CN113308437B - 用于快速培养骨转移癌类器官的培养基、方法以及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及类器官培养领域,具体的,本发明涉及用于快速培养骨转移癌类器官的培养基、方法以及试剂盒。本发明提供快速培养骨转移癌类器官的培养基、方法以及试剂盒,解决了骨转移癌类器官培养成功率低,培养基体系不稳定等问题。采用本发明中的培养基和培养方法可以快速获得高活性、高纯度的骨转移癌类器官。并且,该类器官可以长期传代培养并与亲本组织保持相似的生物学特性。通过收集大量新鲜骨转移癌组织,利用本发明提供的试剂盒的优势,可以快速建立活的类器官生物库,为癌症骨转移机制研究、Biomarker研究、及药物研发提供绝佳的体外平台。
Description
技术领域
本发明涉及类器官培养领域,具体的,本发明涉及用于快速培养骨转移癌类器官的培养基、方法以及试剂盒。
背景技术
骨转移癌是原发于其他脏器的恶性肿瘤细胞经血液循环或其他途径播散到血管丰富的骨骼部位生长,所发生的继发性肿瘤,在晚期恶性肿瘤患者2/3有骨转移。最常见的转移部位,以躯干及四肢的近心端为高发,四肢的远心端为低发,肢端者极少见。早期多属单发,也可为多发。发生在脊柱的转移肿瘤,腰椎最多,胸椎次之,颈椎最少。乳癌、肺癌和肾癌多转移到胸椎;前列腺癌、子宫颈癌直肠癌多转移到腰椎;而鼻咽癌、甲状腺癌多趋向于颈椎转移。此外,肺癌、肝癌、乳腺癌也容易向骨盆和股骨上端转移。
骨转移癌的治疗有如下方式:放疗、化疗、生物治疗、中医药治疗,必要时可采用手术治疗。转移性骨肿瘤在诊断明确之后,应及时采用综合治疗。骨骼的病变可以采用手术清除、局部放疗和全身性化学治疗等方法。出现骨骼并发症如病理性骨折的病例,要及时治疗。骨转移的治疗是综合治疗恶性肿瘤。对骨转移瘤的治疗仍是以减少痛苦、保存功能、提高生存质量、延长寿命为目的。其治疗包括支持疗法、对症治疗、全身治疗和局部治疗几部分。而全身治疗又包括针对原发病的联合化疗、放疗、免疫治疗、内分泌治疗、放射性核素治疗以及中草药治疗等。局部治疗主要是手术和介入治疗。
类器官是近年来开发的一种新型肿瘤体外研究模型,它能够较为真实地反映亲本肿瘤组织的组织特性、突变表达情况,并且能够在体外长期、稳定传代培养。建立骨转移癌类器官有助于理解疾病的发生、发展及早期诊断,并在此基础上为病人筛选适合癌症骨转移的治疗方案。另外,类器官被认为在新药研发早期阶段具有重要的价值。
目前,骨转移癌类器官模型的报道极为少见,其他模型如骨转移癌细胞株或小鼠PDX(异种移植瘤)模型也较少。细胞株的培养基成分较为简单,通常为基础培养基DMEM或者RPMI1640的基础上添加10%FBS(胎牛血清),属于二维培养,不需要经过组织解离等一系列复杂过程。PDX模型是将新鲜的肿瘤组织种植在裸鼠皮下而形成的异种移植瘤模型,属于动物模型,其PDX生长不需要添加额外培养基,传代时,将裸鼠处死后取下瘤体,剪切成小块,再重新移植到新的裸鼠皮下继续生长。
然而,细胞株缺乏研究肿瘤特性必要的异质性,并且,细胞株在结构上也无法真实模拟体内肿瘤,使用细胞株进行肿瘤机制研究具有较大的局限性,同时,细胞株亦无法用来为临床患者筛选治疗方案。PDX模型虽然也是从新鲜的肿瘤组织开始建模,但是其处理方式极为简单,通常将组织进行机械剪切后即可包埋在裸鼠皮下,不需要培养基。传代方式粗糙,不需要解离液。虽然PDX模型能够一定程度上反映肿瘤的真实生物特性,但往往建模成功率较低,建模周期较长(4-6月),样本依赖性较高(多依赖于晚期恶性肿瘤建模),临床应用的局限性较大。
诸如乳腺癌骨转移类器官、前列腺癌类器官或者肺癌骨转移类器官,培养这些类器官的培养基只能用于某种特定癌种的类器官培养,不具备普适性。关于乳腺癌骨转移类器官(中国专利,专利号:201911367549.3)的专利公开了其培养体系是将乳腺癌骨转移细胞和饲养层细胞混合共培养,虽然饲养层细胞经辐照灭活,但依旧可能对类器官的纯度造成影响。饲养层细胞分泌的细胞因子成分和含量不可预知,这就意味着,该发明所公示的共培养方案存在一定的不稳定性。同时,根据该发明的公开资料,组织消化解离的方式为:将组织剪碎后,转移至24孔板,并放入37℃恒温培养箱孵育2小时,每隔30min吹打酶解组织。此方式的酶解时间长,效率低下。
因此,开发一种能够高效、快速培养、对多种骨转移癌类器官的培养具有普适性的培养基以及试剂盒具有重要的科研和商业价值。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此,本发明的一个目的在于提供快速培养骨转移癌类器官的培养基、方法以及试剂盒,解决了骨转移癌类器官培养成功率低,培养基体系不稳定等问题。采用本发明中的培养基和培养方法可以快速获得高活性、高纯度的骨转移癌类器官。并且,该类器官可以长期传代培养并与亲本组织保持相似的生物学特性。通过收集大量新鲜骨转移癌组织,利用本发明提供的试剂盒的优势,可以快速建立活的类器官生物库,为癌症骨转移机制研究、Biomarker研究、及药物研发提供绝佳的体外平台。
为此,本发明第一方面提供了一种用于培养骨转移癌类器官的培养基。根据本发明的实施例,所述培养基包括培养基组分和添加剂组分,其中,所述添加剂组分中含有IL-6和BMP4。骨转移癌尚无特效治疗药物,由于缺乏合适的体外研究模型,对该大类疾病的发病机制研究较少,很难开发出较为特异性的靶向治疗药物。肿瘤类器官技术是近年开发出来的优质肿瘤体外研究模型,可以用来为癌症病人筛选特效药物,亦可助力肿瘤药物研发。
骨转移癌组织常常伴随钙化骨质,并且由于骨微环境的特殊性,离体的骨转移癌细胞常处于休眠状态,因此,骨转移癌类器官培养主要难点在于细胞分离、活化、及诱导增殖。常规方法和培养基得到的癌细胞比率、活化程度相对较低,导致类器官在后续培养过程出现增殖速度慢和老化现象,严重影响类器官培养成功率。此外,肿瘤类器官的培养相对耗时,建立稳定传代的肿瘤类器官系需要4-8周。培养基所用生长因子等主要依赖于研发人员筛选、配制,培养基的配制过程可能会带来污染风险或者体系不稳定等问题,对后续研发产生重大影响。骨转移癌类器官培养同样存在上述问题,并且,目前尚无较好的培养体系能够可以提供解决方案。
因此,建立适当的骨转移癌类器官培养体系,并在此基础上建立骨转移癌类器官生物库,有助于理解疾病的发生、发展及早期诊断,并在此基础上筛选适合骨转移癌的治疗方案,具有很高的临床应用价值。
骨转移癌细胞由于骨微环境的特殊性,离体的骨转移癌细胞常处于休眠状态,因此,骨转移癌类器官培养主要难点在于细胞分离、活化及诱导增殖。常规方法和培养基得到的癌细胞比率、活化程度相对较低,导致类器官在后续培养过程出现增殖速度慢和老化现象,严重影响类器官培养成功率。发明人创造性的发现,在培养基中特异性地添加骨微环境相关生长因子IL-6、BMP4,二者联用能够特异性刺激休眠(不增殖)的细胞重新获得较强的增殖能力,能够大大提高癌细胞的活化程度和增殖速度,整体提高了骨转移癌类器官的培养成功率。经过优化,获得了适合骨转移癌类器官生长的培养基。本发明提供的用于培养骨转移癌类器官的培养基能够解除骨转移癌细胞休眠状态,加速细胞增殖,从而缩短传代周期。另外,现有的方法制备的骨转移癌类器官大部分不增殖,可长达1个月不传代,本发明提供的培养基培养的骨转移癌类器官平均7-8天传代一次。
根据本发明的实施例,在所述培养基中,所述IL-6的浓度为1-20ng/ml,优选为5-15ng/ml。
根据本发明的实施例,所述BMP4的浓度为1-10ng/ml,优选为5-10ng/ml。
根据本发明的实施例,所述添加剂组分进一步包括Wnt3a和Afamin。
Wnt3a是骨转移癌类器官生长的关键因子,但市场上售卖的Wnt3a活性往往较低,发明人创造性地发现,在培养骨转移癌类器官的培养基中添加Afamin蛋白(血清组成部分之一)能够使得Wnt3a保持稳定状态,可以维持高Wnt活性,Afamin蛋白与Wnt3a具有协同作用,能够进一步提高类器官生长速度。
根据本发明的实施例,在所述培养基中,所述Wnt3a的浓度为100-1000ng/ml,优选为200-500ng/ml。
根据本发明的实施例,所述Afamin的浓度为20-200ng/ml,优选为50-100ng/ml。
根据本发明的实施例,所述添加剂组分进一步包括Noggin、EGF、FGF2、Gastrin、SB202190、Y27632、BSA。
根据本发明的实施例,所述Noggin的浓度为20-200ng/ml,优选为50-100ng/ml。
根据本发明的实施例,所述EGF的浓度为10-100ng/ml,优选为25-75ng/ml。
根据本发明的实施例,所述FGF2的浓度为2-50ng/ml,优选为10-30ng/ml。
根据本发明的实施例,所述Gastrin的浓度为1-20nM,优选为5-10nM。
根据本发明的实施例,所述SB202190的浓度为0.1-20μM,优选为5-10μM。
根据本发明的实施例,所述Y27632的浓度为1-20μM,优选为5-10μM。
根据本发明的实施例,所述BSA的浓度为1-10mg/ml,优选为1-5mg/ml。
根据本发明的实施例,所述培养基组分进一步包括基础培养基、HEPES、GlutanMAX、N-乙酰基半胱氨酸。
根据本发明的实施例,所述基础培养基为Advanced DMEM/F12。
根据本发明的实施例,所述HEPES的浓度为1-30mM,优选为10-20mM。
根据本发明的实施例,所述GlutanMAX的浓度为1-10mM,优选为1-5mM。
根据本发明的实施例,所述N-乙酰基半胱氨酸的浓度为0.1-10mM,优选为0.5-5mM。
根据本发明的实施例,所述培养基组分进一步包括庆大霉素、两性霉素。
根据本发明的实施例,所述庆大霉素的浓度为5μg/ml-50μg/ml。
根据本发明的实施例,所述两性霉素的浓度为50ng/ml-500ng/ml。
根据本发明的实施例,所述培养基组分和所述添加剂组分的体积比为24:1。
所述培养基组分和所述添加剂组分的体积比为24:1时,能够进一步提高骨转移癌类器官的总体培养成功率。
本发明第二方面提供第一方面所述的培养基在培养骨转移癌类器官中的用途。根据本发明的实施例,所述骨转移癌类器官选自囊腺癌骨转移类器官、肾癌骨转移类器官、乳腺癌骨转移类器官、肠癌骨转移类器官、前列腺癌骨转移类器官、肺癌骨转移类器官、宫颈癌骨转移类器官。
本发明第三方面提供一种培养骨转移癌类器官的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:
(1)将骨转移癌样本进行消化处理,以便获取骨转移癌细胞;
(2)利用第一方面所述的培养基培养所述骨转移癌细胞,以便获取骨转移癌类器官。
采用本发明提供的培养骨转移癌类器官的方法,可以快速获得高活性、高纯度的骨转移癌类器官。并且,该类器官可以长期传代培养并与亲本组织保持相似的生物学特性。本发明中培养骨转移癌类器官的方法,采用具有普适性的培养基,能够获得多种类型的骨转移癌类器官。
根据本发明的实施例,所述培养骨转移癌类器官的方法还具有以下附加技术特征中的至少之一:
根据本发明的实施例,所述骨转移癌选自囊腺癌骨转移癌、肾癌骨转移癌、乳腺癌骨转移癌、肠癌骨转移癌、前列腺癌骨转移癌、肺癌骨转移癌、宫颈癌骨转移癌。
根据本发明的实施例,所述消化处理包括利用组织消化液对所述骨转移癌样本进行消化,其中,所述组织消化液包括胶原蛋白酶(Collagenase)、透明质酸酶(Hyaluronidase)以及TrypLE。
根据本发明的实施例,所述胶原蛋白酶浓度为5-100μg/ml,优选为20-100μg/ml。
根据本发明的实施例,所述透明质酸酶浓度为1-50μg/ml,优选为10-30μg/ml。
根据本发明的实施例,所述TrypLE浓度25-35%(v/v)。
根据本发明的实施例,所述组织消化液进一步包括庆大霉素、两性霉素;
根据本发明的实施例,所述庆大霉素的浓度为5μg/ml-50μg/ml。
根据本发明的实施例,所述两性霉素的浓度为50ng/ml-500ng/ml。
根据本发明的实施例,所述方法进一步包括在对所述骨转移癌样本进行消化处理之前,将所述骨转移癌样本保存至组织保存液中,
其中,所述组织保存液包括DMEM/F12、HEPES、GlutanMAX、非必须氨基酸NEAA以及BSA。
本发明提供的组织保存液在基础培养基DMEM/F12的基础上添加GlutaMAX、HEPES、添加非必须氨基酸NEAA和BSA,可有效保证细胞活性,特别是NEAA的添加,为后续实验提供保障。
根据本发明的实施例,所述HEPES浓度为1-30mM,优选为10-20mM。
根据本发明的实施例,所述GlutanMAX浓度为1-10mM,优选为1-5mM。
根据本发明的实施例,所述非必须氨基酸NEAA浓度为2-20mM,优选为5-10mM。
根据本发明的实施例,所述BSA浓度为1-10mg/ml。
根据本发明的实施例,所述组织保存液进一步包括庆大霉素、两性霉素。
根据本发明的实施例,所述庆大霉素的浓度为5μg/ml-50μg/ml。
根据本发明的实施例,所述两性霉素的浓度为50ng/ml-500ng/ml。
庆大霉素和两性霉素是强力抑菌剂,可最大程度降低样品污染程度。
本发明第四方面提供一种组织消化液。根据本发明的实施例,所述组织消化液包括胶原蛋白酶、透明质酸酶以及TrypLE。
根据本发明的实施例,所述胶原蛋白酶浓度为5-100μg/ml。
根据本发明的实施例,所述透明质酸酶浓度为1-50μg/ml。
根据本发明的实施例,所述TrypLE浓度25-35%(v/v)。
根据本发明的实施例,所述组织消化液进一步包括庆大霉素、两性霉素。
根据本发明的实施例,所述庆大霉素的浓度为5μg/ml-50μg/ml。
根据本发明的实施例,所述两性霉素的浓度为50ng/ml-500ng/ml。
本发明第五方面提供第四方面所述的组织消化液在消化骨转移癌样本中的用途。根据本发明的实施例,所述骨转移癌选自囊腺癌骨转移癌、肾癌骨转移癌、乳腺癌骨转移癌、肠癌骨转移癌、前列腺癌骨转移癌、肺癌骨转移癌、宫颈癌骨转移癌。
本发明第六方面提供一种组织保存液。根据本发明的实施例,所述组织保存液包括DMEM/F12、HEPES、GlutanMAX、非必须氨基酸NEAA以及BSA。
根据本发明的实施例,所述HEPES浓度为1-30mM。
根据本发明的实施例,所述GlutanMAX浓度为1-10mM。
根据本发明的实施例,所述非必须氨基酸NEAA浓度为2-20mM。根据本发明的实施例,所述BSA浓度为1-10mg/ml。
根据本发明的实施例,所述组织保存液进一步包括庆大霉素、两性霉素。
根据本发明的实施例,所述庆大霉素的浓度为5μg/ml-50μg/ml。
根据本发明的实施例,所述两性霉素的浓度为50ng/ml-500ng/ml。
本发明第七方面提供第六方面所述的组织保存液在保存骨转移癌样本中的用途。根据本发明的实施例,所述骨转移癌选自囊腺癌骨转移癌、肾癌骨转移癌、乳腺癌骨转移癌、肠癌骨转移癌、前列腺癌骨转移癌、肺癌骨转移癌、宫颈癌骨转移癌。
本发明第八方面提供一种培养骨转移癌类器官的试剂盒。根据本发明的实施例,所述试剂盒包括第一方面所述的培养基,所述骨转移癌选自囊腺癌骨转移癌、肾癌骨转移癌、乳腺癌骨转移癌、肠癌骨转移癌、前列腺癌骨转移癌、肺癌骨转移癌、宫颈癌骨转移癌;
根据本发明的实施例,所述试剂盒进一步包括消化液和/或保存液。
根据本发明的实施例,所述消化液为第四方面所述的组织消化液。
根据本发明的实施例,所述保存液为第六方面所述的组织保存液。
本发明第九方面提供一种培养骨转移癌类器官的试剂盒。根据本发明的实施例,所述试剂盒包括第四方面所述的组织消化液,所述骨转移癌选自囊腺癌骨转移癌、肾癌骨转移癌、乳腺癌骨转移癌、肠癌骨转移癌、前列腺癌骨转移癌、肺癌骨转移癌、宫颈癌骨转移癌;
根据本发明的实施例,所述试剂盒进一步包括培养基和/或保存液。
根据本发明的实施例,所述培养基为第一方面所述的培养基。
根据本发明的实施例,所述保存液为第六方面所述的组织保存液。
本发明第十方面提供一种培养骨转移癌类器官的试剂盒。根据本发明的实施例,所述试剂盒包括第六方面所述的组织保存液,所述骨转移癌选自囊腺癌骨转移癌、肾癌骨转移癌、乳腺癌骨转移癌、肠癌骨转移癌、前列腺癌骨转移癌、肺癌骨转移癌、宫颈癌骨转移癌;
根据本发明的实施例,所述试剂盒进一步包括培养基和/或消化液。
根据本发明的实施例,所述培养基为第一方面所述的培养基。
根据本发明的实施例,所述消化液为第四方面所述的组织消化液。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1显示了不同基质胶浓度下骨转移癌类器官成球率;
图2显示了不同生长因子对骨转移癌类器官生长速度的影响;
图3显示了不同培养基培养骨转移癌类器官总体培养成功率统计结果;
图4中A图显示了本发明实施例9中方法培养获得的囊腺癌骨转移类器官,B图显示了不同培养时间囊腺癌骨转移类器官的形态;
图5显示了本发明实施例10中方法培养获得的肾癌骨转移类器官;
图6显示了本发明实施例11中方法培养获得的乳腺癌类器官;
图7显示了本发明实施例12中方法培养获得的肠癌骨转移类器官、前列腺癌骨转移类器官、肺癌骨转移类器官、宫颈癌骨转移类器官;
图8显示了本发明实施例13中原位组织和肠癌骨转移类器官免疫组织化学染色结果。
具体实施方式
根据本发明的一个具体的实施例,通过骨转移癌样本获取骨转移癌样本细胞时,利用切割式研磨仪处理所述骨转移癌样本。
具体地,利用ST-R200切割式研磨仪,样品通过防反溅的进样料斗进入研磨室内,通过旋转的转刀与固定的切割棱之间的剪切作用,对骨质样品进行切割。
由于骨质部分含有较多癌细胞,其他报道的常规组织处理过程,并未提及骨质部分的组织如何处理。使用剪刀或者手术刀片很难将骨质切开,直接丢弃骨质部分将造成细胞丢失较多。本发明尝试多种骨质组织处理方式,最终选用ST-R200切割式研磨仪,样品通过防反溅的进样料斗进入研磨室内,通过旋转的转刀与固定的切割棱之间的剪切作用,对骨质样品进行切割。样品的出样尺寸取决于底筛孔径,可通过设计合适的底筛孔径,保证样品中细胞结构的完整性。对于骨转移癌组织,经优化后的组织处理方法大大提高了组织利用率,保证后续细胞得率。
根据本发明的一个具体的实施例,对骨转移癌进行培养的培养基中完全培养基和基质胶按2:8的比例进行稀释。在该比例下,更有利于骨转移癌类器官的生长。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1试剂配制
1、培养骨转移癌类器官的培养基
培养基组成:
1)培养基组分A:Advanced DMEM/F12、10mM HEPES、2mM GlutaMAX、1mM N-乙酰基半胱氨酸、10μg/ml庆大霉素、250ng/ml两性霉素;
2)添加剂组分B:200ng/ml Wnt3a、50ng/ml Afamin、50ng/ml Noggin、50ng/mlEGF、10ng/ml FGF2、10ng/ml IL-6、5ng/ml BMP4、5nM Gastrin、10μM SB202190、10μMY27632、1mg/ml BSA。
培养基组分A与添加剂组分B按照24:1的体积比混合后配制成100ml完全培养基。
2、组织保存液
组织保存液组成:DMEM/F12、10mM HEPES、2mM GlutanMAX、10μg/ml庆大霉素、250ng/ml两性霉素、10mM 1x非必须氨基酸NEAA、1mg/ml BSA。
3、组织消化液
组织消化液组成:80μg/ml Collagenase、20μg/ml Hyaluronidase、30%TrypLE、10μg/ml庆大霉素、250ng/ml两性霉素。
实施例2组织保存液组成的探究
将适当大小的新鲜摘取的乳腺癌骨转移癌样本放置于实施例1中的组织保存液中,样本自体内取出后,离体时间不超过15min,放入保存液后即封口,并在12小时内存于冰上送往实验室。
针对现有的组织保存液,进行了细胞活性对比试验。取三种保存液(如下A、B、C)进行同种样本不同保存时间,获得的细胞活性进行对比,A、B、C组织保存液组成如下:
A、PBS+100单位/ml青霉素/100μg/ml链霉素
B、DMEM/F12+HEPES+GlutaMAX+庆大霉素+两性霉素(各组分用量参见实施例1中组织保存液)
C、DMEM/F12+HEPES+GlutaMAX+BSA+NEAA+庆大霉素+两性霉素(实施例1中组织保存液)
对比结果如下表1:
表1A、B、C组织保存液保存样本在不同保存时间下的细胞活性
表1中结果表明,相比现有已报道的组织保存液,本发明提供的特定组成的组织保存液能够在较长时间内维持保存在其中的骨转移癌样本的细胞活性。
实施例3骨转移癌细胞的获取
1、组织预处理
骨转移癌组织送达实验室后,先将组织中非骨质部分剔除下来,并用剪刀剪切成3mm小块,放入冷的PBS中暂存,剩余骨质部分使用切割式研磨仪切割成较小块状(此步骤设定时间不超过10s)。然后将所有组织块转移到新的无菌50ml离心管中,加入含有2%青霉素/链霉素的PBS摇洗5分钟,摇洗结束后弃掉PBS,重复上述操作1次,以便去除组织附带的杂质。
选用ST-R200切割式研磨仪,样品通过防反溅的进样料斗进入研磨室内,通过旋转的转刀与固定的切割棱之间的剪切作用,对骨质样品进行切割。样品的出样尺寸取决于底筛孔径,可通过设计合适的底筛孔径,保证样品中细胞结构的完整性。
2、组织解离和细胞获取
上述步骤得到的细小组织经反复清洗、离心后,弃去清洗液,加入实施例1中提供的组织消化液,于37℃恒温空气摇床上消化20-25分钟即可。消化结束后,加10ml含5%FBS的PBS溶液终止消化。将离心管竖直放在冰上30s,待未消化的骨质部分沉降后,取上清,200g离心5分钟,离心结束后弃掉上清,保留细胞沉淀。
实施例4组织消化液组成的探究
利用实施例1中提供的组织消化液,同时设置不同的TryLE浓度梯度,设置5个实验组,具体如下表2,以探究消化效率最高的组织消化液组成。所有实验组的消化步骤与实施例3中步骤2相同,具体结果如下表2所示:
表2不同组成的组织消化液消化骨转移癌细小组织的时间和细胞活性统计
实验结果表明,在Collagenase、Hyaluronidase的基础上添加30%TrypLE,可有效缩短骨转移癌组织消化时间。添加50%或者70%TrypLE虽然可以进一步缩短消化时间,但由于浓度过高的原因,导致细胞活性下降较为明显,综合考虑,30%TrypLE既能缩短消化时间,又可以有效保证细胞活性,较为适合消化骨转移癌组织。相比之下,一则公开专利(专利号201911367549.3)显示,其中的组织消化时间长达2小时,该发明所使用的消化液及其组织解离方法大大缩短消化时间。
实施例5骨转移癌类器官培养
取实施例1中完全培养基与基质胶按2:8比例混合后,取1ml基质胶重悬上述细胞沉淀,形成混合液,并悬空滴加至24孔培养板中间,滴加混合悬液时,将胶滴打出枪头形成悬垂液滴,室温悬垂30s,之后接种至板中央。将培养板放入37℃恒温培养箱孵育5min。5min后取出培养板,加入完全培养基。之后每2-3天更换一次完全培养基,5-7天后可观察到长势良好的骨转移癌类器官。
实施例6完全培养基和基质胶比例的探究
采用实施例5中类器官培养方法,不同之处仅在于设置不同的基质胶浓度,分别为100%、80%、50%。结果如附图1所示,表明当完全培养基和基质胶按2:8的比例进行稀释时,才能够获得更高的类器官成球率,更有利于骨转移癌类器官的生长。
实施例7培养基中生长因子的探究
为探究培养基中添加的生长因子对骨转移癌类器官的生长的影响,采用实施例5中所示的类器官培养过程,分别设置Afamin组、IL-6组、BMP4组、IL-6&BMP4组,同时设置对照组,其中对照组培养基组成:Advanced DMEM/F12、10mM HEPES、2mM GlutaMAX、10mM N-乙酰基半胱氨酸、10μg/ml庆大霉素、250ng/ml两性霉素、200ng/ml Wnt3a、50ng/ml Noggin、50ng/ml EGF、10ng/ml FGF2、5nM Gastrin、10μM SB202190、10μM Y27632、1mg/ml BSA;
Afamin组培养基组成:对照组培养基+50ng/ml Afamin;
IL-6组培养基组成:对照组培养基+10ng/ml IL-6;
BMP4组培养基组成:对照组培养基+5ng/ml BMP4;
IL-6&BMP4组培养基组成:对照组培养基+10ng/ml IL-6+5ng/ml BMP4。
具体见附图2,结果表明,同时含有Wnt3a和Afamin的完全培养基用于培养骨转移癌类器官,能够明显加快骨转移癌类器官的生长速度,在此基础上进一步添加IL-6和/或BMP4能够进一步提高骨转移癌类器官的生长,并且同时添加Wnt3a+Afamin+IL-6+BMP4的培养基,骨转移癌类器官的生长速度最快。
实施例8完全培养基培养骨转移癌类器官成功率评估
采用实施例5中所示的类器官培养过程,分别设置三组完全培养基,公开培养基1(中国专利,专利号:201911367549.3)、公开培养基2(Lee,S.,et al.Establishment andAnalysis of Three-Dimensional(3D)Organoids Derived from Patient ProstateCancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts.J.Vis.Exp.(156),e60367,doi:10.3791/60367(2020).)、本发明培养基(实施例1中完全培养基),根据以上3种培养基,对不同的骨转移癌使用3种培养基进行培养,不限癌种,最后综合统计不同组别培养基培养的类器官成功率,评估各实验组培养获得骨转移癌类器官总体培养成功率。结果如附图3所示,表明利用本发明提供的特定组成的完全培养基,培养获得骨转移癌类器官的成功率远高于现有公开的类器官培养基。
实施例9囊腺癌骨转移类器官培养
1、组织保存与运输
将新鲜摘取的囊腺癌骨转移样本放置于实施例1中的组织保存液中,标本自体内取出后,离体时间不超过15min,放入保存液后即封口,并在12小时内存于冰上送往实验室。
2、组织预处理
癌组织送达实验室后,先将组织中非骨质部分剔除下来,并用剪刀剪切成3mm小块,放入冷的PBS中暂存,剩余骨质部分使用切割式研磨仪切割成较小块状(此步骤设定时间不超过10s)。然后将所有组织块转移到新的无菌50ml离心管中,加入含有2%青霉素/链霉素的PBS摇洗5分钟,摇洗结束后弃掉PBS,重复上述操作1次,以便去除组织附带的杂质。
3、组织解离和细胞获取
上述步骤得到的细小组织经反复清洗、离心后,弃去清洗液,加入实施例1中提供的组织消化液,于37℃恒温空气摇床上消化20-25分钟即可。消化结束后,加10ml含5%FBS的PBS溶液终止消化。将离心管竖直放在冰上30s,待未消化的骨质部分沉降后,取上清,200g离心5分钟,离心结束后弃掉上清,保留细胞沉淀。
4、细胞铺板与类器官培养
取实施例1中完全培养基与基质胶按2:8比例混合后,取1ml基质胶重悬上述细胞沉淀,形成混合液,并悬空滴加至24孔培养板中间,滴加混合悬液时,将胶滴打出枪头形成悬垂液滴,室温悬垂30s,之后接种至板中央。将培养板放入37℃恒温培养箱孵育5min。5min后取出培养板,加入实施例1的完全培养基。之后每2-3天更换一次培养基,5-7天后可观察到长势良好的囊腺癌骨转移类器官。附图4中A图为显微镜观察到的上述方法培养获得的囊腺癌骨转移类器官,B图为在不同培养时间下的形态,表明本发明所用培养基培养出来的囊腺癌骨转移类器官的形态为规则实心球体,并且,随生长时间延长,类器官细胞显示明显的增殖状态。
实施例10肾癌骨转移类器官培养
1、组织保存与运输
将新鲜摘取的肾癌骨转移样本放置于实施例1中的组织保存液中,标本自体内取出后,离体时间不超过15min,放入保存液后即封口,并在12小时内存于冰上送往实验室。
2、组织预处理
癌组织送达实验室后,先将组织中非骨质部分剔除下来,并用剪刀剪切成3mm小块,放入冷的PBS中暂存,剩余骨质部分使用切割式研磨仪切割成较小块状(此步骤设定时间不超过10s)。然后将所有组织块转移到新的无菌50ml离心管中,加入含有2%青霉素/链霉素的PBS摇洗5分钟,摇洗结束后弃掉PBS,重复上述操作1次,以便去除组织附带的杂质。
3、组织解离和细胞获取
上述步骤得到的细小组织经反复清洗、离心后,弃去清洗液,加入实施例1中提供的组织消化液,于37℃恒温空气摇床上消化20-25分钟即可。消化结束后,加10ml含5%FBS的PBS溶液终止消化。将离心管竖直放在冰上30s,待未消化的骨质部分沉降后,取上清,200g离心5分钟,离心结束后弃掉上清,保留细胞沉淀。
4、细胞铺板与类器官培养
取实施例1中完全培养基与基质胶按2:8比例混合后,取1ml基质胶重悬上述细胞沉淀,形成混合液,并悬空滴加至24孔培养板中间,滴加混合悬液时,将胶滴打出枪头形成悬垂液滴,室温悬垂30s,之后接种至板中央。将培养板放入37℃恒温培养箱孵育5min。5min后取出培养板,加入实施例1的完全培养基。之后每2-3天更换一次培养基,5-7天后可观察到长势良好的肾癌骨转移类器官。图5显示了显微镜下观察到的肾癌骨转移类器官,表明本发明所用培养基培养出来的肾癌骨转移类器官的形态在不同代次间保持一致(不规则实心球体,伴出芽状),可连续传代培养。
实施例11乳腺癌类器官培养
1、组织保存与运输
将新鲜摘取的乳腺癌骨转移样本放置于实施例1中的组织保存液中,标本自体内取出后,离体时间不超过15min,放入保存液后即封口,并在12小时内存于冰上送往实验室。
2、组织预处理
癌组织送达实验室后,先将组织中非骨质部分剔除下来,并用剪刀剪切成3mm小块,放入冷的PBS中暂存,剩余骨质部分使用切割式研磨仪切割成较小块状(此步骤设定时间不超过10s)。然后将所有组织块转移到新的无菌50ml离心管中,加入含有2%青霉素/链霉素的PBS摇洗5分钟,摇洗结束后弃掉PBS,重复上述操作1次,以便去除组织附带的杂质。
3、组织解离和细胞获取
上述步骤得到的细小组织经反复清洗、离心后,弃去清洗液,加入实施例1中提供的组织消化液,于37℃恒温空气摇床上消化20-25分钟即可。消化结束后,加10ml含5%FBS的PBS溶液终止消化。将离心管竖直放在冰上30s,待未消化的骨质部分沉降后,取上清,200g离心5分钟,离心结束后弃掉上清,保留细胞沉淀。
4、细胞铺板与类器官培养
取实施例1中完全培养基与基质胶按2:8比例混合后,取1ml基质胶重悬上述细胞沉淀,形成混合液,并悬空滴加至24孔培养板中间,滴加混合悬液时,将胶滴打出枪头形成悬垂液滴,室温悬垂30s,之后接种至板中央。将培养板放入37℃恒温培养箱孵育5min。5min后取出培养板,加入实施例1的完全培养基。之后每2-3天更换一次培养基,5-7天后可观察到长势良好的乳腺癌骨转移类器官。
图6显示了显微镜下观察到的乳腺癌骨转移类器官,表明本发明所用培养基培养出来的乳腺癌骨转移类器官的形态在不同代次间保持一致(不规则实心球体),可连续传代培养。
实施例12其他骨转移类器官培养
采用实施例11中相同的方法,分别培养肠癌骨转移类器官、前列腺癌骨转移类器官、肺癌骨转移类器官、宫颈癌骨转移类器官。图7显示了显微镜下观察到的类器官形态,表明本发明所用培养基也能很好地够针对以上癌种培养出相应的骨转移癌类器官。
实施例13骨转移癌类器官免疫组织化学染色
肿瘤类器官和原位组织在结构或者基因表达上往往具有相似性。本实施例以肠癌骨转移为例,对相似性进行描述。分别对来源组织和由实施例12中方法获得的肠癌骨转移类器官进行免疫荧光染色,从图8中(O代表类器官;T代表组织)可以看出,病理形态上(HE染色)具有相似的腺体结构,同时突变型p53基因(白色箭头所示,p53基因突变常常引起肠癌发生,在肠癌中突变比例较高,可作为组织和类器官来源一致性判断指标)表达在组织和类器官上具有相似性,且β-连环蛋白(β-catenin,灰色箭头所示,肠癌发生过程时常伴随连环蛋白入核表达。通过组织和类器官表达情况进一步判断一致性)和增殖marker Ki-67(白色箭头所示)表达也较为一致。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (14)
1.一种用于培养骨转移癌类器官的培养基,其特征在于,所述培养基包括培养基组分和添加剂组分,其中,所述添加剂组分中含有IL-6、BMP4、Wnt3a、Noggin、EGF、FGF2、Gastrin、SB202190、Y27632、BSA;所述培养基组分中含有基础培养基、HEPES、GlutanMAX、N-乙酰基半胱氨酸;
其中,所述IL-6的浓度为1-20ng/ml,所述BMP4的浓度为1-10ng/ml,所述Wnt3a的浓度为100-1000ng/ml,所述Noggin的浓度为20-200ng/ml,所述EGF的浓度为10-100ng/ml,所述FGF2的浓度为2-50ng/ml,所述Gastrin的浓度为1-20nM,所述SB202190的浓度为0.1-20μM,所述Y27632的浓度为1-20μM,所述BSA的浓度为1-10mg/ml,所述基础培养基为AdvancedDMEM/F12,所述HEPES的浓度为1-30mM,所述GlutanMAX的浓度为1-10mM,所述N-乙酰基半胱氨酸的浓度为0.1-10mM。
2.根据权利要求1所述的培养基,其特征在于,所述添加剂组分进一步包括Afamin,所述Afamin的浓度为20-200ng/ml。
3.根据权利要求1所述的培养基,其特征在于,所述添加剂组分进一步包括庆大霉素、两性霉素。
4.根据权利要求1所述的培养基,其特征在于,所述庆大霉素的浓度为5μg/ml-50μg/ml。
5.根据权利要求1所述的培养基,其特征在于,所述两性霉素的浓度为50ng/ml-500ng/ml。
6.根据权利要求1所述的培养基,其特征在于,所述培养基组分和所述添加剂组分的体积比为24:1。
7.权利要求1-6中任一项所述的培养基在培养骨转移癌类器官中的用途,其特征在于,所述骨转移癌类器官选自囊腺癌骨转移类器官、肾癌骨转移类器官、乳腺癌骨转移类器官、肠癌骨转移类器官、前列腺癌骨转移类器官、肺癌骨转移类器官、宫颈癌骨转移类器官。
8.一种培养骨转移癌类器官的方法,其特征在于,所述方法包括:
(1)将骨转移癌样本进行消化处理,以便获取骨转移癌细胞;
(2)利用权利要求1-6中任一项所述的培养基培养所述骨转移癌细胞,以便获取骨转移癌类器官。
其中,所述骨转移癌选自囊腺癌骨转移癌、肾癌骨转移癌、乳腺癌骨转移癌、肠癌骨转移癌、前列腺癌骨转移癌、肺癌骨转移癌、宫颈癌骨转移癌。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述消化处理包括利用组织消化液对所述骨转移癌样本进行消化,其中,所述组织消化液包括胶原蛋白酶、透明质酸酶以及TrypLE;所述胶原蛋白酶浓度为5-100μg/ml;所述透明质酸酶浓度为1-50μg/ml;所述TrypLE浓度25-35%(v/v)。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述组织消化液进一步包括庆大霉素、两性霉素;所述庆大霉素的浓度为5μg/ml-50μg/ml;所述两性霉素的浓度为50ng/ml-500ng/ml。
11.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述方法进一步包括在对所述骨转移癌样本进行消化处理之前,将所述骨转移癌样本保存至组织保存液中,
其中,所述组织保存液包括DMEM/F12、HEPES、GlutanMAX、非必需氨基酸NEAA以及BSA;所述HEPES浓度为1-30mM;所述GlutanMAX浓度为1-10mM;所述非必需氨基酸NEAA浓度为2-20mM;所述BSA浓度为1-10mg/ml。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述组织保存液进一步包括庆大霉素、两性霉素;所述庆大霉素的浓度为5μg/ml-50μg/ml;所述两性霉素的浓度为50ng/ml-500ng/ml。
13.一种培养骨转移癌类器官的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1-6中任一项所述的培养基,所述骨转移癌选自囊腺癌骨转移癌、肾癌骨转移癌、乳腺癌骨转移癌、肠癌骨转移癌、前列腺癌骨转移癌、肺癌骨转移癌、宫颈癌骨转移癌;所述试剂盒进一步包括消化液和/或保存液。
14.根据权利要求13所述的试剂盒,其特征在于,所述消化液为组织消化液,所述组织消化液包括胶原蛋白酶、透明质酸酶以及TrypLE;所述胶原蛋白酶浓度为5-100μg/ml;
其中,所述透明质酸酶浓度为1-50μg/ml;所述TrypLE浓度25-35%(v/v);所述组织消化液进一步包括庆大霉素、两性霉素;所述庆大霉素的浓度为5μg/ml-50μg/ml;所述两性霉素的浓度为50ng/ml-500ng/ml;所述保存液为组织保存液,所述组织保存液包括DMEM/F12、HEPES、GlutanMAX、非必需氨基酸NEAA以及BSA;所述HEPES浓度为1-30mM;所述GlutanMAX浓度为1-10mM;所述非必需氨基酸NEAA浓度为2-20mM;所述BSA浓度为1-10mg/ml;
其中,所述组织保存液进一步包括庆大霉素、两性霉素;所述庆大霉素的浓度为5μg/ml-50μg/ml;所述两性霉素的浓度为50ng/ml-500ng/ml。
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