CN114317443A - 乳腺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及生物组织工程技术领域，公开一种乳腺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法，所述乳腺癌类器官培养液包括完全培养基和自源条件培养基；完全培养基包括基础培养基、复合抗生素和生长因子；自源条件培养基是利用肿瘤相关成纤维细胞培养基对乳腺癌组织提取的纤维细胞进行培养获得。培养液各组分之间协同作用，加快乳腺癌类器官细胞的形成和生长，增加细胞收获数量的同时还提高培养速度；而且体外培养的类器官更加仿生，能够适用于乳腺癌类器官的个性化培养，能够维持每一例病人原发组织的形体结构与病理特征。

Description

乳腺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法

技术领域

本申请涉及生物组织工程技术领域，例如涉及一种乳腺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法。

背景技术

乳腺癌是我国的十大恶性肿瘤之一。目前，乳腺癌的病因尚未完全清楚，目前认为主要是环境因素与遗传因素综合作用的结果。乳腺癌类器官对研究具有很重要的意义。目前虽有一些乳腺癌类器官培养基的研究报道，但是其培养过程生长慢，增加时间投入成本；且仿生性低。而且，由于乳腺癌的穿刺样本小，培养成功率低。

在实现本申请实施例的过程中，发现相关技术中至少存在如下问题：现有乳腺癌类器官的培养过程中，每次传代至少需要培养14天，甚至更多天，才达到传代要求。而且，获得的细胞量少，为了收获更多的细胞，进行下游试验，需要时间更长，使得整个器官的构建过程缓慢，导致乳腺癌类器官研究的时间成本高，除此之外，更为重要的是，类器官体外培养一段时间后，会发生EMT转变，逐渐丧失体内的间质特性，跟体内真实的肿瘤特性差异会比较大。另外，针对乳腺癌穿刺样本还存在培养成功率低的问题。

发明内容

为了对披露的实施例的一些方面有基本的理解，下面给出了简单的概括。所述概括不是泛泛评述，也不是要确定关键／重要组成元素或描绘这些实施例的保护范围，而是作为后面的详细说明的序言。

本申请实施例提供一种乳腺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法，以加快乳腺癌类器官细胞的生长，提高培养速度；而且体外培养的乳腺癌类器官更加仿生，能够保持器官的间质特性；而且提高了穿刺样本的培养成功率。

在一些实施例中，所述乳腺癌类器官培养液，其中，所述完全培养基包括条件培养基、基础培养基、复合抗生素和生长因子；所述基础培养基包括Advanced DMEM/F12（优化后的杜氏改良Eagle培养基/营养混合物F-12），HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸） 5～15mM和Glutamax 0.5x～1.5x；所述复合抗生素包括Primocin 50～500 μg/mL，青霉素-链霉素0.5x～1.5x和甲硝唑2～10 μg/mL；所述生长因子包括：EGF（表皮细胞生长因子） 10～100 ng/mL，FGF-10（成纤维细胞生长因子10） 10～100 ng/mL，B27 0.25x～1.5x，n-Acetylcysteine（乙酰半胱氨酸） 1～2 mM，Nicotinamide（烟酰胺） 5～20 mM，Y-27632 5～15 μM，β-estradiol（β-雌二醇） 50～200 nM，Heregulin beta-1（Heregulin蛋白家族β1型蛋白）3～10 nM，所述条件培养基包括两种或三种蛋白条件培养基，其中所述蛋白条件培养基选自Wnt-3a（Wnt蛋白家族3a型蛋白）条件培养基，R-spondin1（R-spondin蛋白家族1型蛋白）条件培养基和Noggin（头蛋白）条件培养基；

自源条件培养基是利用肿瘤相关成纤维细胞培养基对乳腺癌组织提取的自源肿瘤纤维细胞进行培养获得；且所述自源条件培养基中至少包括自源生长因子、自源白介素因子、自源趋化因子，自源基质金属蛋白酶和其他自源因子；所述其他自源因子包括SDF1、VEGFA、TGFβ、PDGFα和PGE2。

在一些实施例中，所述乳腺癌类器官培养试剂组合，包括：酶解液和前述的乳腺癌类器官培养液；所述酶解液包括基础培养基、Ⅰ型胶原酶、Ⅲ型胶原酶和Primocin；其中，所述Ⅰ型胶原酶的浓度为0.1～2 mg/mL，所述Ⅲ型胶原酶的浓度为0.1～1 mg/mL，所述Primocin的浓度为0.2～2 mg/mL；所述乳腺癌类器官培养液与所述酶解液独立包装。

在一些实施例中，所述乳腺癌类器官的培养方法，包括：将乳腺癌样本进行物理预处理，得到样本组织碎块；将所述样本组织碎块进行酶解预处理，获得酶解混合液，将所述酶解混合液离心处理，获得细胞团块沉淀；采用基质胶重悬所述细胞团块沉淀，获得混有细胞的凝胶；然后将所述凝胶接种于培养孔，于37℃细胞培养箱静置培养，使得所述凝胶凝固；向培养孔内加入前述的乳腺癌类器官培养液进行培养，获得原代乳腺癌类器官；将原代乳腺癌类器官进行传代培养，传代培养过程中采用前述的乳腺癌类器官培养液进行培养，每次传代培养的培养周期为5～7天，获得相应代乳腺癌类器官。

本申请实施例提供的一种乳腺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法，可以实现以下技术效果：

本申请实施例提供的乳腺癌类器官培养液包括完全培养基和自源条件培养基，其中自源条件培养基中的多种分泌因子之间相互协同作用，同时该些分泌因子与完全培养基中的条件培养基、复合抗生素以及各生长因子之间相互协同作用，再配合复合抗生素的种类和浓度的控制，在防止污染的同时还能够保持细胞活性；而且加快了乳腺癌类器官细胞的形成和生长，保证了乳腺癌的培养成功率，成功率能够达到85%以上；而且提高培养速度，在传代培养过程中，培养5～7天即可达到传代要求；同时，自源条件培养基的加入，使得培养获得的乳腺癌类器官细胞更加仿生，可以体外维持体内的肿瘤特性，不会发生EMT转变，保持体内的间质特性。而且，进行多次传代获得的乳腺癌类器官与肿瘤组织样本的特征性蛋白marker表达具有一致性。

本申请实施例的乳腺癌器官培养液能够适用于人源乳腺癌类器官的培养，尤其适用于乳腺癌类器官的个性化培养，能够维持每一例病人原发组织的形体结构与病理特征。

本申请实施例提供的乳腺癌类器官培养试剂中，酶解液利用Ⅰ型胶原酶和Ⅲ型胶原酶协同进行酶解，能够缩短酶解时间，有效获得细胞或细胞团块且获得的细胞活性高，还可有效降低样本污染；然后利用本申请实施例的乳腺癌类器官培养液对乳腺癌肿瘤样本进行培养，能够加快乳腺癌类器官细胞的生长，提高培养速度。

本申请实施例提供的乳腺癌类器官的培养方法，操作简单，采用本申请实施例的乳腺癌类器官培养液能够有效缩减了原代类器官形成与生长时间，培养3天后即可见酶解后的单细胞与组织团块均形成类器官，并在培养5～7天后的乳腺癌类器官最大直径可达100 μm，可进行传代培养。在传代培养时，每代培养时间能够缩短至5～7天，传代培养5～7天后类器官的最大直径可达100 μm，即可进行传代，传代周期稳定缩短。同时，获得的乳腺癌类器官更加仿生，可以体外维持体内的肿瘤特性。同时，针对穿刺样本的培养成功率提高，达到85%以上。

以上的总体描述和下文中的描述仅是示例性和解释性的，不用于限制本申请。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图进行示例性说明，这些示例性说明和附图并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件示为类似的元件，附图不构成比例限制，并且其中：

图1a至图1c分别是本申请实施例的一种自源条件培养基制备过程中获得的一种自源肿瘤纤维细胞的图片；

图2是本申请实施例的一种自源条件培养基中培养天数与细胞活力曲线图；

图3是本申请实施例的一种自源条件培养基中HGF含量柱状图；

图4是本申请实施例的一种自源条件培养基中IL-6含量柱状图；

图5是本申请实施例的一种乳腺癌类器官培养方法的原代培养3天后的乳腺癌类器官的光镜图；

图6是本申请实施例的另一种乳腺癌类器官培养方法的原代培养7天后的乳腺癌类器官的光镜图；

图7是本申请实施例的另一种乳腺癌类器官培养方法中经酶解预处理的细胞的台盼蓝染色图；

图8是本申请实施例的另一种乳腺癌类器官培养方法的传代培养7天时的乳腺癌类器官的ATP含量发光强度柱状图；

图9是本申请实施例的另一种乳腺癌类器官培养方法的传代培养7天时的乳腺癌类器官的光镜图；

图10是经本申请实施例的冻存方法冻存后复苏并常规培养24 h后的乳腺癌类器官的光镜图；

图11a、图12a和图13a是对比例1中采用对比培养液Ⅰ分别对3个病例的乳腺癌样本进行培养7天时的乳腺癌类器官的光镜图；

图11b、图12b和图13b是采用实施例5的培养方法分别对3个病例的乳腺癌样本进行培养7天时的乳腺癌类器官的光镜图；

图14是对比例2中的一种乳腺癌类器官培养方法的原代培养14天后的乳腺癌类器官的光镜图；

图15是本申请实施例的乳腺癌类器官的上皮标志蛋白E-cadherin的相对表达量柱状图

图16是本申请实施例的乳腺癌类器官的间质标志蛋白vimentin的相对表达量柱状图；

图17是本申请实施例的乳腺癌类器官培养方法获得的乳腺癌类器官的HE染色结果图；

图18是本申请实施例的乳腺癌类器官同源组织的HE染色结果图；

上述附图中，除图17和图18外，其余附图的标尺均为200μm。

具体实施方式

为了能够更加详尽地了解本申请实施例的特点与技术内容，下面结合附图对本申请实施例的实现进行详细阐述，所附附图仅供参考说明之用，并非用来限定本申请实施例。在以下的技术描述中，为方便解释起见，通过多个细节以提供对所披露实施例的充分理解。然而，在没有这些细节的情况下，一个或多个实施例仍然可以实施。在其它情况下，为简化附图，熟知的结构和装置可以简化展示。

本申请实施例的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请实施例的实施例。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。

本申请实施例中，术语“上”、“下”、“内”、“中”、“外”、“前”、“后”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系。这些术语主要是为了更好地描述本申请实施例及其实施例，并非用于限定所指示的装置、元件或组成部分必须具有特定方位，或以特定方位进行构造和操作。并且，上述部分术语除了可以用于表示方位或位置关系以外，还可能用于表示其他含义，例如术语“上”在某些情况下也可能用于表示某种依附关系或连接关系。对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解这些术语在本申请实施例中的具体含义。

另外，术语“设置”、“连接”、“固定”应做广义理解。例如，“连接”可以是固定连接，可拆卸连接，或整体式构造；可以是机械连接，或电连接；可以是直接相连，或者是通过中间媒介间接相连，又或者是两个装置、元件或组成部分之间内部的连通。对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本申请实施例中的具体含义。

除非另有说明，术语“多个”表示两个或两个以上。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请实施例中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

本申请实施例提供的一种乳腺癌类器官培养液，包括完全培养基和自源条件培养基，完全培养基与自源条件培养基的体积比为1～3﹕1。

其中，完全培养基包括基础培养基、复合抗生素和生长因子；所述完全培养基包括条件培养基、基础培养基、复合抗生素和生长因子；所述基础培养基包括Advanced DMEM/F12，HEPES 5～15 mM和Glutamax 0.5x～1.5x；所述复合抗生素包括Primocin 50～500 μg/mL，青霉素-链霉素0.5x～1.5x和甲硝唑2～10 μg/mL；所述生长因子包括：EGF 10～100ng/mL，FGF-10 10～100 ng/mL，B27 0.25x～1.5x，n-Acetylcysteine 1～2 mM，Nicotinamide 5～20 mM，Y-27632 5～15 μM，β-estradiol 50～200 nM，Heregulin beta-1 3～10 nM，所述蛋白条件培养基包括两种或三种蛋白条件培养基，其中所述蛋白条件培养基选自Wnt-3a条件培养基，R-spondin1条件培养基和Noggin条件培养基；

自源条件培养基是利用肿瘤相关成纤维细胞培养基对乳腺癌组织提取的自源肿瘤纤维细胞进行培养获得；且所述自源条件培养基中至少包括自源生长因子、自源白介素因子、自源趋化因子，自源基质金属蛋白酶和其他自源因子；所述其他自源因子包括SDF 1、VEGFA、TGFβ、PDGFα和PGE2。

本申请实施例的乳腺癌类器官培养液包括完全培养基和自源条件培养基，其中自源条件培养基中至少包括自源生长因子（如，HGF、CTGF和IGF），自源白介素因子（如，IL-6、IL-8和IL-11），自源趋化因子（如，CCL2、CCL5、CXCL9和CXCL10），自源基质金属蛋白酶（如，MMP1和MMP9），以及其他自源因子（如，SDF1、VEGFA、TGFβ、PDGFα和PGE2）等分泌因子，该些分泌因子之间相互协同作用，例如，基质衍生因子-1（Stromal Derived Factor-1，SDF1）刺激癌细胞增殖，并可通过招募内皮前体细胞增加肿瘤血管生成；自源生长因子中的HGF可通过HGF/c-Met/STAT3/Twist1通路促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭；自源白介素因子中的IL-6可通过IL-6/IL-6R/JAK2/STAT3/Twist1通路发生相同促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭的作用，IL-6还可以上调c-Met的表达，进而与HGF在增强CAF的特性方面存在协同作用，等等；以及复合抗生素的种类和浓度的控制，在防止污染的同时还能够保持细胞活性；综上，通过在培养基中增加以上细胞因子而产生的相互协同作用，配合复合抗生素，加快了乳腺癌类器官细胞的形成和生长，保证了乳腺癌的培养成功率，穿刺样品的培养成功率能够达到85%以上；而且增加细胞收获数量的同时还提高培养速度，在传代培养过程中，培养6-8天即可达到传代要求；同时，自源条件培养基的加入，使得培养获得的乳腺癌类器官细胞更加仿生，可以体外维持体内的肿瘤特性。本申请实施例的培养液能够适用于人源乳腺癌类器官的培养，尤其适用于乳腺癌类器官的个性化培养，能够维持每一例病人原发组织的形体结构与病理特征。

本申请实施例的乳腺癌类器官培养液中，完全培养基中的条件培养基中的各蛋白条件培养基采用自制获得，以及自源条件培养基也可采用自行培养的方式自制获得，大大降低了成本。其余组分均采用市售产品。

本申请实施例中，将条件培养基和基础培养基按体积比例混合后，获得混合培养基，再向该混合培养基中加入复合抗生素和生长因子，混匀，获得完全培养基，再将完全培养基与自源条件培养基按体积比例混合均匀即得肺癌类器官培养液。

在完全培养基中，基础培养基中的HEPES和Glutamax的浓度是在基础培养基内的浓度。可选地，基础培养基包括Advanced DMEM/F12，HEPES 8～12 mM和Glutamax 0.75x～1.25x。可选地，基础培养基包括Advanced DMEM/F12，HEPES 10 mM和Glutamax 1x。

可选地，条件培养基与基础培养基的体积比为2～3﹕1。可选地，条件培养基与基础培养基的体积比为1﹕1或者7﹕3（2.3﹕1）。

可选地，生长因子包括：EGF 40～80 ng/mL，FGF-10 40～80 ng/mL，B27 0.75x～1.25x，n-Acetylcysteine 1.25～1.8 mM，Nicotinamide 8～15 mM，Y-27632 8～12 μM，β-estradiol 100～180 nM，Heregulin beta-1 4～8 nM。

可选地，生长因子包括：EGF 50 ng/mL，FGF-10 50 ng/mL，B27 0.75x～1x，n-Acetylcysteine 1.25～1.5 mM，Nicotinamide 8～10 mM，Y-27632 8～10 μM，β-estradiol 150 nM，Heregulin beta-1 5 nM。

可选地，复合抗生素包括Primocin 50～150 μg/mL，青霉素-链霉素0.6x～1.4x和甲硝唑2～6 μg/mL。

可选地，复合抗生素包括Primocin 75～125 μg/mL，青霉素-链霉素0.75x～1.25x和甲硝唑3～5μg/mL。

可选地，复合抗生素包括Primocin100 μg/mL，青霉素-链霉素 1x和甲硝唑4μg/mL。

在一些实施例中，条件培养基包括Wnt-3a条件培养基，R-spondin1条件培养基和Noggin条件培养基。三种蛋白条件培养基可以任意比例混合。

可选地，Wnt-3a条件培养基，R-spondin1条件培养基和Noggin条件培养基的体积比依次为0.1～0.8﹕1～2﹕1。

可选地，Wnt-3a条件培养基，R-spondin1条件培养基和Noggin条件培养基的体积比依次为0.3～0.6﹕1.2～1.8﹕1。

可选地，Wnt-3a条件培养基，R-spondin1条件培养基和Noggin条件培养基的体积比依次为0.5﹕1.5﹕1。

可选地，在乳腺癌类器官培养液中，按体积百分比，条件培养基为70%，基础培养基为30%；其中，条件培养基中，按体积百分比，包括Wnt-3a条件培养基为20%，R-spondin1条件培养基为50%，Noggin条件培养基为30%。

在一些实施例中，条件培养基包括R-spondin1条件培养基和Noggin条件培养基。该两种蛋白条件培养可以任意比例混合。

可选地，R-spondin1条件培养基和Noggin条件培养基的体积比为1～2﹕1。

可选地，R-spondin1条件培养基和Noggin条件培养基的体积比为1.2～1.8﹕1。

可选地，R-spondin1条件培养基和Noggin条件培养基的体积比为1.5﹕1。

可选地，在乳腺癌类器官培养液中，按体积百分比，条件培养基为50%，基础培养基为50%；其中，条件培养基中，按体积百分比，包括R-spondin1条件培养基为60%，Noggin条件培养基为40%。

在一些实施例中，蛋白条件培养基通过以下方法获得：

S110、将产目的蛋白的细胞系依次进行初次培养、抗生素筛选培养和二次培养后，进入孵育培养阶段。

步骤S110中，依据目的蛋白的种类确定采用的细胞系，本实施例中将该细胞系定义为目的细胞系，便于后续引用。目的细胞系为目的蛋白过表达细胞株，可以通过慢病毒转染方式，向CHO细胞系中转入目的基因，实现特定蛋白的过表达。例如，目的蛋白为Wnt-3a，采用的Wnt-3a过表达细胞株通过慢病毒转染方式，向CHO细胞系中转入Wnt-3a目的基因，实现特定蛋白的过表达。

可选地，初次培养包括：复苏目的细胞系，并使用第一完全培养基进行培养。第一完全培养基采用Advanced DMEM/F12+10%FBS（胎牛血清）+1% P/S（双抗（青霉素加链霉素））。

可选地，抗生素筛选培养包括：在初次培养至细胞汇合度达90%后，传代至培养皿，然后使用第二完全培养进行一次筛选培养2～3天；在细胞汇合度达90%后，传代至新培养皿，然后使用第二完全培养进行二次筛选培养2～3天。其中，第二完全培养基是在第一完全培养基的基础上，加入Puromycin（嘌呤霉素），且控制其浓度为5 μg/mL。

可选地，二次培养包括：在二次筛选培养至细胞汇合度达90%后，用胰酶消化传代至透气培养瓶，采用第一完全培养基（同初次培养）继续培养，期间2天或者3天换液一次。这里，透气培养瓶采用T175透气培养瓶，且每瓶透气培养瓶中控制总培养基30 mL，当然也可以是其他体积量，不限定。

可选地，孵育培养包括：在二次培养至细胞汇合度达95%～100%后，去除培养基，用PBS清洗后，每瓶加入新配制的第一完全培养基，孵育培养。在PBS清洗过程中，视情况确定PBS的体积，例如，10mL。

S120、在孵育培养阶段中，每孵育24小时收取一次培养基，并将培养基在4℃下离心处理，将上清液转移至无菌瓶，并置于4℃下存储，依据收取时间顺序对应获得第一次条件培养基至第十二次条件培养基；其中，将第一次条件培养基至第四次条件培养基混合作为第一批次条件培养基；将第五次条件培养基至第八次条件培养基混合作为第二批次条件培养基；将第九次条件培养基至第十二次条件培养基混合作为第三批次条件培养基；将第一批次条件培养基、第二批次条件培养基和第三批次条件培养基混合，获得蛋白条件培养基。

这里，还会对各批次条件培养基中的蛋白含量进行检测，检测合格后，再混合使用。同时，还可以将每个批次条件培养基过滤后分别冻存，在使用时，再解冻后混合。

本步骤S120中，可选地，将培养基在4℃下离心处理条件包括：离心力为2000 g，离心时间为5 min。

可选地，每批次条件培养基采用0.22 μm真空过滤器。

可选地，冻存条件为零下80℃（-80℃）。

可选地，第一批次条件培养基、第二批次条件培养基和第三批次条件培养基等体积比例混合。

在一些实施例中，自源条件培养基中，自源生长因子包括HGF、CTGF和IGF，自源白介素因子包括IL-6、IL-8和IL-11；自源趋化因子包括CCL2、CCL5、CXCL9和CXCL10；自源基质金属蛋白酶如MMP1和MMP9。

在一些实施例中，自源条件培养基通过以下步骤培养获得：

S210、提取自源肿瘤相关成纤维细胞，传代并建系，获得自源肿瘤纤维细胞；这里，步骤S210具体包括以下步骤：S221、将乳腺癌样本进行物理预处理，得到样本组织碎块；S222、将样本组织碎块进行酶解预处理，过滤，获得过滤后残存的组织残渣；S223、将步骤S222获得的组织残渣，涂布于T25瓶底部，培养箱贴壁1～3 h，然后加入培养基（ 例如，DMEM基础培养基+5%血清+3%PS），培养；S224、培养至第4天时，观察组织块有无纤维细胞爬出，并进行第一次换液；之后每3天换液一次并观察，在长出足量纤维细胞后，收取纤维细胞，获得自源肿瘤纤维细胞。长势较好的CAF（肿瘤相关成纤维细胞）会在14天左右长满瓶底，一般可在20天左右长出足量纤维细胞。之后，根据细胞生长情况进行传代和扩培保种。

S220、采用肿瘤相关成纤维细胞培养基对所述自源肿瘤纤维细胞进行培养；其中，所述肿瘤相关成纤维细胞培养基包括：DMEM基础培养基+5%血清+3%PS（双抗（青霉素加链霉素））。该处的百分比为体积百分比。

具体地，将自源肿瘤纤维细胞进行3D（3 dimensional）种植，然后加入肿瘤相关成纤维细胞培养基，进行培养。

S230、培养3至5天后，收集培养基，并对收集的培养基进行离心处理，获得自源条件培养基。本实施例中，收集的培养基离心处理以去除血清纤维以及死细胞碎片，所得的离心液即为自源条件培养基。

本实施例中，对步骤S210中获取的自源肿瘤纤维细胞，除了进行后续的自源条件培养基的制备外，还可以将部分自源肿瘤纤维细胞进行传代培养，并冻存保种。

可选地，利用自源肿瘤纤维细胞进行传代培养，并冻存保种的步骤具体包括：

S240、对自源肿瘤纤维细胞进行传代培养，并在第二次传代培养（P2培养）后（包括或者不包括P2培养）CAF约3天进行1：2传代。传代前细胞汇合度应至80%，长势较慢或者较快的纤维细胞可适当调整传代比例与时间。

S250、在第三次传代培养（P3培养）后（包括或者不包括P3培养）开始保种，每0.5×10 cm dish 冻存1支。

本申请实施例还提供一种乳腺癌类器官培养试剂组合，包括酶解液和前述任一实施例的乳腺癌类器官培养液。其中，酶解液，包括基础培养基、Ⅳ型胶原酶、透明质酸酶和青霉素-链霉素；其中，Ⅳ型胶原酶的浓度为0.5～2 mg/mL，透明质酸酶的浓度为10～30 μg/mL，青霉素-链霉素的体积百分比为0.5%～2%；乳腺癌类器官培养液与酶解液独立包装。

本申请实施例的乳腺癌类器官培养试剂组合是套装试剂，利用酶解液进行酶解，能够缩短酶解时间，有效获得细胞或细胞团块且获得的细胞活性高，还可有效降低样本污染；再结合利用本申请实施例的乳腺癌类器官培养液对乳腺癌肿瘤样本进行培养，能够加快乳腺癌类器官细胞的生长，提高培养速度；并促进形成，进一步提高乳腺癌的培养成功率。

在一些实施例中，酶解液中，基础培养基采用与乳腺癌类器官培养液一致的基础培养基，Advanced DMEM/F12。

在一些实施例中，酶解液，包括基础培养基、Ⅰ型胶原酶、Ⅲ型胶原酶和Primocin；其中，所述Ⅰ型胶原酶的浓度为0.1～2 mg/mL，所述Ⅲ型胶原酶的浓度为0.1～1 mg/mL，所述Primocin的浓度为0.2～2 mg/mL。

可选地，酶解液，包括基础培养基、Ⅰ型胶原酶、Ⅲ型胶原酶和Primocin；其中，所述Ⅰ型胶原酶的浓度为1.5mg/mL，所述Ⅲ型胶原酶的浓度为0.5mg/mL，所述Primocin的浓度为1.5 mg/mL。

本申请实施例的培养试剂组合中，酶解液与乳腺癌类器官培养液的比例不限定，依据培养过程的实际需求确定。

本申请实施例还提供一种乳腺癌类器官的培养方法，包括以下步骤：

S310、将乳腺癌样本进行物理预处理，得到样本组织碎块。

本步骤S310中，物理预处理包括清洗和破碎等物理处理方式。可选地，物理预处理，包括步骤S311、将乳腺癌肿瘤样本中的脂肪组织去除后，采用含5%双抗（青霉素-链霉素）的PBS缓冲液清洗后，将样本组织转移至培养皿中，然后剪碎，获得样本组织碎块。清洗次数不限定，达到充分清洗目的即可。这里，样本组织碎块的尺寸为1～2mm。剪碎一般采用眼科剪。

S320、将步骤S310获得的样本组织碎块进行酶解预处理获得酶解混合液；将酶解混合液离心处理，获得细胞团块沉淀。

本步骤S320中，酶解预处理可以采用常规酶解液进行酶解操作。具体地，酶解预处理，包括以下步骤：向样本组织碎块加入酶解液，在37℃摇床上孵育至显微镜下可见细胞团块后，然后加入酶解中止剂，中止酶解后，获得酶解混合液。完成酶解预处理。其中，酶解中止剂可以采用4℃的Advanced DMEM/F12，加入量依据酶解液的加入量确定。这里，孵育时间可控制在15～25min，以显微镜下可见细胞团块确定具体孵育时间。

可选地，酶解混合液离心处理条件包括：离心力为300 g。

S330、采用基质胶重悬步骤S320获得的细胞团块沉淀，获得混有细胞的凝胶；然后将该凝胶接种于培养孔，于37℃细胞培养箱静置培养，使得该凝胶凝固。

可选地，以每孔50μL的接种量将该凝胶接种于孔板中。孔板的孔数不限，例如，24孔板。

可选地，静置培养时间为15～40min。可选地，静置培养时间为15min～30min。可选地，静置培养时间为30min。

本步骤S330中，凝胶凝固的标准为竖直放置培养板凝胶不可自由流动即可。

S340、向培养孔内加入前述任一实施例的乳腺癌类器官培养液进行培养，获得原代乳腺癌类器官。

S350、将步骤S340获得的原代乳腺癌类器官进行传代培养，在代培培养过程中采用前述任一实施例的乳腺癌类器官培养液进行培养，每次传代培养的培养周期为5～7天，获得相应代乳腺癌类器官。

本申请实施例的培养方法中，操作简单，采用本申请实施例的乳腺癌类器官培养液，能够有效缩减了原代类器官形成与生长时间，在传代培养时，每代培养时间能够缩短至5～7天。在传代培养过程中，培养5～7天类器官直径最大可达100 μm，传代周期稳定缩短。而且，获得的乳腺癌类器官更仿生，可以体外维持体内的肿瘤特性。

在一些实施例中，步骤S320中，酶解预处理，包括以下步骤：

S321、向步骤S310获得的样本组织碎块加入前述的乳腺癌类器官培养试剂组合中的酶解液，在37℃摇床、200 r/min的条件下，孵育15～25 min。

本步骤S321中，酶解液的加入量与样本大小相关，针对乳腺癌穿刺取样的样本，样本体积小，可选地，酶解液的加入量为5mL。

S322、加入酶解中止剂，中止酶解后，获得酶解混合液。其中，酶解中止剂可以采用4℃的Advanced DMEM/F12，加入量依据酶解液的加入量确定。

可选地，酶解中止剂的加入体积与酶解液的加入体积的比例为1.5～3﹕1。可选地，比例为2﹕1。

可选地，步骤S321中，酶解液的加入量为5mL，步骤S322中，酶解中止剂的加入量为10mL。

可选地，在加入酶解中止剂后，用移液枪进行充分吹打，中止酶解。

本实施例中，采用前述乳腺癌类器官培养试剂组合中的酶解液进行酶解处理后，能够缩短酶解时间，有效获得细胞或细胞团块且获得的细胞活性高，还可有效降低样本污染；再结合利用本申请实施例的乳腺癌类器官培养液对乳腺癌肿瘤样本进行培养，能够加快乳腺癌类器官细胞的生长，提高培养速度。在进行原代提取培养过程中，培养3天后即可见大量乳腺癌类器官形成；培养5～7天类器官直径即可达100 μm，可进行传代。

在一些实施例中，一种乳腺癌类器官的培养方法，还包括：

S350、用基质胶包埋步骤S340获得的乳腺癌类器官，采用Advanced DMEM/F12培养基吹散后，离心处理，获得基质胶与细胞混合沉淀。

本步骤S350中，离心处理的条件包括：离心力为300 g，离心时间为5 min。

S360、将步骤S350获得的混合沉淀重悬获得重悬液；将重悬液置于37℃水浴8～10min；然后向重悬液中加入两倍体积的4℃的Advanced DMEM/F12培养基中止消化，离心处理，获得二次细胞沉淀。

本步骤S360中，重悬采用TrypLE重悬。离心处理的条件包括：离心力为300 g，离心时间为5 min。

S370、将二次细胞沉淀采用冻存液重悬，然后使用程序性梯度降温盒进行冻存；一天后转移至液氮中进行长期保存。二次细胞沉淀与冻存液的重悬比例为每1×10⁵～5×10⁶个细胞团用1 mL冻存液重悬。冻存液采用市售产品。

经过步骤S350至步骤S370处理进行液氮冻存的类器官12个月后复苏仍然可以稳定生长，且保持了类器官活性与干性，复苏后类器官生长状态良好。

下面给出本申请实施例的具体实施例，以说明本申请实施例的效果。

实施例1 蛋白条件培养基

蛋白条件培养基通过以下方法制备获得：

S101、复苏目的细胞系，并使用第一完全培养基进行培养。第一完全培养基采用Advanced DMEM/F12+10%FBS（胎牛血清）+1% P/S（双抗（青霉素加链霉素））。目的细胞系为目的蛋白过表达细胞株，通过慢病毒转染方式，向CHO细胞系中转入目的基因，实现特定蛋白的过表达。

这里，目的蛋白包括R-spondin1和Noggin。

S102、在初次培养至细胞汇合度达90%后，传代到10cm培养皿，然后使用第二完全培养基进行一次筛选培养2～3天；在细胞汇合度达90%后，传代至新10cm培养皿，然后使用第二完全培养进行二次筛选培养2～3天。其中，第二完全培养基是在第一完全培养基的基础上，加入Puromycin，且控制其浓度为5 μg/mL。

S103、在二次筛选培养至细胞汇合度达90%后，用胰酶消化传代至T175透气培养瓶，每瓶透气培养瓶中控制总培养基30 mL；采用第一完全培养基（同步骤S101）继续培养至细胞汇合度达95%～100%，期间2天或者3天换液一次；然后去除培养基，用10mL PBS震荡清洗一遍，每瓶加入新配制的第一完全培养基，孵育培养。

S104、在孵育培养阶段中，每孵育24小时收取一次培养基，并将培养基在4℃下离心处理（离心力为2000 g，离心时间为5 min），将上清液转移至500mL无菌瓶，并置于4℃下存储，依据收取时间顺序对应获得第一次条件培养基至第十二次条件培养基；其中，将第一次条件培养基至第四次条件培养基混合作为第一批次条件培养基；将第五次条件培养基至第八次条件培养基混合作为第二批次条件培养基；将第九次条件培养基至第十二次条件培养基混合作为第三批次条件培养基。且每批次条件培养基采用0.22μm真空过滤器。冻存条件为零下80℃。

S105、使用时，将冻存的第一批次条件培养基、第二批次条件培养基和第三批次条件培养基解冻后等体积比例混合，作为目的蛋白条件培养基。

即，采用R-spondin1过表达细胞株的目的细胞系培养获得R-spondin 1蛋白条件培养基；采用Noggin过表达细胞株的目的细胞系培养获得Noggin蛋白条件培养基。

使用时，将冻存的两种目的蛋白条件培养基解冻后使用即可。

本实施例1的蛋白条件培养基的制备方法，成本低。

实施例2 自源条件培养基

自源条件培养基采用以下步骤制备获得：

S201、将乳腺癌样本进行物理预处理，得到样本组织碎块；

S202、将样本组织碎块进行酶解预处理，过滤，获得过滤后残存的组织残渣；

S203、将步骤S202获得的组织残渣，涂布于T25瓶底部，培养箱贴壁1～3 h，然后加入培养基（例如，DMEM基础培养基+5%血清+3%PS），培养；

S204、培养至第4天时，观察组织块有无纤维细胞爬出，并进行第一次换液；之后每3天换液一次并观察，在长出足量纤维细胞后，收取纤维细胞，获得自源肿瘤纤维细胞。长势较好的CAF（肿瘤相关成纤维细胞）会在14天左右长满瓶底，一般可在20天左右长出足量纤维细胞。之后，根据细胞生长情况进行传代和扩培保种。

S205、将自源肿瘤纤维细胞进行3D（3 dimensional）种植，然后加入肿瘤相关成纤维细胞培养基，进行培养。其中，肿瘤相关成纤维细胞培养基包括：DMEM基础培养基+5%血清+3%PS（双抗（青霉素加链霉素））。该处的百分比为体积百分比。

S206、分别培养1天、3天和5天后，收集培养基，并分别对收集的培养基进行离心处理，各自对应获得自源条件培养基Ⅰ、自源条件培养基Ⅱ和自源条件培养基Ⅲ。本步骤S206中，收集的培养基离心处理以去除血清纤维以及死细胞碎片，所得的离心液即为自源条件培养基。

本实施例中，步骤S206中，分别培养1天、3天和5天的纤维细胞进行了检测，纤维细胞的明场显微照片分别对应如图1a、图1b和图1c所示，对比分析可知，培养3天时纤维细胞生长达到饱和，培养5天时纤维细胞生长过饱和。

同时，分别培养1天、3天和5天的纤维细胞进行了细胞活力检测，如图2所示的细胞活力曲线图。由图2可知，在培养的前3天，细胞稳定增值，状态良好，第3天至第5天生长稳定。

本实施例2中，对分别培养3天和5天获取的自源条件培养基Ⅱ和Ⅲ进行了HGF含量测定，得到如图3所示的HGF含量柱状图。由图3可知，两者的HGF含量差异不大，自源条件培养基Ⅲ中HGF含量还略低于自源条件培养基Ⅱ。

本实施例2中，对培养5天获取的自源条件培养基Ⅲ进行了IL-6含量测定，得到如图4所示的IL-6含量柱状图。可知，本实施例1制备获得的自源条件培养基中含有一定量的IL-6。

本实施例2制备得到的自源条件培养基中至少包括自源生长因子，如，HGF、CTGF和IGF；自源白介素因子，如，IL-6、IL-8和IL-11；自源趋化因子，如，CCL2、CCL5、CXCL9和CXCL10；自源基质金属蛋白酶，如，MMP1和MMP9；以及其他自源因子，如，SDF1、VEGFA、TGFβ、PDGFα和PGE2。

实施例3 乳腺癌类器官培养液

一种乳腺癌类器官培养液，包括，完全培养基和自源条件培养基，完全培养基与自源条件培养基的体积比为3﹕1。其中，自源条件培养基采用实施例2中获得的自源条件培养基Ⅱ。

完全培养基包括条件培养基、基础培养基、复合抗生素和生长因子。其中，条件培养基和基础培养基的体积比为7﹕3，条件培养基中，按体积百分比，包括Wnt-3a条件培养基20%，R-spondin1条件培养基50%和Noggin条件培养基30%，且三者的体积比依次为0.5﹕1.5﹕1。基础培养基包括Advanced DMEM/F12，HEPES 10 mM和Glutamax 1x。即，按体积比，Wnt-3a条件培养基 20%，R-spondin1条件培养基30%和Noggin条件培养基20%，基础培养基 30%。复合抗生素包括Primocin 100 μg/mL，青霉素-链霉素 1x和甲硝唑4 μg/mL。

本实施例3中，生长因子的种类及含量见下表1所示，从而对应获得不同的完全培养基。

表1

本实施例3的乳腺癌类器官培养液，首先按各成分按比例用量获得完全培养基，再按完全培养基与自源培养基的体积比例混合即可。除了条件培养基和自源条件培养基自行制备获取外，其余成分均可采用市售产品。

本实施例3的乳腺癌类器官培养液适用于人源乳腺癌类器官培养液。

本实施例3中，依据采用的实施例2中自源条件培养基，以及上述完全培养基Ⅰ至完全培养基Ⅴ，可分别获得如下的培养液。

将完全培养基Ⅰ至完全培养基Ⅴ分别与自源条件培养基Ⅱ按体积比为3﹕1的比例混合分别对应获得培养液Ⅰ-Ⅱ至培养液Ⅴ-Ⅱ。

将完全培养基Ⅰ至完全培养基Ⅴ分别与自源条件培养基Ⅲ按体积比为3﹕1的比例混合分别对应获得培养液Ⅰ-Ⅲ至培养液Ⅴ-Ⅲ。

本实施例3中，以培养液Ⅱ-Ⅱ为基础，改变完全培养基Ⅱ中的复合抗生素各组分的浓度，从而获得具有不同抗生素浓度的培养液，如下表2所示。其余组分和各组分含量均与培养液Ⅱ-Ⅱ相同。

表2

实施例4 乳腺癌类器官培养试剂组合

一种乳腺癌类器官培养试剂组合，包括酶解液和实施例3中任一乳腺癌类器官培养液。其中，酶解液，包括基础培养基、Ⅰ型胶原酶、Ⅲ型胶原酶和Primocin；其中，Ⅰ型胶原酶的浓度为0.1～2 mg/mL，Ⅲ型胶原酶的浓度为0.1～1 mg/mL和Primocin的浓度为0.2～2mg/mL；乳腺癌类器官培养液与酶解液独立包装。

本实施例4中，酶解液中的基础培养基为Advanced DMEM/F12。

Ⅰ型胶原酶、Ⅲ型胶原酶和Primocin的浓度不同，分别获得如下表3所示的五种酶解液。

表3

本实施例4中，酶解液按各组分的用量混合即可。

实施例5

一种乳腺癌类器官的培养方法，包括以下步骤：

S301、将乳腺癌肿瘤样本采用含5% PS双抗（青霉素-链霉素）的PBS缓冲液震荡清洗5次后，将样本组织转移至培养皿（例如，60mL培养皿）中，然后用眼科剪剪碎至2～4 mm组织碎块，获得样本组织碎块。并将组织碎块转移至离心管中。

S302、将步骤S301获得的样本组织碎块进行酶解预处理，获得酶解混合液；将酶解混合液离心处理（离心力为300 g），获得细胞团块沉淀。其中，酶解预处理，包括以下步骤：向样本组织碎块加入5 mL酶解液，在37℃摇床（200 r/min）上孵育15～25min后，加入10 mL酶解中止剂（4℃的Advanced DMEM/F12），用移液枪进行充分吹打，中止酶解，采用100 μm细胞筛进行过滤，获取滤过液。

S303、采用基质胶重悬步骤S302获得的细胞团块沉淀，获得混有细胞的凝胶；然后以每孔50 μL的接种量将该凝胶接种24孔板的培养孔中，再静置培养30min，使得该凝胶凝固。

S304、向培养孔内加入实施例3的乳腺癌类器官培养液进行培养，获得原代乳腺癌类器官。本步骤S304中，如图5所示，培养3天后可见酶解后的细胞和组织团块均形成乳腺癌类器官。每3天更换培养液，培养5～7天后即可对乳腺癌类器官进行传代培养。如图6所示的采用经实施例4的酶解液Ⅲ酶解预处理后并采用实施例3的培养液Ⅱ-Ⅱ进行培养（原代培养）7天获得的乳腺癌类器官（记为乳腺癌类器官Ⅱ-Ⅱ-Ⅲ）的光镜图，可见，乳腺癌类器官直径最大可达200μm，可对乳腺癌类器官进行传代培养。

S305、将步骤S304获得的原代乳腺癌类器官进行传代培养，在传代培养过程中采用实施例3的乳腺癌类器官培养液进行培养，每次传代培养的培养周期为5～7天，获得相应代乳腺癌类器官。

本申请实施例中，取8例乳腺癌穿刺样本，采用本实施例5的培养方法进行培养，7例成功培养获得原代乳腺癌类器官，成功率达87.5%。

本申请实施例中，对3例乳腺癌手术组织采用本实施例5的培养方法进行培养，3例样本全部成功。

本实施例5的步骤S304中，培养5～7天后的乳腺癌类器官即可进行传代，传代比例可为1：1.5至1：3。可以稳定长期进行乳腺癌类器官的传代培养，传代周期6～8天。

本实施例5中，在步骤S304中，对分别采用培养液Ⅱ-Ⅱ、培养液Ⅲ-Ⅱ和培养液Ⅳ-Ⅱ进行原代培养7天时，各自获得的乳腺癌类器官Ⅱ-Ⅱ、乳腺癌类器官Ⅲ-Ⅱ和乳腺癌类器官Ⅳ-Ⅱ进行了细胞活率的检测。检测方法为将原代培养7天后的类器官酶解为单细胞，进行台盼蓝染色，对细胞总数和活细胞数进行统计，并计算细胞活率。检测结果如下表4所示。

表4

由表4可知，采用培养液Ⅱ-Ⅱ进行培养时获得的乳腺癌类器官的活性最好，收获的细胞量最多。

本实施例5中，步骤S302中，分别采用实施例4中的酶解液Ⅰ至酶解液Ⅴ进行酶解预处理，各酶解液所对应的孵育时间如下表5所示。

表5

可见，采用实施例4的酶解液在保证酶解效果的同时，能够明显缩短酶解孵育时间。

同时，对酶解后的乳腺癌样本的细胞进行了台盼蓝染色，如图7所示的采用实施例4的酶解液Ⅲ酶解预处理的细胞的台盼蓝染色图，可见，酶解效果好，且细胞具有很好的活性。

本实施例中，在步骤S304中，分别采用实施例3中的具有不同抗生素浓度的培养液Ⅱ-Ⅱ-1、培养液Ⅱ-Ⅱ-2、培养液Ⅱ-Ⅱ-3（即实施例3的培养液Ⅱ-Ⅱ）、培养液Ⅱ-Ⅱ-4和培养液Ⅱ-Ⅱ-5，进行培养7天时，各自获得的乳腺癌类器官Ⅱ-Ⅱ-1至乳腺癌类器官Ⅱ-Ⅱ-5，并对5个乳腺癌类器官进行了ATP（三磷酸腺苷）发光强度测试，测试结果的柱状图如图8所示。由图8可知，采用培养液Ⅱ-Ⅱ-3培养获得的乳腺癌类器官Ⅱ-Ⅱ-3的细胞总ATP值高，即细胞数量更高活性更好，同时结合前述表4的细胞量和细胞活率的检测结果，结合整体提取成功率发现，既可以防止污染，又可以保持活性。

本实施例5中，在步骤S302中，将酶解后的酶解混合液进行过滤，将获得的滤过液进行后续操作。而过滤后残存的组织残渣，可利用实施例2中记载的步骤S204至步骤S206进行操作获得自源肿瘤纤维细胞。并将部分自源肿瘤纤维细胞进行传代培养，并可冻存保种。

具体地，对自源肿瘤纤维细胞进行冻存保种的具体步骤如下：

S401、对自源肿瘤纤维细胞进行传代培养，并在第二次传代培养后CAF约3天进行1：2传代。传代前细胞汇合度应至80%，长势较慢或者较快的纤维细胞可适当调整传代比例与时间。

S402、在第三次传代培养后开始保种，每10 cm 培养皿冻存2支。

实施例6

本实施例6是在实施例5的基础上，对获得的原代乳腺癌类器官进行传代处理。具体地，乳腺癌类器官传代处理包括以下步骤：

S501、对实施例5中基质胶包埋的原代乳腺癌类器官，每孔使用1 mL 4℃Advanced DMEM/F12培养基吹散，回收于离心管中，离心处理（离心力为300 g，离心时间为5min），获得基质胶与细胞混合沉淀。

S502、将获得的沉淀采用TrypLE（Gibco）重悬获得重悬液；将该重悬液置于37℃水浴8～10 min；然后向重悬液中加入两倍体积的4℃的Advanced DMEM/F12培养基中止消化，用移液枪反复吹打数次。离心处理（离心力为300 g，离心时间为5 min），获得二次细胞沉淀。

其中，TrypLE的使用量以包埋类器官的基质胶量为准，理论上每100 μL基质胶包埋的类器官使用1 mL TrypLE进行重悬。

其中，中止消化后使用移液枪反复吹打情况与类器官的消化程度直接相关。使用1mL移液枪吹打10-20次，然后用1 mL移液枪头套200 μL移液枪头再次吹打10-20次，可以将所有类器官消化为均一大小的细胞团，一般的，细胞团中含2-10个细胞。

S503、用Advanced DMEM/F12重悬二次细胞沉淀，吹打均匀，离心处理（离心力为300 g，离心时间为5 min），获得三次细胞沉淀。若杂质较多，可重复此步骤。

S504、采用基质胶重悬三次细胞沉淀，获得混有细胞的凝胶；然后以每孔50 μL的接种量将该凝胶接种24孔板中，37℃培养箱孵育30 min，使得该凝胶凝固。

S505、向凝固后的类器官培养孔中加入实施例3的乳腺癌类器官培养液进行培养。如图9所示，培养7天后类器官的光镜照片，可见，类器官大小均一，长势良好。生长直径近100 μM，且视野内大直径类器官比例高。

实施例7

本实施例7是在实施例5或实施例6的基础上，对获得的乳腺癌类器官进行冻存处理。具体地，冻存处理包括以下步骤：

S601、对实施例5或实施例6中基质胶包埋的乳腺癌类器官，每孔使用1 mL 4℃Advanced DMEM/F12培养基吹散，回收于离心管中，离心处理（离心力为300 g，离心时间为5min），获得基质胶与细胞混合沉淀。

S602、将步骤S601获得的器官细胞沉淀采用TrypLE（市售产品Gibco）重悬获得重悬液；将该重悬液置于37℃水浴8～10min；然后向重悬液中加入两倍体积的4℃的AdvancedDMEM/F12培养基中止消化，离心处理（离心力为300 g，离心时间为5 min），获得二次细胞沉淀。

S603、对于二次细胞沉淀，每1×10⁵～5×10⁶个细胞团用1 mL含有0.1%～0.5%Y27632的冻存液重悬，使用程序性梯度降温盒进行冻存。一天后转移至液氮中进行长期保存。此处，一天一般指过夜。

经本实施例7液氮冻存处理后的乳腺癌类器官12个月后复苏仍然可以稳定生长，且保持了类器官活性与干性，如图10所示的复苏后的乳腺癌类器官经常规培养24h后的光镜图，可见，类器官活性较高，生长状态良好。

下面进行如下对比例，以与前述实施例进行分析对比。

对比例1

本对比例1是在实施例3的培养液Ⅱ-Ⅱ的基础上，不添加自源条件培养基，获得的对比培养液Ⅰ。其他同培养液Ⅱ-Ⅱ相同。

本对比例1中，分别采用了3个病例的乳腺癌样本，采用该对比培养液Ⅰ，对3个乳腺癌样本分别进行培养，培养方法同实施例5，其中，采用经实施例4的酶解液Ⅲ酶解预处理后并采用对比培养液Ⅰ进行对比培养（原代培养）。3个乳腺癌样本的对比培养7天获得的3个对比乳腺癌类器官的光镜图顺次为图11a、图12a和图13a。

同时，对该3个病例的3个乳腺癌样本分别采用实施例5的培养方法进行原代培养，其中，采用经实施例4的酶解液Ⅲ酶解预处理后并采用培养液Ⅱ-Ⅱ-3进行对比培养，培养7天获得的3个乳腺癌类器官的光镜图顺次为图11b、图12b和图13b。

通过对比分析可知，添加自源条件培养基的培养液Ⅱ-Ⅱ更利于类器官的生长，相同培养时间（7天）下，类器官直径显著高于使用培养液Ⅰ的实验组。

对比例2

本对比例2为乳腺癌类器官培养试剂组合对比例，其中，乳腺癌类器官培养液为实施例3中的培养液Ⅱ-Ⅱ，酶解液采用如下对比酶解液，含有1.5 mg/mL Ⅳ型胶原酶，20 μg/mL透明质酸酶和1%双抗（青霉素-链霉素）的Advanced DMEM/F12。

采用对比例2的乳腺癌类器官培养试剂组合进行乳腺癌类器官的培养，培养方法同实施例5的培养方法，不同的是，步骤S302中的酶解液采用该对比例2酶解液，且酶解时间为50min；其余步骤及参数与实施例5均相同。如图14所示，为采用步骤S304的方法，培养14天后的乳腺癌类器官，可见，对比例2方法获得的类器官数量少，直径小，传代培养周期长。

本申请实施例中，对实施例5中的乳腺癌类器官Ⅱ-Ⅱ-Ⅲ和对比例1中的对比乳腺癌类器官分别进行了上皮标志蛋白E-cadherin的表达检测，检测结果如图15所示的上皮标志蛋白E-cadherin的相对表达量柱状图；其中，灰色柱对应实施例5的乳腺癌类器官Ⅱ-Ⅱ-Ⅲ，黑色柱对应对比例1中的对比乳腺癌类器官。可见，培养液中加入了自源条件培养基后，上皮标志蛋白E-cadherin的表达量有显著下降。

本申请实施例中，对实施例5中的乳腺癌类器官Ⅱ-Ⅱ-Ⅲ和对比例1中的对比乳腺癌类器官分别进行了间质标志蛋白vimentin的表达检测，检测结果如图16所示的间质标志蛋白vimentin的相对表达量柱状图；其中，灰色柱对应实施例5的乳腺癌类器官Ⅱ-Ⅱ-Ⅲ，黑色柱对应对比例1中的对比乳腺癌类器官。可见，培养液中加入了自源条件培养基后，间质标志蛋白vimentin的表达量有显著升高，表明自源条件培养基有利于维持细胞的间质特性。

本申请实施例中，对实施例5中获得的原代乳腺癌类器官（例如，乳腺癌类器官Ⅱ-Ⅱ-Ⅲ），采用实施例6中的传代方法，进行传代培养，并进行至9次传代，获得第10代乳腺癌类器官。其中，实施例5中的原代培养以及实施例6中的传代培养中均采用实施例3的培养液Ⅱ-Ⅱ。对每次传代培养8天后获得的乳腺癌类器官进行了鉴定。鉴定方法为：将乳腺癌肿瘤组织样本和该样本形成的类器官HE染色。

如图17所示的由乳腺癌组织标本培养获得的乳腺癌类器官，传代培养10代后的类器官HE染色结果；以及图18所示的实施例5中进行原代乳腺癌类器官培养用的乳腺癌肿瘤组织样本（即同源肺癌组织）的HE染色结果图。可见，乳腺癌类器官与同源肿瘤组织的HE染色结果相同。

本申请实施例中，在不做特殊说明时，涉及百分比浓度时均为体积百分比浓度。

以上描述和附图充分地示出了本申请的实施例，以使本领域的技术人员能够实践它们。其他实施例可以包括结构的以及其他的改变。实施例仅代表可能的变化。除非明确要求，否则单独的部件和功能是可选的，并且操作的顺序可以变化。一些实施例的部分和特征可以被包括在或替换其他实施例的部分和特征。本申请的实施例并不局限于上面已经描述并在附图中示出的结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本申请的范围仅由所附的权利要求来限制。

Claims (10)

1.一种乳腺癌类器官培养液，其特征在于，包括完全培养基和自源条件培养基，所述完全培养基与所述自源条件培养基的体积比为1～3﹕1；

其中，所述完全培养基包括条件培养基、基础培养基、复合抗生素和生长因子；所述基础培养基包括优化后的杜氏改良Eagle培养基/营养混合物F-12， 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸5～15 mM和Glutamax 0.5x～1.5x；所述复合抗生素包括Primocin 50～500 μg/mL，青霉素-链霉素0.5x～1.5x和甲硝唑2～10 μg/mL；所述生长因子包括：表皮细胞生长因子10～100 ng/mL，成纤维细胞生长因子10 10～100 ng/mL，B27 0.25x～1.5x，乙酰半胱氨酸 1～2 mM，烟酰胺5～20 mM，Y-27632 5～15 μM，β-雌二醇50～200 nM，Heregulin蛋白家族β1型蛋白3～10 nM，所述条件培养基包括两种或三种蛋白条件培养基，其中所述蛋白条件培养基选自Wnt蛋白家族3a型蛋白条件培养基，R-spondin蛋白家族1型蛋白条件培养基和头蛋白条件培养基；

自源条件培养基是利用肿瘤相关成纤维细胞培养基对乳腺癌组织提取的自源肿瘤纤维细胞进行培养获得；且所述自源条件培养基中至少包括自源生长因子、自源白介素因子、自源趋化因子，自源基质金属蛋白酶和其他自源因子；所述其他自源因子包括SDF1、VEGFA、TGFβ、PDGFα和PGE2。

2.根据权利要求1所述的乳腺癌类器官培养液，其特征在于，所述生长因子包括：所述生长因子包括：表皮细胞生长因子 50 ng/mL，成纤维细胞生长因子10 50 ng/mL，B270.75x～1x，乙酰半胱氨酸1.25～1.5 mM，烟酰胺 8～10 mM，Y-27632 8～10 μM，β-雌二醇150 nM, Heregulin蛋白家族β1型蛋白 5 nM。

3.根据权利要求1所述的乳腺癌类器官培养液，其特征在于，

所述复合抗生素包括Primocin 100 μg/mL，青霉素-链霉素1x和甲硝唑4 μg/mL。

4.根据权利要求1、2或3所述的乳腺癌类器官培养液，其特征在于，

所述条件培养基包括Wnt蛋白家族3a型蛋白条件培养基，R-spondin蛋白家族1型蛋白条件培养基和头蛋白条件培养基；且所述Wnt蛋白家族3a型蛋白条件培养基、所述R-spondin蛋白家族1型蛋白条件培养基和所述头蛋白条件培养基的体积比依次为0.1～0.8﹕1～2﹕1；

或者，所述条件培养基包括R-spondin蛋白家族1型蛋白条件培养基和头蛋白条件培养基；且所述R-spondin蛋白家族1型蛋白条件培养基和所述头蛋白条件培养基的体积比为1～2﹕1。

5.根据权利要求1、2或3所述的乳腺癌类器官培养液，所述自源条件培养基是通过以下培养方法获得的：

提取自源肿瘤相关成纤维细胞，传代并建系，获得自源肿瘤纤维细胞；

采用肿瘤相关成纤维细胞培养基对所述自源肿瘤纤维细胞进行培养；其中，所述肿瘤相关成纤维细胞培养基包括：DMEM基础培养基+5%血清+3%PS；

培养3天至5天后，收集培养基，并对收集的培养基进行离心处理，获得自源条件培养基。

6.一种乳腺癌类器官培养试剂组合，其特征在于，包括：酶解液和如权利要求1至5中任一项所述的乳腺癌类器官培养液；所述酶解液包括基础培养基、Ⅰ型胶原酶、Ⅲ型胶原酶和Primocin；其中，所述Ⅰ型胶原酶的浓度为0.1～2 mg/mL，所述Ⅲ型胶原酶的浓度为0.1～1mg/mL，所述Primocin的浓度为0.2～2 mg/mL；所述乳腺癌类器官培养液与所述酶解液独立包装。

7.根据权利要求6所述的乳腺癌类器官培养试剂组合，其特征在于，所述酶解液，包括基础培养基、Ⅰ型胶原酶、Ⅲ型胶原酶和Primocin；其中，所述Ⅰ型胶原酶的浓度为1.5mg/mL，所述Ⅲ型胶原酶的浓度为0.5mg/mL，所述Primocin的浓度为1.5 mg/mL。

8.一种乳腺癌类器官的培养方法，其特征在于，包括：

将乳腺癌样本进行物理预处理，得到样本组织碎块；

将所述样本组织碎块进行酶解预处理获得酶解混合液，将所述酶解混合液离心处理，获得细胞团块沉淀；

采用基质胶重悬所述细胞团块沉淀，获得混有细胞的凝胶；然后将所述凝胶接种于培养孔，于37℃细胞培养箱静置培养，使得所述凝胶凝固；

向培养孔内加入如权利要求1至5中任一项所述的乳腺癌类器官培养液进行培养，获得原代乳腺癌类器官；

将所述原代乳腺癌类器官进行传代培养，所述传代培养过程中采用如权利要求1至5中任一项所述的乳腺癌类器官培养液进行培养，每次传代培养的培养周期为5～7天，获得相应代乳腺癌类器官。

9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述酶解预处理，包括：

向所述样本组织碎块加入如权利要求6或7所述的乳腺癌类器官培养试剂组合中的酶解液，在37℃ 摇床、200 r/min的条件下，孵育至显微镜下可见细胞团块；然后加入酶解中止剂，中止酶解后，获得酶解混合液。

10.根据权利要求8或9所述的培养方法，其特征在于，还包括：

用基质胶包埋获得的所述乳腺癌类器官，采用Advanced DMEM/F12培养基吹散后，离心处理，获得基质胶与细胞混合沉淀；

将所述混合沉淀用细胞解离试剂重悬获得重悬液；将所述重悬液置于37℃水浴8～10min；然后向重悬液中加入两倍体积的4℃的优化后的杜氏改良Eagle培养基/营养混合物F-12培养基，混匀后，离心处理，获得二次细胞沉淀；

将所述二次细胞沉淀采用冻存液重悬，然后使用程序性梯度降温盒进行冻存；一天后转移至液氮中进行长期保存；其中，所述二次细胞沉淀与所述冻存液的重悬比例为每1×10⁵～5×10⁶个细胞团用1 mL冻存液重悬。

Images