CN111411083B - 一种胃癌类器官的培养基及培养方法 - Google Patents

一种胃癌类器官的培养基及培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111411083B
CN111411083B CN202010323731.5A CN202010323731A CN111411083B CN 111411083 B CN111411083 B CN 111411083B CN 202010323731 A CN202010323731 A CN 202010323731A CN 111411083 B CN111411083 B CN 111411083B
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture medium
gastric cancer
culture
sterile water
specific additive
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010323731.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111411083A (zh
Inventor
王哲君
李刚
徐丛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Accurate International Biotechnology Guangzhou Co ltd
Original Assignee
Accurate International Biotechnology Guangzhou Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Accurate International Biotechnology Guangzhou Co ltd filed Critical Accurate International Biotechnology Guangzhou Co ltd
Priority to CN202010323731.5A priority Critical patent/CN111411083B/zh
Publication of CN111411083A publication Critical patent/CN111411083A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111411083B publication Critical patent/CN111411083B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/345—Gastrin; Cholecystokinins [CCK]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/405—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclins, cyclin-dependant kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种胃癌类器官的培养基及培养方法，该培养基包括基础培养基1640、特异性添加因子和无菌水；其中，所述基础培养基1640和所述无菌水的质量比为：99:1；所述特异性添加因子包括：不含维生素A的B27、N‑acetylcysteine、EGF、Noggin、R‑spondin 1、Wnt3a、CHIR99021、thiazovivin、Gastrin I、丙戊酸、青霉素链霉素混合液、两性霉素B、Primocin。采用该培养基进行胃癌类器官的培养，能够维持原发组织的形态结构和基因特征，有效降低胃癌培养中的微生物污染风险，提高胃癌类器官培养的成功率和存活率。

Description

一种胃癌类器官的培养基及培养方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及培养基及其应用，更具体涉及一种胃癌类器官的培养基及培养方法。
背景技术
胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，是我国常见恶性肿瘤之一。胃癌可发生于胃的任何部位，其中半数以上发生于胃窦部，胃大弯、胃小弯及前后壁均可受累。绝大多数胃癌属于腺癌，早期无明显症状，或出现上腹不适、嗳气等非特异性症状，常与胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病症状相似，易被忽略，因此，目前我国胃癌的早期诊断率仍较低，绝大多数胃癌被确诊时已是中晚期。目前，胃癌的治疗仍旧以手术为主，同时辅以化疗等以巩固治疗效果。虽然近年来医学界在胃癌靶向治疗、免疫治疗等综合治疗方面取得了不错的进展，但总体预后并不乐观。
根据目前研究，胃癌主要的病因是由多种因素共同造成的结果，其中最常见的病因是包括有幽门螺旋杆菌的感染，以及癌前病变，或者是遗传因素，环境以及饮食的因素变化而导致的。肿瘤的发生发展机制错综复杂，建立一套科学严谨的肿瘤研究模型不但有利于肿瘤的基础研究，而且有助于肿瘤的诊断与治疗。类器官是衍生于干细胞或前体细胞的器官特异性细胞集合。体外培养的类器官在细胞成分和组织架构上与对应器官高度相似，并具备相应的功能学特征。与常规细跑培养在二维环境中培养单一细胞类群不同，类器官培养是在三维环境中培养出特定组织器官包含的多种细胞类群，其培养体系与体内微环境更为相似。因此，在各种器官生理病理的基础研究、精准医疗、药物筛选和开发、基因治疗、再生医学等方面，显示出巨大的应用前景。
虽然多种肿瘤组织使用不同的方法、不同的培养条件下可在体外成功培养成功为类器官，但是目前关于胃癌肿瘤类器官的培养方法的研究及报道较少，尤其是类器官培养基配方尚无太多报道。
发明内容
有鉴于此，有必要针对现有技术存在的问题，提供一种胃癌类器官的培养基及培养方法。本发明的技术方案为：
第一个方面，本发明提供一种胃癌类器官的培养基，包括基础培养基1640、特异性添加因子和无菌水；其中，所述基础培养基1640和所述无菌水的质量比为：99:1；所述特异性添加因子包括：不含维生素A的B27，1-5×；N-acetylcysteine，0.2-5μM；EGF，10-100ng/ml；Noggin，20-500ng/ml；R-spondin 1，100-1000ng/ml；Wnt3a，50-200ng/ml；CHIR99021，1-10μM；thiazovivin，0.5-5μM；Gastrin I，5-50ng/ml；丙戊酸，0.2-5mM；青霉素链霉素混合液，0.8-2×；两性霉素B，0.5-5μg/ml；Primocin，0.5-5mg/ml；上述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的浓度为准。
优选的，所述培养基包括基础培养基1640、特异性添加因子和无菌水；其中，所述基础培养基1640和所述无菌水的质量比为：99:1；所述特异性添加因子包括：不含维生素A的B27，1-2×；N-acetylcysteine，1-2μM；EGF，50-80ng/ml；Noggin，100-200ng/ml；R-spondin 1，200-500ng/ml；Wnt3a，100-150ng/ml；CHIR99021，5μM；thiazovivin，2μM；Gastrin I，20-30ng/ml；丙戊酸，1-4mM；青霉素链霉素混合液，1×；两性霉素B，2μg/ml；Primocin，2mg/ml。
进一步的，所述培养基的pH为4.5-6.0。
进一步的，所述培养基的制备方法为：将特异性添加因子用无菌水配制成混合母液，然后加入到基础培养基1640中既得。
第二个方面，本发明提供一种胃癌类器官的培养方法，包括以下步骤：
1)将新鲜来源为胃癌的手术切除标本或活检组织进行预处理，得到细胞数量为3-50个细胞的细胞团后，离心去除上清，细胞团沉淀备用；
2)将上述培养基与基质胶混合均匀后重悬步骤1)得到的细胞团沉淀，获得混有细胞的凝胶，将该凝胶接种；
3)待步骤2)的接种凝胶充分凝固后加入上述培养基，并于37℃、5％CO2浓度下培养；
4)每隔2-3天更换一次上述培养基，培养4-10天，得到胃癌类器官。
本发明的有益效果是：
①本发明的培养基组分中不需要加入细胞培养中最常见的组分牛血清白蛋白(FBS)，节约成本的同时降低了FBS中带来的细胞毒性和抑制物。
②本发明培养基加入酸性物质，最大程度的模拟了体内生长环境，培养的胃癌类器官维持了原发组织的形态结构和基因特征。
③本发明能够有效降低胃癌培养中的微生物污染风险，提高胃癌类器官培养的成功率和存活率。
附图说明
图1为本发明实施例5中为胃癌类器官光学显微镜图。
图2为本发明实施例6中为胃癌类器官光学显微镜图。
图3为本发明实施例9中为胃癌类器官组织形态结构图。
具体实施方式
本发明实施例采用的100×青霉素链霉素混合液购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
本发明实施例采用的两性霉素B购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
本发明实施例采用的不含维生素A的B27购自赛默飞世尔科技有限公司。
本发明实施例采用的N-acetylcysteine购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的EGF购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的Noggin购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的R-spondin 1购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的Wnt3a购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的CHIR99021购自美国MedChemExpress公司。
本发明实施例采用的thiazovivin购自美国MedChemExpress公司。
本发明实施例采用的Gastrin I购自美国MedChemExpress公司。
本发明实施例采用的丙戊酸购自上海麦克林生化科技有限公司。
本发明实施例采用的Primocin购自美国Invivogen公司。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
本实施例提供一种胃癌类器官的培养基，包括基础培养基1640、特异性添加因子和无菌水；其中，所述基础培养基1640和所述无菌水的质量比为：99:1；所述特异性添加因子包括：不含维生素A的B27，1×；N-acetylcysteine，2μM；EGF，50ng/ml；Noggin，200ng/ml；R-spondin 1，200ng/ml；Wnt3a，100ng/ml；CHIR99021，5μM；thiazovivin，2μM；Gastrin I，20ng/ml；丙戊酸，4mM；青霉素链霉素混合液，1×；两性霉素B，2μg/ml；Primocin，2mg/ml；上述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基1640与无菌水的混合液中的浓度为准。
实施例2
本实施例提供一种胃癌类器官的培养基，包括基础培养基1640、特异性添加因子和无菌水；其中，所述基础培养基1640和所述无菌水的质量比为：99:1；所述特异性添加因子包括：不含维生素A的B27，2×；N-acetylcysteine，1μM；EGF，80ng/ml；Noggin，150ng/ml；R-spondin 1，400ng/ml；Wnt3a，150ng/ml；CHIR99021，5μM；thiazovivin，2μM；Gastrin I，25ng/ml；丙戊酸，2mM；青霉素链霉素混合液，1×；两性霉素B，2μg/ml；Primocin，2mg/ml；上述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的浓度为准。
实施例3
本实施例提供一种胃癌类器官的培养基，包括基础培养基1640、特异性添加因子和无菌水；其中，所述基础培养基1640和所述无菌水的质量比为：99:1；所述特异性添加因子包括：不含维生素A的B27，1.5×；N-acetylcysteine，4.5μM；EGF，80ng/ml；Noggin，250ng/ml；R-spondin 1，150ng/ml；Wnt3a，150ng/ml；CHIR99021，2.5μM；thiazovivin，2.5μM；Gastrin I，40ng/ml；丙戊酸，1.5mM；青霉素链霉素混合液，2×；两性霉素B，2.5μg/ml；Primocin，2.5mg/ml；上述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的浓度为准。
实施例4
本实施例提供一种胃癌类器官的培养基，包括基础培养基1640、特异性添加因子和无菌水；其中，所述基础培养基1640和所述无菌水的质量比为：99:1；所述特异性添加因子包括：不含维生素A的B27，2×；N-acetylcysteine，0.5μM；EGF，50ng/ml；Noggin，100ng/ml；R-spondin 1，800ng/ml；Wnt3a，100ng/ml；CHIR99021，8μM；thiazovivin，1.5μM；Gastrin I，25ng/ml；丙戊酸，0.5mM；青霉素链霉素混合液，1.2×；两性霉素B，0.8μg/ml；Primocin，1mg/ml；上述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的浓度为准。
实施例5
本实施例提供一种胃癌类器官的培养方法，包括：
1)将新鲜的胃癌手术切除标本装入准备好的含有5％双抗的1640培养基中保存，12小时内送入实验室预处理。
2)样本洗涤：将组织转入15ml离心管中，然后用5ml含有5％双抗的1640培养基震荡洗涤30秒，去掉上清，重新加入5ml含有5％双抗的1640培养基洗涤。按照上述方法反复洗涤3次去除组织表面的杂质。
3)样本剪切：在生物安全柜中，将样本转移至6cm培养皿，用已消毒的手术剪在冰上操作将组织剪碎至大小1-5mm3，剪碎过程不应超过10分钟以避免细胞损伤。
4)组织第一次消化：将剪碎后的组织转移至15ml离心管，加入2ml III型胶原酶和1ml透明质酸酶后在37℃震荡消化60分钟。第一次消化结束后，加入5ml无菌生理盐水终止消化，然后1000rpm离心3min，保留沉淀去除上清。
5)组织第二次消化：将2ml III型胶原酶和1ml透明质酸酶加入至步骤(4)中的沉淀中，重悬混匀后37℃震荡消化60分钟。第二次消化结束后，加入5ml无菌生理盐水终止消化。
6)细胞过滤：将步骤(5)中的消化液用100μm滤网过滤，去除未消化的大组织块。将过滤后的细胞液1000rpm离心5min，小心去除上清得到细胞团沉淀。
7)红细胞裂解：加入2ml红细胞裂解液至步骤(6)中的细胞团沉淀，轻轻吹打重悬细胞沉淀，室温裂解3-5min。
8)细胞收集：将步骤(6)中的液体1000rpm离心5min，小心去除上清得到细胞团沉淀备用。
9)取适量实施例1的培养基与基质胶等比混合，然后用混合液重悬步骤8)得到的细胞团沉淀，再用移液器将混有细胞的凝胶滴到60mm培养皿中，每滴约50ul。
10)将接种胶滴后的培养皿放入CO2培养箱内静置2min，轻晃胶滴无明显流动后小心倒扣，待其充分凝固30min。
11)在培养皿内加入实施例1的培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养。
12)每隔2天更换一次培养基，培养6天后可得到胃癌类器官，在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图1所示。
实施例6
本实施例提供一种胃癌类器官的培养方法，包括：
1)将新鲜的胃癌活检组织装入准备好的含有5％双抗的1640培养基中保存，12小时内送入实验室预处理。
2)样本洗涤：将组织转入15ml离心管中，然后用5ml含有5％双抗的1640培养基震荡洗涤30秒，去掉上清，重新加入5ml含有5％双抗的1640培养基洗涤。按照上述方法反复洗涤3次去除组织表面的杂质。
3)样本剪切：在生物安全柜中，将样本转移至6cm培养皿，用已消毒的手术剪在冰上操作将组织剪碎至大小1-5mm3，剪碎过程不应超过10分钟以避免细胞损伤。
4)组织第一次消化：将剪碎后的组织转移至15ml离心管，加入2ml III型胶原酶和1ml透明质酸酶后在37℃震荡消化60分钟。第一次消化结束后，加入5ml无菌生理盐水终止消化，然后1000rpm离心3min，保留沉淀去除上清。
5)组织第二次消化：将2ml III型胶原酶和1ml透明质酸酶加入至步骤(4)中的沉淀中，重悬混匀后37℃震荡消化60分钟。第二次消化结束后，加入5ml无菌生理盐水终止消化。
6)细胞过滤：将步骤(5)中的消化液用100μm滤网过滤，去除未消化的大组织块。将过滤后的细胞液1000rpm离心5min，小心去除上清得到细胞团沉淀备用。
7)取适量实施例2的培养基与基质胶等比混合，然后用混合液重悬步骤6)得到的细胞团沉淀，再用移液器将混有细胞的凝胶滴到60mm培养皿中，每滴约50ul。
8)将接种胶滴后的培养皿放入CO2培养箱内静置2min，轻晃胶滴无明显流动后小心倒扣，待其充分凝固30min。
9)在培养皿内加入实施例2的培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养。
10)每隔3天更换一次培养基，培养10天后可得到胃癌类器官，在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图2所示。
实施例7
本实施例提供一种胃癌类器官的培养方法，包括：
1)将新鲜的胃癌手术切除标本装入准备好的含有5％双抗的1640培养基中保存，12小时内送入实验室预处理。
2)样本洗涤：将组织转入15ml离心管中，然后用5ml含有5％双抗的1640培养基震荡洗涤30秒，去掉上清，重新加入5ml含有5％双抗的1640培养基洗涤。按照上述方法反复洗涤3次去除组织表面的杂质。
3)样本剪切：在生物安全柜中，将样本转移至6cm培养皿，用已消毒的手术剪在冰上操作将组织剪碎至大小1-5mm3，剪碎过程不应超过10分钟以避免细胞损伤。
4)组织第一次消化：将剪碎后的组织转移至15ml离心管，加入2ml III型胶原酶和1ml透明质酸酶后在37℃震荡消化60分钟。第一次消化结束后，加入5ml无菌生理盐水终止消化，然后1000rpm离心3min，保留沉淀去除上清。5)组织第二次消化：将2ml III型胶原酶和1ml透明质酸酶加入至步骤(4)中的沉淀中，重悬混匀后37℃震荡消化60分钟。第二次消化结束后，加入5ml无菌生理盐水终止消化。
6)细胞过滤：将步骤(5)中的消化液用100μm滤网过滤，去除未消化的大组织块。将过滤后的细胞液1000rpm离心5min，小心去除上清得到细胞团沉淀。
7)红细胞裂解：加入2ml红细胞裂解液至步骤(6)中的细胞团沉淀，轻轻吹打重悬细胞沉淀，室温裂解3-5min。
8)细胞收集：将步骤(6)中的液体1000rpm离心5min，小心去除上清得到细胞团沉淀备用。
9)取适量实施例3的培养基与基质胶等比混合，然后用混合液重悬步骤8)得到的细胞团沉淀，再用移液器将混有细胞的凝胶滴到60mm培养皿中，每滴约50ul。
10)将接种胶滴后的培养皿放入CO2培养箱内静置2min，轻晃胶滴无明显流动后小心倒扣，待其充分凝固30min。
11)在培养皿内加入实施例3的培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养。
12)每隔2天更换一次培养基，培养7天后可得到胃癌类器官。
实施例8
本实施例提供一种胃癌类器官的培养方法，包括：
1)将新鲜的胃癌活检组织装入准备好的含有5％双抗的1640培养基中保存，12小时内送入实验室预处理。
2)样本洗涤：将组织转入15ml离心管中，然后用5ml含有5％双抗的1640培养基震荡洗涤30秒，去掉上清，重新加入5ml含有5％双抗的1640培养基洗涤。按照上述方法反复洗涤3次去除组织表面的杂质。
3)样本剪切：在生物安全柜中，将样本转移至6cm培养皿，用已消毒的手术剪在冰上操作将组织剪碎至大小1-5mm3，剪碎过程不应超过10分钟以避免细胞损伤。
4)组织第一次消化：将剪碎后的组织转移至15ml离心管，加入2ml III型胶原酶和1ml透明质酸酶后在37℃震荡消化60分钟。第一次消化结束后，加入5ml无菌生理盐水终止消化，然后1000rpm离心3min，保留沉淀去除上清。
5)组织第二次消化：将2ml III型胶原酶和1ml透明质酸酶加入至步骤(4)中的沉淀中，重悬混匀后37℃震荡消化60分钟。第二次消化结束后，加入5ml无菌生理盐水终止消化。
6)细胞过滤：将步骤(5)中的消化液用100μm滤网过滤，去除未消化的大组织块。将过滤后的细胞液1000rpm离心5min，小心去除上清得到细胞团沉淀备用。
7)取适量实施例4的培养基与基质胶等比混合，然后用混合液重悬步骤6)得到的细胞团沉淀，再用移液器将混有细胞的凝胶滴到60mm培养皿中，每滴约50ul。
8)将接种胶滴后的培养皿放入CO2培养箱内静置2min，轻晃胶滴无明显流动后小心倒扣，待其充分凝固30min。
9)在培养皿内加入实施例4的培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养。
10)每隔3天更换一次培养基，培养10天后可得到胃癌类器官。
实施例9
胃癌类器官形态鉴定
将实施例5获得胃癌类器官进行石蜡包埋切片制备。将包埋好的类器官进行切片，然后进行HE染色观察。
1)类器官收集与固定：投入预先配好的固定液中(4％的甲醛固定)固定2小时。完成固定后1200rpm离心5分钟，弃去福尔马林固定液。
2)梯度脱水：将固定后的类器官依次浸入85％酒精、95％酒精和100％酒精各30分钟。
3)透明浸蜡：加入二甲苯没过类器官处理20分钟，重复两次；然后加入石蜡，在60℃浸蜡1.5小时。
4)包埋切片：用包埋模具包类器官，然后切片机切成4-6μm的切片贴于防脱载玻片。
5)烤片：将载玻片放置在玻片架上，放入烘箱中，65℃，30min，将载玻片上的水分烤干、石蜡烤融即可。
6)脱蜡：使用二甲苯脱蜡三次，每次10分钟；然后用100％酒精浸洗三次，每次1分钟；最后用流水浸洗1分钟。
7)H&E染色：先用苏木素染色8min，然后水洗1min，接着用1％盐酸酒精分化1-2秒钟，然后再用流水冲洗30min，再接着用1％伊红浸染1-2min，最后用流水冲洗1min。
8)染色后固定：依次浸入95％酒精和100％酒精，每种试剂各两次，每次2分钟。
9)透明及封固：使用二甲苯透明2min，取出晾干后用中性树胶封固。
10)在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图3所示。
对比例1
本对比例提供的培养基中不添加Gastrin I，其他同实施例1。
使用上述培养基按照实施例5方法进行胃癌细胞类器官培养。
结果在步骤(12)培养4天后发现胃癌类器官生长缓慢，6天后将细胞进行收集，然后用台盼蓝染色计数，细胞总数量、活细胞比例显著少于实施例5。这说明特异性添加剂Gastrin I有利于胃癌类器官细胞生长。
对比项 活细胞数量 细胞总数 活细胞比例
实施例5 6.6×10<sup>7</sup> 7.2×10<sup>7</sup> 91.67％
对比例1 5.8×10<sup>6</sup> 8.9×10<sup>6</sup> 65.17％
对比例2
本对比例提供的培养基中不添加丙戊酸，其他同实施例1。
使用上述培养基按照实施例5方法进行胃癌细胞类器官培养。
结果在步骤(12)培养4天后发现胃癌类器官生长状态差，细胞呈现出平铺式单层结构，无法形成正常的分化状球形类器官结构。这说明特异性添加剂丙戊酸有利于胃癌类器官生长结构的维持有重要作用。
对比例3
本对比例提供的培养基中不添加两性霉素B和Primocin，其他同实施例1。
使用上述培养基按照实施例5方法进行10皿胃癌类器官培养。
结果在步骤(12)培养4天后，有2个培养皿出现培养基变浑浊，出现些许白色漂浮物，在普通光学显微镜下观察到细胞间出现树枝状真菌菌丝结构，培养失败。培养7天后，有3个培养皿出现生长缓慢，破碎细胞多导致培养失败的情况，取样用支原体检测试剂盒进行支原体检测，结果为阳性。这说明两性霉素B和Primocin的添加有效降低胃癌培养中的微生物污染风险，提高胃癌类器官培养的成功率和存活率。
对比例4
将实施例1的培养基用于直肠癌类器官的培养，参照实施例5)培养10天后，直肠癌细胞生长缓慢，在普通光学显微镜下只能看到少量细胞，无法观察到正常直肠癌类器官结构。
对比例5
将实施例1的培养基用于结肠癌类器官的培养，参照实施例5)培养10天后，结肠癌细胞生长缓慢，在普通光学显微镜下只能看到少量细胞，无法观察到正常结肠癌类器官结构。
综上，本发明的培养基适用于胃癌类器官培养，组分中不需要加入细胞培养中最常见的组分牛血清白蛋白(FBS)，节约成本的同时降低了FBS中带来的细胞毒性和抑制物。本发明的培养基适合胃癌类器官的培养，培养的胃癌类器官维持了原发组织的形态结构和基因特征。此外，本发明的培养基能够有效降低胃癌培养中的微生物污染风险，提高胃癌类器官培养的成功率和存活率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种胃癌类器官的培养基，其特征在于：由基础培养基1640、特异性添加因子和无菌水组成；所述培养基的pH为4.5-6.0；其中，所述基础培养基1640和所述无菌水的质量比为：99:1；所述特异性添加因子由以下组分构成：不含维生素A的B27，1-5×；N-acetylcysteine，0.2-5μM；EGF，10-100ng/ml；Noggin，20-500ng/ml；R-spondin 1，100-1000ng/ml；Wnt3a，50-200ng/ml；CHIR99021，1-10μM；thiazovivin，0.5-5μM；GastrinI，5-50ng/ml；丙戊酸，0.2-5mM；青霉素链霉素混合液，0.8-2×；两性霉素B，0.5-5μg/ml；Primocin，0.5-5mg/ml；上述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的浓度为准。
2.根据权利要求1所述的一种胃癌类器官的培养基，其特征在于：所述培养基包括基础培养基1640、特异性添加因子和无菌水组成；其中，所述基础培养基1640和所述无菌水的质量比为：99:1；所述特异性添加因子由以下组分构成：不含维生素A的B27，1-2×；N-acetylcysteine，1-2μM；EGF，50-80ng/ml；Noggin，100-200ng/ml；R-spondin 1，200-500ng/ml；Wnt3a，100-150ng/ml；CHIR99021，5μM；thiazovivin，2μM；GastrinI，20-30ng/ml；丙戊酸，1-4mM；青霉素链霉素混合液，1×；两性霉素B，2μg/ml；Primocin，2mg/ml。
3.根据权利要求1或2所述的一种胃癌类器官的培养基，其特征在于：所述培养基的制备方法为：将特异性添加因子用无菌水配制成混合母液，然后加入到基础培养基1640中既得。
4.一种胃癌类器官的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将新鲜来源为胃癌的手术切除标本或活检组织进行预处理，得到细胞数量为3-50个细胞的细胞团后，离心去除上清，细胞团沉淀备用；
2)将权利要求1～3任意一项所述的培养基与基质胶混合均匀后重悬步骤1)得到的细胞团沉淀，获得混有细胞的凝胶，将该凝胶接种；
3)待步骤2)的接种凝胶充分凝固后加入上述培养基，并于37℃、5％CO2浓度下培养；
4)每隔2-3天更换一次权利要求1～3任意一项所述的培养基，培养4-10天，得到胃癌类器官。
CN202010323731.5A 2020-04-22 2020-04-22 一种胃癌类器官的培养基及培养方法 Active CN111411083B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010323731.5A CN111411083B (zh) 2020-04-22 2020-04-22 一种胃癌类器官的培养基及培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010323731.5A CN111411083B (zh) 2020-04-22 2020-04-22 一种胃癌类器官的培养基及培养方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111411083A CN111411083A (zh) 2020-07-14
CN111411083B true CN111411083B (zh) 2020-11-03

Family

ID=71492079

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010323731.5A Active CN111411083B (zh) 2020-04-22 2020-04-22 一种胃癌类器官的培养基及培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111411083B (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114480250B (zh) * 2020-11-12 2023-09-08 四川大学华西医院 构建原位原发胃癌动物模型的方法
CN112481214B (zh) * 2020-11-23 2022-07-05 北京科途医学科技有限公司 滑膜肉瘤类器官的培养方法和培养基以及移植体及其用途
CN112608899B (zh) * 2020-11-23 2024-02-27 广州市达瑞生物技术股份有限公司 一种无血清培养基在培养癌组织起源球状体中的应用
CN115975910A (zh) * 2021-10-15 2023-04-18 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 胃癌类器官的培养基及培养方法
CN114317440A (zh) * 2021-12-28 2022-04-12 佛山市第一人民医院 一种肿瘤类器官形成能力的测定方法
CN114908039A (zh) * 2022-06-17 2022-08-16 浙江弘瑞医疗科技有限公司 胃癌类器官的培养基及其无支架培养方法
CN115181730B (zh) * 2022-07-29 2023-05-16 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种胃间质瘤类器官培养基及培养方法
CN115369090A (zh) * 2022-09-05 2022-11-22 上海中医药大学马鞍山康复研究院 一种制备同源胃癌类器官的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ713219A (en) * 2013-03-14 2017-04-28 Massachusetts Inst Technology Compositions and methods for epithelial stem cell expansion and culture

Also Published As

Publication number Publication date
CN111411083A (zh) 2020-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111411083B (zh) 一种胃癌类器官的培养基及培养方法
CN111394314B (zh) 一种肠癌类器官的培养基及培养方法
WO2023274338A1 (zh) 用于快速培养肿瘤类器官的培养基、方法以及试剂盒
CN114317443B (zh) 乳腺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法
JP2023521878A (ja) 食道扁平上皮癌の上皮細胞用の培養培地、培養方法、及びその用途
CN114292816B (zh) 肺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法
CN111471643B (zh) 一种通用型上呼吸道粘膜类器官的培养基及培养方法
CN114790446B (zh) 一种宫颈腺癌类器官培养基及其构建方法
CN113736738B (zh) 一种胃癌微肿瘤细胞模型的培养方法
CN112522201A (zh) 一种膀胱癌类器官的培养基及培养方法
CN113957036B (zh) 一种子宫内膜类器官培养基及培养方法
CN113293133A (zh) 一种人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株及其应用
CN113755441B (zh) 一种肺癌微肿瘤细胞模型的培养方法
CN115232781A (zh) 一种用于培养类器官的水凝胶培养基、制备方法及应用
CN114774359B (zh) 一种宫颈鳞癌类器官培养基及其构建方法
CN116286655A (zh) 一种适用于多种实体瘤类器官培养的培养基及其培养方法
CN112430568B (zh) 一种脐带间充质干细胞饲养上皮来源类器官的方法
CN113817682A (zh) 一种结直肠癌微肿瘤细胞模型的培养方法
CN115181730B (zh) 一种胃间质瘤类器官培养基及培养方法
CN117286108B (zh) 一种乳腺癌类器官专用培养基及培养方法
CN115232792B (zh) 一种用于胸水来源类器官的培养基及培养方法
CN114752566B (zh) 一种肿瘤干细胞筛选和基于肿瘤干细胞的肿瘤类器官构建方法
CN112300996B (zh) 一种脑胶质瘤类器官的3d培养基及其应用
Yang et al. Benchmark for establishment of organoids from gastrointestinal epithelium and cancer based on available consumables and reagents
CN116064389A (zh) 一种制备高纯度外泌体的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Wang Zhejun

Inventor after: Xu Cong

Inventor after: Qiu Pei

Inventor before: Wang Zhejun

Inventor before: Li Gang

Inventor before: Xu Cong

CB03 Change of inventor or designer information