TWI426101B

TWI426101B - Compositions, sets and methods of making cell-containing hardened polymers

Info

Publication number: TWI426101B
Application number: TW100102498A
Authority: TW
Original assignee: Mackay Memorial Hospital
Priority date: 2011-01-24
Filing date: 2011-01-24
Publication date: 2014-02-11
Also published as: TW201231540A

Description

製作含細胞之硬化聚合物的組成物、套組及其方法

本發明係關於一種用於保存生物樣本的組成物，特別是關於一種製作含細胞之硬化聚合物的組成物、套組及其方法。

利用細胞學的方法探討細胞或細胞團塊的型態行為表現以及分子基因層次的變化，有助於判斷生物體內在的變化或疾病的發生，亦有助於評估體外或體內分子細胞實驗的結果。將懸浮的細胞或細胞群以細胞蠟塊形式保存，有助於分析大量且重複診斷或實驗的結果，或將現有的細胞型式保存做為日後所需。然而以細胞蠟塊(cell block)製作免疫染色切片經常面臨到形態學維持不佳，有過多的染色背景值影響判讀的信度和效度，或抗原蒙蔽性過強而無法得到預期的結果。

目前製作細胞蠟塊/細胞擔體(cell block)的習知方法大致上包含以下方式：(1)以血漿凝塊法(plasma-thrombin method)包覆捕捉懸浮的細胞，形成單一細胞塊；(2)以液態洋菜膠(Agar embedding)混合懸浮細胞，經冷卻凝固後形成單一凝塊；(3)Histogel^TM 套組；(4)celloidin bag套組；(5)明膠(gelatin)包埋法。以上述方法所形成之凝塊輔以細胞組織蠟塊製作常規即成為可以長久保存之細胞蠟塊。其中第一、三、五種方法須使用動物性材料，具有來源品質不易穩定，存在遺傳物質或分子汙染細胞，以及散播傳染病的危險，此外肝素(heparin)作為抗凝劑會影響凝血酶(thrombin)的酵素活性，也限制了使用第一種方法時檢體的來源範圍及應用的方便性。而以血漿凝塊法所做成的細胞蠟塊，會造成免疫組織染色(IHC)的背景值過強，影響敏感度和專一性。第二種方法雖然簡便，但是會牽涉到洋菜膠熔點過高，液態洋菜膠的溫度會損傷細胞，造成形態學上的缺失。第四種方法操作程序較複雜，且脫模的過程需要較高的技術性，不適用一般的實驗室使用。

另外，若與固定微生物的技術相比較，一般認為固定細胞與組織的技術難度高於固定微生物。能完善固定微生物的擔體，並不表示用於固定組織或細胞就有很好的表現。同時，固定細胞與組織在目的上與固定微生物(微生物包埋)不同，主要在於微生物包埋的目的是希望微生物(細菌)可以均勻分散於凝膠所形成的物理孔隙當中，而組織或細胞的包埋則是希望分散的單獨細胞聚合成擁擠的團塊以利組織處理及後續病理切片觀察，所以細胞在包埋時的聚合度越密集越好。因此，習知微生物包埋的技術是無法轉用至組織或細胞的包埋方面。

鑒於習知的含細胞之硬化聚合物製作方法具有如上述的各種缺點，包括：動物性材料的使用易造成細胞汙染、具有散播傳染病的危險，檢體來源範圍的限制及應用的方便性等，或是造成後續免疫組織染色(IHC)的背景值過強，影響敏感度和專一性，亦或是洋菜膠的溫度會損傷細胞等諸多缺點。

緣此，本發明之一目的即是提供一種製作含細胞之硬化聚合物的組成物。

本發明之另一目的即是提供一種製作含細胞之硬化聚合物的套組。

本發明之又一目的即是提供一種製作含細胞之硬化聚合物的方法。

本發明為解決習知技術之問題所採用之技術手段係提供一種製作含細胞之硬化聚合物的組成物，係由下列成分所組成：(a)10-40 wt%聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,PVA)；(b)5-10 wt%褐藻膠溶液(alginate)；以及(c)10-25 wt%含鈣離子溶液。另外，亦可將上述的組成物包裝製作成為一種製作含細胞之硬化聚合物的套組。

本發明提供一種製作含細胞之硬化聚合物的方法，係包括下列步驟：(a)以10-40 wt%聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,PVA)及5-10 wt%褐藻膠(alginate)溶液製備形成一膠狀物；(b)將一經固定後的細胞離心取其沉澱細胞，並將該沉澱細胞加入一預定體積之步驟(a)的膠狀物中；(c)將該含有沉澱細胞之膠狀物以一透水材料包覆，浸入10-25 wt%含鈣離子溶液中一預定時間硬化形成該含細胞之硬化聚合物。

經由本發明所採用之技術手段，可針對製作含細胞之硬化聚合物所面臨的問題提出解決方案。除了採用非生物性的材料以避免疾病傳播或遺傳物質汙染細胞的危險之外，也不會影響組織免疫染色或細胞化學染色的結果，可用於細胞學及病理學診斷、細胞化學及免疫染色檢查，或用於保存具有價值的細胞樣本。在常溫時以液態存在避免了因溫度因素損傷細胞而影響細胞型態之因素。此外，檢體採用的抗凝劑種類並不影響後續的含細胞之硬化聚合物製作也增加應用的範圍和便利性。而在常規組織處理流程中，會因為組織聚合度不佳或組織過小導致檢體流失的某些組織，亦可適用於本發明。

本發明所採用的具體實施例，將藉由以下之實施例及附呈圖式作進一步之說明。

定義

本發明所使用之「細胞蠟塊」，在此係指經由一種固定化程序，將細胞或組織等檢體、樣本，完整且均勻地固定保存於適當材質中，有利進行後續的檢體處理程序，例如免疫組織染色(IHC)等。

本發明所使用之「褐藻膠」，在此係指從褐藻中提取的一種化合物，其主要成分為褐藻酸(多聚甘露醣醛酸和多聚古羅醣醛酸構成的高分子化合物)的鹽類。主要以海帶、馬尾藻等大型褐藻為原料，用稀鹼溶出製成的鈉鹽。溶於水，黏度高，常使用於食品、紡織、橡膠、醫藥相關產業。

本發明所使用之「聚乙烯醇」，在此係指一種白色粉末狀、片狀或絮狀固體，可溶於熱水和熱的含羥基溶劑如甘油、苯酚等，不溶於甲醇、苯、丙酮、汽油等一般有機溶劑，是一種用途廣泛的水溶性高分子聚合物，常用作漿料、塗料、粘合劑、穩定劑、分散劑、乳化劑、增厚劑、感光劑和填充材料等。

同時參閱第一圖及第二A~二D圖，第一圖為本發明製作含細胞之硬化聚合物的方法之步驟方塊圖，第二A~二D圖係為本發明製作含細胞之硬化聚合物的方法之示意圖。首先，如步驟101及第二A圖所示，製備一含10-40 wt%聚乙烯醇(PVA)及5-10 wt%褐藻膠(alginate)溶液之膠狀物1。可先分別製備一預定濃度之聚乙烯醇及褐藻膠溶液(PVA濃度40，褐藻膠濃度30)，再依最終濃度取適當量均勻混合(3:1~1:1)，使聚乙烯醇及褐藻膠溶液分別佔總重量之10-40 wt%及5-10 wt%。

接著，如步驟102及第二B圖所示，將一經固定後的細胞離心(離心條件為1500rpm離心10分鐘)(固定方法係將沉澱細胞加入10%中性福馬林或70-100%酒精固定15-45分鐘)，取其沉澱細胞3並以一針筒2將沉澱細胞3注入一預定體積之步驟(a)的膠狀物1中，使沉澱細胞3聚集於該膠狀物1中，(兩者的體積比例較佳為等量)。在此雖以細胞為例，但並非僅限於此，亦可為一組織、細胞塊等不同型態的生物檢體樣本。

如步驟103及第二C~二D圖所示，將膠狀物1以一透水材料4包覆，浸入10-25 wt%含鈣離子溶液5中一預定時間硬化形成含細胞之硬化聚合物，其中該透水材料4可以如：濾紙或PVA薄膜等。在此使用的含鈣離子溶液5可以是氯化鈣、硝酸鈣溶液或其他種類的含鈣離子溶液，而浸入時間較佳為2-3小時。

在完成含細胞之硬化聚合物的製備後，即可使懸浮的細胞或細胞群製成細胞蠟塊形式保存，有助於分析大量且重複診斷或實驗的結果，例如免疫組織染色(IHC)或其他病理學分析等，或將現有的細胞型式保存做為日後研究所需。

另外，經由上述方法製備的細胞蠟塊，由於採用非生物性的材料，可避免疾病傳播或遺傳物質汙染細胞的危險，不會影響免疫組織染色的結果。而在常溫時以液態存在，可以常溫操作，避免了因溫度因素損傷細胞而影響細胞型態之因素，且檢體採用的抗凝劑種類也不會影響後續的含細胞之硬化聚合物製作，和習知技術相較之下具有顯著的優點。且在未來的商業發展上，可利用(a)10-40 wt%聚乙烯醇(PVA)；(b)5-10 wt%褐藻膠溶液(alginate)；以及(c)10-25 wt%含鈣離子溶液，作為一種製作含細胞之硬化聚合物的組成物。將此種組成物連同其他相關使用物件，製作包裝成為一種製作含細胞之硬化聚合物的套組，可讓使用者在使用上更為便利。

第一實施例

參閱第三圖，係顯示本發明第一實施例所呈現之組織染色結果。如圖所示，利用本發明之方法對病人腹水內的血液細胞及腫瘤細胞進行完整包覆，並進行組織染色(H&E stain)，其結果如第三圖所示，顯示其具有良好的組織染色效果(放大倍數：400X)。

第二實施例

參閱第四~五圖，係顯示本發明第二實施例所呈現之組織染色結果。如圖所示，利用本發明之方法進行包覆並進行免疫染色，結果顯示無論是細胞質或細胞和特異性抗體皆具有良好的免疫染色效果，其中第四圖係為anti-AE1/AE3 cytokeratin(細胞角質蛋白)抗體進行免疫染色之結果(放大倍數：400X)，而第五圖係為anti-WT-1(Wilms' tumor protein)抗體進行免疫染色之結果(放大倍數：400X)。

由以上之實施例可知，本發明所提供之製作含細胞之硬化聚合物的組成物、套組及其方法確具產業上之利用價值，故本發明業已符合於專利之要件。惟以上之敘述僅為本發明之較佳實施例說明，凡精於此項技藝者當可依據上述之說明而作其它種種之改良，惟這些改變仍屬於本發明之發明精神及以下所界定之專利範圍中。

1．．．膠狀物

2．．．針筒

3．．．沉澱細胞

4．．．透水材料

5．．．含鈣離子溶液

第一圖係為本發明製作含細胞之硬化聚合物的方法之步驟方塊圖；

第二A~二D圖係為本發明製作含細胞之硬化聚合物的方法之示意圖；

第三圖係顯示本發明第一實施例所呈現之組織染色結果；

第四~五圖係顯示本發明第二實施例所呈現之免疫染色結果。

Claims

一種製作含細胞之硬化聚合物的方法，係包括下列步驟：(a)以10-40wt%聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,PVA)及5-10wt%褐藻膠(alginate)溶液製備形成一膠狀物；(b)於室溫中將一經固定後的細胞離心取其沉澱細胞，並將該沉澱細胞加入一預定體積之步驟(a)的膠狀物中；及(c)於室溫中將該含有沉澱細胞之膠狀物以一透水材料包覆，浸入10-25wt%含鈣離子溶液中一預定時間硬化形成該含細胞之硬化聚合物，其中10-40wt%聚乙烯醇但不包含10-20wt%，以及5-10wt%褐藻膠但不包含5wt%。
如申請範圍第1項所述之製作含細胞之硬化聚合物的方法，其中該含鈣離子溶液係為氯化鈣、硝酸鈣溶液。
如申請範圍第1項所述之製作含細胞之硬化聚合物的方法，其中步驟(b)之離心條件係為1500rpm離心10分鐘。
如申請範圍第1項所述之製作含細胞之硬化聚合物的方法，其中步驟(b)之膠狀物之預定體積係與該沉澱細胞之體積為等量。
如申請範圍第1項所述之製作含細胞之硬化聚合物的方法，其中步驟(b)較佳地利用一針筒將該沉澱細胞注入步驟(a)的膠狀物中，並使該沉澱細胞聚集於該膠狀物中。
如申請範圍第1項所述之製作含細胞之硬化聚合物的方法，其中步驟(c)浸入10-25wt%含鈣離子溶液中之預定時間較佳為2-3小時。
一種製作含細胞之硬化聚合物的組成物，係由下列成分所組成：(a)10-40wt%聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,PVA)； (b)5-10wt%褐藻膠溶液(alginate)；以及(c)10-25wt%含鈣離子溶液。
如申請範圍第7項所述之製作含細胞之硬化聚合物的組成物，其中該含鈣離子溶液係為氯化鈣、硝酸鈣溶液。
一種製作含細胞之硬化聚合物的套組，係包括如申請專利範圍第7項所述之組成物。