的方法，其特征在于，包括：
将结直肠癌细胞在权利要求1～10任意一项所述培养基中进行培养处理，以便获得结直肠癌类器官。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述结直肠癌细胞分离自结直肠癌组织。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118028238A (zh) * | 2024-04-09 | 2024-05-14 | 四川省肿瘤医院 | 一种人源结直肠癌类器官复苏液、培养液及复苏方法 |
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2023
- 2023-06-28 CN CN202310779234.XA patent/CN117625537A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118028238A (zh) * | 2024-04-09 | 2024-05-14 | 四川省肿瘤医院 | 一种人源结直肠癌类器官复苏液、培养液及复苏方法 |
| CN118028238B (zh) * | 2024-04-09 | 2024-06-11 | 四川省肿瘤医院 | 一种人源结直肠癌类器官复苏液、培养液及复苏方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20240301 |