CN115232781A - 一种用于培养类器官的水凝胶培养基、制备方法及应用 - Google Patents

一种用于培养类器官的水凝胶培养基、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于培养类器官的水凝胶培养基、制备方法及应用。一种用于培养类器官的水凝胶培养基，其特征在于，包括醛基化纤维素纳米结晶、明胶、Advanced DMEM/F‑12基础培养液和类器官培养液。该水凝胶培养基能够良好的模拟生物体内的环境，有利于类器官的生长和传代，可以替代一般的基质胶。还可实现只有类器官的细胞大量增殖，其他细胞的比例逐渐减少甚至消失，最终获得纯度较高的类器官。本发明的水凝胶培养基制备方法，具有简单高效的优点。采用该水凝胶培养基进行培养，培养的成功率可达80％以上；同时培养周期短、类器官的细胞直径可达80μm，数量可达107个。

Description

一种用于培养类器官的水凝胶培养基、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于培养类器官的水凝胶培养基、制备方法及应用。
背景技术
结直肠癌是最常见的严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一。在我国结直肠癌的发病率为9.24％，在所有恶性肿瘤中占第四位。而结直肠癌的死亡率为11.77％，在全部恶性肿瘤中占第五位。随着经济的发展、生活水平的提高和生活方式的改变，结直肠癌的发病率还将呈不断上升的趋势。另外，结直肠癌复发转移风险高，超过50％的结直肠癌患者会在根治性治疗后数月到数年内出现不同程度的复发转移。此外，结直肠癌具有高度异质性。其动态结构和物理性质影响肿瘤进展和治疗反应。尽管存在这种多样性，但在过去的几十年中，结直肠研究主要依赖于几种细胞系进行二维培养，这些克隆细胞系无法完全表现结直肠癌异质性，限制了它们在预测临床治疗效果中的应用。同时，，患者来源的异种移植物，将人肿瘤片段直接移植到免疫功能缺陷的小鼠中，虽然它们在很大程度上保留了亲本肿瘤的形态，基因组特征和肿瘤内异质性，但是异种移植模型模型带来了伦理问题，并且是花费大量时间且成本昂贵。
患者来源的肿瘤类器官，从癌症患者组织中生长的亚毫米级三维多细胞结构，在3D基质胶中，已经成为一种有前景的模型，可以有效解决永生化细胞系和异种移植模型的问题。与细胞系相比，类器官模型体现出不同患者间肿瘤异质性，并且相比异种移植模型的效率高花费小。此外，类器官具有维持组织学特征和基因表达的能力，最重要的是，可以在体外精准检测患者对肿瘤的药物反应。从而使其成为抗癌药物临床前评估和潜在的个性化癌症治疗的可靠模型。
目前，类器官的应用因严重依赖小鼠肿瘤基底膜提取物(BME)(市售为Matrigel，Cultrex BME或Geltrex)而受到很大的限制，但是这依然是3D细胞培养的标准。基质胶BME是层粘连蛋白，IV型胶原蛋白，肠他汀，蛋白聚糖和生长因子的凝胶状混合物，由Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞分泌。由于异种化合物(小鼠来源)和残留生长因子的存在，以及BME组成和性质的批次间差异性(每批次细胞生长状态，传代数都不一样)导致BME作为类器官生长基质的可靠性降低。此外，BME不利于其机械性能的改变，这点对于了解肿瘤微环在癌症进展中的作用非常重要。另外，肿瘤对药物的反应，由于BME是一种物理水凝胶，因此它对流动引起的耐受性较差，从而使BME对于药物筛选存在影响。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于培养类器官的水凝胶培养基、制备方法及应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供用于培养类器官的水凝胶培养基，包括醛基化纤维素纳米结晶溶液、明胶溶液和类器官培养液。
进一步，所述醛基化纤维素纳米结晶溶液包括醛基化纤维素纳米结晶、水和HBSS平衡溶液；
所述明胶溶液包括明胶和Advanced DMEM/F-12基础培养液；
所述类器官培养液的成分包括L-谷氨酰胺、青链霉素、MEM NEAA培养基、A83-01、烟酰胺、L-半胱氨酸、人胰岛素、FBS、B27、EGF、人胃泌素以及DMEM/F12基础培养基。
进一步，所述醛基化纤维素纳米结晶的质量占所述水凝胶培养基质量的1wt％，所述明胶的质量占所述水凝胶培养基质量的2wt％。
本发明提供如上述的水凝胶培养基在培养结肠癌或直肠癌类器官中的应用。
本发明提供一种如上述的水凝胶培养基制备方法，先分别制备醛基化纤维素纳米结晶溶液和所述明胶溶液，再将所述醛基化纤维素纳米结晶溶液、所述明胶溶液和所述类器官培养液混合均匀，得到所述水凝胶培养基。
进一步，所述醛基化纤维素纳米结晶溶液中，所述醛基化纤维素纳米结晶的质量百分数为3wt％,所述明胶溶液中，所述明胶的质量百分数为10wt％；所述醛基化纤维素纳米结晶溶液、所述明胶溶液和所述类器官培养液的体积比为5:3:7。
进一步，所述醛基化纤维素纳米结晶溶液的制备包括以下步骤：
S1-1、将1.2g高碘酸加入300ml质量百分数为1wt％的纤维素纳米结晶悬浮液中，并在室温下搅拌2h，得到氧化后的悬浮液；
S1-2、向所述氧化后的悬浮液中加入600μL乙二醇；
S1-3、使用去离子水对所述步骤S1-2得到的悬浮液进行透析；透析时间为14天，并且每天更换两次去离子水；
S1-4、将透析后的混合物进行旋蒸浓缩，旋蒸浓缩后的悬液体积为100ml；
S1-5、将浓度为10×的HBSS平衡溶液添加到所述旋蒸浓缩后的悬液中，使得到所述醛基化纤维素纳米结晶溶液中醛基化纤维素纳米结晶的浓度为3wt％。
进一步，采用涡旋的方法将所述醛基化纤维素纳米结晶溶液、所述明胶溶液和所述类器官培养液混合。
进一步，混合后，将所述水凝胶培养基在紫外灯下灭菌，灭菌时间为至少10min。
本发明还提供结肠癌或直肠癌类器官的培养方法，对结肠癌或直肠癌组织进行消化得到细胞沉淀，再将所述细胞沉淀进行重悬得到细胞溶液；采用上述的水凝胶培养基与所述细胞溶液混合并进行滴胶接种，培养后得到结肠癌类器官或直肠癌类器官。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的用于培养类器官的水凝胶培养基，其成分中含有醛基化纤维素纳米结晶和明胶，使醛基化纤维素纳米结晶中的醛基团能够与明胶中的赖氨酸残基的胺基团形成席夫碱交联的结构，从而在微观上形成适合培养类器官的纤维网络；
(2)本发明的用于培养类器官的水凝胶培养基，能够良好的模拟生物体内的环境，使其更有利于类器官的生长和传代；
(3)本发明的用于培养类器官的水凝胶培养基，可以替代一般的基质胶，并且相比于基质胶具有更好的效果；
(4)本发明的用于培养类器官的水凝胶培养基，可以实现只有类器官的细胞大量增殖，其他细胞的比例逐渐减少甚至消失，最终获得纯度较高的类器官；
(5)本发明的水凝胶培养基制备方法，具有简单高效的优点；
(6)本发明的结肠癌或直肠癌类器官的培养方法，采用水凝胶培养基进行培养，培养的成功率可达80％以上；同时培养周期短、类器官的细胞直径可达80μm，数量可达107个。
附图说明
图1为本发明用于培养类器官水凝胶培养基的电子显微镜微观图；
图2为基质胶BME的电子显微镜微观图；
图3为本发明用于培养类器官水凝胶培养基，实施例1中，采用水凝胶培养基培养的类器官的倒置显微镜图；
图4为本发明用于培养类器官水凝胶培养基，对比例1中，采用基质胶BME培养的类器官的倒置显微镜图；
图5为采用本发明用于培养类器官水凝胶培养基培养的类器官的HE染色对比图，其中，图5A为实施例1的样品病理组织的HE染色图，图5B为实施例1培养的类器官的HE染色图，图5C为对比例1培养的类器官的HE染色图；
图6为本发明用于培养类器官水凝胶培养基，实施例1的样品病理组织、实施例1和对比例1培养的类器官的免疫组化染色鉴定对比图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明的用于培养类器官的水凝胶培养基，包括醛基化纤维素纳米结晶、明胶溶液和类器官培养液；所述明胶溶液为明胶与Advanced DMEM/F-12基础培养液的混合溶液。
本发明的水凝胶培养基，可以替代一般的基质胶，如BME。醛基化纤维素纳米结晶中的醛基团(式1)能够与明胶中的赖氨酸残基的胺基团(式2)形成席夫碱交联的结构(式3)，从而在微观上形成纤维网络。
如图1所示，本发明的水凝胶培养基的纤维网络与图2所示的BME相比，具有更大的孔洞，这样的纤维网络与生物体内肿瘤ECM纤维中胶原蛋白的结构相似。因此，采用该水凝胶培养基能够良好的模拟生物体内的环境，使其更有利于类器官的生长和传代。
另外，类器官培养采用的组织样品中往往会掺杂一些其他细胞，这些细胞在一般的培养基中也会生长，造成与类器官的营养竞争，导致类器官生长不良；而采用本发明的水凝胶培养基进行培养，可以实现只有类器官的细胞大量增殖，其他细胞的比例逐渐减少甚至消失，最终获得纯度较高的类器官。
Figure BDA0003720399220000061
优选的，在水凝胶培养基中，醛基化纤维素纳米结晶的质量百分数为1wt％，明胶的质量百分数为2wt％；该配比的水凝胶培养基，与生物体内肿瘤ECM纤维中胶原蛋白的结构最为相似，能够良好的模拟体内环境。
优选的，类器官培养液采用的是常规的培养液，一般来说包括各种细胞生长所需的因子、抗菌成分、缓冲成分。在本发明的一个实施例中，类器官的培养液成分包括L-谷氨酰胺(Gluta MAX)、青链霉素(Penicillin-Streptomycin)、MEM NEAA培养基、A83-01、烟酰胺(Nicotinamide)、L-半胱氨酸(N-acety-l-cystein)、人胰岛素(Insulin human)、FBS、B27、EGF、人胃泌素([Leu15]-GastrinI human)以及DMEM/F12基础培养基。
本发明的水凝胶培养基可应用在培养结直肠癌类器官中。
本发明的水凝胶培养基制备方法，先分别制备醛基化纤维素纳米结晶溶液、明胶溶液和所述类器官培养液，再将醛基化纤维素纳米结晶溶液、明胶溶液和类器官培养液进行涡旋混合，得到水凝胶培养基。
优选的，醛基化纤维素纳米结晶溶液的浓度为3wt％,明胶溶液的浓度为10wt％；醛基化纤维素纳米结晶溶液、明胶溶液和所述类器官培养液的体积比为5：3：7。
醛基化纤维素纳米结晶溶液的制备包括以下步骤：
S1-1、将1.2g高碘酸加入300ml质量百分数为1wt％的纤维素纳米结晶悬浮液中，并在室温下搅拌2h，得到氧化后的悬浮液；
S1-2、向所述氧化后的悬浮液中加入600μL乙二醇；
S1-3、使用去离子水对所述步骤S1-2得到的悬浮液进行透析；透析时间为14天，并且每天更换两次去离子水；
S1-4、将透析后的混合物进行旋蒸浓缩，旋蒸浓缩后的悬液体积为100ml；
S1-5、将浓度为10×的HBSS平衡溶液添加到旋蒸浓缩后的悬液中，使得到所述醛基化纤维素纳米结晶溶液中醛基化纤维素纳米结晶的浓度为3wt％。
一般来说，HBSS缓冲液按大约1:10的体积比添加到旋蒸浓缩后的悬液中，即可得到浓度为3wt％的醛基化纤维素纳米结晶溶液，具体的用量可进行微调，只要最终的浓度为3wt％即可。
本步骤的目的是为了调节醛基化纤维素纳米结晶溶液的离子强度。
涡旋混合后，将水凝胶培养基在紫外灯下灭菌，灭菌时间为至少10min。
本发明的结直肠癌类器官的培养方法，对结肠癌或直肠癌组织进行消化得到细胞沉淀，再将细胞沉淀进行重悬得到细胞溶液；采用上述的水凝胶培养基与细胞溶液混合并进行滴胶接种，接种后采用类器官培养液进行培养，最后得到结肠癌类器官或直肠癌类器官。
经过大量样本测试，采用本发明的方法培养的结直肠癌原代肿瘤细胞体外培养成功率可以达到80％以上。
本发明的培养法，培养周期短，仅为3-10天；类器官的细胞直径可达80μm，类器官的总数量可以超过107，其他类型的细胞数量逐渐减少甚至消失。
以下通过具体的实施例对采用本发明的水凝胶培养基培养结肠癌类器官的具体过程进行说明：
实施例1
本实施例采用本发明的水凝胶培养基对获取的直肠癌类器官进行培养，并对培养得到的类器官进行HE染色鉴定和免疫组化染色鉴定。
具体的实验步骤如下：
1.配制用于培养结直肠癌类器官的试剂
(1)样本保存液的配制。本实施例配制500mL样本保存液，具体配方如表1所示：
表1样本保存液
Figure BDA0003720399220000081
样本保存液配制完成后，用15mL离心管进行分装，每管10mL，分装后可于4℃保存1个月。
(2)样本清洗液的配制。本实施例配制500mL样本清洗液，具体配方如表2所示：
表2样本清洗液
Figure BDA0003720399220000082
样本清洗液配制完成后于4℃保存1周。
(3)样本消化液的配制。本实施例配制50mL样本消化液，具体配方如表3所示：
表3样本消化液
Figure BDA0003720399220000091
样本消化液配制完成后，用2mL冻存管进行分装，每管0.5mL，分装后可于-80℃保存6个月。
(4)样本终止液的配制。本实施例配制200mL样本终止液，具体配方如表4所示：
表4样本终止液
Figure BDA0003720399220000092
样本终止液配制完成后于4℃保存2周。
(5)样本类器官培养液的配制。本实施例配制50mL样本类器官培养液，具体配方如表5所示:
表5样本类器官培养液
Figure BDA0003720399220000093
Figure BDA0003720399220000101
(6)样本冻存液的配制。本实施例配制10mL样本冻存液,具体配方如表6所示:
表6样本冻存液
Figure BDA0003720399220000102
(7)纤维素纳米结晶溶液的配制。
采用本发明的制备方法，用醛基对纤维素纳米结晶进行表面改性。本实施例采用的纤维素纳米结晶是由缅因大学开发部开发的产品。
醛基功能化的纤维素纳米结晶是用由高碘酸钠(Sigma-Aldrich)表面氧化的纤维素纳米结晶得来的。将高碘酸钠(NaIO4,1.2g)加入到200ml的1wt％纤维素纳米结晶悬浮液(a-CNC)中。在烧瓶上盖上铝箔，在室温下搅拌2h。加入600μL乙二醇(Sigma-Aldrich)对氧化反应进行淬火。然后将醛基化的纤维素纳米结晶悬浮液使用去离子水透析两周，水每天换两次。然后通过旋转蒸发将a-CNC悬浮液浓缩到>3wt％。为了调节醛基化纤维素纳米结晶溶液的离子强度，将10×HBSS缓冲液按1:10的体积比添加到醛基化纤维素纳米结晶悬液中，使其最终浓度为1×HBSS。
(8)明胶溶液的配制。本实施例配制50ml明胶溶液，具体配方如表7所示：
表7明胶溶液
Figure BDA0003720399220000111
2、直肠癌组织样本的获取。
本实施例采用的样本是与三甲医院合作取得的样本，并通过了正规的医学伦理审查。具体的，主治医生按照医学指南规定的临床指征选择入组患者，并根据术中临床指征选择合适的样本用于体外培养。主治医生提供患者的性别、年龄、病史、家族史、病理分期分型、临床诊断等基本临床信息。隐去患者的姓名、身份证号等与病人隐私相关的信息，用统一的实验编号代替，实验室的命名原则为地区简写+接受样本日期+流水号。例如昆明于2022年3月15号收到的第一例样本，则样本实验编号为K22031501。
样本由医生在无菌环境采集，采集后置于事先准备好的样本保存液中，样本离体后，6小时内冷藏运输到实验室进行下一步操作。
3、直肠癌组织样本消化前处理。
本步骤操作中用到的器材均经过高温高压灭菌和烘干。
将接收的样本用样本清洗液清洗样本10-20次。清洗后，剔除样本中的结缔组织、脂肪组织、坏死组织等多余组织。取出一小块组织，用福尔马林液固定剩余样本用样本清洗液清洗样本5-10次，样本称重。
4、直肠癌组织样本的消化
本步骤操作中用到的器材均经过高温高压灭菌和烘干。离心管、移液管及其他耗材均经过无菌处理。具体步骤如下：
按每克组织样本加2mL样本消化液的用量，将样本消化液加到样本上，再将组织样本剪切成1mm3左右的小块。剪切后，在37℃条件下振荡消化，消化时间为30分钟至2小时。每30分钟在显微镜下观察样本消化情况，直到观察到大量的单细胞，加入10倍体积的终止消化液终止消化。终止消化后，用40μm的无菌过滤网过滤细胞悬液，去除残留组织。对细胞悬液进行离心，离心条件为500xg室温离心5分钟，离心后，弃去上清，得到细胞沉淀。采用用10mL无菌PBS对上述细胞沉淀进行重悬，重悬后再在500xg室温离心5分钟，并再次弃去上清，得到细胞沉淀。
如果得到的细胞沉淀中含有红细胞，即细胞沉淀呈红色，可加红细胞裂解液(Solarbio#R1010)2mL，室温裂解3分钟，加无菌PBS缓冲液10mL终止裂解，500xg室温离心5分钟，弃去上清，得到细胞沉淀。
5、直肠癌类器官的培养。具体步骤如下：
(1)将上述配制好的纤维素纳米结晶溶液和明胶溶液与类器官培养液进行彻底涡旋混合，得到水凝胶培养基。本实施例的水凝胶培养基中，醛基化纤维素纳米结晶的质量分数为1wt％，明胶的质量分数为2wt％。混合后，将水凝胶培养基在紫外灯灭菌至少10min。
(2)采用上述配制好的样本类器官培养液对消化后得到的细胞沉淀进行重悬，得到细胞溶液。在显微镜下观察细胞溶液中细胞的状态，用细胞计数仪对细胞溶液中的细胞进行计数。将细胞溶液与水凝胶培养基混合，进行滴胶接种和培养。其中，每个胶滴40-60μL，每个胶滴中含有5000-25000个细胞。将培养箱先正置10分钟，再倒置30分钟；之后，将胶滴放置在培养箱中，培养箱的条件为37℃、体积百分数为5％的CO2。
(3)每天观察细胞状态。每3天添加一次样本类器官培养液。如果培养液颜色变黄，可提前添加样本类器官培养液，直到细胞形成大于80μm的细胞团。
如图3所示，经过3-10天的培养，类器官的细胞大量扩增形成直径80μm大小的细胞团。另外，类器官的总数量可以超过107，其他类型的细胞数量逐渐减少甚至消失。
6、直肠癌类器官的传代培养。具体步骤如下：
(1)收集上述培养得到的细胞团，并在500xg、室温下离心5分钟，弃去上清，得到细胞团沉淀。
(2)用无菌PBS溶液清洗细胞团沉淀，再次在500xg、室温下离心5分钟，再次弃去上清，得到细胞团沉淀。
(3)用上述配制好的样本消化液对细胞团进行重悬，在37℃条件下消化细胞，每5分钟在显微镜下观察细胞，直到细胞团被消化为单个细胞。
(4)用10倍体积的样本终止消化液终止消化，收集细胞悬液；再在500xg、室温下离心5分钟，弃去上清，得到细胞沉淀。
(5)采用上述配制好的样本类器官培养液对消化后得到的细胞沉淀进行重悬，得到细胞溶液。在显微镜下观察细胞溶液中细胞的状态，用细胞计数仪对细胞溶液中的细胞进行计数。将细胞溶液与水凝胶培养基混合，进行滴胶接种和培养。其中，每个胶滴40-60μL，每个胶滴中含有5000-25000个细胞。将培养箱先正置10分钟，再倒置30分钟；之后，将胶滴放置在培养箱中，培养箱的条件为37℃、体积百分数为5％的CO2。
7、直肠癌类器官的HE染色鉴定。
下述实施例中用到的试剂耗材说明：
HE染色试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司)；多聚甲醛固定液(4％)(武汉赛维尔生物科技有限公司，G1101)；苏木素染液(武汉赛维尔生物科技有限公司，G1005-1)；伊红染液(武汉赛维尔生物科技有限公司，G1005-2)；苏木素分化液(武汉赛维尔生物科技有限公司，G1093-500ML)；黏附载玻片(江苏世泰实验器材有限公司,21025)；标准级盖玻片(江苏世泰实验器材有限公司,21022)；二甲苯(天津市津东天正精细化学试剂厂，分析纯，20211010)无水乙醇(云南景锐，分析纯)；中性树脂胶(国药集团化学试剂有限公司，10004160)。
具体的步骤如下：
(1)取传代培养后的细胞培养体系，弃去培养液，在细胞板中加入细胞修复液，放置在4℃冰箱1.5h左右。期间，随时观察消化情况，可视情况用剪过的枪头轻轻吹打。
(2)把悬液收集到1.5mL ep管中，在500xg、室温条件下离心5分钟，弃去上清，得到细胞沉淀。在细胞沉淀中加入1mL多聚甲醛，常温固定。细胞团块沉淀经梯度酒精脱水后用石蜡包埋并进行切片，切片厚度为3μm。
(3)把切片放到60℃烘箱中放置5分钟左右，融化石蜡。
(4)脱蜡：二甲苯5分钟-二甲苯-5分钟-无水乙醇3分钟-无水乙醇3分钟-95％酒精3分钟-85％酒精3分钟-75％酒精3分钟。
(5)玻片放在纯水或自来水中浸泡1分钟，洗去酒精。
(6)取出玻片，加200μL苏木素染液完全覆盖切片，染色5分钟，使细胞核被染色。染色后，用清水清洗玻片2-3次。
(7)将清洗后的玻片放在分化液中浸泡2s，马上取出并放在清水中浸泡，浸泡后，再缓慢的采用清水对玻片进行冲洗，冲洗时间为15分钟。
(8)取出玻片，滴加200μL伊红染液，染色3分钟，使细胞质被染色。染色后，用清水冲洗浮色。
(9)将玻片按照以下顺序依次进行处理：75％酒精2秒-85％酒精20秒-95％酒精40秒-无水乙醇40秒。
(10)待无水乙醇晾干后，滴加100μL二甲苯；待二甲苯晾干后滴加一滴中性树脂，用盖玻片进行封片。
(11)在显微镜下观察染色状况，并拍照，得到的HE染色图如图5B所示。
8、直肠癌类器官的免疫组化染色鉴定。
免疫组化染色鉴定所需的试剂耗材具体为，多聚甲醛固定液(4％)(武汉赛维尔生物科技有限公司，G1101)；黏附载玻片(江苏世泰实验器材有限公司,21025)；标准级盖玻片(江苏世泰实验器材有限公司,21022)；二甲苯(天津市津东天正精细化学试剂厂，分析纯，20211010)；无水乙醇(云南景锐，分析纯)；中性树脂胶(国药集团化学试剂有限公司，10004160)。
本实施例分别采用以下抗体进行染色：CDX2(AffinitY，DF4679)pan-Cytokeratin(AffinitY，AF0193)、β-Catenin(AffinitY，AF6266)\ki67(AffinitY，AF0198)。
柠檬酸钠抗原修复液50x(碧云天，P0081)、即用型免疫组化试剂盒(迈新KIT-9720)DAB显色试剂盒(迈新DAB-1031)、过氧化氢(昆明天亘消毒制品有限公司，20210902)、苏木素染液(武汉赛维尔生物科技有限公司，G1005-1)。
具体步骤为：
(1)另取传代培养后的细胞培养体系，弃去培养液。向细胞板中加入细胞修复液放置在4℃冰箱1.5h左右。期间，随时观察消化情况，可视情况用剪过的枪头轻轻吹打。
(2)把悬液收集到1.5mL ep管中，在500xg、室温下离心5分钟，弃去上清，得到细胞沉淀；向细胞沉淀中加入1mL多聚甲醛固定液，常温固定。细胞团块沉淀经梯度酒精脱水后用石蜡包埋并进行切片，切片厚度为3μm。
(3)将切片在60℃烘箱中放置5分钟左右，融化石蜡。
(4)按照以下步骤进行脱蜡：二甲苯5分钟-二甲苯-5分钟-无水乙醇3分钟-无水乙醇3分钟-95％酒精3分钟-85％酒精3分钟-75％酒精3分钟。
(5)将玻片放置在纯水或自来水中，浸泡1分钟，洗去酒精。
(6)将切片浸入抗原修复液中，并在微波炉内加热煮沸10分钟。停止后自然冷却至60℃左右，再放置在自来水中浸泡1分钟。
(7)滴加过氧化氢并在避光条件下放置10分钟，之后在PBS中浸泡3分钟。
(8)滴加一抗工作液，在室温下90分钟，或可在4℃下过夜。之后在PBS中浸泡3分钟。
(9)滴加生物素标记的IgG，室温孵育10分钟。PBS浸泡3分钟。滴加链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶，室温孵育10分钟。PBS浸泡3分钟。
(10)滴加DAB显色液，显微镜下随时观察，出现阳性后终止显色，PBS浸泡3分钟。
(11)复染细胞核，苏木素3分钟。自来水浸泡3分钟。
(12)梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
对比例1
采用与实施例相同的溶液和培养、染色步骤对相同的样品进行培养。其中，滴胶接种采用BME替代本发明的水凝胶，并与上述相同的类器官培养液混合并培养，得到的类器官如图4所示，HE染色图如图5C所示，各免疫染色图如图6所示。
为了形成对照，还对实施例1的样品病理组织进行了HE染色和免疫染色，以对比特征。
通过图3和图4可以看出，采用本发明的水凝胶培养基培养的类器官与采用BME培养的类器官相比，具有更大的体积，说明本发明的水凝胶培养基更有利于类器官的生长。
通过图4和图5可以看出，实施例1培养得到的类器官与病理组织以及对比例中采用BME培养的类器官具有相似的特征，可以确定实施例1培养得到类器官为结肠癌类器官。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于培养类器官的水凝胶培养基，其特征在于，包括醛基化纤维素纳米结晶溶液、明胶溶液和类器官培养液。
2.根据权利要求1所述一种用于培养类器官的水凝胶培养基，其特征在于，所述醛基化纤维素纳米结晶溶液包括醛基化纤维素纳米结晶、水和HBSS平衡溶液；
所述明胶溶液包括明胶和Advanced DMEM/F-12基础培养液；
所述类器官培养液的成分包括L-谷氨酰胺、青链霉素、MEM NEAA培养基、A83-01、烟酰胺、L-半胱氨酸、人胰岛素、FBS、B27、EGF、人胃泌素以及DMEM/F12基础培养基。
3.根据权利要求2所述一种用于培养类器官的水凝胶培养基，其特征在于，所述醛基化纤维素纳米结晶的质量占所述水凝胶培养基质量的1wt％，所述明胶的质量占所述水凝胶培养基质量的2wt％。
4.如权利要求1～3任意一项所述的水凝胶培养基在培养结肠癌或直肠癌类器官中的应用。
5.一种如权利要求1～3任意一项所述的水凝胶培养基制备方法，其特征在于，先分别制备所述醛基化纤维素纳米结晶溶液、所述明胶溶液和所述类器官培养液，再将所述醛基化纤维素纳米结晶溶液、所述明胶溶液和所述类器官培养液混合均匀，得到所述水凝胶培养基。
6.根据权利要求5所述一种水凝胶培养基制备方法，其特征在于，所述醛基化纤维素纳米结晶溶液中，所述醛基化纤维素纳米结晶的质量百分数为3wt％,所述明胶溶液中，所述明胶的质量百分数为10wt％；所述醛基化纤维素纳米结晶溶液、所述明胶溶液和所述类器官培养液的体积比为5:3:7。
7.根据权利要求5所述一种水凝胶培养基制备方法，其特征在于，所述醛基化纤维素纳米结晶溶液的制备包括以下步骤：
S1-1、将1.2g高碘酸加入300ml质量百分数为1wt％的纤维素纳米结晶悬浮液中，并在室温下搅拌2h，得到氧化后的悬浮液；
S1-2、向所述氧化后的悬浮液中加入600μL乙二醇；
S1-3、使用去离子水对所述步骤S1-2得到的悬浮液进行透析；透析时间为14天，并且每天更换两次去离子水；
S1-4、将透析后的混合物进行旋蒸浓缩，旋蒸浓缩后的悬液体积为100ml；
S1-5、将浓度为10×的HBSS平衡溶液添加到所述旋蒸浓缩后的悬液中，使得到所述醛基化纤维素纳米结晶溶液中醛基化纤维素纳米结晶的浓度为3wt％。
8.根据权利要求5所述一种水凝胶培养基制备方法，其特征在于，采用涡旋的方法将所述醛基化纤维素纳米结晶溶液、所述明胶溶液和所述类器官培养液混合。
9.根据权利要求5所述一种水凝胶培养基制备方法，其特征在于，最后将所述水凝胶培养基在紫外灯下灭菌，灭菌时间为至少10min。
10.一种结肠癌或直肠癌类器官的培养方法，其特征在于，对结肠癌或直肠癌组织进行消化得到细胞沉淀，再将所述细胞沉淀进行重悬得到细胞溶液；采用权利要求1～3任意一项所述的水凝胶培养基与所述细胞溶液混合并进行滴胶接种，培养后得到结肠癌类器官或直肠癌类器官。
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